含有富含亮氨酸重复序列的融合蛋白及其制法和应用的制作方法

含有富含亮氨酸重复序列的融合蛋白及其制法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种含有富含亮氨酸重复序列的融合蛋白及其制法和应用。具体的，本发明涉及一种融合蛋白，所述的融合蛋白自N端至C端具有以下结构：A—X—E—Y1—Y2式Ia；A—Y2—Y1—E—X式Ib；其中，A为任选的分泌信号肽；X为Slit2蛋白(神经导向因子2)富含亮氨酸的重复序列1-2(LRRs1-2)元件；E为酶切位点；Y1为第一标签多肽元件；Y2为第二标签短肽元件，所述第二标签短肽元件为His标签元件；“—”表示连接上述元件的肽键或肽接头。本发明融合蛋白有助于LRR正确折叠，形成有活性的功能多肽，而且可以简便地通过一次酶切就将两种标签元件清除，从而制得高纯度、高活性的LRR序列。
【专利说明】含有富含亮氨酸重复序列的融合蛋白及其制法和应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物分子领域，尤其涉及含有富含亮氨酸重复序列的融合蛋白及其制 法和应用。

【背景技术】
[0002] 神经导向因子Slit是一种在进化上高度保守的分泌型细胞外基质糖蛋白，其 基因在1988年发现在中枢神经系统的形成中发挥作用。Slit是一组相对分子质量为 170-190kDa的细胞外分泌蛋白，对轴突生长和神经元迁移起导向作用的轴突定向分子族成 员之一。
[0003] Slit蛋白是作为Roundabout (Robo)的配体发挥多功能的导向分子，它不仅具有 调节神经轴突生长方向、引导神经细胞迁移、影响神经细胞形态分化的功能。近年来的研究 发现，Slit在血管生成、心脏形态发生、肿瘤细胞迁移等多种生理过程中也发挥作用。
[0004] 在脊椎动物中存在3种Slit基因，即Slitl、Slit2、Slit3,并在各种生物组织中 广泛表达。
[0005] S1 i t蛋白的主要结构包括N端的胞外分泌信号肽，4个连续的富含亮氨酸 的重复序列（leucine-rich repeat，LRRs),也被命名为D1-D4结构域，串联的6-9个 EGF (epidermal growth factor)样功能区，一个laminin G样结构域和一个富含半光氨酸 的C末端结构域。
[0006] Slit2能够抑制神经胶质瘤、纤维肉瘤、乳腺癌、口腔鳞癌细胞的迁移，Slit3能 够抑制恶性黑色素瘤细胞的迁移，也有报道称Slit2能够促进乳腺癌和结直肠癌细胞的转 移。目前，Slit2对血管生成的作用仍存在争议，关于Slit2促进血管生成和抑制血管生成 的两方面作用都有文献报道。Dunaway等发现，在Slit2单独存在时，体外和体内实验都证 明其能促进血管生成；然而在Ephrin-Al存在时，Slit2则能抑制血管生成，说明体外相对 简单的细胞实验环境得到的结果并不能完全反映体内的真实作用。
[0007] Anil Prasad等人的研究表明，过度表达Slit2可以抑制乳腺癌细胞以及小鼠体 内肿瘤的生长；Tseng等人的研究表明Slit2可以减缓肺癌的发展过程；Yuasa-Kawada等 人报道了 Slit蛋白能够抑制乳腺癌细胞的迁移；Werbowetski-Ogilvie等人报道了 Slit2 能抑制成神经管细胞瘤细胞的侵袭；Yiin等人报道了 Slit2能抑制大脑中神经胶质细胞瘤 细胞的侵袭。综合考虑Slit2和/或Robol基因在肿瘤中存在广泛的启动子甲基化而导致 功能的缺失，以及Slit2对肿瘤发生发展的抑制作用。
[0008] 为了研究和应用，有必要对Slit蛋白或其片段进行表达和分离纯化。然而，由于 天然蛋白的含量有限，分离困难，因此需要开发高效的重组生产工艺。
[0009] 在重组生产工艺中，高效地生产出构象正确且便于分离和纯化的目的蛋白，常常 是较为困难的。常用的大肠杆菌表达系统虽然可以较高效地表达目的蛋白，但却常常需要 复杂的复性工艺，且复性后的目标蛋白的活性往往难以令人满意。
[0010] 当采用真核表达系统进行表达时，虽然避免了复性工艺，但目标蛋白的正确折叠、 如何实现高表达水平以及如何有效分离目标蛋白仍然是难点，尤其是对于某些短肽或含重 复序列的多肽而言。
[0011] 获得了含目标蛋白的培养液（或发酵产物）后，可采用各种不同的纯化手段进行 分离纯化。目前，一种常用的分离纯化重组蛋白的方法为亲和层析技术。
[0012] 以采用的His标签为例，6XHis是专门设计用于重组蛋白质纯化工作的标签蛋 白，是目前最常见的表达方式，其表达纯化技术都很成熟，而且相对比便宜，它的优点是表 达方便而且基本不影响蛋白的活性。通常带组氨酸蛋白都可以在天然情况下被镍琼脂糖凝 胶或镍NTA琼脂糖凝胶吸附，但是因为His标签非常小，如果在融合蛋白折叠过程中被折叠 到蛋白内部而导致His标签不容易暴露的话，则很难开展蛋白纯化工作；同时His标签确实 还存在特异性不够的问题。
[0013] 通常，使用His标签技术分离所得的蛋白质纯度约为90%左右，而现有技术中，使 蛋白进一步纯化的工艺和步骤都相对较为繁琐，且添加的蛋白或肽段常会对目标蛋白的活 性造成干扰，导致目标蛋白的表达不准确或杂质过多。
[0014] 综上所述，为了简便高效地制备高纯度、高活性的重组蛋白，本领域迫切需要开发 高效简便的生产工艺。


【发明内容】

[0015] 本发明的目的就是提供一种高效简便的生产外源蛋白的方法，从而简便高效地制 备高纯度、高活性的重组蛋白。
[0016] 本发明提供了一种融合蛋白，所述的融合蛋白自N端至C端具有式la或lb所述 的结构：
[0017] A-X-E-Yl-Y2 式 la ;
[0018] A - Y2-Yl-E- X 式 lb ;
[0019] 其中，
[0020] A为任选的分泌信号肽；
[0021] X 为 Slit2 蛋白的富含亮氨酸的重复序列 1-2 (leucine-rich repeatl-2, LRR1-2) 元件；
[0022] E为酶切位点；
[0023] Y1为第一标签多肽元件；
[0024] Y2为第二标签短肽元件，所述第二标签短肽元件为His标签元件；
[0025] "一，，表示连接上述元件的肽键或肽接头。
[0026] 在另一优选例中，所述的融合蛋白具有位于N端的分泌信号肽。
[0027] 在另一优选例中，所述的分泌信号肽是来自于Slit2的分泌信号肽、或来自于其 他蛋白的分泌信号肽。
[0028] 在另一优选例中，所述的分泌信号肽在其N端具有或不具有起始氨基酸Met。
[0029] 在另一优选例中，所述的第一标签多肽元件的46aa。
[0030] 在另一优选例中，在X和E之间的"一"为肽键。
[0031] 在另一优选例中，在Y1和Y2之间无蛋白酶切位点。
[0032] 在另一优选例中，在Y1和Y2之间的"一"为肽键。
[0033] 在另一优选例中，所述的酶切位点是TEV蛋白酶的酶切位点。
[0034] (LeuGluValLeuPheGlnGlyPro, SEQ ID NO. :3)
[0035] 在另一优选例中，所述的肽接头长度为3-15个氨基酸；较佳地5-10个氨基酸。
[0036] 在另一优选例中，所述的Slit2蛋白来源于哺乳动物。
[0037] 在另一优选例中，所述的Slit2蛋白来源于人、大鼠、小鼠；更佳地，来源于人。
[0038] 在另一优选例中，所述的Y1包括SEQ ID N0. : 2所示的改良型亲和素标签（Strap II标签）、链亲和素（Strepavidin)标签。
[0039] 在另一优选例中，所述的His标签元件包括8 XHis标签元件和6 XHis标签元件。
[0040] 在另一优选例中，所述的Y1为Strap II标签，而Y2为8XHis标签元件。
[0041] 在另一优选例中，所述的S1U2LRR1-2的氨基酸序列如SEQ ID N0. :5所示。
[0042] 本发明第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码本发明第一 方面所述的融合蛋白。
[0043] 在另一优选例中，所述的多核苷酸序列如SEQ ID N0. :6所示。
[0044] 本发明第三方面，提供了一种表达载体，所述的表达载体含有本发明第二方面所 述的多核苷酸。
[0045] 在另一优选例中，所述的表达载体包括真核表达载体、原核表达载体。
[0046] 本发明第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第三方面所 述的表达载体或转染了本发明第二方面所述的多核苷酸。
[0047] 在另一优选例中，所述的宿主细胞包括哺乳动物细胞；较佳地包括CH0细胞、293 细胞。
[0048] 本发明第五方面，提供了一种制备Slit2LRRl-2蛋白的方法，所述的方法包括步 骤：
[0049] (i)在合适的表达条件下，培养如本发明第四方面所述的宿主细胞，从而表达本发 明第一方面所述的融合蛋白；
[0050] (ii)从培养体系中分离纯化出本发明第一方面所述的融合蛋白；
[0051] (iii)对所述的融合蛋白，用针对元件E的蛋白酶进行酶解，从而制得 Slit2LRRl-2。
[0052] 在另一优选例中，在步骤（ii)中，先用针对Y1元件的亲和层析进行第一次分离； 然后用针对Y2元件的亲和层析进行第二次分离。
[0053] 在另一优选例中，在步骤（iii)中，还包括将S1U2LRR1-2与多肽E - Y1-Y2或 Y2 - Y1-E分开，从而制得纯化的S1U2LRR1-2。
[0054] 本发明第六方面，提供了一种制备Slit2LRRl-2蛋白的方法，所述的方法包括步 骤：
[0055] 对本发明第一方面所述的融合蛋白，用针对元件E的蛋白酶进行酶解，从而制得 Slit2LRRl-2。
[0056] 本发明第七方面，提供了一种纯化的S1U2LRR1-2蛋白，是通过本发明第五或第 六方面所述的方法生产制备的。
[0057] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。

【专利附图】

【附图说明】
[0058] 图1为原始的pcDNA3. 1 (_)质粒的图谱；
[0059] 图2显示了实施例1中的真核表达Slit2蛋白的LRR1-2结构域部分序列的表达 质粒的构建方法的流程图；
[0060] 图3为Slit2蛋白的LRR1-2结构域部分序列的RT-PCR扩增电泳图；
[0061] 图4为Strap II蛋白标签、His蛋白标签以及TEV酶切位点序列的PCR扩增电泳 图；
[0062] 图5为构建好的pcDNA3. 1 (_)/Slit2LRRl_2质粒的图谱；
[0063] 图6为Western Blot方法检测构建质粒的蛋白表达图。

【具体实施方式】
[0064] 本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，在LRR序列的一端（尤其是C 端）添加第一标签多肽元件和第二标签短肽元件，不仅有助于LRR正确折叠，形成有活性的 功能多肽，而且可以极其简便地通过一次酶切就将两种标签元件清除，从而制得高纯度、高 活性的LRR序列。在此基础上完成了本发明。
[0065] 术语
[0066] 如本文所用，"本发明蛋白"、"本发明融合蛋白"、"具有式la或lb的融合蛋白"可 互换使用，均指具有式la或lb的融合蛋白，其N端至C端分别含有任选的分泌信号肽、目 标基因、酶切位点、第一标签多肽元件以及第二标签短肽元件；或任选的分泌信号肽、第二 标签短肽元件、第一标签多肽元件、酶切位点以及目标基因。本发明融合蛋白的一个显著特 点是在C端或N端具有可通过酶切去除的连续串联标签元件。此外，应理解，所述术语还包 括重组融合蛋白的活性片段和衍生物。
[0067] 如本文所用，"分离的"是指物质从其原始环境中分离出来（如果是天然的物质， 原始环境即是天然环境）。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化 的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。 [0068] 如本文所用，术语"标签蛋白"、"标签"、"标签蛋白元件"、"标签元件"可互换使用， 均指可用于分离纯化具有本发明式la或lb的融合蛋白的标签多肽。
[0069] Slit2 蛋白及其 LRR
[0070] Slit2蛋白的全长序列如SEQ ID N0. :13所示，编码其蛋白的核苷酸序列如SEQID N0. :12所示。本发明S1U2LRR1-2蛋白的序列如SEQ ID N0. :5所示，编码其蛋白的核苷酸 序列如SEQ ID N0. :4所示。
[0071] 本发明Slit2蛋白来源于哺乳动物，优选地，来源于人、大鼠、小鼠。
[0072] 如本文所用，"S1U2LRR1-2蛋白"是指Slit2蛋白的LRR1-2结构域。
[0073] 如本文所用，"纯化的S1U2LRR1-2蛋白"是指S1U2LRR1-2蛋白基本上不含天然 与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技 术纯化S1U2LRR1-2蛋白。基本上纯的蛋白在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主 带。
[0074] 肽键或肽接头
[0075] 本发明的具有式la或lb的融合蛋白各元件之间可以直接以肽键相连接，或者通 过肽接头连接。作为本发明的一种优选的方式，所述的具有式la或lb的融合蛋白各元件 之间通过肽键之间连接，从而形成融合蛋白。
[0076] 通常，过短的肽接头可在融合蛋白内部造成空间位阻，影响蛋白的正确折叠，过长 的肽接头可能增加融合蛋白的免疫原性，还可能影响融合蛋白的活性和功能。因此，可用于 本发明的肽接头一般包括3-15个氨基酸；较佳地为5-10个氨基酸。
[0077] 具有连续串联标签元件的融合蛋白
[0078] 本发明融合蛋白的氨基端（或羧基端）连续地含有两个标签元件（如式la或lb 所示）。
[0079] A-X-E-Yl-Y2 式 la
[0080] A-Y2-Yl-E-X 式 lb
[0081] 其中，A、X、E、Y1、Y2的定义如上所述。
[0082] 对于第一标签多肽元件Y1而言，优选的Y1选自下组：改良型亲和素标签（Strap II标签）（长度为46aa)、链亲和素（Str印II标签）（长度为9aa)。
[0083] 改良型亲和素标签（Strap II标签）是在链亲和素（Str印II标签）的基础上改 良过的一种标签蛋白，其多肽序列如SEQ ID N0. :2所示，编码其多肽的核苷酸序列如SEQ ID N0. :1 所示。
[0084] 本发明Strap II标签与Str印II标签的纯化方式可以是相同或基本相同，即通 过与生物素的亲和力进行层析。与Str印II标签相比，Strap II标签（SEQ ID NO. :2)增 加了标签的亲和性，其优点在于纯化过程在生理条件下进行，使用的脱硫生物素温和程度 的洗脱保护了靶蛋白的活性。而且，避免了常规Strep II标签的纯化技术需要进行封闭处 理步骤。
[0085] Y2为第二标签短肽元件，且为His标签元件。可用于本发明的His标签元件包括 6XHis或8XHis短肽，优选的，为8XHis标签元件。
[0086] 此外，Y1和Y2之间无蛋白酶切位点，并以肽键直接连接。
[0087] 连续串联标签的蛋白表达方案，一方面是结合两种载体的优点，避免存在的问题， 另一方面可以优化蛋白纯化步骤，提高纯化后蛋白的纯度，尽量减少来自动物源性的污染 和纯化过程中的离子性污染。
[0088] 在本发明融合蛋白中，在元件Y1和X之间为蛋白酶酶切位点，可以包括本领域常 用的用于分离纯化蛋白的酶切位点，如TEV蛋白酶、Hrv3C蛋白酶。附加条件是，在本发明 融合蛋白的其他元件序列中，不含有该酶切位点。
[0089] TEV蛋白酶是来源于烟草蚀纹病毒（TEV)的Nla蛋白酶经改进后的50kDa的蛋白 酶，经过设计后与天然TEV蛋白酶相比其稳定性更好。此蛋白酶被用来切除纯化后融合蛋 白的亲和标签；并且该酶是经由6 XHis标签纯化而得（含组氨酸标签），纯度达99%，剪切 反应完毕后可通过Ni亲和层析去除。在PH7. 0, 30°C时可达到最佳活性，但在PH5. 5-8. 5和 4-30°C的广泛范围内TEV蛋白酶皆有活性，使得反应条件的选择可根据目的蛋白的情况而 修改。
