专利名称：在极小胚胎样(vsel)干细胞中印迹的制作方法
技术领域：
当前公开的主题在某些实施方案中涉及在不同的干细胞类型中确定相对多能性的方法。更具体地，当前公开的主题在某些实施方案中涉及比较选自Igf2-H19、Rasgrfl、 Igf2R、Kcnql和Pegl/Mest的座位的印迹状态，其中Igf2_H19座位的低甲基化、Rasgrf 1座位的低甲基化、Igf2R座位的超甲基化、Kcnql座位的超甲基化以及Pegl/Mest座位的超甲基化是更高多能性状态的指示。
背景技术：
多能细胞及其衍生物的应用在医学研究中得到了越来越多的关注，在提供治疗由于遗传缺陷、损伤和/或疾病过程导致的组织损伤的试剂的领域尤其如此。理想地，可将能够分化为受影响的细胞类型的多能细胞移植至有需要的受试者，它们在那里可与器官微环境相互作用，并提供所需的细胞类型以修复损伤。已付出了相当多的努力以从许多不同的组织中分离多能细胞用于再生医学。例如，Tsukamoto等的美国专利5，750，397号公开了人造血干细胞的分离和生长，据报道所述造血干细胞能够分化为淋巴、红细胞和髓单核细胞系。Bruder等的美国专利5，736，396公开了分离的人间充质干细胞在适当的生长和/或分化因子的影响下谱系定向分化的方法。 然后可将经衍生的细胞引入宿主用于间充质组织再生或修复。极其关注的一个领域涉及胚胎干(EQ细胞的应用，已在小鼠中显示其具有分化为动物所有不同细胞类型的潜能。小鼠ES细胞衍生自胚泡期早期小鼠胚胎的内细胞团的细胞，并且已从生殖组织(例如，原生殖细胞；PGC)分离了其他的多能和/或全能细胞。这些多能和/或全能干细胞在体外以未分化状态增殖、保持正常的核型以及保持分化为所有三种胚胎胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的衍生物的能力，使得这些细胞作为用于出生后受试者的再生治疗的细胞的潜在来源是有吸引力的。然而，人ES (hES)细胞的发展不如小鼠ES细胞的进展那么成功，并且引起了与产生hES细胞的方法相关的伦理学关切。此外，能够从受试者分离和纯化干细胞和/或其他多能细胞是有益的，所述细胞此后能在体外进一步得以纯化和/或操作，然后再引入该受试者用于治疗目的。使用受试者自身的细胞还具有优势，尤其是考虑到不需要应用附加的免疫抑制治疗，由此维持受试者免疫系统的能力。备选地或另外，能够证实已分离了合适的细胞，和/或评估分离自受试者的细胞群中干细胞和/或其他多能细胞的纯度也是有益的。
如此，对来自成年动物的多能细胞类型的研究是正在进行的努力，其已取得了一定程度的进展。例如，间充质干细胞(MSC)即为一种此类细胞类型。已显示MSC具有分化为多个谱系的潜能，包括骨(Haynesworth等(1992) 13 Bone 81-88)、软骨(Mackay等 (1998) 4 Tissue Eng 415-28 ；Yoo 等(1998) 80 J Bone Joint Surg Am 1745-57)、脂肪组织(Pittenger 等 Q000) 251 Curr Top Microbiol Immunol 3-11)、腱(Young 等 (1998) 16 J Orthop Res 406-13)、肌肉和基质(CapIan 等 Q001) 7 Trends Mol Med 259-64)。还已从骨髓(BM)中纯化了另一群细胞，即多能成体祖细胞(MAPC) (Reyes等 (2001) 98 Blood 2615-2625; Reyes & Verfaillie (2001) 938 Ann NY AcacI Sci 231-235)。已显示这些细胞能在体外扩增超过100次群体倍增，而没有端粒缩短或核型异常的发展。