专利名称：一种提高目标蛋白在转基因水稻胚乳中表达量的方法
技术领域：
本发明涉及一种可提高目标蛋白在转基因水稻胚乳中表达量的方法。更具体地 说，本发明涉及水稻种子贮藏蛋白之一的谷蛋白GluA-2的信号肽编码序列以及利用该序 列的研究与应用，将该序列与目标蛋白融合，可明显地提高目标蛋白在转基因水稻胚乳中 的表达量。本发明属于生物基因工程领域。
背景技术：
利用转基因技术在植物中表达异源基因，以提高抗逆性、增加产量和改善品质等 已成为现代农业生物技术研究开发的重点与热点。尤其是近年来，利用植物这一廉价生产 系统作为生物反应器，来大量生产重组的编码具重要功能的异源蛋白、医用活性多肽或疫 苗、抗体、工业用酶或蛋白质等，是目前植物基因工程发展的一个重要领域之一，其研究与 开发方兴未艾，有可能形成一个低投入、高产出的新兴生物技术产业。但是，在植物生物反 应器研究中存在一个较为突出的问题，即目标蛋白的表达量极低，某些蛋白还不能稳定积 累下来，如在转基因植物中表达的重组抗原的量一般只占总可溶性蛋白的0.01-1 %。因此， 建立高效稳定的新型植物生物反应器技术体系历来是该领域研究的重点与难点。细胞代谢 合成的蛋白质在植物与动物中贮存的方式有所不同；因此，要实现重组蛋白(尤其是一些 非植物来源的目标蛋白)在转基因植物细胞中高效表达与稳定积累，需要遵循与植物本身 蛋白一致的表达与贮存规律。除了对目标蛋白编码基因的密码子进行修改外，另一关键技 术，便是要应用受体植物来源的基因表达调控元件和目标蛋白靶向序列。其中，使用组织特 异性表达基因的启动子及其相关靶向调控元件，尤其是种子特异性表达基因的启动子及其 氨基-端(N-端)的信号肽编码序列，被认为是实现目标蛋白在植物特定的组织中高效表 达的有效途径。种子贮藏蛋白是水稻种子中仅次于淀粉的一种富含成分，其编码基因的表达往往 具有极严格的组织与时空特异性，而且还含有特定的蛋白靶向调控元件。这些基因在翻译 形成蛋白前体时，其氨基末端都含有一段信号肽(signal peptide, SP)序列，长度随贮藏蛋 白种类的不同而有所不同，它们在贮藏蛋白及其mRNA分子的定位及运输中起重要作用。在 贮藏蛋白基因转录出成熟的mRNA后，首先翻译形成含信号肽的前体蛋白，此时该前体蛋白 由信号肽序列牵引定向地转移到粗糙型内质网腔内，随后这一信号肽序列从前体蛋白上被 剪除下来，以便贮藏蛋白能正确地加工(Coleman等1995)。除了在目标蛋白的正确定向中 具有决定作用外，信号肽序列在调控基因表达水平上也具有重要的作用(Boehm等2000)。 信号肽序列的上些特性已在转基因植物研究中获得了很好的应用。例如，利用菜豆肌动蛋 白内质网特异的信号肽序列可明显增强大肠杆菌辅酶Q在转基因烟草中的转录与随后的 表达量。由此可见，贮藏蛋白的信号肽序列对于在转基因植物中外源蛋白的表达与沉积是 有积极作用的。谷蛋白是水稻胚乳中最主要的贮藏蛋白，它一般在种子发育的中后期大量合成并 积累(Yamagata等1982)。虽然它与豆科植物中的IlS球蛋白的溶解性能完全不同，但它们在氨基酸组成、蛋白质结构及其合成途径上有许多相似之处(Zhao等1983，Wen和Luthe 1985)，因此有时将水稻谷蛋白也归为植物的球蛋白大家族中。水稻种子中含有三种不同 分子量的谷蛋白，分别为57KDa的前体谷蛋白、37-39KDa的酸性亚基(具酸性等电点)和 20-22KDa的碱性亚基(具碱性等电点)，其中的酸性亚基和碱性亚基是由谷蛋白前体经翻 译后加工剪切而成(Yamagata等1982)。成熟的谷蛋白都是异质性的，如谷蛋白酸性亚基至 少由12个多肽组成，而碱性亚基也至少含有9个多肽(Wen和Luthe 1985)。根据谷蛋白的 氨基酸序列，可将其分为A和B两个大的亚家族(Sub-fami Iy，分别简称为GluA和GluB)，每 一个亚家族中都由多基因控制；GluA或GluB内各多肽间氨基酸序列的同源性在80-88%之 间，而两类不同亚家族间多肽的氨基酸序列同源性却不到65% (Takaiwa等1991)。