[0090] -种可用于本发明的蛋白酶酶切位点为TEV蛋白酶，如SEQ ID N0. : 3所示。
[0091] 此外，在本发明的融合蛋白的N端，可具有或不具有分泌信号肽。当具有分泌信号 肽时，有助于实现融合蛋白的分泌表达，以便提高纯化效率。在本发明中，适用的分泌信号 肽包括来自于Slit2的分泌信号肽、或来外源导入的自于其他蛋白的分泌信号肽。其中，来 源于Slit2的分泌信号肽的核苷酸序列如SEQ ID N0. :14所不，其编码的信号肽序列如SEQ ID N0. : 15 所示。
[0092] 编码序列和重组生产
[0093] 对于本发明的融合蛋白而言，本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA 形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是 编码链或非编码链。
[0094] 本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋 白质片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然 发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域 所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失 或插入，但不会从实质上改变其编码多肽的功能。
[0095] 如本文所用，术语"引物"指的是在与模板配对，在DNA聚合酶的作用下能以其为 起点进行合成与模板互补的DNA链的寡居核苷酸的总称。引物可以是天然的RNA、DNA，也可 以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物"大 致上"（或"基本上"）与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一 条链充分互补才能开始延伸，但引物的序列不必与模板的序列完全互补。比如，在一个3' 端与模板互补的引物的5'端加上一段与模板不互补的序列，这样的引物仍大致上与模板 互补。只要有足够长的引物能与模板充分的结合，非完全互补的引物也可以与模板形成引 物-模板复合物，从而进行扩增。
[0096] 本发明融合蛋白的各元件的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重 组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开 放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制 备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR 扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
[0097] -旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将 其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。 [0098] 此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通 过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
[0099] 应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引 物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方 法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
[0100] 本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或融合蛋白编 码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及制备本发明所述融合蛋白的方法。
[0101] 通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组 蛋白。一般来说有以下步骤：
[0102] (1).用本发明的编码本发明蛋白的多核苷酸（或变异体），或用含有该多核苷酸 的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
[0103] (2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
[0104] (3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
[0105] 本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明蛋白的编码DNA序列和合适 的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内 重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。 表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
[0106] 包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适 当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
[0107] 宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高 等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞 如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、C0S、或293细胞的动物细胞等。
[0108] 用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原 核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理， 所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl 2。如果需要，转化也可用电穿孔的 方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方 法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
[0109] 获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用 的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下 进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法（如温度转换或化学诱导） 诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
[0110] 在上面的方法中的蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果 需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是 本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀 剂处理（盐析方法）、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析（凝胶过滤）、吸附层析、 离子交换层析、高效液相层析（HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
[0111] 表达载体
[0112] 在获得了编码本发明融合蛋白的DNA序列之后，将其连入合适的表达载体，再转 入合适的宿主细胞。最后通过培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到本发明的融合蛋 白。
[0113] 因此，本发明还提供了包含编码所述融合蛋白的核酸分子的载体。所述的载体还 可包含与所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，以便于所述融合蛋白的表达。
[0114] 如本文所用，"操作性相连"或"可操作地连于"指这样一种状况，即线性DNA序列 的某些部分能够影响同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体 表达并参与多肽的分泌，那么信号肽（分泌前导序列）DNA就是可操作地连于多肽DNA ;如 果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置 于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般"可操作地连于"意味着相 邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
[0115] 在本发明中，任何合适的载体都可以使用，比如一些用于细菌、真菌、酵母和哺乳 动物细胞的克隆和表达的载体，如Pouwels等，克隆载体：实验室手册（Elsevier最新版） 中所描述的。可选用本领域已知的各种载体如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将 编码本发明新融合蛋白的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成蛋白表达载体。
[0116] 可用于本发明的一种优选的真核表达载体可以为pcDNA3. 1 (_)(购自Invitrogen 公司）。
[0117] 表达载体包括连接有合适的转录和翻译调控序列的融合蛋白DNA序列，如来源于 哺乳动物、微生物、病毒或昆虫的基因。调控序列可包括转录启动子、操纵子、增强子、核糖 体结合位点或控制转录和翻译起始和终止的合适序列。在融合蛋白序列需要调节序列功能 的时候，则连接合适的调控序列。这样，启动子序列被连接在编码融合蛋白DNA序列前端。 在宿主细胞内的复制的能力通常由复制起始点控制。用于转化株识别的筛选基因也可加入 表达载体。
[0118] 另外，非天然的Slit2蛋白的信号肽的编码序列可以引入表达载体。例如：信号肽 (分泌引导物）序列可以和与融合蛋白编码序列融合，从而使翻译的融合蛋白可分泌到细 胞外。信号肽可增强宿主细胞向胞外分泌嵌合多肽。信号肽在多肽从细胞内分泌出来的过 程中可被切去。
[0119] 生产Slit2 LRR1-2蛋白的方法
[0120] 本发明还包括生产融合蛋白以及纯化的Slit2 LRR1-2蛋白的方法，所述方法包括 培养含有融合蛋白编码核酸的宿主细胞，从而培养本发明融合蛋白，从培养体系中分离纯 化出权利要求1所述的融合蛋白；以及对所述的融合蛋白，用针对元件E的蛋白酶进行酶 解，从而制得纯化的S1U2LRR1-2蛋白。
[0121] 在分离本发明融合蛋白的标签元件时，可以使用分别针对不同标签元件的亲和 层析进行两次分离后，再使用针对酶切位点的蛋白酶进行酶解，从而分离出纯度更高的 Slit2LRRl-2 蛋白。
[0122] 所述的融合蛋白包括S1U2LRR1-2或其活性片段。所述方法可包括让细胞表达编 码的融合蛋白，以及使表达的融合蛋白的复性。此外所述方法还可包括复性的融合蛋白的 分离和/或纯化。
[0123] 可将上述制备获得的融合蛋白纯化为基本均一的性质，例如在SDS-PAGE电泳上 呈单一条带。例如，当重组蛋白为分泌表达时，可以采用商品化的超滤膜来分离所述蛋白， 例如Millipore、Pellicon等公司产品，首先将表达上清浓缩。浓缩液可采用凝胶层析的方 法进一步加以纯化，或采用离子交换层析的方法纯化。例如阴离子交换层析（DEAE等）或 阳离子交换层析。凝胶基质可为琼脂糖、葡聚糖、聚酰胺等常用于蛋白纯化的基质。Q-或 SP-基团是较为理想的离子交换基团。最后，还可用羟基磷灰石吸附层析，金属螯合层析，疏 水相互作用层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC)等方法对上述纯化产物进一步精制纯化。
[0124] 可利用含有Slit2LRRl-2结构域的特异性抗体、受体或配体的亲和层析柱对表达 的融合性多肽进行纯化。根据所使用的亲和柱的特性，可利用常规的方法，如高盐缓冲液、 改变pH等方法洗脱结合在亲和柱上的融合性多肽。
[0125] 重组蛋白以及编码该重组蛋白的核酸可利用适当的方法制备，例如，化学合成、重 组表达，或其合并应用。参见John Wiley&Sons，Inc2000年出版的《Current Protocols in Molecular Biology》，以及 Cold Spring Harbor Laboratory Pressl989 年出版的 ((Molecular Coning:A Laboratory Manual〉〉。
[0126] 本发明的有益效果
[0127] 1.本发明融合蛋白独特的连续串联标签元件设计，尤其是经改良的Strap II标 签，其长度合适，使表达的蛋白在宿主细胞中能够得到各种修饰，能在不影响蛋白质折叠的 情况下，最大程度的还原其天然构象，使S1U2LRR1-2蛋白能于宿主细胞中表达，其表达量 高，且表达完整、准确。
[0128] 2.本发明融合蛋白的连续串联标签元件设计使目标蛋白更易纯化，且标签元件能 通过一次酶切完整切除，制备工艺简单，制得的S1U2LRR1-2蛋白纯度高，活性强。
[0129] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照 常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否 则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0130] 实施例 1 构建 pcDNA3. 1 (_)/Slit2LRRl_2 载体
[0131] 方法：采用外切酶法构建质粒。构建质粒的过程，共PCR扩增2段片段（信号肽序 列+目标序列、酶切位点+标签蛋白序列），进行2次片段连接插入。所使用的引物分别是 Primerl、Primer2〇
[0132] 外切酶法具体步骤：
[0133] 1、配制反应体系：载体片段（BamHI酶切后胶回收并测定浓度）和PCR片段（PCR 后胶回收并测定浓度）各50ng，lullOx外切酶buffer,补充ddH20至10ul ;
[0134] 2、冰上放置5min，加入lul稀释至20U/ul的外切酶III(Takara公司），混匀后冰 上放置60min ;
[0135] 3、加入lulO. 5M EDTA(pH8. 0)溶液终止反应，之后65°C水浴5min ;
[0136] 4、水浴后冰上放置5min ;
[0137] 5、转化连接产物。
[0138] 引物：
[0139] Primerl-F ：CCACACTGGACTAGTATGCGCGGCGTTGGCTGG SEQ ID NO. :8
[0140] Primerl-R ：ACCGAGCTCGGATCCTTATGAACAACGGAATTTCTTG SEQ ID NO. :9
[0141] Primer2-F ：AAATTCCGTTGTTCACTGGAAGTGCTGTTCCAG SEQ ID NO. : 10
[0142] Primer2-R ：ACCGAGCTCGGATCCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTG SEQ ID NO. :11