还已显示MAPC能够在规定的培养条件下分化为各种间充质细胞类型(例如，成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和骨骼成肌细胞)、内皮、神经外胚层细胞，以及最近发现分化为肝细胞(Schwartz 等 Q000) 109 J Clin Invest 1291-1302)。此夕卜，已报道造血干细胞(HSC)能分化为各种细胞类型。已报道BM造血干细胞能够“转分化”为表达早期心脏(Orlic 等 Q003) 7 Pediatr Transplant 86-88; Makino 等(1999) 103 J Clin Invest 697-705)、骨骼肌(Labarge & Blau (2002) 111 Cell 589-601; Corti 等 Q002) 277 Exp Cell Res 74-85)、神经(Sanchez-Ramos (2002) 69 Neurosci Res 880-893)、肝脏(Petersen 等(1999) 284 Science 1168-1170)或胰细胞(Ianus 等 O003) 111 J Clin Invest 843-850; Lee & Stoffel (2003) 111 J Clin Invest 799-801)标记物的细胞。人体内实验也证实了移植⑶34+周围血(PB)干细胞导致出现了供体衍生的肝细胞(Korbling等Q002) 346 N Engl J Med 738-746)、上皮细胞(Korbling 等 Q002) 346 N Engl J Med 738-746)和神经元(Hao 等 Q003) 12 J Hematother Stem Cell Res 23_32)。此外，还显示了人BM衍生的细胞对梗塞心肌再生有作用 Gtamm 等 Q003) 361 Lancet 45-46)。这些报道已被理解为存在成体干细胞的转分化或可塑性现象的证据。然而，成体组织特异性干细胞转分化的观念当前是科学和医学界存在极大争议的话题(例如，参见 Lemischka (2002) 30 Exp Hematol 848-852; Holden & Vogel (2002) 296 Science 2U6-2129)。试图重复结果的研究提示神经干细胞的转分化不成功(Castro等.Q002) 297 Science 1299)。还显示在肌肉组织中发现的造血干细胞/祖细胞(HSPC)源自 BM(McKinney-Freeman 等 U002) 99 Proc Natl Acad Sci U S A 1341-1346; Geiger 等. 100 BloocI 721-723; Kawada & Ogawa (2001) 98 BloocI 2008-2013)。此外，涉及移植单 HSPC至经致死辐射的小鼠的嵌合动物研究证实循环HPSC和/或它们的后代的转分化和可塑性即使发生的话，也是非常稀有的事件(Wagers等.Q002) 297 Science 2256-2259)。因此，仍然需要产生、鉴定和/或证实适于各种应用的可移植细胞群的纯度的方法，所述应用包括但不限于治理各种器官和/或组织的损伤和/或疾病。发明概述