从谷蛋 白基因或其cDNA推导的氨基酸序列分析，在谷蛋白前体的氨基末端(N-端)有一个很典型 的由24个氨基酸残基组成的信号肽，该信号肽序列在引导谷蛋白前体定位于内质网膜上， 并进而转运到内质网膜腔内的过程中起重要作用(Okita等1989，Takaiwa等1991)。目前，已有多个谷蛋白基因被分离克隆(Okita等1989，Takaiwa等1987，Takaiwa 等1991，Takaiwa和Oono 1991)。在GluA亚家族中至少有三种不同的编码基因，Takaiwa 和 Oono (1991)将它们分别命名为 GluA-I (D00584)、GluA_2 (Y00687)和 GluA-3 (X54313)，它 们在每个水稻单倍性基因组上都含有5-8个拷贝(Okita等1989)。另外还有一个基因称为 GluA-4，属于假基因(Pseudogene,Takaiwa和 Oono 1991)。GluA-I 与 GluA-2 的编码区核苷 酸序列同源性较高，达到95%，而GluA-I (或GluA-2)与GluA-3的同源性只有81%。GluA 亚家族内各成员间在基因组织结构及一些特异序列上都很保守(Okita等1989)。GluA-2 是水稻谷蛋白家族的成员之一，其前体蛋白的氨基末端含有由24个氨基酸组成的信号肽 序列。该基因的基因组序列已被克隆(GenBank登记号为Y00687)。对GluA_2基因的表达 特性研究表明，该基因只有发育的水稻胚乳中特异性地表达。发明人的前期研究已表明，该 基因启动子可指导外源基因在转基因水稻种子胚乳中特异性高效表达。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高目标蛋白在转基因水稻种子胚乳中表达量的方法， 通过先制备可用于提高目标蛋白在转基因水稻胚乳中表达量的信号肽编码序列，再将该序 列转化进入水稻细胞中再生植株，从而提高目标蛋白在转基因水稻胚乳中的表达量。本发明的技术方案是这样的一种提高目标蛋白在转基因水稻胚乳中表达量的方 法，其特征是将水稻谷蛋白GluA-2基因信号肽编码序列与目标蛋白基因编码序列连接在 一起构建成融合蛋白基因，将融合蛋白基因转化进入水稻细胞中获得转基因水稻，转基因 水稻经培养结实，种子胚乳中表达有目标重组蛋白。上述方法中融合蛋白基因与种子特异性表达启动子或组成型表达启动子连接并 克隆到可转化水稻的载体上，再转化进入水稻细胞中，从该转化细胞再生出植株。所述的信号肽编码序列有72位碱基的核酸，其核苷酸序列如SEQ IDNo. 1所示。 该核酸编码水稻谷蛋白GluA-2基因的氨基末端的信号肽，共24个氨基酸残基，如SEQ ID No. 2所示。所述的转基因水稻包括转基因水稻细胞或将转化的水稻细胞培育成植株，以及由 这些转基因植株的有性或无性繁殖的后代。
所述的目标蛋白可以包括任何在生产上的有应用价值的蛋白或酶，编码该蛋白的 基因可以来自植物、人、动物或微生物。本发明利用转基因技术在水稻胚乳中表达目标基因，提高目标蛋白在转基因水稻 胚乳中的表达量，方法科学简单先进。将包括SEQ ID NO. 1的GluA-2基因信号肽编码序 列与目标蛋白基因编码序列连接在一起，构建成融合蛋白基因，再与相关的种子特异性表 达启动子连接并克隆到可用于转化植物的载体上；通过转基因技术将构建的嵌合基因转化 进入作物或植物细胞中，从该转化细胞再生出植株，经自交或人工授粉结实生产种子；采用 Northern blot和Western blot等技术检测异源重组蛋白在转基因植物种子中的表达量， 相比于未使用GluA-2基因信号肽编码序列的构建，目标蛋白的表达量明显提高。
