专利名称：抗gp39抗体及其应用的制作方法
发明的背景为了诱导抗原特异性T细胞激活和克隆扩充，必须使由抗原呈递细胞(APC)提供的两个信号传递到静息T淋巴细胞的表面上(Jenkins，M.and Schwartz，R.(1987)J.Exp.Med.165，302-319；Mueller，D.L.，et al.，(1990)J.Immunol.144，3701-3709；Williams I.R.and Unanue，E.R.(1990)J.Immunol.145，85-93)。赋予免疫反应之特异性的第一个信号是在识别呈现于主要组织相容性复合体(MHC)相关部分中的外来抗原肽之后，通过T细胞受体(TCR)介导的。称为共刺激信号的第二个信号诱导T细胞增殖并变成功能细胞(Schwartz，R.H.(1990)Science 248，1349-1356)。共刺激信号既不是抗原特异性的，也不是MHC限制性的，并且被认为是由APC表达的一种或多种不同的细胞表面分子提供的(Jenkins，M.K.，et al.(1988)J.Immunol.140，3324-3330；Linsley，P.S.，et al.(1991)J.Exp.Med.173，721-730；Gimmi，C.D.，et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，6575-6579；Young，J.W.，et al.(1992)J.Clin，Invest.90，229-237；Koulova，L.，et al.(1991)J.Exp.Med.173，759-762；Reiser，H.，et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，271-275；Van-Seventer，G.A.，et al.(1990)J.Immunol.144，4579-4586；LaSalle，J.M.，et al.，(1991)J.Immunol.147，774-80；Dustin，M.I.，et al.，(1989)J.Exp.Med.169，503；Armitage，R.J.，et al.，(1992)Nature 357，80-82；Liu，Y.，et al.(1992)J.Exp.Med.175，437-445)。一个参与T细胞激活的共刺激途径涉及T细胞表面上的分子CD28。该分子可接受由B细胞或其他APC上的配体传递的共刺激信号。CD28的配体包括B淋巴细胞激活抗原B7家族的成员，如B7-1和/或B7-2(Freedman，A.S.et al.(1987)J.Immunol.137，3260-3267；Freeman，G.J.et al.(1989)J.Immunol.143，2714-2722；Freeman，G.J.et al.(1991)J.Exp.Med.174，625-631；Freeman，G.J.et al.(1993)Science 262，909-911；Azuma，M.et al.(1993)Nature 366，76-79；Freeman，G.J.et al.(1993)J.Exp.Med.178，2185-2192)。B7-1和B7-2也是存在于激活的T细胞表面的另一种分子CTLA4的配体，但CTLA4在其刺激中的作用尚不明确。
由共刺激信号向T细胞传递抗原特异性信号导致T细胞活化，其可包括T细胞增殖和细胞因子分泌。相反，认为在没有共刺激信号的情况下向T细胞传递抗原特异性信号可诱导T细胞中的非反应或无反应性状态，从而诱导T细胞中的抗原特异性耐受。
T细胞和B细胞间的相互作用在免疫反应中起着关键性作用。诱导对胸腺依赖性抗原的体液免疫需要有由T辅助(以下缩写为“Th”)细胞提供的“帮助”。虽然提供给B淋巴细胞的某些帮助是由Th细胞释放的可溶性分子(例如淋巴因子IL-4和IL-5)介导的，但B细胞的激活也需要B细胞和Th细胞间的接触依赖性相互作用(Hirohata et al.，J.Immunol.，1403736-3744(1988)；Bartlett et al.，J.Immunol.，1431745-1754(1989))。这表明B细胞激活需要有B细胞和Th细胞上细胞表面分子间的专性相互作用。因此T细胞上的分子介导T细胞的接触依赖性辅助效应子功能。分离的被激活T细胞的质膜可提供B细胞激活所需的辅助功能这一观察结果，进一步证实B细胞和T细胞上的分子间的接触依赖性相互作用(Brian，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85564-568(1988)；Hodgkin et al.，J.Immunol.，1452025-2034(1990)；Noelle et al.，J.Immunol.，1461118-1124(1991))。
已鉴定了不成熟和成熟B淋巴细胞表面上的一种称为CD40的分子，当其与抗体交联时可诱导B细胞增殖(Valle et al.，Eur.J.Immunol.，191463-1467(1989)；Gordon et al.，J.Immunol.，1401425-1430(1988)；Gruber et al.，J.Immunol.，1424144-4152(1989))。已分子克隆CD40并鉴定了其性质。(Stamenkovic et al.，EMBO J.，81403-1410(1989))。也已分子克隆了CD40的配体gp39(也称为CD40配体或CD40L)并鉴定了gp39的性质(Armitage et al.，Nature，35780-82(1992)；Lederman et al.，J.Exp.Med.，1751091-1101(1992)；Hollenbaugh et al.，EMBO J.，114313-4319(1992))。gp39蛋白质在活化的而不是静息的CD4+Th细胞上表达(Spriggs etal.，J.Exp.Med.，1761543-1550(1992)；Lane et al.，Eur.J.Immunol.，222573-2578(1992)；Roy et al.，J.Immunol.，1511-14(1993))。用gp39基因转染细胞并在其表面表达gp39蛋白质可激发B细胞增殖，并且可与其他刺激信号一起诱导抗体产生(Armitage et al.，Nature，35780-82(1992)；Hollenbaughet al.，EMBO J.，114313-4319(1992))。
发明的概要介导T细胞之接触依赖性辅助效应子功能的细胞表面分子对于诱导需要T细胞帮助的免疫反应是很重要的。例如，T细胞上的gp39与B细胞上的CD40间的相互作用在激活B细胞对抗原的反应中起着关键性作用。本发明至少是部分地基于介导接触依赖性辅助效应子功能的细胞表面分子也在T细胞对抗原的反应中起关键性作用这一发现。具体地说，已发现在适当条件下干扰T细胞上gp39和向T细胞呈递抗原的细胞上的配体间的相互作用，可诱导抗原特异性T细胞耐受。因此，向T细胞呈递抗原的细胞需要该细胞上的gp39配体(如CD40)和T细胞上的gp39之间的相互作用，以便能够提供激活T细胞所需的信号。抑制gp39配体和gp39间的相互作用可阻止T细胞活化并进而诱导抗原特异性T细胞耐受。
本发明的方法涉及诱导抗原特异性T细胞耐受。该方法包括使T细胞与下述细胞或物质接触1)向T细胞呈递抗原并在其表面上有配体的细胞，所说的配体与T细胞表面上介导接触依赖性辅助效应子功能的受体相互作用；和2)T细胞表面上介导接触依赖性辅助效应子功能之受体的拮抗物。该拮抗物抑制受体与其配体间的相互作用。T细胞可以在体外与呈递抗原的细胞和拮抗物接触，或者说将细胞与拮抗物给予受试对象以在体内诱导T细胞耐受。
在一优选实施方案中，介导接触依赖性辅助效应子功能的T细胞表面上受体是gp39。在该实施方案中，拮抗物是抑制gp39与将抗原呈递给T细胞之细胞上的它的配体之相互作用的分子。特别优选的gp39拮抗物是抗gp39抗体。或者，gp39拮抗物是可溶形式的gp39配体，例如可溶性CD40。将抗原呈递给T细胞的细胞较好是B细胞。该B细胞可以是小的静息B细胞。为了诱导T细胞对可溶性抗原的耐受性，可以使B细胞在与T细胞接触之前(例如在给受试对象使用T细胞之前)与抗原接触。在另一个实施方案中，为了诱导T细胞对同种抗原的耐受性，用于向T细胞呈递抗原的细胞是同种异体细胞。同种异体细胞例如可以是同种异体B细胞、同种异体骨髓、同种异体脾细胞或外周血中的同种异体细胞。
本发明的方法例如可用于诱导T细胞对可溶性抗原的耐受性，诱导T细胞对骨髓移植或其他器官移植的耐受性，或者抑制骨髓移植中的移植物抗宿主疾病。就骨髓移植来说，被移植的骨髓细胞本身被用作本发明方法中向T细胞呈递抗原的细胞。因此，在本发明的一个实施方案中，通过给受试对象使用同种异体骨髓连同gp39拮抗物(例如抗gp39抗体)来促进对骨髓移植物的接受程度。
本发明进一步涉及能够抑制B细胞增殖、B细胞分化及T细胞反应的抗人gp39单克隆抗体，和含有这些抗体的药物组合物。本发明的抗人gp39单克隆抗体较好用于从总体上调节免疫反应，特别是用于诱导抗原特异性T细胞耐受性。优选的抗体包括实施例6中所述的单克隆抗体3E4、2H5、2H8、4D9-8、4D9-9、24-31、24-43、89-76和89-79。特别优选的抗体是单克隆抗体89-76和24-31。分别产生89-76和24-31抗体的89-76和24-31杂交瘤已按照布达佩斯条约的规定于1994年9月2日保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Parklawn Drive，Rockville，Md.)。89-76杂交瘤的ATCC保藏登记号为＿＿，24-31杂交瘤的ATCC保藏登记号为＿＿。24-31和89-76抗体均为IgG1同种型的。
