一种etec卵黄抗体粉及其制备方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及食品加工领域，尤其涉及一种ETEC卵黄抗体粉及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 仔猪腹泻是困扰养猪业的一种典型的多因素性疾病，给养猪业带来巨大经济损 失，而由大肠杆菌引起的仔猪腹泻是其中危害较为严重的一种。仔猪大肠杆菌性腹泻的主 要病原为肠毒素性大肠杆菌(￡]1丨61'〇1：(?18611；[0￡801161'；[01113001；[，￡1￡0，￡1￡(]的致病作用 主要由肠毒素和黏附素性菌毛等两类毒力因子共同构成，其主要的致病环节是ETEC通过黏 附素性菌毛与小肠黏膜上皮细胞上的特异性的受体相结合，继而增殖并产生大量毒素引起 小肠吸收分泌功能失常而导致腹泻。通过母乳获得抗体，可以较好的防治仔猪ETEC感染性 腹泻。但仔猪获得母乳抗体受多方面因素的影响，抗体在断奶后将很快消失，高免血清价格 昂贵，抗生素治疗常引发细菌耐药性等问题。
[0003] 因此，现有技术还有待于改进和发展。
【发明内容】
[0004] 鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种ETEC卵黄抗体粉及其制备 方法，旨在解决现有抗体在断奶后将很快消失，尚免血清价格昂贵，抗生素治疗常引发细菌 耐药性的问题。
[0005] 本发明的技术方案如下： 一种ETEC卵黄抗体粉的制备方法，其中，包括步骤： A、 将大肠杆菌菌株在固体培养基35-40°C下培养18-24h; B、 培养完后从固体培养基中粗提菌毛蛋白，并对粗提的菌毛蛋白进行纯化； C、 将纯化后的菌毛蛋白与等体积的弗氏佐剂混合成油乳疫苗，然后用油乳疫苗免疫初 产母鸡，免疫后收集血清和卵黄抗体； D、 利用喷粉机将卵黄抗体进行喷雾干燥，制成卵黄抗体粉。
[0006] 所述的ETEC卵黄抗体粉的制备方法，其中，步骤A中，所述大肠杆菌菌株包括987P菌 株、K99菌株和K 88菌株;所述987P菌株、K99菌株和K88菌株对应的固体培养基分别为Slanctz固 体培养基、Minca固体培养基和Slanctz固体培养基。
[0007] 所述的ETEC卵黄抗体粉的制备方法，其中，步骤B中，从固体培养基中粗提菌毛蛋 白的步骤具体包括:用生理盐水清洗由固体培养基培养的菌苔，然后离心，离心后的沉淀悬 浮在生理盐水中，再离心2-4次;再将离心后的沉淀物悬浮于含尿素的roS缓冲液中，水浴中 震动25-35min脱去沉淀物上的细菌，再在16000-180001'/111；[11的条件下离心10-15111；[11，去细 菌沉淀，得到的上清即为粗提的菌毛蛋白。
[0008] 所述的ETEC卵黄抗体粉的制备方法，其中，步骤B中，对粗提的菌毛蛋白进行纯化 的步骤具体包括:将粗提的菌毛蛋白在磁力搅拌的情况下，缓慢加入固体硫酸铵使之达到 质量占比为25-35%，2-4°C放置沉淀过夜;将沉淀好的菌毛蛋白离心并收集沉淀，然后将沉 淀溶于含尿素的Tris-Hcl缓冲液中，并用相同的缓冲液搅拌透析46-50小时，更换透析液2-3次，除去硫酸铵，即为纯化后的菌毛蛋白。
[0009] 所述的ETEC卵黄抗体粉的制备方法，其中，用油乳疫苗免疫初产母鸡的方法为:对 初产母鸡进行多点注射油乳疫苗共2-2.5mL。
[0010] 所述的ETEC卵黄抗体粉的制备方法，其中，注射的次数为三次，所述三次的间隔时 间为一免间隔两周后进行二免，二免间隔两周后进行三免。
[0011] 所述的ETEC卵黄抗体粉的制备方法，其中，免疫后收集血清和卵黄抗体的步骤具 体包括:血液样本采集后于37°C放置1小时后于4°C存放过夜，次日取出抽取上清液-20°C保 存待测;鸡蛋打破后，除去卵白和卵黄膜，以1:9的质量比例加入单蒸水置于搅拌器中搅拌 均匀，于4°C沉淀过夜，取上清液既为脱脂卵黄抗体，加入适量庆大霉素，-20°C保存卵黄抗 体。
[0012] 所述的ETEC卵黄抗体粉的制备方法，其中，步骤C中还包括:采用ELISA方法测定卵 黄抗体效价。
[0013]所述的ETEC卵黄抗体粉的制备方法，其中，步骤D具体包括:利用喷粉机将卵黄抗 体以入口温度为160-180°C，出口温度为70-75°C进行喷雾干燥，制成卵黄抗体粉。
[0014] 一种ETEC卵黄抗体粉，其中，采用如上任一所述的ETEC卵黄抗体粉的制备方法制 备而成。