图1转基因水稻GG和GSG未成熟种子总RNA的Northern杂交分析。上图为 Northern杂交结果，下图显示总RNA中的28S核糖体RNA。总RNA分别抽提自GG和GSG类 转基因水稻植株或武香粳9号未转化植株(标记为WT)的未成熟种子( 12DAP)，其中GSG 类转基因水稻植株中的GUS嵌合基因含有谷蛋白GluA-2的信号肽编码序列。杂交所用的 探针为地高辛标记的反义GUS编码区片段。图2GG和GSG转基因水稻植株成熟种子总蛋白的Western杂交分析。胚乳总蛋白 分别抽提自GG和GSG类转基因水稻植株或武香粳9号未转化植株(标记为WT)的成熟种 子，其中GSG类转基因水稻植株中的GUS嵌合基因含有谷蛋白GluA-2的信号肽编码序列。 每个泳道所加的总蛋白量一致，各为30微克，蛋白经SDS-PAGE分离后，转印到硝酸纤维素 膜上，然后用抗GUS蛋白的特异抗体进行杂交分析。箭头所指即为GUS蛋白。
具体实施例方式以下分四个最佳步骤进一步阐明本发明的具体实施方式
。实施例所述内容不构成 对本发明权利要求范围的限制。1、水稻谷蛋白GluA-2信号肽编码序列的克隆在水稻谷蛋白GluA-2前体的N-端含有由24个氨基酸组成的信号肽序列。根据 已发表的水稻谷蛋白GluA-2基因的核苷酸序列(GenBank Y00687)，设计了一对引物GtlP6 5’ CAGGATCCAATGGCATCCATAAATCGCCCC-3’ (SEQ ID N0. 3)和 GtlPin :5’ -CACCATGGCTAGGGA GCCATCGCACAA-3，(SEQ ID N0. 4)，在引物5’末端分别加上BamHI和NcoI位酶切位点。以 水稻品种武运粳8号基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增条件为95°C、5min ；95°C、 50sec, 55°C、50sec，72°C、30sec，30 个循环；72°C、5min。PCR 产物经克隆入质粒 pGEM-T (购 自Promega公司)后进行序列分析。经测序分析，克隆的GluA-2信号肽编码序列片段(称 为GluA-2_SP片段)包含了 GluA-2基因ATG下游+1到+72位碱基之间的序列，该序列即为 该基因的信号肽编码序列，见序列表SEQ ID NO. 1中所示。经测序鉴定正确的、含GluA-2_ SP片段的克隆标记为pGtSP。同时，又根据已发表的GluA-2基因序列，设计并合成了一对引物GtlP1 5'-GGCM GCTTCACTGCTACCTTTAAGTAAC-3’ (SEQ ID N0. 5)和GtlP35‘CGAG GATCCGTTGTTGTAGGACTAAT GAA-3，(SEQ IDN0. 6)，借助于PCR技术从水稻品种武运粳8号总DNA中扩增GluA-2基因翻译起始密码子ATG上游1.3kb长的启动子区。在两个引物的5’末端分别加上了 Hind III 和Bam HI限制性内切酶位点，以方便随后的克隆。PCR扩增前，在50 μ 1反应液中混合IX 反应缓冲液、1. 5mM MgCl2、0. 2mMdNTPs、l μ M 引物 GtlP1U μ M 引物 GtlP3、2.西 5 单位 Taq DNA 聚合酶(Promega) ；PCR 扩增程序如下95°C、5min ；95°C、lmin，50°C、lmin，72°C、Imin 30sec，30 个循环；72°C、10min。扩增的 DNA 片段称为 GluA_2_Pro。2、GluA-2信号肽编码序列与⑶S融合基因的构建为检测上述所克隆的GluA-2信号肽编码序列(GluA_2_SP片段)对于目标基因在 转基因水稻种子胚乳中表达的影响，分别将GluA-2_Pro和GluA_2_SP片段与⑶S(i3 -半 乳糖苷酸酶)报告基因编码区、胭脂碱(NOS)基因终止子序列构建成融合基因。