因此，在一个实施方案中，本发明提供IgG1同种型的抗人gp39单克隆抗体(mAb)。本发明的抗人gp39mAb可抑制标准体外试验中的B细胞增殖，例如经用。白细胞介素4或可溶性gp39处理B细胞而诱导的B细胞增殖。抗人gp39抗体较好以大约0.01至5.0μg/ml，更好以大约0.1至2.5μg/ml，最好以大约0.1至1.25μg/ml的IC50(即抑制50％增殖所必需的浓度)抑制B细胞增殖。本发明的抗人gp39 mAb还可在标准体外试验中抑制B细胞产生IgG、IgM和/或IgA，例如将B细胞与激活的T细胞(例如经用抗CD3抗体处理而激活的T细胞)一起培养所诱导的Ig产生。抗人gp39抗体较好以大约0.01至1.0μg/ml，或更好以大约0.01至0.1μg/ml的IC50抑制B细胞产生IgG、IgM和/或IgA。
在一优选实施方案中，本发明的抗人gp39 mAb与可被选自下列一组中的单克隆抗体识别的表位结合，这些单克隆抗体是3E4、2H5、2H8、4D9-8、4D9-9、24-31、24-43、89-76和89-79。抗人gp39 mAb较好与可被单克隆抗体24-31或单克隆抗体89-76识别的表位结合。可用标准交叉竞争法确定mAb与可被上述任何抗体识别的表位结合的能力。例如，与可被mAb 24-31识别的同样表位结合的抗体将同标记的24-31竞争与活化之T细胞的结合，而结合了与被mAb 24-31识别的表位不同之表位的抗体则不同标记的24-31竞争与活化之T细胞的结合。
本发明还提供含本发明抗人gp39抗体的药物组合物。这些组合物一般包含抗人gp39 mAb(例如更好是24-31或89-76)和药学上可接受的载体。
本发明的再一个方面涉及编码抗人gp39 mAb的核酸(如编码抗人gp39 mAb之免疫球蛋白重链或轻链，或其部分的DNA)。可用标准技术从产生抗人gp39 mAb的细胞(如杂交瘤)中分离这样的核酸。例如，可以用cDNA文库筛选、PCR扩增或其他常规技术分别从24-31或89-76杂交瘤中分离编码24-31或89-76mAb的核酸。可以用常规DNA重组技术操作编码抗人gp39 mAb的核酸，以产生重组抗人gp39 mAb，例如嵌合或人源化抗人gp39 mAb。
此外，可以将编码抗人gp39 mAb的核酸掺入表达载体中并导入宿主细胞内，以便于表达并产生重组体形式的抗人gp39抗体。
附图的简单描述
图1是图解说明经体内抗gp39处理而诱导的T细胞对蛋白质抗原的耐受性。在加或不加抗gp39抗体的情况下，用以前体内给予的抗原攻击脉冲输送抗原的B细胞后，于体外检测T细胞反应。
图2是图解说明经体内抗gp39处理而诱导的T细胞对同种异体B细胞的耐受性。在加或不加抗gp39抗体的情况下，用以前体内给予的同种异体B细胞攻击后体外检测T细胞反应。
图3A是图解说明当用抗gp39抗体处理接受体动物时对同种异体B细胞诱导的初次同种异体CTL反应的抑制作用。图中给出的各组分别是未经处理的小鼠(■)、经抗gp39处理的小鼠(△)和未致敏的Balb/c小鼠的脾细胞(●；用作阴性对照效应细胞)。
图3B和3C是图解说明当用抗gp39抗体处理接受体动物时对LPS处理的B细胞母细胞诱导的初次同种异体CTL反应的抑制作用。B和C代表两个独立的实验。所给出的各组分别是没有处理的体内LPS母细胞(▲)、用抗gp39处理的体内LPS母细胞(●)、没有处理的体内静息B细胞(○)和用抗gp39处理的体内静息B细胞(□)。
图4A是图解说明当用抗gp39抗体处理接受体动物时，对同种异体B细胞诱导的再次同种异体CTL反应的抑制作用。所示的各组效应子是用Hlg处理的接受体(●)、首次试验的Balb/c(▲)和抗gp39处理的接受体(■)。相应的同源反应(用Balb/c细胞刺激的Balb/c细胞)用空心符号表示。
图4B是图解说明抗gp39处理对同种异体CTL反应之抑制作用的特异性。所显示的各组分别是由首次试验Balb/c细胞(○)或经给予H-2b单元型B细胞及抗gp39而对H-2b产生耐受的细胞(■)抗H-2k靶的CTL反应。
图5所示直方图说明在用或不用抗gp39抗体处理的情况下，在给宿主移植骨髓后的不同时间，已接受了骨髓移植物的宿主体内的脾细胞数目。
图6A是图解说明在体内用或不用抗gp39处理的情况下，从接受了骨髓移植物的小鼠体内除去脾脏后，脾脏B细胞于体外产生的IgA的浓度。除去脾脏B细胞并在骨髓移植后第7或14天检测抗体产生量。
图6B是图解说明在体内用或不用抗gp39处理的情况下，从接受了骨髓移植物的小鼠体内除去脾脏后，脾脏B细胞于体外产生的IgG1的浓度。除去脾脏B细胞并在骨髓移植后第7或14天检测抗体产生量。
图7A是图解说明在骨髓移植后的不同时间，在体内用或不用抗gp39处理的情况下，接受骨髓移植物的小鼠体内的血清IgE浓度。
图7B是图解说明在骨髓移植后的不同时间，在体内用或不用抗gp39处理的情况下，接受骨髓移植物的小鼠体内的血清抗DNA抗体浓度。
图8A和8B是图解说明在体内用或不用抗gp39处理的情况下，以不同的效应细胞对靶细胞比例(E∶T比例)，得自己接受了骨髓移植物的小鼠的细胞毒性T细胞的体外溶细胞活性。A和B代表两个独立的实验。
图9A、9B和9C是显示用CD40Ig(A)、mAb 4D9-8(B)和mAb 4D9-9(C)着染被激活的人外周血淋巴细胞6小时后的流式细胞分布图。
图10A、10B和10C是显示在被mAb 4D9-8(A)、mAb 4D9-9(B)或CD40Ig(C)着染的环孢菌素A(cycloporin A)存在下将培养的被激活之人外周血淋巴细胞着染6小时后的流式细胞分布图。
图11A和11B是显示在未标记的mAb 4D9-8(A)或未标记的mAb4D9-9(B)存在下用CD40Ig着染被激活的人外周血淋巴细胞6小时后的流式细胞分布图。
图12是图解说明当在抗人gp39 mAb 4D9-8、4D9-9、24-31、24-43、89-76或89-79存在下培养细胞时，对由可溶性gp39和IL-4诱导的人B细胞增殖的抑制作用。
图13是图解说明当在抗人gp39 mAb 24-31或89-79存在下培养细胞时，对同种异体特异性混合的淋巴细胞反应的抑制作用。
发明的详细描述本发明着意描述诱导抗原特异性T细胞耐受性的方法。该方法包括使T细胞与1)向T细胞呈递抗原并在其细胞表面上有配体的细胞-所说的配体与T细胞表面上介导接触依赖性辅助效应子功能的受体相互作用，和2)T细胞上的抑制受体与配体相互作用之受体的拮抗物接触。如本文所限定的，介导接触依赖性辅助效应子功能的分子或受体是在Th细胞上表达的，并与效应细胞(如B细胞)上的配体相互作用的分子或受体，其中受体与其配体的相互作用是产生效应细胞反应(如B细胞激活)所必需的。现已发现，这些分子除参与效应细胞反应外，还参与T细胞对抗原的反应。
介导接触依赖性辅助效应子功能的T细胞上的优选分子是gp39。因此，在优选的实施方案中，本发明的方法包括使T细胞与呈递抗原的细胞和gp39拮抗物接触。因此，用于呈递抗原的细胞是与T细胞表面上的gp39相互作用以激活T细胞(即向T细胞呈递T细胞活化所必需的信号)的细胞。例如，该细胞可以是表达CD40并向T细胞呈递抗原的B细胞。通过抑制呈递抗原的细胞上的gp39配体与T细胞上的gp39间的相互作用，T细胞便不被所呈递的抗原激活，而是变得更加耐受抗原。
本发明的方法可用于在体内诱导T细胞对抗原的耐受性。例如，可以给受试对象使用向T细胞呈递抗原的细胞连同在介导接触依赖性辅助效应子功能的T细胞上表达之受体的拮抗物(如gp39拮抗物)。本发明的方法还可通过使T细胞在体外与向T细胞呈递抗原的细胞连同在介导接触依赖性辅助效应子功能的T细胞上表达之受体的拮抗物(如gp39拮抗物)接触，进一步用于在体外使T细胞易于耐受抗原。然后可将体外耐受的T细胞用于受试对象。本发明的方法可用于使受试者体内T细胞耐受特异性抗原，或被移植的细胞，如同种异体骨髓(如在骨髓移植中)。本发明的方法还可用于在骨髓移植中抑制移植物抗宿主疾病。
本发明的各个方面将在下面小节中作更详细地描述。I.gp39拮抗物按照本发明的方法，将gp39拮抗物与T细胞接触(例如给受试对象施用的)以干扰T细胞上的gp39与抗原呈递细胞，如B细胞上的gp39配体相互作用。gp39拮抗物被限定为干扰这种相互作用的分子。gp39拮抗物可以是抗gp39的抗体(例如抗gp39的单克隆抗体)、抗gp39之抗体的片段或衍生物(例如Fab或F(ab)′2片段、嵌合抗体或人源化抗体)、可溶形式的gp39配体(例如可溶性CD40)、可溶形式的gp39配体的融合蛋白质(例如可溶性CD40Ig)，或破坏或干扰gp39-CD40相互作用的药剂。
A.抗体可以用在哺乳动物体内引发抗体反应的免疫原形式的gp39蛋白质或蛋白质片段(如肽片段)免疫哺乳动物(例如小鼠、仓鼠或兔)。也可以使用在其表面表达gp39的细胞作为免疫原。可代用的免疫原包括纯化的gp39蛋白质或蛋白质片段。可以用常规纯化技术从表达gp39的细胞中纯化gp39；可以在宿主细胞如细菌或哺乳动物细胞系中表达gp39 cDNA(Armitage et al.，Nature，35780-82(1992)；Lederman et al.，J.Exp.Med.，1751091-1101(1992)；Ho1lenbaugh et al.，EMBO J.，114313-4319(1992))，并可用标准技术从细胞培养物中纯化gp39蛋白质。可以使用已知方法(例如F-moc或T-boc化学合成技术)，基于gp39的氨基酸序列(如在Armitage et al.，Nature，35780-82(1992)；Ledermanet al.，J.Exp.Med.，1751091-1101(1992)；Hollenbaughet al.，EMBO J.，114313-4319(1992)中公开的)合成gp39肽。赋予蛋白质以免疫原性的技术包括与载体连接或本领域已知的其他技术。例如，可以在佐剂存在下施用蛋白质。可以检测血浆或血清中的抗体滴度以监视免疫进程。可使用标准ELISA或其他免疫检测法及作为抗原的免疫原来估计抗体水平。