本概述列出了当前公开的主题的数个实施方案，以及在许多情况下列出了这些实施方案的变形和互换。这一概述仅是许多且不同的实施方案的示例。给定实施方案的一个或更多个代表性特征的提及同样是示例性的。此类实施方案可在有或无该提及的特征的情况下一般地存在；同样地，这些特征可应用于当前公开的主题的其他实施方案，而无论在这一概述中列出与否。为避免过多的重复，这一概述没有列出或提示此类特征的所有可能组合。当前公开的主题提供了用于确定第一假定干细胞相对于第二假定干细胞的多能性程度的方法。在一些实施方案中，该方法包括比较第一假定干细胞和第二假定干细胞之间选自Igf2_H19、Rasgrf 1、Igf2R、Kcnql和Pegl/Mest的一个或更多个座位的印迹状态， 其中Igf2_H19座位的低甲基化、Rasgrfl座位的低甲基化、Igf2R座位的超甲基化、Kcnql 座位的超甲基化以及Pegl/Mest座位的超甲基化是更高多能性状态的指示。在一些实施方案中，该第一和第二假定干细胞选自极小胚胎样干细胞(VSEL)、造血干细胞(HSC)和间充质干细胞(MSC)。当前公开的主题还提供了用于将极小胚胎样干细胞(VSEL)与造血干细胞(HSC) 或间充质干细胞(MSC)相区分的方法。在一些实施方案中，该方法包括将VSEL的选自 Igf2_H19、Rasgrfl、Igf2R、Kcnql和Pegl/Mest的一个或更多个座位的印迹状态与HSC或 MSC中相同的一个或更多个座位相比较，其中相对于HSC或MSC在这些座位的甲基化水平的Igf2_H19座位的低甲基化、Rasgrfl座位的低甲基化、Igf2R座位的超甲基化、Kcnql座位的超甲基化以及Pegl/Mest座位的超甲基化是VSEL的指示。当前公开的主题还提供了用于从预期包含VSEL的来源中分离极小胚胎样干细胞 (VSEL)的方法。在一些实施方案中，该方法包括(a)从该来源分离多个ka-Γ或⑶34+的 CD457lirT细胞以及(b)从该多个或CD34+的CD457lirT细胞中分离细胞亚群， 其中该细胞亚群由以下一个或更多个表征与该多fka-r或⑶34+的⑶45_/lin_细胞中剩余的细胞级份相比的Igf 2-H19座位的低甲基化、Rasgrfl座位的低甲基化、Igf 2R座位的超甲基化、Kcnql座位的超甲基化以及Pegl/Mest座位的超甲基化。在一些实施方案中， 该方法还包括对该细胞进行分级分离，以鉴定Oct-4+、CXCR4+、和/或SSEA-Γ的细胞。当前公开的主题还提供了用于评估极小胚胎样干细胞(VSEL)制备物的纯度的方法。在一些实施方案中，该方法包括(a)提供怀疑包含VSEL的第一制备物；以及(b)将该第一制备物细胞关于选自Igf2_H19、RasgrfU Igf2R、Kcnql和Pegl/Mest的一个或更多个座位的印迹模式与VSEL的第二制备物关于相同的一个或更多个座位的印迹模式进行比较，其中相对于第二制备物，相对于该第二制备物这些座位甲基化水平的Igf2-H19座位的超甲基化、Rasgrfl座位的超甲基化、Igf2R座位的低甲基化、Kcnql座位的低甲基化以及 Pegl/Mest座位的低甲基化是该第一制备物就VSEL而言比该第二制备物更不纯的指示。在一些实施方案中，当前公开的方法还包括从包含VSEL和至少一种选自造血干细胞(HSC)和间充质干细胞(MSC)的其他干细胞类型的来源中分离该第一制备物。在任一个当前公开的方法中的一些实施方案中，Rasgrfl座位的低甲基化包括 Rasgrfl启动子的差异甲基化区(DMR)处的低甲基化，Igf2R座位的超甲基化包括IgfR2启动子DMR2区处的低甲基化，Kcnql座位的超甲基化包括Kcnql启动子KvDMR区的超甲基化， 和/或Pegl/Mest座位的超甲基化包括Pegl/Mest启动子DMR区的超甲基化。当前公开的主题还提供了在当前公开的方法中使用的组合物。在一些实施方案中，该组合物包括包含有多个寡核苷酸引物的试剂盒，其中该寡核苷酸引物与核酸中的差异甲基化区(DMR)的子序列特异性地结合，或与核酸中DMR的侧翼核苷酸序列特异性地结合，其中该寡核苷酸引物可用于分析该DMR中存在的至少一个甲基化核苷酸的甲基化状态。在一些实施方案中，该DMR是人DMR。