[0015] 有益效果：ELISA方法分析免疫后卵黄抗体效价，发现以纯化菌毛蛋白作为抗原 进行免疫，能获得较高效价的卵黄抗体。利用喷粉机，将卵黄抗体液进行喷雾干燥，制备卵 黄抗体粉剂后，抗体效价仅下降了一个倍比度，卵黄抗体具有很好的高温稳定性，喷雾干燥 法制粉工艺适用于卵黄抗体粉的生产。
【附图说明】
[0016] 图1为大肠杆菌K88菌株相应培养基的菌毛蛋白SDS电泳图。
[0017]图2为大肠杆菌K99菌株相应培养基的菌毛蛋白SDS电泳图。
[0018]图3为大肠杆菌987P菌株相应培养基的菌毛蛋白SDS电泳图。
【具体实施方式】
[0019]本发明提供一种ETEC卵黄抗体粉及其制备方法，为使本发明的目的、技术方案及 效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例 仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0020] 本发明提供一种ETEC卵黄抗体粉的制备方法，其中，包括步骤： A、 将大肠杆菌菌株在固体培养基35-40°C下培养18-24h; B、 培养完后从固体培养基中粗提菌毛蛋白，并对粗提的菌毛蛋白进行纯化； C、 将纯化后的菌毛蛋白与等体积的弗氏佐剂混合成油乳疫苗，然后用油乳疫苗免疫初 产母鸡，免疫后收集血清和卵黄抗体； D、 利用喷粉机将卵黄抗体进行喷雾干燥，制成卵黄抗体粉。
[0021] 进一步地，步骤A中，所述大肠杆菌菌株包括987P菌株、K99菌株和K 88菌株;所述987P 菌株、K99菌株和K88菌株对应的固体培养基分别为Slanctz固体培养基、Minca固体培养基和 Slanctz固体培养基。本发明上述987P菌株、K99菌株和K88菌株三者均为市购产品。
[0022]进一步地，步骤B中，从固体培养基中粗提菌毛蛋白的步骤具体包括：用生理盐水 清洗由固体培养基培养的菌苔，然后离心，离心后的沉淀悬浮在生理盐水中，再离心2-4次； 再将离心后的沉淀物悬浮于含尿素的PBS缓冲液中，水浴中震动25-35min脱去沉淀物上的 细菌，再在16000-18000r/min的条件下离心10-15min，去细菌沉淀，得到的上清即为粗提的 囷毛蛋白。
[0023] 进一步地，步骤B中，对粗提的菌毛蛋白进行纯化的步骤具体包括:将粗提的菌毛 蛋白在磁力搅拌的情况下，缓慢加入固体硫酸铵使之达到质量占比为25-35%，2_4°C放置 沉淀过夜;将沉淀好的菌毛蛋白离心并收集沉淀，然后将沉淀溶于含尿素的Tris-Hcl缓冲 液中，并用相同的缓冲液搅拌透析46-50小时，更换透析液2-3次，除去硫酸铵，即为纯化后 的菌毛蛋白。
[0024] 进一步地，用油乳疫苗免疫初产母鸡的方法为:对初产母鸡进行多点注射油乳疫 苗共2-2.5mL。进一步地，注射的次数为三次，所述三次的间隔时间为一免间隔两周后进行 二免，二免间隔两周后进行三免。
[0025] 进一步地，免疫后收集血清和卵黄抗体的步骤具体包括:血液样本采集后于37°C 放置1小时后于4 °C存放过夜，次日取出抽取上清液-20 °C保存待测;鸡蛋打破后，除去卵白 和卵黄膜，以1:9的质量比例加入单蒸水置于搅拌器中搅拌均匀，于4°C沉淀过夜，取上清液 既为脱脂卵黄抗体，加入适量庆大霉素，_20°C保存卵黄抗体。
[0026] 进一步地，步骤C中还包括:采用ELISA方法测定卵黄抗体效价。ELISA方法分析免 疫后卵黄抗体效价，发现以纯化菌毛蛋白作为抗原进行免疫，能获得较高效价的卵黄抗体。
[0027] 进一步地，步骤D具体包括:利用喷粉机将卵黄抗体以入口温度为160-180°C，出口 温度为70-75 °C进行喷雾干燥，制成卵黄抗体粉。
[0028]基于上述方法，本发明还提供一种ETEC卵黄抗体粉，其中，采用如上任一所述的 ETEC卵黄抗体粉的制备方法制备而成。ELISA方法分析免疫后卵黄抗体效价，发现以纯化菌 毛蛋白作为抗原进行免疫，能获得较高效价的卵黄抗体。利用喷粉机，将液体状的卵黄抗体 进行喷雾干燥，制备卵黄抗体粉剂后，抗体效价仅下降了 一个倍比度，卵黄抗体具有很好的 高温稳定性，喷雾干燥法制粉工艺适用于卵黄抗体粉的生产。
[0029] 下面通过具体实施例对本发明进行详细说明。
[0030] (1)、菌毛蛋白的生长 987P菌株在Slanctz固体培养基37 °C下培养24小时获得高表达量的菌毛蛋白；K99菌株 在Minca固体培养基37°C下培养22小时获得高表达量的菌毛蛋白；K88在Slanctz固体培养基 37°C下培养18小时获得高表达量的菌毛蛋白。
[0031] (2)、菌毛蛋白的粗提与纯化 粗提:用2mL生理盐水洗下由固体培养基培养的菌苔，8000r/min离心10