免疫后，可得到抗血清并在必要时从血清中分离多克隆抗体。为了产生单克隆抗体，可以从被免疫动物体内收获抗体生成细胞(淋巴细胞)并用常规体细胞融合方法与骨髓瘤细胞融合，从而使这些细胞永生化并产生杂交瘤细胞。这些技术是本领域已知的。例如，最初由Kohler和Milstein建立的杂交瘤技术(Nature(1975)256495-497)及其他一些技术，例如人B细胞杂交瘤技术(Kozbar et al.，Immunol.Today(1983)472)、用于产生人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole et al.，Monoclonal Antibodies in CancerTherapy(1985)Allen R.Bliss，Inc.，pp.77-96)，及筛选组合抗体文库的技术(Huse et al.，Science(1989)2461275)。可用免疫化学方法筛选杂交瘤细胞以产生与蛋白质或肽特异反应的抗体以及所分离的单克隆抗体。
本文所用的术语“抗体”意欲包括其可与gp39蛋白质或其肽或gp39融合蛋白质特异反应的片段。可使用常规技术分段切割抗体并筛选出那些可以与上述完整抗体一样的方式被利用的片段。例如，可以用胃蛋白酶处理抗体以产生F(ab′)2片段。可以处理所得到的F(ab′)2片段，还原二硫桥键以产生Fab′片段。本发明的抗体还欲包括具有抗gp39部分的双特异性分子和嵌合分子。
当将在非人受试对象体内产生的抗体用于人体治疗时，它们可在不同程度上被识别为外来物质并可在病人体内产生免疫反应。一种减小或消除这一问题的办法(其较好是达到普遍性免疫抑制)是产生嵌合抗体衍生物，即产生与非人动物可变区和人恒定区结合的抗体分子。嵌合抗体分子例如可包括来自小鼠、大鼠或其他种动物抗体的抗原结合区与人恒定区。已描述过多种制备嵌合抗体的方法并可将其用于制备含有识别gp39之免疫球蛋白可变区的嵌合抗体(例如参见Morrisonet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8l5851(1985)；Takedaet al.，Nature 314452(1985)Cabilly et al.，美国专利No.4,816,567；Boss et al.，美国专利No.4,816,397Tanaguchiet al.，欧洲专利公开EP171496；欧洲专利公开0173494；英国专利GB2177096B)。可望这样的嵌合抗体在人受试对象体内比相应的非嵌合抗体有较小的免疫原性。
为了人类治疗目的，可以通过产生人可变区嵌合体进一步使与gp39蛋白质或肽特异性反应的单克隆或嵌合抗体人源化，该人源化抗体中一部分可变区，特别是抗原结合区域的保守的构架区是来源于人的，而只有高可变区是非人来源的。可以用本领域中已知的任何一种技术制备这种改变的免疫球蛋白分子(例如，Teng et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，807308-7312(1983)；Kozbor et tl.，Immunology Today，47279(1983)；Olsson et al.，Meth.Enzymol.，923-16(1982))，并且较好按照PCT公开WO92/06193或EP0239400中公开的技术制备。例如可以由例如ScotgenLimited，2 Holly Road，Twickenham，Middlesex，Great Britain产业化生产人源化抗体。
产生对gp39蛋白质或肽有反应性的特异性抗体或抗体片段的另一种方法是，用gp39蛋白质或肽筛选在细菌中表达的编码免疫球蛋白基因或其部分的表达文库。例如，可以随用噬菌体表达文库在细菌中表达完整Fab片段、VH区和FV区(例如参见Ward et a1.，Nature，341544-546(1989)；Huse et al.，Science，2461275-1281(1989)；McCafferty et al.，Nature，348552-554(1990))。用例如gp39肽筛选这样的文库可以鉴定与gp39反应的免疫球蛋白片段。另外，可以用SCID-hu小鼠(可购自Genpharm)产生抗体或其片段。
实施例6中将进一步详细描述产生抗gp39，包括人gp39和小鼠gp39单克隆抗体的方法学，以及用于本发明方法的适当单克隆抗体。本发明的特别优选的抗人gp39抗体是分别由杂交瘤24-31和89-76产生的mAb 24-31和mAb 89-76。分别产生89-76和24-31抗体的89-76和24-31杂交瘤已按布达佩斯条约的规定于1994年9月2日保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，Parklawn Drive，Rockville，Md.)。89-76杂交瘤的保藏登记号为No.＿＿，24-31杂交瘤的保藏登记号为No.＿＿。
可按照标准重组DNA技术操作编码抗gp39抗体的核酸(如DNA)以产生重组抗gp39抗体，如嵌合和人源化抗体。因此，本发明的另一个方面涉及分离的编码与gp39特别是人gp39反应之免疫球蛋白重或轻链或其部分的核酸分子。编码免疫球蛋白的核酸可编码免疫球蛋白轻或重链可变区，其中有或没有与之连接的重或轻链恒定区(或其部分)。可以用标准技术从产生抗人gp39 mAb的细胞(如杂交瘤)中分离这样的核酸。例如，可以用cDNA文库筛选、PCR扩增及其他标准技术分别从24-31或89-76杂交瘤中分离编码24-31或89-76mAb的核酸。在分离及可能的进一步操作之后，可以将编码抗人gp39 mAb的核酸掺入表达载体中并导入宿主细胞内，以便于表达和生产重组形式的抗人gp39抗体。
B.gp39的可溶性配体可用于诱导T细胞耐受性的其他gp39拮抗物是可溶形式的gp39配体。gp39的单价可溶性配体如可溶性CD40可以结合gp39，从而抑制gp39与B细胞上的CD40间的相互作用。术语“可溶性”是指配体与细胞膜不能持久结合。可以用化学合成或优选地用重组DNA技术，例如只表达配体的细胞外区域(没有跨膜和胞桨区域)来制备可溶性gp39配体。优选的可溶性gp39配体是可溶性CD40。另外，可溶性gp39配体也可以是融合蛋白质形式的。这样的融合蛋白质包含与第二分子连接的至少一部分的gp39配体。例如，CD40可以作为与免疫球蛋白融合的融合蛋白质(即CD40Ig融合蛋白质)被表达。在一个实施方案中，所产生的融合蛋白质包含CD40分子之细胞外区域部分的氨基酸残基，所说部分与相当于绞链区，免疫球蛋白重链的CH2和CH3区如Cγ1之序列的氨基酸残基结合以形成CD40Ig融合蛋白质(例如参见Linsley et al.(1991)J.Exp.Med.1783721-730；Capon et al.(1989)Nature 337525-531；Capon，美国专利5,116,964)。可以用化学合成方法，或较好地用基于CD40的cDNA(Stamenkovic et al.，EMBO J.，81403-1410(1989))的重组DNA技术生产融合蛋白质。II.诱导抗原特异性耐受的细胞本发明至少部分地基于这一发现在gp39拮抗物存在下当抗原呈递于T细胞时，由呈递抗原并与gp39相互作用的细胞向T细胞呈递抗原将导致抗原特异性T细胞耐受。能够以这种机制诱导T细胞耐受的细胞包括那些向T细胞呈递抗原，并需要该细胞上的gp39配体与T细胞上的gp39相互作用，以向T细胞传递T细胞活化所需的信号的细胞。抑制这种相互作用将阻止T细胞被呈递的抗原激活，因而会诱导T细胞中的抗原特异性耐受。通过gp39干扰T细胞活化可阻止对抗原呈递细胞上的共刺激分子(例如抗原呈递细胞(如B细胞)上的B7家族分子)的诱导作用，以便使抗原呈递细胞只在没有共刺激信号的情况下传递抗原信号，从而诱导耐受性。
因此，在本发明的方法中，给接受体对象施用呈递抗原的细胞。本文中使用的短语“呈递抗原的细胞”和“抗原呈递细胞”可以互换使用，并意欲包括向接受体的T细胞呈递抗原的细胞，例如B淋巴细胞、“专业”抗原呈递细胞(如单核细胞、树枝状细胞、郎汉氏细胞)及其他向免疫细胞呈递抗原的细胞(如角质细胞、上皮细胞、星形细胞、成纤维细胞、少突胶质细胞)。此外，抗原呈递细胞较好地有较低的刺激接受体T细胞中共刺激信号的能力。例如，呈递抗原的细胞可能不表达或只以低水平表达共刺激分子如B7家庭的蛋白质(如B7-1和B7-2)。可以使用常规技术，例如其中利用抗共刺激分子之抗体的流式细胞计数法估测将用于本发明方法中之潜在抗原呈递细胞上的共刺激分子的表达。
用于诱导T细胞耐受的优选的抗原呈递细胞是淋巴样细胞，例如外周血淋巴细胞或脾细胞。用于诱导T细胞耐受的优选淋巴样细胞是B细胞。可用常规细胞分离技术从混合的细胞群体(如外周血或脾脏中的其他细胞类型)中纯化B细胞。例如，可以在塑料平皿上培养脾细胞除去贴壁细胞并回收非贴壁细胞群体。可以通过用抗T细胞抗体(如抗Thy 1.1和/或抗Thy 1.2)和补体处理从混合的细胞群体中除去T细胞。在一个实施方案中，使用静息淋巴样细胞，优选用静息B细胞作为抗原呈递细胞。可用本领域已知的技术，例如基于它们的小体积和密度的技术分离静息淋巴样细胞如静息B细胞。例如可用Tony，H-P和Parker，D.C(J.Exp.Med.161222-241(1985))描述的反流离心淘析(counterflow centrifugal elutriation)技术分离静息淋巴样细胞。使用反流离心淘析技术，以14-19ml/分钟，较好以19ml/分钟(3,200rpm)的流速收集各部分而得到耗尽可激活T细胞反应之细胞的小的静息淋巴样细胞群体。另外，也可以用不连续密度梯度离心法，例如使用Ficoll或Percoll梯度分离小的静息淋巴细胞(如B细胞)，并在离心后得到含有小的静息淋巴细胞的细胞层。还可以用常规技术(如免疫荧光法)检测活化的B细胞之表面上共刺激分子如B7-1和/或B7-2的表达，以从活化B细胞中区分出小的静息B细胞。