[0143] 结果：目标序列、酶切位点+标签蛋白序列的扩增结果图3和4所示，图中可见，信 号肽序列+目标序列、酶切位点+标签蛋白序列扩增成功。
[0144] 实施例 2pcDNA3. 1 (_)/Slit2LRRl_2 的成功表达
[0145] 方法：为了检测构建的质粒是否成功表达，通过把质粒转染到AD293细胞中，之后 经标签蛋白8XHis来做Western Blot,检测融合蛋白是否成功表达。
[0146] 材料：High glucose DMEM培养基、胎牛血清均购自HyClone公司；转染试剂 Magetran购自Origene公司；AD293细胞用含10%胎牛血清的High glucose DMEM培养液 培养。倒置显微镜为Olympus产品，突光倒置显微镜为Nikon公司产品。
[0147] 步骤：
[0148] 2. 1.将冻存的细胞复苏培养，传代3至4次使细胞达到良好的生长状态，进行铺 板检测。Magetran试剂转染贴壁细胞。
[0149] 2. 2.接种AD293细胞至6孔板，用含10%胎牛血清的High glucose DMEM培 养基培养至密度约为70%-80%时可用于转染。将Magetran试剂及质粒pcDNA3. 1 (-) / S1U2LRR1-2溶液平衡至室温，在离心管内准备下列混合液：200μ lopti-DMEM、2y g质粒、 6μ1 Magetran转染试剂，震荡混匀后静置室温孵育lOmin。给细胞更换新的培养基后将混 合液加入培养盘中，摇匀。置于37°C、5%C02培养箱中培养，培养12小时候移除培养基，更 换为新鲜的含10%胎牛血清的High glucoseDMEM培养基继续培养，转染48h后，收蛋白用 于Western Blot检测质粒的蛋白表达情况。
[0150] 2. 3去除培养基后加入4°C PBS将细胞用细胞刮刮下来放入1. 5ml离心管中，2000 转5min离心，去除上清。接着开始裂解细胞，将RIPA强裂解液与蛋白酶抑制剂，100:1的比 例混合后加到细胞沉淀中，4°C摇晃裂解lh后，4°C，14000g离心30min，取上清即样品。最 后测样品蛋白浓度，并加入Loading buffer煮沸8min，再调平上样量用SDS-聚丙烯凝胶电 泳跑胶。电泳3小时，转膜2小时，之后抗体孵育，一抗2小时，显色曝光。
[0151] 结果：Western Blot检测结果如图6所示。转染质粒组蛋白表达正常，而转染空 载组没有检测到蛋白表达，说明所构建的真核表达质粒能正常的在真核细胞中表达，质粒 构建成功。
[0152] 实施例3表达量的测试
[0153] 将一个纯化得到的已知浓度（20 μ g/ml)的HisGFP蛋白作为对照，用Western Blot的方法进行蛋白表达量的测定。
[0154] 具体方法同实施例2,先转染细胞，之后做Western Blot检测。区别在于，跑 SDS-PAGE电泳时，加入一定已知量的HisGFP蛋白作为阳性对照。
[0155] 曝光得到结果后，通过对条带进行灰度分析，计算得到蛋白的表达量。
[0156] 实施例4S1U2LRR1-2蛋白的纯化
[0157] 方法及材料：由于采用的蛋白表达系统是哺乳动物高效表达系统，选择的细胞是 广泛用于蛋白表达的经过优化的中国仓鼠卵巢细胞CH0-S，而表达载体中有加入胞外分泌 信号肽，因此采用悬浮培养的方法，使细胞在高密度情况下分泌尽可能多的蛋白到培养液 中，收集培养液用于后续蛋白纯化。
[0158] 纯化方法：
[0159] 4. 1先用针对第一标签多肽元件的生物素亲和柱进行层析，再用针对第二标签短 肽元件的Ni亲和柱进行层析；或
[0160] 4. 2先用针对第二标签短肽元件的Ni亲和柱进行层析，再用针对第一标签多肽元 件的生物素亲和柱进行层析。
[0161] 首先，对纯化得到的蛋白片段进行定量，按比例的加入TEV蛋白酶进行酶切，去除 蛋白标签。
[0162] 酶切缓冲液：50mMTris7. 5,500mM NaCl，5%Glycerol 的反应体系，于 4°C过夜酶 切。
[0163] 酶切过后体系内的标签蛋白片段和TEV蛋白酶均可通过Ni亲和层析去除。
[0164] 实施例5纯化的S1U2LRR1-2的测定
[0165] 方法：纯化得到S1U2LRR1-2蛋白之后，将采用细胞生物学实验进行功能检测。其 中，细胞划痕实验和Transwell细胞迁移实验进行蛋白功能的初步判断。
[0166] 划痕实验借鉴了体外细胞致伤愈合实验模型，在体外培养的单层细胞上，划痕致 伤，然后加入药物观察其抑制肿瘤细胞迁移的能力。
[0167] 胰酶消化对数生长期细胞，计数调整细胞浓度为2-10X 105个/ml，24孔板每孔加 入500ul细胞悬液，37°C细胞培养箱中培养24h，使细胞贴壁。用10uL移液枪枪头（或者无 菌牙签）在单层细胞上呈"一"字划痕，用PBS清洗3次，然后加入用2%FBS培养基配好的 不同的S1U2LRR1-2蛋白片段（可设置浓度梯度）溶液，取3-4个平行样本，依据肿瘤细胞 的侵袭能力不同，37°C培养12-24h。镜下拍照测量细胞迁移的面积。
[0168] Transwell细胞迁移实验主要采用24孔板小室。用胶原（collagen)包被 Transwell小室（Millipore公司）底部膜。消化细胞，PBS洗1-2遍，用含0. 2%BSA的无血 清培养基重悬细胞，计数后调整细胞密度至1-10 X 1〇5,取细胞悬液200 μ 1加入Transwell 小室，24孔板下室加入500 μ 1含血清的培养基，其中加入不同的S1U2LRR1-2蛋白片段。 依据肿瘤细胞的侵袭能力不同，37°C培养12-48h。采用结晶紫染色细胞，镜下拍照计数穿过 的细胞数，评价S1U2LRR1-2蛋白片段对肿瘤细胞侵袭能力的影响。
[0169] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
[0001] 序列表 <110> 李华顺 <120〉含有富含亮氨酸重复序列的融合蛋白及其制法和应用 <130> P2013-0429 <160> 15 <170> Patentln version 3. 5 <2i0> i <211> 138 <212> DM <213> S核苷酸 <220> <221> CDS <222> (1)·. (138) <400> 1 Ctg tcc acc ggt ggc age gat gag aag acc act ggt tgg aga ggt ggc 48 Leu Sei"· Thr Gly Ser Asp Glu Lys Thr Thr Glv Trp Arg Gly Gly 1 5 ' 10 * 15· ' cat gtt gtg gaa ggc ttg get ggt ga,a ttg gaa caa ttg aga gcc cgt 96 His Val Val GLu Gly Leu Ala Gly GJu Leu Glu Gin Leu Arg Ala Arg 20 2B 30 ctg gag cat cac cca caa ggc caa aga gaa cca ggc age ggc 138 Leu Glu His His Pro Gin Glv Gin Arg Glu Pro Gly Ser Gly 35 40 45 <210> 2 <211> 46 <212> PRT <213〉人 TJt:列 <400> 2 Leu Scr Thr G1y G1y Sor Asp Glu Lys Thr Thr Giy Trp Arg Gly Gly 15 10 15 His Val Val Glu Glv Leu Ma Glv Glu Leu Glu Gin Leu Arg Ala Arg 20 25 30 Lou Glu His His Pro Gin Gly Gin Arg Glu Pro Gly Scr Glv 35 40 45 <210> 3 <211> 8 <212> Ρ1Π' <2i3>人X序列 <220> <221> MISCFMTURE <223>人1:序列 <400> 3 Leu Glu Val Leu Phe Gin G1y Pro 1 5 <210> 4 <211> 1374 <212> DNA <213> 智人（Homo sapiens) <220> <221> CDS <222> (1).. (1374)
[0002] <400> 4 cag tgc tct tgc teg ggc age aca gtg gac tgt cac ggg ct'g geg ctg 48 Glti Cvs Ser Cys Ser Glv Ser Thr Val Asp Cys His Gly Leu Ala Leu 1 5 10 15 ege age gig ccc agg aal ale ccc ege aac acc gag aga clg gal tia 96 Arg Ser Val Pro Arg Asn lie Pro Arg Asn Thr Glu Arg Leu Asp Leu 20 25 30 aat gga aat aac ate aca aga att aeg aag aca gat ttt get ggt ett 144 Asn Gly Asn Aso lie Thr Arg lie Thr Lvs Thr Asp Phe Ala Glv Leu 35 40 45 aga cat eta aga gtt ett cag ett atg gag aat aag att age acc att. 192 Arg His Leu Arg Val Leu Gin Leu Met Glu Asn Lys lie Ser Tlrr lie 50 55 60 gaa aga gga gca ttc cag gat ett aaa gaa eta gag aga ctg cgt tta 240 Glu Arg Gly Ala Phe Gin Asp Leu Ly,s Glu Leu Glu Arg Leu Arg Leu 65 ' 70 ' 75 80 aac aga aat cac ett cag ctg ttt cct gag ttg ctg ttt ett ggg act 288 Asn Arg Asn His Leu Gin Leu Phe Pro Glu Leu Leu Phe Leu Gly Thr 85 90 95 geg aag eta tac agg ett gat etc agt gaa aac caa att cag gca ate 336 Ala Lys Leu Tvr Arg Leu Asp Leu Ser Glu Asn Gin lie Gin Ala He 100 105 110 cca agg aaa get ttc cgt ggg gca gtt gac ata aaa aat ttg caa ctg 384 Pro Arg Lys Ala Phe Arg Gly Ala Val Asp lie Lys Asn Leu Gin Leu 115 120 125 gat tac aac cag ate age tgt att gaa gat ggg gca ttc agg get etc 432 Asp Τυγ Asn G丄n lie Ser Cys 丄ie Giu Asp /Ua Phe Arg Ala leu 130 135 140 egg gac ctg gaa gtg etc act etc aac aat aac aac att act aga ett 480 Arg Asp Leu Glu Val Leu Thr Leu Asn Asn Asn Asn lie Thr Arg Leu 145 150 155 160 tct gtg gca agt ttc aac cat atg cct aaa ett agg act ttt ega ctg 528 Ser Val Ala Ser Phe Asn His Met Pro Lys Leu Arg Thr Phe Arg Leu 165 170 175 cat tea aac aac ctg tat tgt gac tgc cac ctg gee tgg etc tee gac 576 His Ser Asn Asn Leu Tyr Cys Asp Cys His Leu Ala Trp Leu Ser Asp 180 185 190 tgg ett ege caa agg cct egg gtt ggt ctg tac act cag tgt atg ggc 624 Trp Lou Arg Gin Arg Pro Arg Val Gly Leu Tyr Thr Gin Cys Met Gly 195 200 205 ^ ccc tee cac ctg aga ggc cat aat gta gee gag gtt caa aaa ega gaa 672 Pro Ser His Leu Arg Gly His Asn Val Ala Glu Val Gin Lys Arg Glu 210 215 220 ttt gxc tgc agt ggt cac cag tea ttt atg get cct tct tgt agt gtt 720 Phe Val Cys Ser Gly His Gin Ser Phe Met Ala Pro Ser Cys Ser Val 225 ' 230 235 ' 240 ttg cac tgc cct gee gee tgt acc tgt age aac aat ate gta gac tgt 768 Leu His Cys Pro Ala Ala Cys Thr Cys Ser Asn Asn lie Val Asd Cys ' 245 ' ' 250 255 cgt ggg aaa ggt etc act gag ate ccc aca aat ett cca gag acc ate 816 Arg Gly Lys Gly Leu Thr Glu lie Pro Thr Asn Leu Pro Glu Thr lie ^ 260 265 270 aca gaa ata cgt ttg gaa cag aac aca ate aaa gtc ate cct cct gga 864 Thr Glu lie Arg Leu Glu Gin Asn Thr lie Lys Val He Pro Pro G1y 275 280 ' 285 ^ get ttc tea cca tat aaa aag ett aga ega att gac ctg age aat aat 912 Ala Phe Ser Pro Tyr Lys Lys Leu Arg Arg He Asp Leu Ser Asn Asn 290 ' ' 295 300 cag ate tct gaa ett gca cca gat get ttc caa gga eta ege tct ctg 960 Gin lie Ser Glu Leu Ala Pro Asp Ala Phe Gin Gly Leu Arg Ser Leu 305 310 315 ^ 320 aat tea ett gtc etc tat gga aat aaa ate aca gaa etc ccc aaa agt 1008 Asn Ser Leu Val Leu Tyr Gly Asn Lys lie Thr Glu Leu Pro Lys Ser 325 ' 330 335 tta ttt gaa gga ctg ttt tee tta cag etc eta tta ttg aat gee aac 1056 Leu Phe Glu Glv Leu Phe Ser Leu Gin Leu Leu Leu Leu Asn Ala Asn 340 345 350