首先将 GluA-2_Pro和GluA_2_SP片段连接在一起，形成GluA_2_Pro+SP片段。然后，将该片段经 Hind III和Nco I双酶切，替代双元载体pCAMBIA1301 (由澳大利亚CAMBIA机构惠赠)中 ⑶S编码区上游的35S启动子，即构建成双元载体P13GSG。该载体中，在GluA_2_Pro启动子 与GUS基因编码区(保留有自己的ATG序列)之间即含有GluA-2基因的信号肽编码序列， 信号肽编码序列与GUS编码区序列组成一个融合基因，经测序证明两者的读码框都没有发 生改变。同时，为比较GluA-2基因信号肽编码序列对⑶S基因表达的影响，又构建了只 含有GluA-2基因启动子(GluA-2_Pro)的⑶S嵌合基因。构建流程如下。首先用限制性 内切酶Sac I和Eco RI从质粒pBI121上切下270bp长的NOS终止子，克隆进双元载体 PCAMBIA1300 (由澳大利亚CAMBIA机构惠赠)的相应位点中，构建成质粒pC1300/N0S。再 从双元载体pIG121Hm(由日本Hiei等惠赠)(Hiei等1994)上用Bam HI和Sac I切下并 回收2. Okb长的GUS基因编码区序列，将其克隆进质粒PC1300/N0S的相应位点中，形成质 粒PC1300/GN。进一步用Hind III和BamHI双酶切GluA_2_Pro片段，连接入质粒pC1300/ GN的相应酶切位点中，构建成含GluA-2_Pro启动子与⑶S报告基因相融合的质粒pl3GG。3、GluA-2信号肽编码序列与⑶S融合基因导入水稻获转基因植株将上述2中所构建的双元载体P13GSG和pl3GG经冻融法分别导入根癌农杆菌菌 株EHA105感受态细胞中；按申请人已建立的农杆菌介导转化水稻的程序(刘巧泉等，植物 生理学报，1998)，将所构建的两个GUS融合基因分别导入水稻中。具体转化程序如下。取开花后12 15天的水稻品种武香粳9号未成熟种子经 70%乙醇表面消毒2min后，于含2%活性氯的NaClO溶液中消毒90min以上，并不时摇动， 用无菌水冲洗4 5次，然后用解剖刀和镊子剥出幼胚并培养于愈伤组织诱导培养基上诱 导愈伤组织，经4-7天预培养后诱导出的初生愈伤组织用于农杆菌介导的转化实验。将在 超低温保存的根癌农杆菌菌种于含50mg/l卡那霉素的YEB半固体培养基上活化后，挑取单 菌落接种到3ml含50mg/l Km的YEB液体培养基中，于28°C振摇培养过夜；第2天按1 % 接种量转接入40ml含50mg/l Km的AB液体培养基中，于28°C、250rpm继续培养6 8hr。 将新鲜的培养液于6000rpm、4°C离心5min，收集菌体并重悬于10 15ml的AAM(含100 400umol/l乙酰丁香酮)液体培养基中，立即用于与水稻受体材料的共培养转化。将各种 适宜的水稻受体材料浸没在新鲜的AAM农杆菌菌液中15 30min，间或摇动几次。然后将水 稻材料移出，在无菌滤纸上吸去过多的菌液，随即转移到N6D2C共培养培养基上，于26-28°C 黑暗条件下共培养3天。3天后，切去胚芽并转入选择培养基上进行选择培养。10 14天后长出的新鲜愈伤组织再转移到新的选择培养基上继续筛选2代(10 14天/代)，然后 选择生长旺盛的抗性愈伤组织转移到分化培养基上分化小苗(12hr光照/天)，再生的小 苗经生根壮苗后移入网室或人工气候室盆栽。两个融合基因构建中，各获得了 20个以上的 独立转化子。含GluA-2_Pro+GUS融合基因的转基因植株称为GG，依次编号为GG1、GG2和 GG20等，而含GluA-2_Pro_SP+GUS融合基因的转基因植株称为GSG，依次编号为GSG1、GSG2 和GSG20等。每个转化子含有2-6个转基因水稻植株。转基因水稻植株移栽入大田后，绝 大多数能正常生长、开花并结实。