可以在与T细胞接触之前(在给受试对象施用之前)使抗原呈递细胞如B细胞与抗原(如可溶性蛋白质)接触，并在gp39拮抗物存在下利用读细胞向T细胞呈递抗原，以诱导T细胞对抗原的特异性耐受(参见实施例1)。另外，可以使用同种异体细胞作为抗原呈递细胞诱导对同种抗原的耐受性(参见实施例2和3)。同种异体细胞向T细胞呈递同种异体蛋白质的抗原片段。在一个实施方案中，同种异体细胞是同种异体淋巴样细胞，如同种异体B细胞。另外，可用外周血中的细胞(如外周血淋巴细胞)、脾细胞或骨髓细胞使受试对象获得耐受性。在骨髓移植的情况下，将供体骨髓细胞本身用作为与T细胞接触(如施予受试对象)的抗原呈递细胞。因此，可以将同种异体骨髓与gp39拮抗物一起联合施用，以诱导接受体内对骨髓的耐受性并阻止移植物抗宿主疾病(参见实施例4和5)。III.细胞和gp39拮抗物的施用根据本发明，可以给受试对象联合施用gp39拮抗物和向T细胞呈递抗原并表达与T细胞上gp39相互作用之配体的细胞，以诱导抗原性异性T细胞耐受。在一个优选实施方案中，可合并或同时施用抗原呈递细胞和gp39拮抗物。或者，可以在施用细胞之前施用gp39拮抗物，例如当拮抗物是有长半寿期的抗体时。在将施用的细胞是骨髓细胞(其中期望抑制移植物抗宿主疾病)的情况下，可将供体骨髓与宿主的B细胞及gp39拮抗物在体外一起保温，以在将骨髓移入接受宿主体内之前使供体T细胞对骨髓产生耐受。必要时，可在骨髓移植期间或之后使gp39处理过程在体内继续进行。在接受骨髓或其他器官移植物的受试对象体内，可以经用一种在器官或骨髓细胞转移之前诱导同种异体耐受的方法，处理受试对象以诱导其对移植物的同种异体耐受。这种预处理方法可包括给受试对象施用供体的细胞以及gp39拮抗物。供体的细胞例如可以是B细胞、全外周血或其某些部分(如外周血淋巴细胞或小的静息淋巴细胞或B细胞)。
已发现，施用一剂抗原呈现细胞(与拮抗物合用)便足以诱导T细胞耐受(参见有关实施例)。施用抗原呈递细胞的数目可依据所用细胞的类型、组织或器官移植物的类型、接受体的体重和一般状况及其他本领域技术人员已知的可变因素的不同而有所变化。可由本领域普通技术人员按常规方法(例如使用实施例中所述的检测法)确定用于本发明方法中之细胞的数目。以一种适于诱导接受体耐受性的形式和途径施用细胞。可将细胞加在生理上可接受的溶液中如缓冲盐水或类似载体中施用。较好以静脉内途径施用细胞。
为诱导T细胞耐受性，以适于体内药理学给药的生理相容形式给受试对象施用本发明的拮抗物。所说的“适于体内给药的生理相容形式”是指待施用之拮抗剂的形式，其中蛋白质的治疗效应胜过任何毒性作用。术语“受试对象”意欲包括可在其体内引发免疫反应的活的生物体，例如哺乳动物。这些受试对象的例子包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。可以任何药理形式，任选加在药物可接受的载体内施用gp39拮抗物。施用治疗活性量拮抗物限定为在一定剂量和用药疗程下，为达到预期效果所需的有效量。例如，gp39拮抗物的治疗活性量可依据个体的病情、年龄、性别和体重，以及拮抗物在个体体内引发预期反应的能力等因素的不同而不同。可调整疗程和剂量以提供最适治疗反应。例如，可根据治疗状态的急迫情况每天分几次施用或按比例降低剂量。
可以按常规方式如注射(皮下、静脉内等)、口服、吸入、透皮或直肠用药等方式施用活性化合物(拮抗物)。根据给药途径的不同，可以用某种材料包被活性化合物，以防止化合物遭受到那些可能使化合物失活的酶、酸及其他天然条件的破坏作用。优选的给药途径是静脉内注射。
为了以非胃肠道外途径施用gp39拮抗物，用某种防止其失活的材料包被拮抗物或与之共同施用可能是必要的。例如，可将拮抗剂加在适当的载体或稀释剂中施用，与酶抑制剂合用或加在适当的载体如脂质体中施用。药学上可接受的稀释剂包括盐水和缓冲水溶液。酶抑制剂包括胰腺胰蛋白酶抑制剂、二异丙基氟磷酸酯(DEP)和trasylol。脂质体包括水包油包水型(水/油/水)型乳剂及常规脂质体(Strejan et al.，(1984)J.Neuroimmunol.727)。
该活性化合物也可以经胃肠道外或腹腔内途径给药。还可以在甘油、液态聚乙二醇、和其混合物及油中制成分散剂。在常规储存和使用条件下，这些制剂可含有防止微生物生长的防腐剂。
适于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(此时是水溶性的)或分散剂，和用于临时制备无菌可注射溶液和分散剂的无菌粉末。在所有这些情况下，组合物都必须是无菌的并且必须是容易注射的液体。其在制造和储存条件下必须是稳定的，并且必须能阻止微生物如细菌和真菌的污染。载体可以是溶剂或含有例如水、乙醇、多元醇(如丙三醇、丙二醇和液态聚乙二醇等)的分散介质，及其适当的混合物。例如借助使用卵磷酯等复盖层、维持分散剂中固形物的必要颗粒大小及使用表面活性剂，以保持适当的流动性。可使用如parabens、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸、乙基汞硫代水杨酸钠等各种抗细菌剂和抗真菌剂来达到抑制微生物的作用。在许多情况下，组合物中优选包含等渗剂，例如糖、甘露醇和山梨醇等聚醇、氯化钠。可在组合物中加入例如单硬脂酸铝和明胶等延迟吸收的制剂来延长可注射组合物的吸收。
可以按需要将活性化合物(如gp39的拮抗物)以所需量与一种或几种上述成分一起掺入到适当的溶剂中，然后过滤除菌以制得无菌可注射溶液。一般说来，可将活性化合物掺入到包含基本分散介质及如上所述之其他必需组分的无菌载体中，以制得分散剂。就用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末来说，优选的制备方法是经真空干燥和冷冻干燥以产生活性成分(如拮抗物)以及来自其以前无菌过滤之溶液的其他所需成分的粉末。
当按上述方法适当地保护活性化合物时，该蛋白质可以例如与惰性稀释剂或某种可同化的可食载体一起口服给药。本文所说的“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂及吸收延迟剂等。这些介质和制剂对药理学活性物质的应用是本领域中已知的。除非某种常规介质或制剂是与活性化合物不相容的，否则均可考虑将其应用于本发明的治疗组合物中。也可以将附加的活性化合物掺入该组合物中。
为了易于给药和保持剂量的均一性，以剂量单位形式配制胃肠道外给药组合物是特别有利的。本文所说的“剂量单位形式”是指对于被治疗的哺乳动物受试对象来说适于作为单一剂量的物理上分立的单位；每个单位含有经过计算的预定量的活性化合物，从而可与必要的药物载体结合以产生所需的治疗效果。本发明的剂量单位形式的规格由下列因素指定并直接取决于这些因素(a)活性化合物的独特性质和将要达到的特定治疗效果和(b)为处理个体敏感性问题而提出的掺合这些活性化合物的本领域特有限制。
除了T细胞的体内耐受化外，本发明还欲包括例如在gp39拮抗物存在下使T细胞与抗原呈递细胞接触以诱导T细胞的体外耐受。例如，可从受试对象体内得到T细胞，经与抗原呈递细胞和拮抗物一起培养而使之产生体外耐受，然后重新施用于受试对象。IV.本发明方法的应用本发明的方法可应用于诱导T细胞对多种抗原的耐受性。例如，如实施例1中所述，可诱导T细胞对可溶性抗原(如可溶性蛋白质)的耐受。可以使T细胞耐受与自身免疫病或与异常免疫反应有关之疾病的抗原。例如在一个实施方案中，抗原是自身抗原。在另一个实施方案中，抗原是变应原。或者，可以使T细胞耐受外来细胞上表达的抗原(参见实施例2至5)。因此，在另一个实施方案中，抗原是同种抗原或异种抗原。诱导T细胞对同种抗原和异种抗原的耐受是移植中的特殊应用，例如用于抑制移植物接受体对供体移植物如组织或器官移植物或骨髓移植物的排斥。另外，骨髓移植物内供体T细胞的耐受化可用于抑制移植物抗宿主疾病(参见实施例5)。
下列实施例旨在进一步举例说明本发明而不构成对本发明的限制。本申请通篇所列出的所有参考文献、专利和已公布的专利申请的内容均掺入本文作为参考。
实施例1诱导抗原特异性耐受方法用KLH施加脉冲的脾B淋巴细胞免疫小鼠5天。初次免疫期间不处理或用抗gp39抗体MR1处理动物。初始免疫后5天，局部(爪垫)注射加在完全弗氏佐剂(CFA)中的KLH以攻击小鼠。5天后杀死小鼠，切除引流淋巴结并在体外检测T细胞对KLH的增殖反应。
结果用经抗原脉冲的活化的B淋巴细胞免疫动物并在其后用同样抗原攻击，产生明显的抗免疫抗原的免疫反应。图1中显示根据抗原特异性T淋巴细胞增殖情况所测得的反应水平。在初次免疫期间用抗gp39抗体处理动物，导致在体外抗原攻击后抗原特异性T淋巴细胞的无反应性。与得自未经处理之动物的淋巴结的T淋巴细胞相比，得自用抗gp39抗体处理之动物的淋巴结的T淋巴细胞显示降低了增殖能力。
实施例2诱导T细胞对同种异体细胞的耐受方法用DBA/2(H-2b)小鼠的同种异体脾脏B细胞免疫Balb/c(H-2d)小鼠。免疫后用抗gp39抗体MR1处理，或不处理动物5天。第6天杀死动物并取脾脏。然后将得自抗gp39抗体处理的或未经处理之动物的脾细胞在体外与未刺激的或经过照射的DBA/2脾细胞一起培养。开始培养后第3天检测对此再次同种异体刺激的增殖反应。
结果当在体外用同样细胞攻击5天后，经同种异体脾脏B细胞免疫之动物的T淋巴细胞产生了强的增殖反应(图2)。但在继后体外攻击后，经同种异体脾脏B细胞免疫的并用抗gp39抗体处理之小鼠的T淋巴细胞则表现有降低的增殖能力。与对照组未处理的小鼠相比，抗gp39抗体处理的小鼠表现对攻击的反应性降低约50％。
实施例3抗gp39处理干扰对同种异体B细胞之CTL反应的产生本实施例中研究gp39在产生细胞毒性T细胞(CTL)中的作用。为了估计gp39在CTL产生中的体内功能，检测抗gp39处理对经用同种异体B细胞免疫引起之同种异体特异性CTL产生的影响。确定抗gp39处理对初次和再次CTL反应的影响。