[0003] aag ata aac tgc c.tt egg gta gat get ttt cag gat etc cac aac ttg 1104 Lys lie Asn Cys Leu Arg Val Asp Ala Phe Gin Asp Leu His Asn Leu ' 355 360 365 _ aac ett etc tee eta tat gac aac aag ett cag acc ate rcc aag ggg 1152 Asn Len Leu Ser Leu Τγτ Asp Asn Lys Leu Gin Thr lie Ala Lys Glv 370 ' 375 ^ 380 ' acc ttt tea cct ett egg gee att caa act atg cat ttg gee cag aac 1200 Thr Phe Ser Pro Leu Arg Ala lie Cln Thr Met His Leu Ala Gin Asn 385 390 395 400 ccc ttt att tgt gac tgc cat etc aag tgg eta geg gat tat etc cat 124-8 Pro Phe lie Cys Asp Cys His Leu Lys Trp Leu Ala Asp Tyr Leu His 405 410 415 acc aac cc-g att gag acc agt ggt gee cgt tgc acc age ccc ege ege 1296 Thr Asn Pro Tie Glu Thr Ser Gly Ala Arg Cys Thr Ser Pro Arg Arg 420 425 430 ctg gca aac aaa aga att gga cag ate aaa age aag aaa ttc cgt tgt 1344 Leu Ala Asn LyvS Arg lie Glv Gin lie Lvs Ser Lys Lys Plie Arg Cvs 43E 440 445 tea ate aaa age aag aaa ttc cgt tgt tea 1371 Ser ile Lys Ser Lys Lys Phe Arg Cys Ser 450 ' ' 455 <210> δ <21?> 158 <212> PRT <213> fiACHomo sapiens) <400> 5 Gin Cys Ser Cys Ser Gly Ser Thr Val Asp Cys His Gly Leu Ala Leu 1 5 10 15 Arg Ser Val Pro Arg Asn Ile Pro Arg Asn Thr Glu Arg Leu Asp Leu 20 25 30 Asn Gly Asn Asn lie Thr Arg lie Thr Lys Thr Asp Phe Ala Gly Leu 35 40 45 Arg His Leu Arg Val Leu Gin Leu Met Glu Asn Lvs Ile Ser Thr Ile 50 55 60 Glu Arg Gly Ala F^he Gin Asp Leu Lys Glu Leu Glu Arg Leu Arg Leu 65 ' 70 75 80 Asn Arg Asn His Leu Gin Leu Phe Pro Glu Leu Leu Phe Leu Gly Thr RB 90 95 Ala Lys Leu Tvr Arg Leu Asp Leu Ser Glu Asn Gin Ile Gin Ala Ile 100 105 110 Pro Arg Lvs Ala Phe Arg Gly A1p Yal Asp Ile Lys Asn Leu Gin Leu 115 120 125 Asp Tvr Asn Gin Tie Ser Cys Tie Glu Asp Gly Ala Phe Arg Ala Leu 130 135 140 Arg Asp Leu Giu Val Leu Thr Leu Asn Asn Asn Asn lie Thr Arg Leu 145 150 155 160 Ser Val Ala Ser Phe Asn His Mel Pro Lvs Leu Arg Thr Phe Ai-g Leu 165 170 175 His Ser Asn Asn Leu Tyr Cys Asp Cys His Leu Ala Trp Leu Ser Asp 180 185 190 Trp Leu Arg Gin Arg Pro Arg Val Gly Leu Tvr Thr Gin Cys Met Glv 195 200 205 Pro Ser His Leu Arg Gly His Asn Val Ala Glu Val Gin Lts Arg Glu 210 215 220 ^ Phe Val Cys Ser Gly His Glri Ser Phe Met Ala Pro Ser Cys Ser Val 225 ^ 230 235 ^ 240 Leu His Cvs Pro Ala Ala Cvs Thr Cys Ser Asn Asn Ile Val Asp Cys 245 250 255 Arg Gly Lys Gly Lou Thr Glu Ilo Pro Thr Asn Leu Pro Glu Thr lie 260 265 270 Thr Clu Ile Arg Leu Giu Gin Asn Thr Ι1θ Lvs Val lie Pro Pro Gly 275 280 285 Ala Phe Ser Pro Tyr Lys Lys Leu Arg Arg lie Asp Lei] Ser Asn Asn 290 295 300 Gin lie Ser Giu Len Ala Pro Asp Ala Phe Gin Gly Leu Arg Ser Leu
[0004] 305 310 315 320 Asn Ser Leu Val Leu Tyr Gly Asn Lvs lie Thr Glu Leu Pro Lys Ser 325 ' 330 335 Leu Phe Glu Gly Leu Phe Ser Leu Gin Leu Leu Leu Leu Asn Ala Asn 340 345 350 Lys lie Asn Cys Leu Arg Val Asp Ala Phe Gin Asp Leu His Asn Leu 355 360 365 Asn Leu Leu Ser Leu Tyr Asp Asn Lys Leu Gin Thr lie Ala Lys Cly 370 375 380 Thr Phe Ser Pro Leu Arg Ala lie Gin Thr Met Iiis Leu Ala Gin Asn 385 390 395 400 Pro Phe lie Cys Asp Cy^s His Leu Lys Tip Leu Ala Asp Tvr Lea His ^ 405 410 ^ 415 Thr Asn Pro lie Glu Thr Ser Gly Ala Arg Cys Thr Ser Pro Arg Arg 420 425 430 Leu Ala Asn Lys Arg lie G1y Gin He Lvs Ser Lys Lys Phe Ai'g Cvs 435 440 445 Ker 11 r I,vs Sei' Lys I.y.s Phe Arg Cvs Ser 450 ' 455 - <210> 6 <211> 1626 <212> DNA <213>人工序列 <220> <22i> CDS <222> (1).. (1626) <400> 6 atg ege ggc gtt ggc tgg cag atg ctg tc.c ctg teg ctg ggg tta gtg 48 Met Arg Gly Val Gly Trp Gin Met Leu Ser Leu Ser Leu Gly Leu Val 1 ' 5 ' 10 15 ctg geg ate ctg aac aag gtg gca ccg cag geg tgc ccg geg cag tgc 96 Leu Ala lie Leu Asn Lys Val Ala Pro Gin Ala Cys Pro Ala Gin Cys 20 ' 25 ' 30 tet tgc teg ggc age aca gtg gac igt cac ggg ctg geg ctg ege age 144 Ser Cys Ser Gly Ser Thr Val Asp Cys Iiis Gly Leu Ala Leu Arg Ser 35 40 ' 45 gtg ccc agg aat ate ccc ege aac acc g&g aga ctg gat tta aat gga, 192 Va.1 Pro Arg Asn Tie Pro hrg Asn Thr Gilt Arg Asp Leu Asn Glv 50 55 60 * aat aac ate aca aga att aeg aag aca gat ttt get ggt ett aga cat 240 Asn Asn lie Thr Arg He Thr Lys Thr Asp Phe Ala Gly Leu Arg His 65 70 75 80 eta aga gtt c.tt cag ett atg gag aat aag att a,gc acc art. gaa aga 288 Leu Arg Val Leu Gin Leu Met Glu Asn Lvs lie Ser Thr lie Glu Arg 85 90 95 gga gca ttc cag gat ett aaa gaa eta gag aga ctg cgt tta aac aga 336 Glv Ala Phe Glu Asp Leu Lys Glu Leu Glu Arg Leu Arg Leu Asn Arg ^ 100 " 105 110 aat cac ett cag ctg tt-t. cct gag ttg ctg ttt ett ggg act geg aag 384 Asn His Leu Gin Leu Phe Pro Glu Leu Leu Phe Leu Gly Thr Ala Lys 115 120 125 eta tac agg ett gat etc agt gaa aac caa att cag gca ate cca agg 432 Leu Tyr Are Leu Asp Leu Ser Glu Asn Gin lie Gin Ala lie Pro Arg 130 135 140 aaa get ttc cgt ggg gca gtt gac ata aaa aat ttg caa ctg gat tac i80 Lys Ala Phe Arg Gly Ala Val Asp lie Lys Asn Leu Gin Leu Asp Tyr 145 150 155 160 aac cag ate age tgt att gaa. gat ggg gca ttc agg get etc egg gac 528 Asn Gin lie Ser Cys lie Glu Asp Gly Ala Pho Arg Ala Leu Arg Asp 165 170 175 ctg gaa gtg etc act etc aac aat aac aac att act aga ert tet gtg 576 Leu Glu Val Leu Thr Leu Asn Asn Asn Asn lie Thr Arg Leu Ser Val 180 185 190 gea agt ttc aac cat atg cct aaa ett agg act ttt ega ctg cat tea 624 Ala Ser Phe Asn His Met Pro Lys Leu Arg Thr Phe Arg Leu His Ser
[0005] 195 200 205 aac aac ctg tat tgt gac tgc cac ctg gcc tgg etc tee gac tgg ett 672 Asn Asn Leu Tyr €vs Asp Cys His Leu Ala Trp Leu Ser Asp Trp Leu 210 215 220 ege caa agg cct egg gtt ggt ctg tac act cag tgt atg ggc ccc tee 720 Arg Gin Arg Pro Arg Val Gly i.eu Tvr Thr Gin Cys Met Gly Pro Ser 225 230 . ^ 235 240 cac ctg aga ggc cat aat gta gcc gag gtt caa aaa ega gaa ttt gtc 768 His Leu Arg Gly His Asn Yal Ala Glu Yal Gin Lys Arg Glu Phe Val 245 250 255 tgc. agt- ggt- cac cag tea ttt atg get cct tet tgt agt gtt ttg cac 816 Cvs Ser G1y His CIn Ser Phe Met. Ala Pro Ser Cys Ser Val Leu His 260 265 270 tgc cct gcc gcc tgt acc tgt age aac aat ate gta gac tgt cgt ggg 864 Cvs Pro Ala Ala Cys Thr Cvs Ser Asa Asn lie Val Asp Cys Arg Glv " 275 " 280 285 . aaa ggt etc act gag ate ccc aca aat ett cca gag acc ate aca gaa 912 Lys Gly Leu Thr Glu lie Pro Thr Asn Leu Pro Glu Thr lie Thr Glu 290 295 300 ato, cgt ttg gaa cag aac aca ate aaa gtc ate cct cct gga get ttc 960 lie Arg Leu Glu Gin Asn Thr lie Lys Val lie Pro Pro GIy Ala Phe 305 310 ^ 315 ^ 320 tea cca tat aaa aag ett aga ega att gac ctg age aat aat cag ate 1008 Ser Pro Tyr ^rs Lvs Leu Arg Ai'g Ilo Asp Leu Sor Asn Asn Gin lie 325 330 335 tet gaa ett gca cca gat get t-tc caa gga eta ege tet ctg aat tea 1056 Ser Glu Leu Ala Pro Asp A上a Phe G丄n Gly leu Arg Ser hen Asn Ser 340 345 350 ett gtc etc- tat gga aat aaa ate aca gaa etc ccc aaa agt tta ttt 1104 Leu VaJ Leu Tyr Glv Asn Lys lie Thr Glu Leu Pro Lys Ser Leu Phe 355 360 365 gaa gga ctg ttt tee tta cag etc eta tta ttg aat gcc aac aag ata 1152 Glu Gly Leu Phe Ser Leu Gin Leu Leu Leu Leu Asn Ala Asn Lys lie 370 375 380 ^ aac tgc ett egg gta gat. gei, 11.1; cag gB,t. etc cac aac ttg aac ett 1200 Asn Cys Leu Arg Val Asp Ala Phe Gin Asp Leu His Aen Leu Asn Leu 385 390 395 400 etc tee ct.a tat gac aac aag ett cag acc ate gcc aag ggg acc ttt 1248 Len Ser Leu Tyr Asp Asn I.ys Leu Gin Thr Tie Ala Lvs G1y Thr Phe 405 ~ 410 415 tea cct ett egg gee at.t caa act atg cat ttg gcc cag aac ccc ttt 1296 Ser Pro Leu Arg Ala lie Gin Thr Met His Leu Ala Gin Asn Pro Phe 420 425 430 att tgt gac tgc cat etc aag tgg eta geg gat tat etc cat acc aac 1344 lie Cvs Asp Cys His Leu Lys Trp Leu Ala Asp Tyr Leu His Thr Asn 435 440 445 ccg att gag acc agt ggt gcc cgt tgc acc age ccc ege ege ctg gca 1392 Pro lie Glu Thr Ser Gly Ala Arg Cvs Thi - Ser Pro Arg Arg Lm Ala 450 455 ^ 460 aac aaa aga att gga cag ate aaa age aag aaa ttc cgt tgt tea ctg 1440 Asn Lys Arg lie Gly Gin lie Lys Ser Lvs Lys Phe Arg Cys Ser Leu 465 470 475 480 gaa gtg ctg ttc cag ggc cct ctg tee acc ggt ggc age gat gag aag 1488 Glu Val Leu Phe Gin Glv Pro Leu Ser Thr Glv Gly Ser Asp Glu Lys 485 " 490 495 acc act ggt tgg aga ggt· ggc cat gtt gtg gaa ggc ttg get ggt gaa 1536 Thr Thr Gly Trp Arg Glv Gly His Val Vai Glu Gly Leu Ala Gly Glu 500 505 ' 510 ttg gaa caa ttg aga gcc cgt ctg gag cat cac cca caa ggc caa aga 1584 Leu Glu Gin Leu Arg Aia Arg Leu GJ_u iiis Uis Pro Gin Gly Gin Arg 515 520 525 gaa cca ggc age ggc cac cac cac car rpr rac car r-nc ta?i 1626 Glu Pro Gly Ser Glv His His His His His His His 530 535 540 <210> 7 <211> 541 <212> PRT