在一些实施方案中，该DMR存在于选自Igf2_H19 座位、Rasgrfl座位、Igf2R座位、Kcnql座位和Pegl/Mest座位的座位中。在一些实施方案中，该多个寡核苷酸引物经设计以应用选自亚硫酸氢盐测序、载体染色质免疫沉淀(ChIP) 和定量ChIP (qChIP)的技术分析DMR。在一些实施方案中，该多个寡核苷酸引物的至少之一包含SEQ ID NO: 1-96任一个的核苷酸序列。因此，当前公开的主题的一个目标是提供用于确定第一假定干细胞相对于第二假定干细胞的多能性程度的方法。上文已指出了当前公开的主题的一个目标，并且其全部或部分由当前公开的主题实现，当联系作为后文中最佳描述的附图时，其他目标也会随着描述的进行而变得明显。附图简述
图1A-1G描述了实验结果，其显示VSEL中的0ct4启动子是有转录活性的。图IA描述了用于从鼠科动物骨髓(BM)中分离VSEL (Lin7Sca-l+/CD45-)和 HSC(Lin7SCa-l7⑶45+)的荧光激活细胞分选(FACS)策略。如图所示，将淋巴细胞门槛 (Rl)延伸至左边以包括小型干细胞(SC)。图IB是RT-PCR产物的琼脂糖凝胶照片，其显示了 VSEL、HSC、ST和ESC-D3细胞中 0ct4 mRNA的表达。β -肌动蛋白包括在内作为上样对照。在无RT酶的情况下进行对照反应(标记为“_”的泳道)。图IC描述了针对0ct4和SSEA-I免疫染色VSEL的结果。0ct4定位于细胞核中， 如通过用DAPI进行核染色所显示的那样。图ID是描述了 CpG位点(空心圆)在0ct4启动子中的位置，以及用于ChIP测试法的引物0ct4-Sl和0ct4-S2的位置的示意图。图IE描述了 VSEL、HSC、ST和EB中0ct4启动子DNA甲基化的亚硫酸氢盐测序结果。甲基化和未甲基化的CpG位点分别由实心圆和空心圆示出。每一亚硫酸氢盐测序图下的数字显示了甲基化的CpG位点的百分比。图IF是显示了混合有THP-I细胞的VSEL、HSC、丽C和ES细胞(ESC)中0ct4启动子的ChIP分析结果的系列琼脂糖凝胶照片。顶部图描述了常规ChIP分析，其中扩增了 β-肌动蛋白启动子作为内源管家基因的对照反应。对于图1F，应用两个不同的对小鼠序列特异的用于0ct4启动子的引物组(0ct4-Sl、0ct4-S2)在结合(B)及未结合(UB)级份中进行PCR反应。在底部图中，描述了 H3Ac (左图)和H3K9me2 (右图)的ChIP分析。对于这些图，以所指出的循环数(Cs)进行相应的PCR反应。还单独测试了 THP-I细胞作为阴性对照，并在相应的泳道中未观察到PCR产物。应用兔IgG (IgG)抗体作为阴性免疫沉淀对照。D.W.蒸馏水。图IG是一对柱状图，其显示了 0ct4启动子的定量ChIP分析结果，以评估其在 VSEL、HSC、丽C和ESC中与H3Ac及H3K9me2组蛋白的联系。在该定量ChIP测试法中，作为来自结合级份(B)的值与来自未结合级份(UB)的值之比计算每一组蛋白修饰的富集。作为来自至少四个独立实验的平均值士 S.D.显示倍差。**与BM-MNC相比/7 < 0.01。图2A-2D描述了 VSEL、HSC、ST和ESC-D3细胞中Nanog启动子后生状态的分析结^ ο图2A是琼脂糖凝胶照片，其显示了 VSEL、HSC、ST和ESC-D3细胞中Nanog mRNA的RT-PCR分析结果。肌动蛋白用作上样对照，并将在不存在RT酶(_)的情况下进行的分析用作阴性对照。图2Β描述了 Nanog启动子的DNA甲基化亚硫酸氢盐测序结果。甲基化和未甲基化的CpG位点分别由实心圆和空心圆示出。每一亚硫酸氢盐测序结果下方的数字显示了甲基化的CpG位点的百分比。