初次CTL反应为了试验抗gp39是否能阻止同种异体B细胞引发体内同种异体特异性CTL反应，给接受体小鼠施用加有或不加抗gp39的同种异体B细胞(排除T细胞的脾细胞)。用借助抗Thy 1.2(从ATCC克隆HO13.4制备的腹水)和兔补体处理而排除了T细胞的C57BL/6(雌性，6-8周龄，Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)脾细胞(30－50×106个)免疫Balb/c小鼠(雌性，6-8周龄，Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)。然后不处理或用抗gp39处理这些接受体小鼠5天(第0、2和4天，250mg/接受体动物)。第5天，切除脾脏并使用4小时铬释放检测法检测CTL反应。使用未致敏Balb/c小鼠的脾细胞作为阴性对照效应细胞。所使用的靶细胞是E雌性K1(H-2b，衍生于C57BL/6品系的T细胞淋巴瘤)和P815(H-2d，衍生于DBA/2J品系的肥大细胞瘤)。洗51Cr标记的靶细胞并按每孔1×104个细胞铺敷在以100∶1、20∶1和4∶1的效应子∶靶(E∶T)比例加入效应细胞的96孔平板中。简单离心平板并在5％CO2保温箱中37℃保温4小时。再次离心平板并从各孔中收集100ml无细胞上清以进行γ计数(LKB Clinigamma，Wallace Inc.，Gaithersburg，MD)。百分特异性溶胞限定为(a－b)/c，其中a是由加效应细胞一起保温之靶细胞释放的cpm，b是由只加培养基保温之靶细胞释放(自发释放)的cpm，c是可从靶细胞冻融释放的cpm(约为所掺入之总cpm的80％)。P815靶细胞没有被所试验的任何细胞样品裂解。图3A中图解显示了E雌性K1靶的结果，其中所示出的各组是未经处理的小鼠(■)、经抗gp39处理的小鼠(△)和未致敏Balb/c小鼠的脾细胞(●；用作阴性对照效应细胞)。结果证明，接受了抗gp39和同种异体细胞的小鼠在对同种异体B细胞反应中没有产生体内初次CTL反应。相反，在没有抗gp39的情况下，同种异体B细胞使接受体小鼠产生对同种异体抗原的敏感性并诱导了实质性CTL反应。
为了确定抗gp39是否只能放大未活化的脾脏B细胞的致耐受效应，在加有或没有加抗gp39的情况下用LPS激活的B细胞刺激CTL反应。按上述方法制备C57BL/6小鼠的B细胞并在加有或不加脂多糖(LPS；50mg/ml；Sigma Diagnostics，St.Louis，MO)的条件下培养2天。然后收获细胞，彻底洗涤并腹膜注射(30－50×106个)到Balb/c接受体小鼠体内。在第0、2和4天按上述方法用抗gp39处理接受体小鼠或不作此处理。第5天，切除脾脏并按上述方法检测CTL反应。图3B(顶部和底部框)中显示了两个独立的实验的结果。所给出的各组是没有处理的体内LPS母细胞(▲)、用抗gp39处理的体内LPS母细胞(●)、没有处理的体内静息B细胞(○)和用抗gp39处理的体内静息B细胞(□)。结果表明，虽然不是完全的，但抗gp39处理还是降低了对同种异体LPS母细胞的初次CTL反应。
再次CTL反应为了检查施用抗gp39和同种异体B细胞对CTL形成的影响，体外刺激经处理和未经处理之小鼠的脾细胞并研究CTL反应的程度。按上述方法用C57BL/6衍生的B细胞体内致敏Balb/c小鼠。分离抗gp39和对照仓鼠Ig(HIg)处理之动物的脾细胞，并将5×106个细胞/ml(“反应者”)与密度为5×106个刺激细胞/ml的各种丝裂霉素C(Sigma Diagnostics，St.Louis，MO)处理(2.5mg/ml，37℃)的不同品系小鼠的脾脏B细胞(经用抗Thy 1.2+补体处理而制备的)一起培养5天。刺激细胞组分别是指示再次同种异体反应和初次同源反应的C57BL/6(H-2b)和Balb/c(H-2d)。在新鲜制备的致敏RPMI-1640培养基(Bio Whittaker，Walkersville，MD)、1×105M 2-巯基乙醇(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)、2mM L-谷氯酰胺(Sigma Diagnostics，St.Louis，MO)、500U/ml青霉素和5000U/ml链霉素(SigmaDiagnostics，St.Louis，MO)中培养刺激细胞和反应细胞。5天后，收获反应细胞并在密度梯度上离心除去死细胞。在如上文所述的CTL检测法中使用所得到的活细胞作为效应细胞。靶包括E雌性K1(H-2b，得自C57BL/6品系的T细胞淋巴瘤)和P815(H-2d，得自DBA/2J品系的肥大细胞瘤)。结果图解显示于图4A中。所显示的各组同种异体刺激的效应于是Hlg处理的接受体(●)；首次试验的Balb/c(▲)和抗gp39处理的接受体(■)。空心符号表示相应的同源反应(经Balb/c细胞刺激的Balb/c细胞)。正如所期望的，在没有抗gp39处理的情况下体内用同种异体除去T细胞的脾细胞(H-2b)免疫小鼠后在体外产生了强烈的再次CTL反应。如果给小鼠体内施用抗gp39则没有再观察到增高的再次抗H-2bCTL反应。
为了确定抗gp39处理对CTL反应之抑制作用的特异性，在CTL检测法中使用B10BR(H-2k)脾脏B细胞作为刺激细胞并用SL8(H-2k，衍生于AKR品种的自发性T细胞淋巴瘤)作为靶，分析上述脾细胞培养物的抗H-2k同种异体反应(第三组同种异体反应)。结果示于图4B中。图中所示的各组是首次试验的Balb/c(○)和抗gp39处理的接受体(■)。结果证明经用抗gp39处理抑制抗H2b特异性CTL反应是同种异体特异性的，因为施用H-2b脾细胞和抗gp39并未改变对“旁观者”同种异体抗原(H-2k)的体外CTL反应。
以上这些数据显示，抗gp39干扰同种异体特异性CTL反应(初次和再次反应)的产生。在抗gp39存在下，对相关同种异体抗原特异的CTL前体仍然存在，因为在体外次级培养物中可以证明某些抗H-2bCTL活性。可以认为，抗gp39处理通过阻断CTL引发或降低已引发的同种异体特异性CTL的频率而降低了再次体外反应。使用静息B细胞对于证明这种无反应性不是绝对必要的，因为由LPS母细胞诱导的同种异体CTL反应也被抗gp39所减弱。
实施例4用抗gp39抗体处理接受体时转移同种异体鼠骨髓诱导稳定的嵌合体治疗许多不能用常规化学疗法治愈的血液学疾病涉及转移同种异体骨髓。这种进攻疗法包括施用高的、骨髓脱落剂量的化学治疗连同输注致使克隆发生肿瘤细胞消亡的同种异体骨髓。
已经证明，当使用包括抗CD 4mAb在内的抗T细胞单克隆抗体(mAb)时，胸腺照射，缺失胸腺T细胞可增加稳定嵌合体的发生率。这种抗体补给法导致T细胞缺失并进而导致供体特异性耐受(此可根据对供体皮肤移植物的耐受来表示)。在300拉德WBI、体内抗T细胞mAb处理及施用同种异体骨髓后没有达到永久同种异体移植可能是由于胸腺内未受影响的T细胞所致。使用抗CD4和抗CD8mAb可导致外周血和脾脏T细胞的有效消耗，但胸腺T细胞只是被mAb简单地包裹而没有被除掉。因此对小鼠进行胸腺照射。
方法使用将F1的同种异体骨髓转移(BMT)到亲代的鼠模型以避免移植物抗宿主疾病被诱导。我们使用了F1品系CB6，其为产生H-2d/b之总MHC单元型的(C57BL/6×Balb/c)F1。除去骨髓并加或不加抗gp39抗体MR1静脉注射到经过照射的BALB/c亲代小鼠体内。改变总体照射(WBI)水平以便确定最好的嵌合状态水平，并比较处于各照射水平的抗gp39抗体处理的和未经处理的动物。用流式细胞计数法分析存在于H-2d(BALB/c)小鼠体内的H-2bMHC单元型的外周血淋巴细胞，以确定嵌合状态。以前已表明小鼠的这种组合是适宜的并且可以在500和600拉德WBI的水平上得到嵌合体。
结果经用流式细胞计数法鉴定C57BL/6衍生的细胞(H-2b)以检测嵌合状态。发现在用400、500和600拉德全身照射的小鼠中，只有从研究开始就用抗gp39抗体处理时才在14天内产生嵌合状态。除给予600拉德全身照射外，没有接受抗体处理的小鼠均在所有照射水平上排斥细胞，从而它们接受骨髓达到与以400拉德照射的抗体处理组相同的程度(表1)。发现用抗gp39抗体治疗并以400、500和600拉德照射，于治疗6周后嵌合状态的水平分别是70.7＋5.74、94.1和84.4＋8.56；而以600拉德照射并且没处理则发现它们为85.7＋5.9嵌合(表2)。在这一点上对细胞进行表型鉴定表明，T细胞、B细胞和巨噬细胞都是嵌合的，并且与600拉德照射的未处理组相比，以400拉德照射的处理组达到同样的嵌合程度(表2)。还看出抗gp39抗体处理并没有显著地改变该范围内任何淋巴样细胞的总百分群体。当终止用抗gp39抗体处理动物时，发现直到移植物8周仍是稳定嵌合的。
表1用抗gp39处理的嵌合 未经抗gp39外理的嵌合全身照射水平(拉德)动物的数目动物的数目0 0(5) 0(5)2000(5) 0(5)4009(9) 0(9)4503(5) 0(5)5004(5) 2(5)6007(9) 7(9)导致嵌合状态之全身照射的水平。括号内数字代表在各水平上试验之动物的总数。
表2拉德 处理 II-2Kb+B细胞II-2Kb+T细胞II-2Kb+Mac.II-2Kb+400 +70.7±5.7489±2.6 45.9±13.3 82.3±3.3500 +94.1 100 89 100600 +84.4±8.5699.3±0.9472.3±15.9 91.1±8.3600 -85.7±5.9 97.3±1.7767.1±10.3 91±9B细胞、T细胞和巨噬细胞(Mac.)H-2Kb±标准误差阳性的百分数。
实施例5同种异体骨髓移植并用抗gp39处理移植物接受体以抑制急性和慢性移植物抗宿主疾病本实施例中使用下述方法学小鼠从NCI实验室(Bethesda，Maryland)得到DBA/2(H-2d)、C57BL/6(H-2b)和B6D2F1(C57BL/6(H-2d)×DBA/2)F1杂种)小鼠并饲养在Dartmouth Medical School动物室的无病毒环境中。本研究中使用的所有小鼠均为雌性，6-8周龄。
诱发慢性GVHD将亲本(DBA/2)脾细胞静脉注射到未经照射的(C57BL/6×DBA/2)F1杂种接受体体内以诱发慢性GVHD(Fast，L.D.(1990)J.Immunol.1444177)。麻醉亲代小鼠并断颈处死以切除脾脏。洗离散的脾细胞并重新悬浮在RPMI 1640培养基(Whittaker，Waldersville，Maryland)中，用以静脉注射到F1接受体动物体内。
诱发急性GVHD将亲本C57BL/6脾细胞静脉注射到未经照射的(C57BL/6×DBA/2)F1杂种接受体体内以诱发急性GVHD。制备细胞用以如诱发慢性GVHD的细胞传输。