所有转基因植株经PCR和Southern杂交分析证明⑶S融合基因已整合进转基因 水稻的基因组中，整合位点从1至4个不等，GG与GSG两类转基因水稻植株中的整合情况 相似。4、GluA-2信号肽编码序列与⑶S融合基因在转基因水稻胚乳中的表达在转基因水稻开花后12天左右，从每一植株上收取40粒左右未成熟种子，提取总 RNA,并用与GUS基因编码区序列特异的反义DNA探针进行Northern杂交分析，结果显示在 两类转基因水稻植株未成熟种子中都有较高的GUS基因的转录本(图1)。从杂交信号的强 弱判断，虽然在不同转化子间的表达量有较大的差异，但从总体情况分析，在GSG转基因水 稻中，与GluA-2信号肽序列融合的GUS嵌合基因的表达水平明显高于GG类转基因水稻种 子中GUS嵌合基因(即不含信号肽序列、只含GluA-2启动子序列的GUS嵌合基因)的转录 水平，说明有GluA-2信号肽序列的存在，可提高目标基因在转基因水稻胚乳中的转录水平 (图 1)。在转基因水稻成熟后，收取成熟种子，从其胚乳中提取种子总蛋白，用抗GUS的特 异抗体进行Western杂交分析，结果也显示在两类转基因水稻成熟种子中都有GUS蛋白的 积累(图2)。在不同转基因水稻种子中GUS蛋白的表达量有所不同，这与Northern杂交的 结果相类似。但从总体趋势上分析，在GSG类转基因水稻胚乳中GUS蛋白的积累量明显高 于GG类转基因水稻中的(图2)。综合上述结果，当在GUS基因编码区前加接上GluA-2基因的信号肽编码序列时， 不仅可明显促进GUS融合基因的转录效率，而且可使最终的蛋白产物表达量也明显增多。 对Northern和Western杂交中各杂交信号进行扫描定量比较分析，在GSG类转基因水稻胚 乳中⑶S蛋白的表达量比GG类转基因水稻中的要高5-10倍。
权利要求
一种提高目标蛋白在转基因水稻胚乳中表达量的方法，其特征是将水稻GluA 2基因信号肽编码序列与目标蛋白编码序列连接在一起构建成融合蛋白基因，将融合蛋白基因转化进入水稻细胞中获得转基因水稻，转基因水稻经培养结实，种子胚乳中表达有目标重组蛋白。
2.根据权利要求1所述的提高目标蛋白在转基因水稻胚乳中表达量的方法，其特征是 所述的信号肽编码序列如SEQ ID No. 1所示，是有72位碱基的核酸；该核酸编码水稻谷蛋 白GluA-2基因的氨基末端的信号肽，信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
3.根据权利要求1所述的提高目标蛋白在转基因水稻胚乳中表达量的方法，其特征是 所说的融合蛋白基因与种子特异性表达启动子或组成型表达启动子连接并克隆到可转化 水稻的载体上，再转化进入水稻细胞。
4.根据权利要求1、2或3所述提高目标蛋白在转基因水稻胚乳中表达量的方法，其特 征是所说的转基因水稻包括转基因水稻细胞或将转化的水稻细胞培育成植株，以及由这些 转基因植株的有性或无性繁殖的后代。
5.根据权利要求1所述提高目标蛋白在转基因水稻胚乳中表达量的方法，其特征是所 说的目标蛋白包括任何在生产上的有应用价值的蛋白或酶，编码该蛋白的基因来自植物、 人、动物或微生物。
全文摘要
本发明公开了一种利用水稻贮藏蛋白的信号肽编码序列提高目标蛋白在转基因水稻胚乳中表达量的方法。该方法是将水稻GluA-2基因信号肽编码序列与目标蛋白编码序列连接在一起构建成融合蛋白基因，将融合蛋白基因转化进入水稻细胞中获得转基因水稻，转基因水稻经培养结实，种子胚乳中表达有目标重组蛋白。本发明借助于包含SEQ ID NO.1序列的GluA-2信号肽编码序列，将目标蛋白编码序列与其构建成融合基因，并导入植物中，可以显著地提高目标蛋白在转基因水稻胚乳中的表达量。
文档编号C12N15/62GK101942477SQ20101024486
公开日2011年1月12日 申请日期2010年8月4日 优先权日2010年8月4日
发明者刘巧泉, 顾铭洪 申请人:扬州大学