[0006] <213>人工序列 <400> 7 Met Arg Glv Val Gly Trp Gin Met Leu Ser Leu Ser Leu Glv Leu ￥al 15 10 15 Leu Ala lie Leu Asn Lys Yal Ala Pro Gin Ala Cys Pro Ala Gin Cys 20 25 30 Ser Cys Ser Γτ?γ Ser Thr Val Asp Cys His Crly i.eu Ala. I.eu Arg Ser 35 40 ' 15 Val Pro Arg Asn lie Pro Arg Asn Thr Glu Arg Leu Asp Leu Asn Gly 50 55 60 ' Asn Asn lie Thr Arg lie Thr Lys Thr Asp Phe Ala Gly Leu Arg His 65 70 75 ^ 80 Leu Arg Val Lou Gin Lou Met Glu Asn Lys He Scr Thr lie Glu Arg 85 90 95 Gly Ala Phe Gin Asp Leu Lys Glu Leu Glu Arg Leu Arg Leu Asn Arg 100 105 110 Asn Ilis Leu Gin Leu Phe Pro Glu Leu Leu Phe Leii Gly Thr Ala Lys 115 120 125 ' Leu Tyr Arg Leu Asp Leu Ser Glu Asn Gin lie Gin Ala lie Pro Arg 130 135 140 Lys Ala Phe Arg Gly Ala Val Asp lie Lys Asn Leu Gin Leu Asp Tyr 145 150 155 160 Asn Gin He Ser C^s He Glu Asp Gly Ala Phe Arg Ala Leu Arg Asp 165 170 175 Leu Glu Val Leu Thr Leu Asn Asn Asn Asn Tie Thr Arg I.eu Ser Val 180 185 190 Ala Ser Fhe Asn His Met Pro Lys Leu Arg Thr Phe Arg Leu His Ser 195 200 205 Asn Asn Leu Tyr Cys Asp €vs His Leu Ala Trp Leu Ser Asp Trp Leu 210 2*15 220 Arg Gin Arg Pro Arg Val Gly Leu Tyr Thr Gin Cvs Met Glv Pro Ser 225 230 235 240 His Leu Arg Gly His Asn Val Ala Glu Val Gin Lvs Arg Glu Phe Val 245 250 255 Cys Ser Gly His Gin Ser Phe Met Ala Pro Ser Cvs Ser Val Leu His I 260 265 ' 270 Cys Pro Ala Ala Cys Thr Cvs Ser Asn Asn lie Val Asp Os Arg Gly ' 275 ' ' 280 285 ' Lys Gly Leu Thr Glu He Pro Thr Asn Leu Pro Glu Thr lie Thr Glu 290 295 300 lie Arg Leu Glu Gin Asn Thr lie Lys Val lie Pro Pro Glv Ala Phe 305 310 315 320 Ser Pro Tyr Lvs Lys Leu Arg Arg lie Asp Leu Ser Asn Asn Gin lie 325 330 335 Ser Glu Leu Ala Pro Asp Ala Phe Gin Gly Leu Arg Ser Leu Asn Ser 340 345 ^ 350 Leu Val Leu Tyr Gly Asn Lys lie Thr Glu Leu Pro Lvs Ser Leu Phe 355 360 365 Glu Gly Leu Phe Ser Leu Gin Leu Leu Leu Leu Asn Ala Asn Lys lie 370 375 380 Asn Cys Leu Arg Val Asp Ala Phe Gin Asp Leu His Asn Leu Asn Leu 385 390 395 400 Leu Ser Len Tyr Asp Asn \,ys Leu Gin Thr Tie Ala, Lys Glv Thr Phe ^ 405 ~ 410 415 Ser Pro Leu Arg Aia lie G_Ln Thr Met His Leu Ma Gin Asn Pro Phe 420 425 430 lie Cys Asp Cys His Leu Lvs Trp Leu Ala Asp Tyr Leu His Thr Asn ' 435 " 440 445 Pro lie Glu Thr Ser Glv Ala Arg Cys Thr Ser Pro Arg Arg Leu Ala 450 455 460 Asn Lys Arg He Gly Gin lie Lys Ser Lys Lys Phe Arg Cvs Ser Leu 465 470 475 480 Glu Yal Leu Phe Gin Gly Pro Leu Ser Thr Gly Glv .Ser Asp Glu Lys ?185 ' 490 495 Thr Thr Gly Trp Arg Gly Gly His Val Val Glu Glv Leu Ala Glv Glu 500 505 510
[0007] Leu Glu Gin Leu Arg Ala Arg Leu Glu His His Pro Gin Gly Gin Arg 515 520 525 Glu Pro G1y Ser Gly His His His His His His His His 530 535 540 <210> 8 <211> 33 <212> DMA <213:>寡核ff酸 <220> <221> misc feature <223> 人工序列 <400> 8 ccacactgga ctagtatgcg cggcgttggc tgg 33 <210> 9 <211> 37 <212》DNA <213>寡核苷酸 <220> <221> miscfcaturc <223> 人-!:序列 <400> 9 acc.gagctcg gatccttatg aacaacggaa tttcttg 37 <210> 10 <2M> 33 <212> DNA <213>寡核苷酸 <220> <22! > mi ac_featiirp <223>人工序列 <400> 10 aaa1tccgtl gltcactgga agtgcigtlc cag 33 <210> 1? <211> 36 <212> DM <213〉寡核苷酸 <220> <221> iiiisc_feature <223> 人-T:序列 <400> 11 accgagctcg gatccttagt ggtggtggig giggtg 36 <210> 12 <211 :> 4590 <212> DNA <213> 智人(Homo sapiens) <220> <221> CDS <222> (1).. (4590) <400> 12 afg cgc ggc gtt ggc tgg cag at_g ctg t_cc ct,g rcg ctg ggg tta gtg 48 Met Arg GIy Val Glv Trp Gin Met Leu Ser Leu Ser Leu Gly Leu Val 15 10 15 ctg gcg ate ctg aac aag gtg gca ccg cag geg tgc ccg geg cag tgc 96 Leu Ala lie Leu Asn Lys Val Ala Pro Gin Ala Cys Pro Ala Gin Cys
[0008] 20 25 30 tct tgc teg ggc age aca gtg gac tgt cac ggg ctg geg ctg ege age 144 Ser Cvs Ser Gly Ser Thr Val Asp Cvs His Gly Leu Ala Leu Arg Ser 35 40 45 gtg ccc agg aat a.tc ccc ege aac acc gag aga ctg gat tta aat gga. 192 Val Pro Arg Asn lie Pro Arg Asn Thr Glu Arg Leu Asp Leu Asn Glv 50 55 60 ' aat aac ate aca aga att aeg aag aca gat ttt get ggt ett aga cat 240 Asn Asn lie Thr Arg lie Thr Lys Thr Asp Phe Ala Gly Leu Arg His 65 70 75 80 eta aga gtt ett cag ett atg gag aat aag att age acc att gaa aga 288 Leu Arg Val Leu Glri Leu Met Glu Asn Lys lie Ser Thi' lie Glu Arg 85 90 95 gga gca t,tc cag gat ett. aaa gaa eta gag aga ctg cgt tta aac aga 336 Gly Ala Fhe Gin Asp Leu Lys Glu l,eu GLu Arg Leu Arg Leu Asn Arg 100 105 110 aat cac ett cag clg l 丨-丨 eel gag Ug rig It t cti ggg act geg aag 384 Asn His Lei! Gin Phe Pro filu Lem Lon Phe Lei] dy ?Π?τ a Lys 115 120 125 ' eta tac agg ett gat etc agt gaa aac caa att cag gca ate cca agg 432 Leu Tvr Arg Leu Asp Leu Ser Glu Asn Gin lie Gin Aia lie Pro Arg 130 135 140 aaa get ttc cgt ggg gca gtt gac ata aaa aat ttg caa ctg gat tac 480 Lys Ala Phe Arg Glv Ala Val Asp He Lvs Asn Leu Gin Leu Asp Tyr 145 150 155 160 aac cag ate age tgt att gaa gat ggg gca ttc agg get etc egg gac 528 Asn Gin He Ser Cys He Glu Asp Gly Ala Phe Arg Ala Leu Arg Asd 165 170 175 ctg gaa gtg etc a,ct etc aac aat aac aac att act aga ett tct gtg 576 Leu Glu Val Leu Thr Leu Asn Asn Asn Asn lie Thr Arg Leu Ser Val 180 185 190 gca agt ttc aac cat atg eel: aaa ett agg act ttt ega ctg cat tea 624 Ala Ser Phe Asn Ilis Met Pro Lys Leu Arg Thr Phe Arg Leu His Ser 195 200 205 aac aac ctg tat tgt gac tgc cac ctg gee tgg etc tee gac tgg ett 672 Asn Asn Leu Tvr Cys Asp Cvs His Leu Ala Trp Leu Ser Asp Trp Leu 210 215 220 ege caa agg cct egg gtt ggt ctg tac act cag tgt atg ggc ccc tee 720 Arg Gin Arg Pro Arg V-al GIy Leu Tvr Thr Gin Cys Met GIy Pro Ser 225 230 235 240 C.3.C ctg aga ggc cat. aa.f. gta. gee gag gtt. caa a.aa ega gaa ttt gtc 768 His Leu Arg Gly His Asn Val Ala Glu Val Gin Lvs Arg Glu Phe Val 245 250 255 tgc agt ggt cac cag tea ttt atg get cct tct tgt o,gt gtt ttg cac 816 Cys Ser Gly His Gin Ser Phe Met, Ala Pi.u Ser Cys Se_r Val Leu ~ 260 265 ' 270 tgc cct gee gee tgt acc tgt age aac aat ate gta gac tgt cgt ggg 864 Cys Pro Ala Ala Cys Thr Cvs Ser Asn Asn lie Val Asp Cys Arg Gly " 275 . ' 280 285 ' aaa ggi etc ac l gag ate ccc aca aai cU_ cca gag acc ate aca· gaa· 912 Lys Gly Leu Thr Glu lie Pro Thr Asn Leu Pro Glu Thr lie Thr Glu "290 295 300 ata cgt ttg gaa cag aac aca ate aaa gtc ate cct cct gga get ttc 960 lie Arg Leu Glu Gin Asn Thr He Lys Val II? Pro Pro Gly Ala Phe 305 310 315 ' 320 tea cca tat aaa a,ag ett aga ega att gac ctg age aat aat cag ate 1UU8 Ser Pro Tyr Lys Lys Lou Arg Arg lie Asp Leu Ser Asn Asn Gin lie 325 330 335 tct gaa ett geo cca gat get ttc caa gga eta ege tct ctg aat tea 1056 Ser Glu Leu Ala Pro Asp Ala Phe Gin Glv Leu Arg Ser Leu Asn Ser 340 345 350 ett gtc etc- tat gga aat aaa ate aca gaa etc ccc aaa agt tta ttt 1104 Leu Val Leu Tyr Gly Asn Lys lie Thr Glu Leu Pro Lys Ser Leu Phe 355 ' 360 365 _ gaa gga ctg ttt tee tta cag etc. eta tta ttg aat gee aac aag ata 1152 Glu Glv hen Fhe Ser Leu Gin. Leu Leu Leu Leu Asn Ala Asn Lvs lie 370 375 380 ' aac tgc eLt egg gta gal gel Lit cag gat etc cac aac tig aac cl? 1200