抗体按已描述过的方法(Foy，T.M.et al.(1993)J.Exp.Med.1781567-1575；Noelle，R.J.et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 896550)在腹水中产生抗gp39MR1并用离子交换HPLC纯化之。多克隆抗同种型抗体从Southern BiotechnologyAssociates，Inc.，(Birmingham AL)得到所有抗IgG1和IgA抗体及标准对照品。抗IgE抗体用于IgE特异性ELASA的所有抗IgE抗体(BIE3和Biotin AM95)和标准品(A3B1)均由Dr.T.Waldschmidt，IA惠赠。抗MHC单元型抗体H-2KbFITC结合的抗体和H-2DdBiotin结合的抗体得自PharMingen(San Diego，CA)。
细胞系所使用的细胞系包括得自美国典型培养物保藏中心(ATCC)的P815(H-2d)和LB27.4(H-2bxd)。细胞系cl.18.5(H-2b)由Dr.William R.Green惠赠。
多克隆Ig体外产生分离对照组和cGVHD小鼠的脾脏并制备单细胞悬液。用Tris缓冲的氯化铵处理细胞以除去红细胞并用肉眼可见的血细胞计数法确定总白细胞数。在1ml完全(c)RPMI-1640培养基(添加有10％胎牛血清(Hyclone，Logan UT)、25mM HEPES、2mML-谷氯酰胺、5000U/ml青霉素和5000mg/ml链霉素)中，5％CO2环境下37℃培养细胞3天。离心沉淀细胞收集培养物上清并用同种型特异性ELISA检测法定量Ig。
同种型特异性和抗原特异性ELISA检测IgG1和IgA的ELISA使溶于PBS中的羊抗小鼠IgG1或IgA(10μg/ml；SouthernBiotechnology Associates，Inc.，Birmingham AL)在96孔聚乙烯微滴定板上37℃吸附1小时，然后4℃保温过夜。洗平板并用含有1％FCS的PBS于37℃封闭1小时。再次洗平板并加入上清液和标准对照物(IgG1和IgA，Southern Biotechnology Associates，Inc.，Birmingham AL)的适当稀释液并于37℃下保持2小时。这一时间过后，将平板洗3次并加入碱性磷酸酶结合的羊抗小鼠IgG1或IgA(1/500稀释)(Southern Biotechnology Associates，Inc.，Birmingham Alabama)37℃保持2小时。彻底洗平板并加入磷酸酶底物(1mg/ml；Sigma Diagnostics，St.Louis，MO)而产生适当的颜色改变。于410nm吸光率处用ELISA读出器(DynatechLaboratories，Inc.)确定读数。与适当的同种型标准曲线相比较，确定Ig浓度并表示为平均值＋标准误差(n＝3)。
检测IgE的ELISA用抗小鼠IgE俘获抗体(B1E3(2mg/ml))包被96孔聚乙烯微滴定板的各小孔(4℃过夜)，然后于37℃用含有1％FCS的PBS封闭1小时。再次洗平板并加入上清液和标准对照样品(A3B1(IgE))的适当稀释液，37℃放置2小时。彻底洗平板，向各孔内加入EM95-Biotin(5mg/ml)并于37℃保温2小时。这一时间过后，加入与链霉抗生物素蛋白结合的碱性磷酸酶(1/500稀释)继续放置2小时，然后彻底洗平板并加入磷酸酶底物(1mg/ml；Sigma Diagnostics，St.Louis，MO)以产生适当的颜色改变。于410nm吸光率处用ELISA读出器(Dynatech Laboritories，Inc.)确定吸光率读数。经与标准曲线比较确定Ig的浓度并表示为平均值＋标准误差(n＝3)。
检测抗DNA Ab的ELISA将牛胸腺DNA(Sigma，St.Louis，MO)(5μg/ml)溶解于含有0.1M碳酸钠/碳酸氢钠(pH9.8)的偶联缓冲液中。将所得溶液煮沸10分钟后在冰上保温3分钟。测定DNA的OD 260并将其浓度调到所需的5μg/ml DNA。向96孔聚乙烯微滴定板的小孔内加入100μl样品并于4℃保温过夜。然后将平板洗3次并于37℃用含有1％ FCS和0.02％叠氮化钠的PBS封闭1小时。再次洗平板并加入一系列血清样品的稀释液(100ml)并于37℃保温2小时。检测抗体，再向各孔加入羊抗小鼠IgG 1-碱性磷酸酶并再次于37℃保温2小时。彻底洗平板并加入磷酸酶底物(1mg/ml，Sigma Diagnostics，St.Louis，MO)以产生适当的颜色改变。在410nm米吸收处用ELISA读出器(Dynatech Laboratories，Inc.)确定吸光率读数。与阳性血清样品比较抗体滴度并用任意单位表示结果。
检测供体衍生之细胞的流式细胞计算分析法从用和未用抗gp39处理之正常BDF1，cGVHD小鼠体内切除脾脏并制备单细胞悬液。将细胞在Ficoll-Hypaque上铺层(4∶1)，然后于室温下以2000rpm离心20分钟。除下所得的淋巴细胞层并用含有5％FCS的BSS洗细胞1次。将每管1×106个细胞以50μl终体积用于染色。向各管内加入50μl大鼠血清以阻止抗体的非特异性结合。用(a)对照抗体大鼠Ig FITC(1∶100终稀释度)和PE-链霉抗生物素蛋白(1∶500终稀释度)，和(b)FITC H-2Kb及Biotin H-2Dd(两者均为1∶100终稀释度)着染细胞。在冰上将细胞保温20分钟，然后洗两次以除去未结合的抗体。最后向适当试管内加入PE-链霉抗生物素蛋白(1∶500终稀释度)，再于冰上保温20分钟检测生物素结合的抗体。再洗细胞两次以备在Becton Dickinson FACScan上进行分析。通过前向和侧向散射阳性控制后，每份样品收集10,000个流通颗粒以确定相关MHC单元型阳性的百分细胞数。
估值CTL试验的铬释放检测法洗51Cr标记的靶细胞并以每孔1×104个细胞，按100∶1、20∶1和4∶1的E∶T比例与效应细胞一起铺敷于96孔平板各孔中。所用的靶细胞包括P815(H-2d)、LB27.4(H-2bxd)和c118.5(H-2b)。将平板简单离心后于5％CO2中37℃保温4小时。再次离心平板并从每孔中收集无细胞上清液的等分样品，用γ计数器计数。百分特异性溶胞限定为(a－b)/c，其中a＝与效应细胞一起保温之靶细胞释放的cpm，b是只加培养基保温之靶细胞释放的cpm(自发释放)，且c是靶细胞的可冻融释放的cpm(均为所掺入之cpm的80％)。
急性GVHD脾细胞的体外二次刺激从经抗-gp39处理、HIg处理或未经处理的动物中切除急性GVHD脾脏，清除脾细胞中的红细胞并以每孔1×104个脾细胞等分铺板。将经过照射的刺激细胞(P815)加到适当的孔中。7天后按以前提到的方法进行针对适当靶细胞的CTL试验。
结果小鼠的GVHD导致脾大。在小鼠中，cGVHD的后果之一是脾脏增大。主要的是宿主自身的细胞浸润和增大脾脏，但这是在对供体细胞存在的反应中出现的(Rolink，A.G.et al.(1983)J.Exp.Med.158546)。图5表明cGVHD发生后7-14天，与没有cGVHD的小鼠相比脾脏几乎含有两倍数目的白细胞。在cGVHD发作时用抗gp39处理小鼠(250μg/小鼠，第0、2、4和6天)，可使cGVHD小鼠脾脏中白细胞的数目降低到相同于没有疾病之小鼠的值。
GVHD诱导的多克隆免疫球蛋白的过度产生。已报导由于供体T细胞和B细胞之间同性质相互作用而在有cGVHD小鼠体内出现Ig的过度产生(Morris，S.E.et al.(1990)J.Exp.Med.171503)。为了确定抗gp39是否抑制Ig过量产生，给患cGVHD的小鼠施用抗gp39。于第7或14天，从对照和cGVHD小鼠体上切除脾脏并于体外检测脾B细胞的IgG1和IgA的自发产生。得自患cGVHD小鼠的脾细胞于体外产生了高水平的IgA和IgG1(图6A和6B)。然而，得自患有cGVHD并用抗gp39(第0、2、4和6天)处理之小鼠的脾细胞则产生了与没有病之小鼠完全相同水平的IgG1和IgA。向患有cGVHD小鼠的脾细胞培养物中加入抗gp39没有降低体外Ig产生的水平，此提示抗gp39只在体内发挥其作用。
当用仓鼠Ig(HIg)作为这些实验的对照时，发现其在诱发GVHD中没有显示抑制作用，而是不仅就多克隆Ig产生而言而且就所形成的脾肿大而言实质上都加重了疾病。与未经1周处理的诱发GVHD的小鼠相比，测得经过1周HIg处理的诱发了GVHD的小鼠所产生的Ig水平增加达8倍。此表明，HIg本身就是一种免疫原。因此决定将未经处理的F1接受体小鼠称为相关对照组。
抗gp39对GVHD诱导的血清高IgE和抗DNA自身抗体的影响。可根据血清IgE和抗双链DNA抗体的升高监测cGVHD病程(Morris，S.E.et al.(1990)J.Exp.Med.171503)。使用IgE特异性ELISA检测血清IgE的水平。在第0、2、4和6天用抗gp39处理诱发了慢性GVHD的小鼠，然后不再施用抗体。以周为间隔期间养小鼠并确定血清IgE水平(图7A)。cGVHD诱使血清IgE水平增加10-15倍。施用抗gp39在发病后长达8周时间抑制cGVHD诱发的血清IgE增加。除了抑制血清IgE升高外，施用抗gp39还阻断了血清抗DNA自身抗体的产生。经用抗gp39处理降低了因慢性GVHD导致的高达5-10倍的抗DNA抗体增加水平(图7B)。
以前的研究已显示，抗gp39(MR1克隆)的半寿期为12天(Foy，T.M.et al.(1993)J.Exp.Med.1781567-1575)。对检测抗gp39特异的ELISA试验表明，治疗后8周，经处理的小鼠血清中查不到抗gp39。因此，抗gp39持续存在不能说明延长了对cGVHD的抑制作用。进行转移研究以明确是否患有cGVHD的并且已施用抗gp39之小鼠的脾细胞可转移cGVHD。在过继转移后得自cGVHD和抗gp39之小鼠的脾细胞不能诱导IgE和抗DNA自身抗体血清水平的升高；而患有cGVHD之小鼠的脾细胞则诱导了血清IgE和抗DNA抗体的升高。这些数据提示，由于抗gp39处理的结果，同种异体反应性T细胞已被诱导成为非反应性的。