图2C和2D描述了 Nanog启动子中H3Ac和H3K9me2修饰的常规(图2C)及定量 (图2D) ChIP分析结果。在常规ChIP分析(图2C)中，应用来自结合(B)和未结合(UB) 级份的ChIP产物进行PCR，运行所指出的循环数(C)。在定量ChIP分析(图2D)中，作为来自B的值与来自皿级份的值之比计算每一组蛋白修饰的富集，并且作为来自至少四个独立实验的平均值士 S.D.显示倍差。#与BMMNC相比ρ < 0.01。图3A-3E描述了这样的分析结果，即显示了在VSEL中父本甲基化印迹基因的基因组印迹消除。图3A是在Igf2_H19、Rasgrfl和Meg3座位中存在的DMR的示意图。上方和下方的箭头分别表示所示基因的母本和父本起始转录位点。E 增强子。图!3B-3D 描述了 Igf2_H19 (图 3B) ,Rasgrfl (图 3C)和 Meg3 (图 3D)座位 DMR 的DNA甲基化的亚硫酸氢盐测序图。通过应用亚硫酸氢盐修饰和测序结果显示甲基化CpG 位点的百分比。与Igf2-H19和Rasgrfl的DMR不同，Meg3座位的基因间(IG)-DMR的DNA 甲基化仅有很小的差异。图3E描述了通过Taq\限制酶的Igf2_H19 DMRl (上图)和通过feiOT限制酶的 Meg3座位IG-DMR(下图)的COBRA分析结果。与甲基化DNA(Me)不同，未甲基化的DNA(UMe) 不被切割，表明了亚硫酸氢盐反应后限制酶相应识别位点中的序列改变。图4A-4F描述了这样的分析结果，即显示了在母本甲基化印迹基因中VSEL的DMR 超甲基化状态。图4A是Kcnql和Igf^R座位的DMR的示意图。Kcnql和Igf^R座位的DMR分别位于反义转录物的启动子Litl和Air处。图 4B、4C、4E 和 4F 描述了 Kcnql (图 4B)、Igf2R (图 4C)、Pegl (图 4E)禾Π SNRPN (图4F)座位的DMR的DNA甲基化模式亚硫酸氢盐测序结果。甲基化CpG位点的百分比在每一亚硫酸氢盐测序结果的下方示出。图4D是琼脂糖凝胶照片，其显示了通过Taql限制酶切割的Igf2R DMR2(上图) 和通过feii/I切割的KvDMR(下图)的COBRA分析结果。与甲基化DNA(Me)不同，未甲基化的DNA (UMe)不被切割。图5A-5G是系列柱状图和照片，其显示了 VSEL中独特的基因组印迹模式影响了印迹基因的表达水平。图5A-5D和5F是显示了其DMR在VSEL中低甲基化的Igf2_H19 (图5A) 和 Rasgrfl (图5B)，以及母本甲基化的印迹基因Igf2R (图5C)、p57KIP2 (图5D)和Pegl (图 5F)的RQ-PCR分析结果的柱状图。注意，VSEL表达分别针对Igf2R和Kcnql座位的少量反义转录物Air (图5C)和Litl (图5D)。相对表达水平作为相对ST中确定值的倍差表示， 并且作为来自对双分选VSEL、HSC、ST和ESC-D3不同样本的至少三个独立实验的平均值士 S. D.示出。与 ST 相比较，< 0.05，< 0.01。
图5E是显示了 VSEL中p57KIP2免疫染色的一对照片。ρ57ΚΙΡ2蛋白位于细胞核中。图5G是一系列柱状图，其显示了在VSEL、HSC、ST和ESC-D3中分析各CDKI和Cdk 表达的结果。描述了各 CDKI (p21Cip1、pl8Iffi4。、p57KIP2，a)和 Cdk (Cdk2、Cdk4 和 Cdk6)的 RQ-PCR分析。相对表达水平作为就ST中表达而言的倍差表示(y_轴)，并且作为来自对不同细胞群进行的至少4个独立实验的平均值士 S.D.示出。与ST相比较，切< 0. 05, ^p