[0009] Asn Cvs Leu Arg Vai Asp Ala Phe Gin Asp Leu His Asn Leu Asn Leu 385 390 395 400 etc tcc eta tat. gac aac aag ett cag acc ate gee aag ggg acc ttt 1248 Leu Ser Leu Tyr Asp Asn Lys Leu Gin Thr lie Ala Lys Gly Thr Phe 405 · 410 415 tea cct ett egg gee att caa act atg cat t,tg gee cag aac ccc ttt 1296 Ser Pro Leu Aig Ala lie Gin Thr Met His Leu Ala Gin Asn Pro Phe 420 42B 430 att tgt gac tgc cat etc aag tgg eta geg gat tat etc cat acc aac 1311 He Cvs Asp Cys His Leu Lvs Trp Leu Ala Asp Tyr Leu His Thr Asn 435 ' 440 ' 445 ccg all gag acc agl ggl gee egl igc acc age ccc ege ege clg gca 1392 Pro Tie Gin Thr Ser G'fy Ala. Arg Cys Thr Ser Pro Arg Arg Leu Ala 450 455 * 460 aac ctaa aga att gget cag ate aae. ctge actg aeta ttc cgt tgt tea get 1440 Asn Lys Arg lie Gly Gin lie Lys Ser Lys Lys Phe Arg Cys Ser Ala 465 470 475 480 aaa gaa cag tat ttc att cca ggt aca gaa gat tat ega tea aaa tta 1488 Lys Glu Gin Tyr Phe lie Pro Glv Thr Glu Asp Tyr Arg Sox* Lys Lou 485 490 495 agt gga gac tgc ttt geg gat ctg get tgc cct gaa aag tgt ege tgt 1536 Ser Gly Asp Cys Phe Ala Asp Leu Ala Cys Pro Glu Lys Cys Arg Cys 500 505 510 gaa gga acc aca gta gat tgc tet aat caa aag etc aac aaa ate ccg 1584 Gla Glv Thr Thr Vai Asp Cvs Ser Asn Gin Lys Leu Asn Lvs lie Pio 515 ' 520 525 gag cac att ccc cag tac act gca gag 1:tg cgt etc aat aat aat gaa 1632 Glu Ilis lie Pro Gin Tyr Thr Ala Glu Leu Arg Leu Asn Asn Asn Glu 530 · 535 540 ill acc gig Itg gaa gee aca gga ale ill aag aaa clt eel caa Ha 1680 Phe Thr Vai Leo Glu Ala. Thr G1 v~ Tie Phe Lys Lvs T,eii Pro Gin Leu 545 550 - 555 560 cgt aaa ata aac ttt age aac aat aag ate aca gat att gag gag gga. 1728 Arg Lys lie Asn Phe Ser Asn Asn Lys lie Thr Asp lie Glu Glu Glv 565 570 575 gca. ttt gaa gga gr,a tet. ggt. gt.R. aat gaa ata. ctr. eft. a eg a.gt aat. 1776 Ala Phe Glu Gly Ala Ser Gly Vai Asn Glu lie Leu Leu Thr Ser Asn 580 585 590 cgt ttg gaa aat gtg cag cat aag atg ttc aag gga ttg gaa age etc 1824 Arg Leu Glu Asn Vai Glu His Lys Met Plie Lvs Glv Leu Glu Ser Leu 595 600 ^ 605 aaa act ttg atg ttg aga age aat ega ata acc tgt gtg ggg aat gac 1872 Lys Thr Leu Met Leu Arg Ser Asn Arg lie Thr Cys Vai Gly Asn Asp "610 615 620 ' agt ttc ata gga etc agt tet gtg cgt ett tet ttg tat gat aat 1920 Ser Phe lie Gly Leu Ser Ser Vai Arg Leu Leu Ser Leu Tyr ksp Asn 625 ' 630 635 · 640 caa att act aca gtt gca cca ggg gca ttt gat act etc cat tet tta 1968 Gin lie Thr Thr Vai Ala Pro Glv Ala Phe Asp Thr Leu His Ser Leu 645 650 655 tet act eta aac etc ttg gee aat cct ttt aac tgt aac tgc tac ctg 2016 Ser Thr Leu Asn Leu Leu Ala Asn Pro Phe Asn Cys Asn Cys Tyr Lou 660 665 670 get tgg ttg gga gag tgg ctg aga aag aag aga att gtc aeg gga aat 2064 Ala Trp Leu Gly Glu Trp Leu Ai'g Lvs Lvs Arg lie Vai Thr Gly Asa 675 680 B85 cct aga tgt caa aaa cca tac ttc ctg aaa gaa ata ccc ate cag gat 2112 Pro Arg Cys Glu Lys Pro Tyr Phe Leu Lys Glu lie Pro He Gin Asu 690 69B 700 gtg gee att cag gac ttc act. tgt gat gac gga aat gat gac aat. agt 2160 Vai Ala He Gin Asp Phe Thr Cys Asp Asp Gly Asn Asp Asp Asn Ser 705 710 ' 715 720 Lgc tec cca ell icl ege tgl cct act gaa tgt cici igc 1 ig gal aca 2208 Cys Ser Pro Leu Ser Arg Cys Prn Thr Glu Cys Thr Cys Leu Asp Thr ^ 725 ' 730 ' 735 gtc gtc ega tgt age aac aag ggt ttg aag gtc ttg ccg aaa ggt att 2256 Vai Vai Arg Cys Ser Asn Lys Glv Leu Lvs Vai Leu Pro Lys Glv lie 740 745 750
[0010] cca aga gat gtc aca gag ttg tat ctg gat gga aac caa ttt aca ctg 2304 Pro Arg Asp Val Thi' Glu Leu Tyr Leu Asp Gly Asn Gin Phe Thr Leu 755 760 ' 765 gtt ccc aag gaa etc tcc aac t.ac aaa cat tta aca ctt ata gac tta 2352 Val Pro Lvs Glu Leu Ser Asn Tyr Lys His Leu Thr Leu lie Asp Leu 770 775 780 agt aac aac aga ata age aeg ctt tet aat cag age ttc age aac atg 2400 Ser Asn Asn Arg lie Ser Thr Leu Ser Asn Gin Ser Phe Ser Asn Met 785 790 795 800 acc cag etc etc acc tta att ctt agt tac aac cgt ctg aga tgt att 244-8 Thr Gin Leu Leu Thr Leu lie Leu Ser Tyr Asn Arg Leu Arg Cys lie 805 810 815 cct cct ege acc ttt gat gga tta, aag tet ctt ega tta ctt tet eta 2196 Pro Pro Arg Thr Phe Asp Gly Leu Lvs Ser Leu Arg Leu Leu Ser Leu 820 825 830 cat gga aat gac att tet gtt gtg cct gaa ggt get ttc aat gat ctt 2544 His Gly Asn Asp lie Ser Val ￥al Pro Glu Gly Ala Phe Asn Asp Leu 83E 840 ' 845 tet gca tta tea cat eta gca att gga gcc aac ccc ctt tac tgt gat 2592 Ser Ala Leu Ser His Leu Ala lie Gly Ala Asn Fro Leu Tyr Cys Asd 850 855 ' 860 Lgl aac atg cag tgg tla tcc gac igg gtg aitg leg gaa tat aag gag 2640 Cys Asn Met Gin Trp Leu vSer Asp Trp Yal Lys Ser Gin Tvr Lys Glu 865 870 875 ' ' 880 cct gga att get cgt tgt get ggt cct gga gaa atg gca gat aaa ctt 2688 Pro Glv He Ala Arg Cys Ala Glv Pro Gly Glu Met Ala Asp Lys Leu 885 890 895 tta etc aca act ccc tcc aaa aaa ttt acc tgt caa ggt cct gtg gat 2736 Lou Leu Thr Thr Pro Scr Lys Lys Phe Thr Cys Gin Gly Pro Val Asd 900 905 910 gtc aat att eta get aag tgt aac ccc tgc eta tea aat ccg tgt aaa 2784 Val Asn lie Leu Ala Lys Cys Asn Pro Cys Leu Ser Asn Pro Cys Ljs 915 920 ' 925 ' aat gat ggc aca tgt aat agt gat cca gtt gac ttt tac ega tgc acc 2832 Asn Asp Gly Thr Cys Asn Ser Asp Pro Val Asp Phe Tyr Arg Cys Tiir 930 ' 935 940 ' tgt cca tat ggt ttc aag ggg cag gac tgt gat gtc cca att cat gcc 2880 Ors Pro Tyr Giv Phe Lys Giv GJ_n Asp Cys Asp Vai Pro lie liis Aia 945 950 ' 955 960 tgc ate agt aac cca tgt aaa cat gga gga act tgc cac tta aag gaa, 292S Cys Tie Ser Asn Fro Cys l.vs Hi s (rly Gly Thr Cys His I,eu I.ys Gin ^ 965 ' 970 ' 975 gga gaa gaa gat gga ttc tgg tgt att tgt get gat gga ttt gaa gga 2976 Gly Glu Glu Asp Glv Phe Trp Cys lie Cvs Ala Asp Gly Phe Glu Gly 980 985 990 ga,a aat tgt gaa gtc aac gtt gat gat tgt gaa gat aat gac tgt gaa 3024 Glu Asn Cvs Glu Vai Asn Val Asp Asp Cys Glu Asp Asn Asp Cys Glu 995 1000 1005 aat aat tet aca tgt gtc gat ggc att aat aac tac aca tgc ctt 3069 Asn Asn Ser Thr Cys Val Asd Gly He Asn Asn Tyr Thr Cys Leu 1010 * 1015 ' 1020 ' tgc cca cct gag tat aca ggt gag ttg tgt gag gag aag ctg gac 3114 Cys Pro Pro Glu Tvr Thr Gly Glu Leu Cys Glu Glu Lys Leu Asp 1025 ' 1030 ^ 1035 ttc tgt gcc cag gac ctg aac ccc tgc cag cac gat tea aag tgc 3159 Phe Cys Ala Gin Asp Leu Asn Pro Cys Gin His Asd Ser Lys Cys 1040 1045 " 1050 ' ale cla ac t cca aag gga U,c y,aa tgl gac tgc aca cca ggg lac 3204 lie Leu Thr Pro Lys Gly Phe Lys Cys Asp Cys Thr Pro Glv Tyr 1055 1060 1065 gta ggt gaa cac tgc gac ate gat ttt gac gac tgc caa gac aac 3249 Val Gly Glu His Cys Asp lie Asp Phe Asp Asp C^s Gin Asp Asn 1070 1075 1080 aag tgt aaa aac gga gcc cac tgc aca gat gca gtg aac ggc tat 3294 Lys Cys Lys Asn Gly Ala His Cys Tlxr Asp Ala Val Asn Gly Tyr 1085 1090 1095 aeg tgc ata tgc ccc gaa ggt tac agt ggc ttg ttc tgt gag ttt 3339 Thr Cys lie Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly Leu Phe Cvs Glu Plie