检测同种异体反应性供体细胞。当分析诱发了cGVHD的小鼠脾脏内是否存在供体衍生的细胞时，发现与H-2Kb和H-2Dd着染双阳性的正常BDF1小鼠相比，cGVHD小鼠拥有约5-7％供体细胞。这些细胞是DBA/2衍生的，因此对H-2Dd呈着染单阳性。检测这些细胞时不考虑抗gp39处理。这一结果说明抗gp39处理充许输入供体细胞而没有不当地引出接受体B细胞的辅助功能，该辅助功能可在未经处理的cGVHD组小鼠体内导致多克隆Ig产生。
抗gp39处理对诱发急性GVHD的影响。急性GVHD与诱导增加的抗同种异体CTL反应有关。虽然已知gp39-CD40相互作用对于Th-B细胞相互作用是很关键的，但还不清楚抗gp39治疗是否也可改变对其他免疫效应物机制的诱导作用。经F1接受体施用C57BL/6脾脏细胞可诱发AGVHD。如图8中所示，在转移同种异体细胞后12天，检测到强的H-2b抗H-2dCTL反应。用抗gp39但不用HIg处理小鼠，阻止了H-2b抗H-2dCTL的产生(图8)。在两个实验中的一个实验中，经用抗gp39处理使动物的CTL反应降低到未实验过之小鼠脾细胞的CTL反应水平以下。这一结果表明GVHD小鼠的脾细胞此时受到了攻击。如果其后在被照射过的P815细胞存在下将这些脾细胞培养7天并继而进行CTL检测，可见这些细胞没有发动对P815细胞的二次刺激，但正常BDF1脾细胞则出现了初次反应。如所预期的，未经处理的aGVHD诱导的小鼠发起了二次免疫反应。这些结果表明，用抗gp39处理急性GVHD小鼠使得CD8+群体对二次攻击无反应性。
讨论经施用gp39后，在诱发了GVH的小鼠体内出现脾肿大逆转(图5)、抑制Ig过度产生(图6A和6B)、抑制血清IgE和抗DNA自身抗体产生的水平(图7A和7B)等作用，提示抗gp39阻断了被移植之T细胞诱导宿主B细胞活化的能力。在停止施用抗体后7天，这种对脾肿大和多克隆IgG1与IgA产生的抑制作用仍处于低水平。当终止处理时，IgE和抗DNA抗体的降低甚至持续8周。这些结果表明，T细胞功能已受到反应性T细胞之克隆缺失，或者T细胞无反应性已出现的影响。前已证明(Van den Eertwegh et al.(1993)J.Exp.Med.1781555-1565)，在被免疫小鼠的原位杂交研究中，抗体处理之小鼠的细胞因子生成细胞的水平仍保持正常。这一结果表明，T细胞没有因上述处理而被消除。当分析cGVHD小鼠体内供体衍生之细胞的存在时，发现它们存在于未经处理或经用抗gp39处理的小鼠中。因此抗gp39具有诱导这些供体T细胞之非反应性状态，且不当地产生对抗体反应抑制的能力。的确，如果将这些动物的脾脏移入未实验过的接受体动物体内，当供体脾脏是未经处理的cGVHD小鼠的脾脏时可见抗体水平升高，但经抗gp39处理之cGVHD小鼠则不能在转移后造成再次cGVHD状态。这一数据提示，抗gp39干扰T细胞引起强的GVHD临床免疫病理学状态和脾肿大的能力，即施用抗体可引起对CD4+亚群的无反应性。
已报导，正如在对B细胞缺陷小鼠进行的诱导抗Friend鼠白血病病毒所致白血病的保护性T细胞免疫研究中所看到的，为诱导CTL反应须由B细胞提供帮助(Schultz，K.R.et al.(1990)Science249)。因此似乎可以理解到，在诱发aGVHD的小鼠中抗gp39抑制B细胞活化，因此阻止抗原呈递并进行致敏CD8+T细胞。也已显示，CD8+CTL的产生需要II类限制性Th细胞的相互作用(Von Boehmer，H.et al.，(1979)J.Exp.Med.1501134；Keene，J.et al.(1982)J.Exp.Med.155768)，并且当TCR亲和力低时，体内需要CD4+介导的T细胞帮助(Gao，X.et al.，(1991)J.Immunol.1473268)。
已进行了寻找CD28-B7/BB1相互作用在诱导CD8+CTL反应中所发挥之作用的研究。发现CD28-B7/BB1相互作用对于I类MHC特异性CTL的产生是必要的并且是足够的(Harding，F.A.andAllison，J.P.(1993)J.Exp.Med.1771791)。正如通过用抗CD40抗体抑制B7在正常和白血病B细胞上表达的研究所显示的，有人认为CD40的配体可能是B7的重要诱导物(Ranheim，E.A.and Kipps，T.J.(1993)J.Exp.Med.177925)。这些研究结果共同表明，抗gp39可能阻断CD4+T细胞与B细胞的相互作用，因而未能诱导B7的表达，也就不能供以使B细胞有效地激活T细胞以发生增殖并产生细胞因子。这些数据提示，CD4+T细胞是首先通过gp39和其配体CD40间的T-B细胞关联性相互作用诱导CTL形成所必需的。然后B细胞上CD40的发出信号致使B7/BB1上调。B7/BB1与其配体CD28在T细胞上的交互作用使T细胞增殖和细胞因子产生得以增强。但如果只向T细胞提供一个信号，即gp39与CD40相互作用的信号，而未得到第二个信号，则在T细胞中诱导了无反应性并使之变为耐受化的和无反应化的。
这些研究表明，当在小鼠体内诱发了aGVHD时，即获得抗H-2d反应。但如果用抗gp39处理动物则观察不到CTL反应。显然抗gp39正在以以前已描述的方法抑制CTL生成(Schultz，K.R.et al.(1990)Science 249)。B细胞没有通过CD40连接被激活并因此而不能促进CTL的诱导。此外，我们的研究显示当用P815细胞体外攻击脾细胞时，发现体内暴露于抗gp39的细胞不能发动二次抗H-2dCTL。因此，这可能表明抗gp39已诱导了对T细胞区室的耐受状态，因为gp39不能连接CD40，从而没有造成B7/BB1上调作用并因此使T细胞没有进一步被激活而仍是非反应性的。还了解到，除非被抗IgM抗体、PMA或LPS预激活，静息B细胞在混合的淋巴细胞反应中一般是同种异体T细胞的无效刺激物(Inaba，K.and Steinman，R.M.(1989)J.Exp.Med.1601717；Metley，J.P.et al.(1989)J.Exp.Med.169239；Frohman，M.and Cowing，C.(1985)J.Immunol.1342269)。另外，直接由B细胞体内呈递的可溶性单体抗原可导致特异性T细胞无反应性(Eynon，E.E.and Parker，D.(1992)J.Exp.Med.175131)。因此，似乎可以证明，依据所涉及的抗原和APC的施用方法的不同，可能诱导无反应性或耐受性。在P815细胞攻击脾脏的CD8+T细胞区室之后，抗原呈递即不需要B细胞，从而同种异体抗原可直接呈递并诱导CTL。脾脏对再次刺激无反应表明在该系统中已诱导了同种异体特异性耐受。
这一结果与以前的结果(Foy，T.M.et al.(1993)J.Exp.Med.1781567-1575)相反，后者表明在抗原特异性系统中抗体没有诱导耐受性。两个系统不同是因为呈递同种异体抗原的aGVHD模型已结合到抗原呈递细胞上，而就抗原特异性系统来说则施用了抗原并且已在体内被摄取、加工并由专职APC呈递。因此似乎抗gp39可依据所使用的抗原及呈递方法而可能有不同的作用。
可以认为，抗gp39可在免疫系统的CD4+和CD8+区室中诱导同种异体特异性耐受，并且考虑移植物免疫学和免疫治疗时这种耐受可能是明显有益的治疗干预。可以想象到为处理经受骨髓移植的病人，抗gp39治疗将足以诱导对移植物的耐受，并防止诱发如GVHD这样的移植物处理的后果。
实施例6抗gp39抗体的产生和性质鉴定实验1-抗人gp39抗体为了在人类受试对象体内诱导抗原特异性T细胞耐受，较好地可施用抗人gp39的抗体。使用下述方法学产生小鼠抗人gp39单克隆抗体。用加在完全弗氏佐剂(CFA)中的可溶性gp39融合蛋白质gp39-CD8免疫Balb/c小鼠。6周后用加在不完全弗氏佐剂(IFA)中的可溶性gp39-CD8再次攻击小鼠。第二次免疫后4周施用可溶形式的可溶性gp39-CD8。2周后用活化的人外周血淋巴细胞对小鼠进行加强免疫，然后再在2周后用可溶性gp39-CD8进行末次加强免疫。末次免疫后第4天按标准方法将脾细胞与NS-1融合对象融合。
基于多筛选方法选择产生抗人gp39抗体的克隆。首先使用gp39-CD8以平板结合试验筛选克隆。然后筛选抗对照CD8融合蛋白质，CD72-CD8的阳性克隆。除去在CD8-CD72平板结合试验中记录为阳性的克隆。然后用流式细胞计数分析法在静息和6小时活化的人外周血淋巴细胞(PBL)上筛选其余的克隆。着染被激活后，但非静息的PBL杂交瘤视为阳性。最后，试验其余的克隆检查它们阻断CD40Ig与平板结合之gp39结合的能力。
在平板结合试验中初次筛选约300个抗gp39-CD8和CD72-CD8的克隆。这些克隆中，发现30个可检出与平板结合的gp39并且不能检出CD8。然后筛选这些克隆用于在激活的人PBL上检测gp39。约15个克隆检测出了在活化的PBL，而不是静息细胞上的分子。经确定这些克隆阻断CD40Ig检测与平板结合之gp39的能力进一步证实特异性。在该试验中10个克隆中有3个阻断CD40Ig结合。这些克隆是3E4、2H5和2H8。这样的克隆较好用于本文所述方法中。还根据与活化的大鼠T细胞克隆POMC8的反应性筛选在活化的但非静息的PBL上试验阳性的克隆。克隆2H8表达了与该大鼠T细胞系的交叉反应性。
实验2-抗人gp39抗体使用如实验1中所述的相似的免疫程序产生另外的抗人gp39抗体。用加在CFA中的可溶性gp39-CD 8免疫一只Balb/c小鼠，4周后用6小时活化的人外周血淋巴细胞进行攻击。再用可溶性gp39-CD8加强免疫小鼠，4天后按标准方法将脾细胞与NS-1融合对象融合。经流式细胞法染色6小时活化的人PBL以筛选杂交瘤克隆。选择活化的但非静息的人PBL的着染克隆。选择4D9-8、4D9-9、24-31、24-43、89-76和89-79等6个克隆进行进一步分析。