< 0. Olo图6A和6B分别是系列柱状图和系列照片，其显示了 VSEL表达高水平的Dnmts。图6A是显示了 Dnmt 1、3b、3a和相关蛋白Dnmt3L的RQ-PCR分析结果的柱状图。相对表达水平作为相对ST的值的倍差表示，并且作为来自对双分选VSEL、HSC、ST和ESC-D3 细胞进行的至少三个独立实验的平均值士 S.D.示出。与ST相比较，呦< 0. 05, ^p < 0. 01。图6B是显示了针对Dnmtl和Dnmt3b蛋白免疫染色VSEL的结果的系列照片。包括了 DAPI染色以显现细胞核，并且在每一图的右半部分显示了与DAPI合并的图像(合并的)。两个Dnmt均定位于细胞核中。图7A-7F描述了经设计以分析在VSEL-DS形成期间从抑制的基因组印迹中恢复的实验策略和结果。图7A是示意图，其描述了在下文实施例4中更详细描述的实验策略概况。简而言之，从GFP转基因小鼠(GFP-Tg)的BM中新鲜分离VSEL，并用于发展VSEL-DS。从培养物中分选GFP+细胞。图7B是曲线图，其显示了在新鲜分离的VSEL和VSEL-DS (5、7、11天)中印迹基因DMR和0ct4启动子中DNA甲基化的亚硫酸氢盐测序结果(参见图7C-7E)概述。父本印迹DMR(H19 Jasgrfl)标记为蓝线，以及母本印迹DMR (Igf2R、KvDMR和Pegl)标记为红线。 虚红线表示正常甲基化状态(50%)。图7C-7E描述了在VSEL-DS形成期间DMR的DNA甲基化状态。在新鲜分离的VSEL 和在与C2C12细胞共培养第5、7和11天形成的VSEL-DS中，0ct4 (图7C)、父本甲基化的 DMR H19 (图7D，顶图)、Rasgrfl (图7D，底图)、以及母本甲基化的DMR Igf2R、Kcnql、和 Pegl (图7E)的DNA甲基化亚硫酸氢盐测序图。接种GFP+ VSEL,并通过FACS从VSEL-DS 纯化GFP+细胞。图7F是对位于成体组织中的VSEL在发育以及它们可能的对组织和器官损伤发生反应的活化期间后生的程序重排所提出模型的示意图。序列表简述
SEQ ID NO: 1-42是在实施例中描述的亚硫酸氢盐测序、常规ChIP以及定量 ChlP(qChlP)分析中使用的寡核苷酸引物序列。这些寡核苷酸引物的序列如表1所示。表 1
在亚硫酸氢盐测序、常规ChIP以及定量ChlP(qChlP)分析中使用的寡核苷酸引物序列
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权利要求
1.用于确定第一假定干细胞相对于第二假定干细胞的多能性程度的方法，所述方法包括比较第一假定干细胞和第二假定干细胞之间选自Igf2_H19、RasgrfU Igf2R、Kcnql和 Pegl/Mest的一个或更多个座位的印迹状态，其中Igf2_H19座位的低甲基化、Rasgrf 1座位的低甲基化、Igf2R座位的超甲基化、Kcnql座位的超甲基化以及Pegl/Mest座位的超甲基化是更高多能性状态的指示。
2.权利要求1的方法，其中所述第一和第二假定干细胞选自极小胚胎样干细胞 (VSEL)、造血干细胞(HSC)和间充质干细胞(MSC)。
3.用于将极小胚胎样干细胞(VSEL)与造血干细胞(HSC)或间充质干细胞(MSC)相区分的方法，所述方法包括将VSEL的选自Igf2_H19、RasgrfU Igf2R、Kcnql和Pegl/Mest 的一个或更多个座位的印迹状态与HSC或MSC中相同的一个或更多个座位相比较，其中相对于HSC或MSC在这些座位的甲基化水平的Igf2-H19座位的低甲基化、Rasgrf 1座位的低甲基化、Igf2R座位的超甲基化、Kcnql座位的超甲基化以及Pegl/Mest座位的超甲基化是 VSEL的指示。