[0011] 1100 1105 1110 tct cca ccc atg gtc etc cct cgt acc age ccc tgt gat aat ttt 3384 Ser Pro Pro Met Val Leu Pro Arg Thr Ser Pro Cys Asp Asn Phe 1115 1120 1125 gat tgt cag aat gga get cag tgt ate gtc aga ata. aat gag cca. 3429 Asp Cys Gin Asn Glv Ala Gin Cys lie Val Arg lie Asn Glu Pro 1130 1135 1140 ata tgt cag tgt ttg cct ggc tat cag gga gaa aag tgt gaa aaa 3474 lie Cys Gin Cys Leu Pro Gly Tyr Gin Gly Glu Lys Cys Glu Lys 1145 1150 1155 ttg gtt agt gtg aat ttt ata aac aaa gag tct tat eft cag att 3519 Leu Val Ser Val Asn Phe lie Asn Lys Glu Ser Τυγ Leu Gin lie 1160 1165 ' 1170 cct tea gc(、aag gt t egg cct cag aeg aac π丨 h acy d t cag att 3564 Fro Ser Aia Lys Val Arg Fro Gin Tkr Asn He I'hr Leu Gin lie 1175 1180 1185 gee aca gal. gaa gac age gga ale ctc ci-g tal aag ggi gac aaa 3609 Ala Thr Asp Gin A.sp Ser Glv T]e Leu i.eu Tyr I.ys Gly Asp Lys 1190 1195 ' 1200 ' ' gac cat ate geg gtet gaa etc tat egg ggg cgt gtt cgt gee age 3654 Asp His lie Ala Val Glu Leu Tyr Arg G1y Arg Val Arg Ala Ser 1205 1210 1215 tat gac acc ggc tct cat cca get tct gee att tac agt gtg gag 3699 Tyr Asp Thr Gly Ser His Pro Ala Ser Ala lie Tyr Ser Val Glu 1220 1225 1230 aca, ate oat gat gga aac ttc cac att gtg gaa eta ett gee ttg 3744 Thr lie Asn Asp Gly Asn Phe His lie Val Glu Leu Leu Ala Leu 1235 1240 1245 gat cag agt etc tct ttg tee gtg gat ggt ggg aac ccc aaa ate 3789 Asd Gin Ser Leu Ser Leu Ser Val Asp G1y Gly Asn Pro Lys lie 1250 1255 ^ 1260 ate act aac ttg tea aag cag tee act ctg aat ttt gac tct cca 3834 lie Thr Asn Leu Ser Lys Gin Ser Thr Leu Asn Phe Asp Ser Pro 1265 . 1270 1275 etc tat gta gga ggc atg cca ggg aag agt aac gtg gca tct ctg 3879 Leu Tyr Val Gly Giy Met Pro Gly Lrs Ser Asn Yal Ala Ser Leu 1280 1285 1290 ege cag gee cct ggg cag aac gga acc age ttc cac ggc tgc ate 3924 Arg Gin Ala Pro GIy Gin Asn Gly Thr Ser Phe His Glv Cys lie 1295 1300 ' 1305 egg aac r,tt tac ate aac agt gag ctg eng gac ttc cag a.ag gtg 3969 Arg Asn Leu Tyr lie Asn Ser Glu Leu Gin Asp Phe Gin Lys Val 1310 1315 1320 ccg atg caa aca ggc att ttg cct ggc tgt gag cca tgc cac aag 4014 Pro Met Gin Tin- Glv lie Leu Pro Glv Cvs Glu Pro Cys His Lvs 1325 1330 1335 aag gtg tgt gee cat ggc aca tgc cag ccc age age cag gca ggc 1059 Lys Yal Cys Ala His Glv Thr Cys Gin Pro Ser Ser Gin Ala Gly "1340 1345 1350 " lie acc tgc gag Lgc cag gaa gga igg aig ggg ccc cic Igl gac 4104 Phe Thr Cys Glu Cys Gin Glu Gly Trp Met Gly Pro Leu Cys Asp 1355 ' 1360 ' 1365 ^ caa egg acc aat gac cct tgc ett gga aat aaa tgc gta cat ggc 414-9 Gin Arg Thr Asn Asp Pro Cys Leu Glv Asn Lys Cys Val His Gly 1370 1375 1380 acc tgc ttg ccc ate aat geg ttc tee tac age tgt aag tgc ttg 1191 Thr Cys Leu Pro lie Asn Ala Phe Ser Tvr Ser Cys Lys Cys Leu 1385 1390 1395 gag ggc cat gga ggt gtc etc tgt gat gaa gag gag gat ctg ttt 4239 Glu Gly His Gly Gly Val Leu Cys Asp Glu Glu Glu Asp Leu Phe 1400 1405 1410 aac cca tgc cag geg ate aag tgc aag cac ggg aag tgc agg ett 4284 Asn Pro Cys Gin Aia lie Lys Cys Lys His Gly Lys Cys Arg Leu 1415 1420 ' 1425 tea ggt ctg ggg cag ccc tac tgt gaa tgc age agt gga tac aeg 4329 Ser Gly Leu Gly Gin Fro Tvr Cys Giu CVs Ser Ser GIt Tyr Thr 1430 ' 1435 ' 1440 ' ' ggg gac age tgt gal ega, gaa ate tel tgl ega ggg gaa agg ala 4374
[0012] Glv Asp Ser Cys Asp Arg Glu lie Ser Cys Arg Gly Glu Arg lie 1445 1450 1455 aga gat tat tac caa aag cag cag ggc tat get get tgc caa aca 44丄ii Arg Asp Tyr ?γτ Gin Lys Gin Gin Gly Tvr Ala Ala Cys Gin Thr 1460 1465 ' 1470 acc aag aag gtg tcc cgpi tta gag tgc aga ggt ggg tgt gca gga 4?6 ] Thr Lys Lys Val Ser Arg Leu Glu Cys Arg Gly Gly Cys Ala Gly 1475 1480 ' 1485 ^ ggg cag tgc tgt gga ccg ctg agg age aag egg egg aaa tac tet .1509 Gly Gin Cvs Cvs Giy Fro Leu Arg Ser Lys Arg Arg Lvs Tvr Ser 1490 ' * 1495 ' 1500 ' i.lc gaa tgc act gac ggc tec lee li.丨 gig gac: gag git. gag aaa 4554 Phe Glu Cys Thr Asp Glv Ser Ser Phe Val Asp Glu Ve1 G1u Lvs 1505 1510 1515 · gtg gtg aag tgc ggc tgt aeg agg tgt gtg tec taa 4590 Val Yal Lys Cys Giy Cys Thr Arg Cys Val Ser 1520 1525 <210> 13 <211> 1529 <212> PRT <213> 智人（Homo sapiens) <400> 13 Met Arg Gly Val Gly Trp Gin Met Leu Ser Leu Ser Leu Gly Leu Val 15 10 15 Leu Ala lie Leu Asn Lys Val Ala Pro Gin Ala Cys Pro Ala Gin Cys 20 ' 25 ' 30 ^ Ser Cys Ser Gly Ser Thr Val Asp. Cys His Gly Leu Ala Leu Arg Ser 35 ' 40 ' 45 Yal Pro Arg Asn lie Pro Arg Asn Thr Glu Arg Leu Asp Leu Asn Gly 50 55 60 Asn Asn lie Thr Arg lie Thr Lys Thr Asp Phe Ala Gly Leu Arg His 65 70 75 80 !,eu Ars Yal Leu Gin Leu Met Glu Asn Lvs Tie Ser Thr Tie Glu Ars 85 90 95 G丄y Ala Phe Gin Asp Leu Lys Glu Leu Glu Arg Leu Axg Leu Asn Arg 100 ~ 105 110 Asn His Leu Gin Leu Phe Pro Glu Leu Leu Phe Leu Glv Thr Ala Lvs 115 120 125 ~ Leu Tyr Arg Leu Asp Leu Ser Glu Asn Gin lie Gin Ala He Pro Arg 130 135 140 Lys Ala Phe Arg Glv Ala Val Asp lie Lvs Asn Leu Cln Leu Asp Tvr 145 150 155 160 Asn Gin lie Ser Cys lie Glu AvSp Gly Ala Phe Arg Ala Leu Arg Asp 165 170 175 Leu Glu Val Leu Thr Leu Asn Asn Asn Asn lie Thr Arg Leu Ser Val 180 185 190 Ala Ser Phe Asn His Met. Pro Lys Leu Arg Thr Phe Arg Leu His Ser 195 200 205 Asn Asn Lou Tyr Cys Asp Cvs His Leu Ala Trp Leu Ser Asp Trp Lou 210 215 220 Arg Gin Arg Pro Arg Val Gly Leu Tyr Thr Gin Cys Met Glv Pro Ser 225 230 235 240 iiis Leu Ai:g Glv Itis Asn Val Ala Glu Val Gin Lys Arg Glu Fhe Val 245 250 ' 255 Cys Ser Gly His Gin Ser Phe Met Ala Pro Ser Cys Ser Val Leu His " 260 265 ' 270 Cys Pro Ala Ala Cys Thr Cys Ser Asn Asn He Val Asp Cys Arg Gly 275 280 285 Lys Gly Leu Thr Glu lie Pro Thr Asn Leu Pro Glu Thr lie Thr Glu 290 295 300 Tie Arg Leu Glu Gin Asn Thr Tie I.ya Yal Tie Pro Fra Gly Ala Phe 305 310 ^ 315 ^ 320 Ser Pro Tvr Lys Lys Leu Arg Arg lie Asp Leu Ser Asn Asn Gin lie ' ' 325 330 335 Ser Glu Leu Ala Pro Asp Ala Phe Gin Gly Leu Arg Ser Leu Asn Ser