用几种试验证实所选择之抗体的特异性。首先，流式细胞计数分析证明所有六种mAb品系均着染活化的但非静息的外周血T细胞(参见有代表性实例的图9B和9C，图示分别用4D9-8和4D9-9着染活化的T细胞)。由六种抗体中的每一种识别的分子表达可在激活后4小时内检测到，激活后6-8小时达到最大值，到激活后24小时即测不到。所有六种mAb均识别到在活化的CD3+PBL上表达的分子，且其中主要是CD4+表型，但一部分CD8+T细胞也表达该分子。同gp39的表达一样，培养基中存在环孢菌素A可抑制由六种mAb识别之分子的表达(参见图10A和10B所示的有代表性的实例，附图分别显示用4D9-8和4D9-9着染的经环孢菌素处理的T细胞)。如用人CD40Ig的融合蛋白质测得的，发现由这些mAb识别之分子表达的动力学和分布与gp39的完全相同。另外，所有六种mAb均阻断CD40Ig对gp39的着染(参见图11A和11B所示的有代表性的实例，附图分别显示在4D9-8和4D9-9存在下CD40Ig对gp39着染的抑制作用)。在ELISA试验中，所有六种mAb均识别一种可溶性融合蛋白质形式的gp39分子，即gp39-CD8。此外，所有六种mAb均从经35S-蛋氨酸标记的活化的人PBL中免疫沉淀一种约36Kd的分子。该免疫沉淀的分子与被人CD40Ig融合蛋白质沉淀的分子相同。
按下述方法检测六种选择的mAb(4D9-8、4D9-9、24-32、24-43、89-76和89-79)的功能活性。首先，检测mAb抑制加IL-4和可溶性gp39培养的纯化之人B细胞增殖的能力。在有或没有剂量为0至12.5μg/ml的纯化之单克隆抗体或CD40Ig存在下，加gp39和IL-4培养纯化的人B细胞。培养3天后以胸苷掺入法检测B细胞增殖情况。结果(如图12中所示)证明六种mAb均可抑制由gp39和IL-4诱导的B细胞增殖。在抑制被诱导的B细胞增殖方面，mAb 89-76和24-31是最有效的。89-76的IC50(抑制B细胞增殖达50％所需的抗体浓度)约为1μg/ml，24-31约为1.25μg/ml。
然后，检测由抗CD 3激活之T细胞和IL-2诱导的Ig产生量，以测出mAb抑制B细胞分化的能力。用FACS进行阳性选择以制备纯化的IgD+人B细胞，然后在有或没有剂量为0至10μg/ml的纯化之抗gp39单克隆抗体存在下，将细胞与抗CD3激活的人T细胞(丝裂霉素C处理的)和IL-2一起培养6天。于第6天以ELISA估测IgM、IgG和IgA产生量。结果(下列表3所示)证明，如根据IgM、IgG和IgA产生量所测知的，所有六种抗体均可抑制T细胞依赖性B细胞分化。所有六种mAb(包括24-31和89-76抗体)的IC50(抑制Ig产生达50％所需的抗体浓度)为1.0μg/ml至0.1μg/ml以下。
表3免疫球蛋白的产生量mAb μg/ml IgM IgG IgA无 17,500671044714D9-80.1 4813 213028191.0 4394 2558151910.01081 389 3964D9-90.1 3594 919 17311.0 2659 1233160610.0374 448 26624-310.1 3863 981 3441.0 1287 314 16510.01120 596 2324-430.1 6227 41324321.0 3193 2130192100 7021 1232108189-760.1 3783 10693441.0 2180 352 17110.0818 551 1989-790.1 9763 192430211.0 2314 460 15610.0183 135 434为了检验抗gp39 mAb对T细胞反应的影响，在标准混合淋巴细胞反应(MLR)中包括mAb。在有或没有抗gp39 mAb(10μg/ml)存在下，将300,000个人外周血淋巴细胞(反应细胞＝R)与100,000个经过照射的同种异体外周血淋巴细胞(刺激细胞＝S)一起培养。于第4、5或6天用3H-胸苷对培养物施加脉冲并在18小时后收获细胞。如用MLR方法测知的，所有六种抗人gp39 mAb均抑制同种异体特异性反应(参见图13所示的代表性实例，图中显示当在24-31或89-76存在下保温R和S时对同种异体特异性反应的抑制；使用CTLA 4-免疫球蛋白融合蛋白质和抗CD28mAb作为阳性对照)。
为了确定是否六种mAb识别人gp39分子上的不同表位，进行交叉阻断实验。首先用六种mAb中的每一种阻断激活的人PBL(25μg/ml未结合的抗体)。洗涤细胞并用10μg/ml生物素结合的抗体着染细胞，然后与植物刺酮碱(phytoerythrin)结合的抗生物素蛋白(PE-Av)反应。用FACS分析PE-Av着染的细胞。结果示于下列表4中。
表4阻断 着染抗体Ab 4D9-84D9-924-3124-4389-7689-79无 +++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++4D9-8ND -++++ ++++ +++ +++4D9-9+++ ND +++ ++++ +++ +++24-31++ND +++ ++ ++24-43+++++ ND ++ +89-76+++++ +++ ND +++89-79+++ +++ +++ +++ ND用+号代表染色强度和阳性细胞的百分比(++++＝MI＞200；+++＝MI＞125；++＝MI＞50；+＝MI＞25；-＝没有在本底以上着染。)ND＝未测。
所有抗体均阻断CD40Ig与活化的人PBL的结合。但表4中所示数据清楚地证明某些抗体阻断其他抗体与活化的人PBL结合的失败，提示它们识别人gp39分子上的不同表位。
分别产生89-76和24-31抗体的89-76和24-31杂交瘤已按布达佩斯条约的有关规定于1994年9月2日保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Parklawn Drive，Rockville，Md.)。89-76杂交瘤保藏登记号为ATCC No.＿＿，24-31杂交瘤保藏登记号为ATCC No.＿＿。24-31和89-76抗体是IgG1同种型的。
实验3-抗小鼠gp39抗体在本发明的一个实施方案中，gp39拮抗物是抗小鼠gp39单克隆抗体MR1。使用下述方法产生MR1单克隆抗体，并且该方法也可用于产生其他抗gp39抗体。
经腹腔内注射，以周为间隔用5-106个活化的Th1细胞(d1.6)免疫仓鼠共6周。当抗小鼠Th1的血清滴度大于约1∶10,000时，用免疫仓鼠脾细胞和NS-1在聚乙二醇作用下进行细胞融合。用流式细胞计算法在静息和活化的Th1上筛选得自含生长的杂交瘤之小孔中的上清液。进一步试验一个产生选择性识别被活化Th之Mab的特定杂交瘤，并亚克隆之以产生MR1。在腹水中产生MR1并经离子交换HPLC纯化之。杂交瘤MR1已保藏在美国典型培养物保藏中心，保藏登记号为HB11048。
等同物本领域技术人员将会理解到，或者能够使用常规实验方法确定许多本文所述的本发明特定实施方案的等同物。这些等同物也将包括在本发明权利要求范围内。本申请通篇所列的参考文献、已公布专利申请的内容均列入本文以供参考。
权利要求
1.IgG1同种型的抗人gp39单克隆抗体。
2.如权利要求1的抗人gp39单克隆抗体，其在标准的体外试验中以大约0.01至5.0μg/ml的IC50值抑制B细胞增殖。
3.如权利要求2的抗人gp39单克隆抗体，其在标准的体外试验中以大约0.1至2.5μg/ml的IC50值抑制B细胞增殖。
4.如权利要求3的抗人gp39单克隆抗体，其在标准的体外试验中以大约0.1至1.25μg/ml的IC50值抑制B细胞增殖。
5.如权利要求2的抗人gp39单克隆抗体，其中B细胞增殖是体外用白细胞介素4和可溶性gp39处理B细胞而诱导的。
6.如权利要求1的抗人gp39单克隆抗体，其在标准的体外试验中以大约0.01至1.0μg/ml的IC50值抑制B细胞产生IgM、IgG或IgA。
7.如权利要求6的抗人gp39单克隆抗体，其在标准的体外试验中以大约0.01至0.1μg/ml的IC50值抑制B细胞产生IgM、IgG或IgA。
8.如权利要求6的抗人gp39单克隆抗体，其中B细胞产生IgM、IgG或IgA是经培养B细胞与抗CD3活化的T细胞而被诱导的。
9.与被选自下列一组中的单克隆抗体识别的表位结合的抗人gp39单克隆抗体单克隆抗体3E4、单克隆抗体2H5、单克隆抗体2H8、单克隆抗体4D9-8、单克隆抗体4D9-9、单克隆抗体24-31、单克隆抗体24-43、单克隆抗体89-76、和单克隆抗体89-79。
10.如权利要求9的抗人gp39单克隆抗体，其与由单克隆抗体24-31识别的表位结合。
11.如权利要求10的抗人gp39单克隆抗体，其为单克隆抗体24-31。
12.ATCC保藏登记号为No＿＿的杂交瘤24-31。
13.由权利要求12的杂交瘤产生的单克隆抗体24-31。
14.如权利要求9的抗人gp39单克隆抗体，其与由单克隆抗体89-76识别的表位结合。
15.如权利要求14的抗人gp39单克隆抗体，其为单克隆抗体89-76。
16.ATCC保藏登记号为No.＿＿的杂交瘤89-76。
17.由权利要求16的杂交瘤产生的单克隆抗体89-76。
18.包含权利要求1之抗人gp39单克隆抗体和药学上可接受之载体的药物组合物。
19.包含权利要求9之抗人gp39单克隆抗体和药学上可接受之载体的药物组合物。
20.包含权利要求13之单克隆抗体24-31和药学上可接受之载体的药物组合物。
21.包含权利要求17之单克隆抗体89-76和药学上可接受之载体的药物组合物。
全文摘要
本发明公开了与蛋白质gp39(也称为CD40配体)结合的抗体。这些抗体较好是IgG1同种型并与人gp39结合的单克隆抗体。在一优选实施方案中，本发明的抗体与由杂交瘤24-31(ATCC保藏登记号No.——)产生的单克隆抗体24-31识别的表位结合，或者与由杂交瘤89-76(ATCC保藏登记号No.——)产生的单克隆抗体89-76识别的表位结合。本发明还公开了包含本发明抗体的药物组合物。本发明的抗体可用于抑制B细胞增殖和分化，抑制T细胞反应以诱导T细胞耐受。本发明还包括编码抗gp39抗体的核酸分子或其部分，以及掺入所说核酸分子的表达载体和宿主细胞。
文档编号A61K38/17GK1149299SQ94193918
公开日1997年5月7日 申请日期1994年9月2日 优先权日1993年9月2日
发明者R·J·内勒, T·M·富瓦, A·阿鲁夫福, J·A·莱德欠特 申请人:达特茅斯学院理事, 布里斯托尔-迈尔斯斯奎布公司