4.用于从预期包含VSEL的来源中分离极小胚胎样干细胞(VSEL)的方法，所述方法包括(a)从所述来源分离多个ka-Γ或⑶34+的⑶45_/lin_细胞；以及(b)从所述多个ka-Γ或⑶34+的⑶45_/lin_细胞中分离细胞亚群，其中所述细胞亚群的特征在于以下一个或更多个与所述多个ka-Γ或⑶34+的⑶45_/lin_细胞中剩余的细胞级份相比的Igf2_H19座位的低甲基化、Rasgrfl座位的低甲基化、Igf2R座位的超甲基化、Kcnql座位的超甲基化以及Pegl/Mest座位的超甲基化。
5.权利要求4的方法，还包括对该细胞进行分级分离，以鉴定Oct-4+、CXCR4+、和/或 SSEA-I+的细胞。
6.权利要求1、3和4任一项的方法，其中Rasgrfl座位的低甲基化包括Rasgrfl启动子的差异甲基化区(DMR)处的低甲基化，Igf2R座位的超甲基化包括IgfR2启动子DMR2区处的低甲基化，Kcnql座位的超甲基化包括Kcnql启动子KvDMR区的超甲基化，和/或Pegl/ Mest座位的超甲基化包括Pegl/Mest启动子DMR区的超甲基化。
7.包含有多个寡核苷酸引物的试剂盒，其中所述寡核苷酸引物与核酸中的差异甲基化区(DMR)的子序列特异性地结合，或与核酸中DMR的侧翼核苷酸序列特异性地结合，其中所述寡核苷酸引物可用于分析所述DMR中存在的至少一个甲基化核苷酸的甲基化状态。
8.权利要求7的试剂盒，其中所述DMR是人DMR。
9.权利要求7的试剂盒，其中所述DMR存在于选自Igf2-H19座位、Rasgrfl座位、Igf2R 座位、Kcnql座位和Pegl/Mest座位的座位中。
10.权利要求7的试剂盒，其中所述多个寡核苷酸引物经设计以应用选自亚硫酸氢盐测序、载体染色质免疫沉淀(ChIP)和定量ChIP (qChIP)的技术分析DMR。
11.权利要求10的试剂盒，其中所述多个寡核苷酸引物的至少之一包含SEQID NO: 1-96任一个的核苷酸序列。
12.用于评估极小胚胎样干细胞(VSEL)制备物的纯度的方法，所述方法包括(a)提供怀疑包含VSEL的第一制备物；以及(b)将该第一制备物细胞关于选自Igf2_H19、Rasgrfl、Igf2R、Kcnql和Pegl/Mest的一个或更多个座位的印迹模式与VSEL的第二制备物关于相同的一个或更多个座位的印迹模式进行比较，其中相对于第二制备物，相对于该第二制备物这些座位甲基化水平的Igf2_H19座位的超甲基化、Rasgrfl座位的超甲基化、Igf2R座位的低甲基化、Kcnql座位的低甲基化以及 Pegl/Mest座位的低甲基化是所述第一制备物就VSEL而言比所述第二制备物更不纯的指示ο
13.权利要求12的方法，还包括从包含VSEL和至少一种选自造血干细胞(HSC)和间充质干细胞(MSC)的其他干细胞类型的来源中分离所述第一制备物。
全文摘要
提供了用于确定第一假定干细胞相对于第二假定干细胞的多能性程度的方法。在一些实施方案中，该方法包括比较第一假定干细胞相对于第二假定干细胞的选自Igf2-H19、Rasgrf1、Igf2R、Kcnq1和Peg1/Mest的座位的印迹状态。还提供了用于将极小胚胎样(VSEL)干细胞与造血干细胞(HSC)或间充质干细胞(MSC)相区分的方法，用于从预期包含VSEL的来源中分离VSEL的方法，用于评估极小胚胎样干细胞(VSEL)制备物的纯度的方法，以及包含可在实施所要求保护的方法中应用的寡核苷酸引物的试剂盒。
文档编号C12N5/071GK102395683SQ200980154505
公开日2012年3月28日 申请日期2009年11月16日 优先权日2008年11月14日
发明者辛 D-M., 拉塔查克 J., 库恰 M., 拉塔查克 M. 申请人:路易斯维尔大学研究基金会有限公司