[0013] 340 34δ 350 Leu Val Leu Tvr GIy Asn Lvs lie Thr Glu Leu Pro Lys Ser Leu Phe 355 ' 360 365 Glu Glv Leu Phe Ser Leu Gin Leu Leu Leu Leu Asn Ala Asn Lys lie 370 375 380 Asn Cys Leu Arg Val Asp Ala Phc Gin Asp Lou His Asn Lou Asn Leu 385 390 395 400 Leu Ser Leu Tvr Asp Asn Lys Leu Gin Thr lie Ala Lvs Gly Thr Phe 405 410 · 415 Ser Pro Leu Arg Ala lie Gin Thr Met Ills Leu Ala Gin Asn Pro Phe 420 425 430 lie Cys Asp Cys His Lea Lvs Tip Leu Ala ksp Tyr Lea His Thr Asn ' 435 ^ 440 445 Pro He Glu Thr Ser Glv Ala ArR Cys Thr Ser Pro Arg Ars Leu Ala 450 455 4t>0 Asn Lys Arg lie GIy Gin lie Lys Ser Lys Lys Phe Arg Cys Ser Ala 465 470 475 480 Lys Gin Gin Tvr Phe He Pro Gly Thr G]u Asp Tyr Arg Ser I.ys i.mi ' ' 485 ' 490 ' 495 Ser Gly Asp Cys Phe Ala Asp Leu Ala Cys Pro Glu Lys Cvs Arg Cys " 500 505 ' 510 ^ Glu Gly Thr Thr Val Asp Cys Ser Asn GIji Lys Leu Asn Lys He Pro 515 520 525 Glu His He Pro Gin Tyr Thr Ala Glu Leu Arg Leu Asn Asn Asn Glu 530 535 540 Phe Thr Val Leu Glu Ala Thr Gly He Phe Lys Lvs Leu Pro Gin Leu 545 550 555 560 Arg Lys lie Asn Phe Ser Asn Asn Lys lie Thr Asp lie Glu Glu Gly ' 565 ' 570 575 ' Ala Phe Glu Glv Ala Ser Gly Val Asn Glu lie Leu Leu Thr Ser Asn 580 ' 585 590 Atr Leu Glu Asn Val Gin His Lys Met Phe Lys Gly Leu Glu Ser Leu 595 600 605 Lys Thr Leu Met Leu Arg Scr Asn Arg lie Thr Cys Val Glv Asn Asp 610 615 620 Ser Phe lie Gly Leu Ser Ser Val Arg Leu Leu Ser Leu Tyr Asp Asn 625 630 635 640 Gin lie Thr Thr Val Ala Pro Gly Ala Phe Asp Thr Leu His Ser Leu 645 ' 650 655 Ser Thr Leu Asn Leu Leu Ala Asn Pro Phe Asn Cvs Asn Cys TVr Leu ββ? 665 * 670 Ala Trp Leu GIy Glu Trp Leu Arg Lys Lys Arg lie Val Thr Gly Asn 675 ' 680 685 Pro Arg Cys Gin Lys Pro Tvr Phe Leu Lys Glu lie Pro lie Gin Asp 690 695 700 Val Ala Tie Gin Asp Phe Thr Cys Asp Asp Glv Asn Asp Asp Asn Ser 705 710 ~ 715 720 Cys Ser Pro Leu Ser Arg Cys Pio Thr Glu Cys Thr Cys Leu Asp Thr ' 725 ' 730 · 735 Val Val Arg Cvs Ser Asti Lvs Gly Leu Lys Val Leu Pro Lvs Gly lie 740 " 745 750 ' Pro Arg Asp Val Thr Glu Leu Tyr Leu Asp Gly Asn Gin Phe Thr Leu 755 760 765 Val Pro Lys Glu Leu Ser Asn Tvr Lys His Leu Thr Leu lie Asp Leu 770 775 780 Ser Asn Asn Arg He Ser Thr Leu Ser Asn Gin Ser Phe Ser Asn Met 785 790 795 800 Thr Gin Leu Leu Thr Leu lie Leu Ser Tyr Asn Arg Leu Arg (Vs 丁]p 805 810 815 Pro Pro Arg Thr Phe Asp Glv Lou Lvs Ser Leu Arg Leu Lou Sor Leu 820 825 830 His Glv Asn Asp lie Scr Vol \%1 Pro Glu Gly Ma Phc Asn Asp Lou 835 840 845 Ser Ala Leu Ser His Leu Ala lie Glv Ala Asn Pro Leu Tvr Cys Asp 850 855 860 Cys Asn Met Gin Trp Leu Ser Asp Trp Val Lys Ser Giu Tyr Lys Giu 865 870 875 ^ 880 Pro Gly lie Ala Arg Cys Ala Gly Pro Gly Glu Met Ala Asp Lys Leu
[0014] 885 890 895 Leu Leu Thr Thr Pro Ser Lys Lys Phe Thr Os Gin Gly Pro Val Asp 900 905 ' 910 ￥al Asn lie Leu Ala Lys Cys Asn Pro Cvs Leu Ser Asn Pro Cys Lvs 915 920 925 Asn Asp G1y Thr Cvs Asn Ser Asp Pro Val Asp Phc Tyr Arg Cys Thr 930 ' 935 940 Cys Pro Tvr Gly Phe Lvs Glv Gin Asp Cvs Asp Val Pro lie His Ala 945 950 955 960 Cys lie Ser Asn Pro Cys Lys Iiis Gly Glv Thr Cvs His Leu Lys Glu 965 970 ' 975 Gly Glu Glu Asp Gly Phe Trp Cys lie Cys Ala Asp Gly Phe Glu Gly ^ 080 ^ 985 990 - Glu Asn Cys Glu Val Asn Val Asp Asp Cvs Glu Asp Asn Asp Cys Glu 995 1000 1005 Asn Asn Ser Thr Cys Val Asp Gly lie Asn Asn Tvr Thr Cys Leu 3010 ' 1015 1020 Cy.s Pro Pro Gin Tyr Thr Gly Gin i.eu Cys Gin Glu i,y,s i.au Asp ' 1025 ' 1030 ' 1035 Fhe Cvs Ala Gin Asd Leu Asn Pro Cys Gin His Asp Ser Lys Cys 1040 * 1045 1050 ' He Leu Thr Pro Lys Glv Phe Lvs Cys Asp Cys Tin· Pro Gly Tyr 1055 1060 1065 Val Gly Glu His Cys Asp lie Asp Phe Asp Asp Cvs Gin Asp Asn 1070 1075 1080 Lys Cys Lys Asn Gly Ala His Cys Thr Asp Ala Val Asn Gly Tyr 1085 1090 1095 Thr Cvs lie Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly Leu Phe Cvs Glu Phe 1100 ' 1105 1110 Ser Pro Pro Met Val Leu Pro Arg Thr Ser Pro Cys Asp Asn Phe 1115 1120 1125 Asp Cys Gin Asn Gly Ala Gin Cys lie Val Arg lie Asn Glu Pro 1130 1135 1140 lie Cys Gin Cys Leu Pro Gly Tyr Gin Gly Glu Lys Cts Glu Lys 1145 1150 1155 Leu Val Ser Val Asn Phe lie Asn Lys Glu Ser Tyr Leu Gin lie 1160 1165 1170 Pro Ser Ala Lys Val Arg Pro Gin Thr Asn lie Thr Leu Gin lie 1175 ' 1180 1185 Ala Thr Asp Glu Asd Ser Gly lie Leu Leu Tyr Lvs Glv Asp Lys I 190 * I 195 · 1200 · · Asp His lie Ala ￥al Glu Leu Tyr Arg Glv Arg Val Arg Ala Ser 1205 1210 1215 Tyr Asp Thr Gly Ser His Pro Ala Ser Ala lie Tyr Ser Val Glu 1220 1225 1230 Thr Tie Asn Asp Gly Asn Phe His Tie Val Gin Leu Leu Ala Leu 1235 1240 1245 Asp Gin Ser Leu Ser Leu Ser Val Asp Glv Glv Asn Pro Lys lie 1250 1255 * 1260 ^ lie Thr Asn Leu Ser Lys Glo Ser Thr Leu Asn Phe Asp Ser Pro 1265 ' 1270 1275 Leu Tyr Val Gly Gly Met Pro Gly Lys Ser Asn Val Ala Ser Leu 1280 ' 1285 1290 Arg Gin Ala Pro Glv Gin Asn Gly Thr Ser Phe His Gly Cys lie 1295 1300 1305 Arg Asn Leu Tyr lie Asn Ser Glu Leu Gin Asp Phe Gin Lys Val 1310 [ 1315 1320 Pro Met Gin Thr Gly lie Leu Pro Glv Cys Glu Pro Cys His Lvs 1325 1330 ' ' 1335 ' Lys Val Cys Ala His Gly Thr Cvs Gin Pro Ser Ser Gin Ala Gly 1340 1345 1350 Plic Thr Cys Glu Cvs Gin Glu Glv Trp Met Glv Pro Lou Cys Asp 1355 1360 1365 Gin Arg Thr Asn Asp Pro Cvs Leu Gly Asn Lys Cvs Val His Gly 1370 1375 1380 Thr Cys Leu Pro lie Asn Aia Phe Ser Tyr Ser Cys Lys Cys Leu 1385 1390 1395 Glu Gly His Gly Gly Val Leu Cys Asp Glu Glu Glu Asp Leu Phe
[0015] 1400 1405 1410 Asn Pro Cys Gin Ala lie Lvs Cvs Lys His Gly Lys Cys Arg Leu 1415 1420 1425 Ser Gly Leu Glv Gin Pro Tvr Cvs Glu Cys Ser Ser Gly Tyr Thr 1430 1435 1440 Gly Asp Ser Cys Asp Arg Glu lie Ser Cys Arg G1y Glu Arg lie 1445 1450 1455 Arg Asp Tyr Tyr Gin Lys Gin Gin Gly Tyr Ala Ala Cvs Gin Thr 1460 1465 1470 Thr Lys Lys Val Ser Arg Leu Glu Cys Arg Gly Gly Cys Ala Gly 1475 1480 1485 Gly Gin Cys Cys G1y Pro Leu Arg Ser Lys Arg Arg Lys Tyr Ser 1490 1495 1500 Phe Glu Cys Thr Asp Gly Ser Ser Phe Val Asp Glu Yal Glu Lys 1505 1510 1515 Val Yal Lys Cys G1y Cys Thr Arg Cys Val Ser 1520 1525 <210> 14 <211> 90 <212> DNA <213> 智人（Homo sapiens) <220> <221> CDS <222> (1).. (90) <400> 14 atg cgc ggc gtt ggc tgg cag atg ctg tcc ctg teg ctg ggg tta gtg 48 Met Arg Gly Val Gly Trp Gin Met Leu Ser Leu Ser Leu Gly Leu Val 15 10 15 ctg geg ate ctg aac aag gtg gca ccg cag geg tgc ccg geg 90 Leu Ala lie Leu Asn Lys Val Ala Pro Gin Ala Cys Pro Ala 20 25 30 <210> 15 <211> 30 <212> PRT <213〉智人（Homo sapiens) <400> 15 Met Arg Gly Val Gly Trp Gin Met Leu Ser Leu Ser Leu Gly Leu Val 1 5 10 15 Leu Ala lie Leu Asn Lys Val Ala Pro Gin Ala Cys Pro Ala 20 25 30
【权利要求】
1. 一种融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白自N端至C端具有式la或lb所述的结 构： A-X-E-Y1-Y2 式 la ; A-Y2-Υ1-Ε-X 式 lb ; 其中， A为任选的分泌信号肽； X为Slit2蛋白的富含亮氨酸的重复序列1-2 (leucine-rich repeatl-2, LRR1-2)元 件； E为酶切位点； Y1为第一标签多肽元件； Y2为第二标签短肽元件，所述第二标签短肽元件为His标签元件； "一"表示连接上述元件的肽键或肽接头。
2. 如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的Y1包括SEQ ID NO. : 2所示的改 良型亲和素标签（Strap II标签）、链亲和素（Strepavidin)标签。
3. 如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的Y1为Strap II标签，而Y2为 8XHis标签元件。
4. 如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的S1U2LRR1-2的氨基酸序列如 SEQ ID NO. :5 所示。
5. -种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求1所述的融合蛋 白。
6. -种表达载体，其特征在于，所述的表达载体含有权利要求5所述的多核苷酸。
7. -种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求6所述的表达载体或转 染了权利要求5所述的多核苷酸。
8. 如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞包括哺乳动物细胞；较 佳地包括CH0细胞、293细胞。
9. 一种制备S1U2LRR1-2蛋白的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤： (i) 在合适的表达条件下，培养如权利要求8所述的宿主细胞，从而表达权利要求1所 述的融合蛋白； (ii) 从培养体系中分离纯化出权利要求1所述的融合蛋白； (iii) 对所述的融合蛋白，用针对元件E的蛋白酶进行酶解，从而制得S1U2LRR1-2。
10. -种制备S1U2LRR1-2蛋白的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤： 对权利要求1所述的融合蛋白，用针对元件E的蛋白酶进行酶解，从而制得 Slit2LRRl-2。
11. 一种纯化的S1U2LRR1-2蛋白，其特征在于，是通过权利要求9或10所述的方法生 产制备的。
【文档编号】C12P21/02GK104119445SQ201310150884
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2013年4月26日 优先权日:2013年4月26日
【发明者】李华顺 申请人:李华顺