标准孔7孔，依次加入100yL不同 浓度的标准品（见试剂准备⑵），空白孔加l〇〇yL(见试剂准备⑵），余孔加待测样品100yL， 37°C温育2小时，细胞周期因子Y将与预包被在酶标板表面的单克隆抗体相结合。
[0179] (2)弃去液体，甩干，每孔用350yL的洗涤液洗涤，浸泡1-2分钟，吸去（不可触及板 壁)或甩掉酶标板内的液体，在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次(也可轻 拍将孔内液体拍干），洗板3次，最后一次洗涤后，要把孔内的洗涤液完全甩干。自动洗板机 亦可。
[0180] (3)向步骤(2)得到的酶标板中，每孔加入检测抗体100yl，37°C温育1小时。检测抗 体与第一次孵育中被捕获的细胞周期因子γ结合。
[0181] (4)弃去步骤(3)得到酶标板中的液体，甩干，洗板5次，方法同步骤(2)。
[0182] (5)向步骤(4)得到的酶标板中，每孔加入辣根过氧化物酶标抗体100yl，37°C温育 1小时，辣根过氧化物酶标抗体与上一步中的检测抗体相结合，形成一个4组分的夹心形状 的结合物。
[0183] (6)弃去步骤(5)得到酶标板中的液体，甩干，洗板5次，方法同步骤(2)。
[0184] (7)将底物显色液A和底物显色液B等体积充分混匀后，向步骤(6)得到的酶标板 中，每孔加入90yl，37°C避光显色，10-20分钟，不要超过30分钟，孔内液体在辣根过氧化物 酶的催化下转化成蓝色，当标准孔的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显时，即 可终止
[0185](8)向步骤(7)得到的酶标板中，每孔加终止溶液50yL，终止反应，此时蓝色立转黄 色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。如出现颜色不匀一，请轻轻晃动 酶标板以使溶液混合均匀。
[0186] (9)在确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在450nm波长测量各孔 的光密度(O.D.值）。
[0187] 4、计算：
[0188] 各标准品及样本0D值扣除空白孔0D值后作图，如设置复孔，则应取其平均值计算。 以标准品的浓度为纵坐标(或对数坐标），0D值为横坐标(或对数坐标），绘出标准曲线(最佳 方程式应依回归方程计算的R2值来定，以R2值越趋近于1为好），标准曲线的示意图如图3所 示。推荐使用专业制作曲线软件进行分析，如curveexpert1.30,根据样品0D值，由标准曲 线查出相应的浓度，乘以稀释倍数，或用标准物的浓度与0D值计算出标准曲线的回归方程 式，将样品的0D值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。所 提供的标准曲线仅供参考，实验者需要根据自已的实验建立标准曲线。
[0189] 在本说明书的描述中，参考术语"一个实施例"、"一些实施例"、"示例"、"具体示 例"、或"一些示例"等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特 点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不 一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何 的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0190]尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解:在不 脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本 发明的范围由权利要求及其等同物限定。
【主权项】
1. 一种分离的多肽，所述多肽具有SEQIDNO: 1所示氨基酸序列。2. -种单克隆抗体，所述单克隆抗体的识别表位是SEQIDN0:1所示氨基酸序列。3. 根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为鼠源性单克隆抗 体。4. 一种制备权利要求2或3所述的单克隆抗体的方法，其特征在于，包括： 将权利要求1所述的多肽与KLH载体蛋白进行连接，以便得到载体-多肽连接体溶液； 将所述载体-多肽连接体溶液与弗氏佐剂混合并乳化，以便得到免疫乳剂； 利用所述免疫乳剂对哺乳动物进行初次免疫，以便得到初次免疫后的哺乳动物； 利用所述免疫乳剂对所述初次免疫后的哺乳动物进行加强免疫，以便得到加强免疫后 的哺乳动物； 提取所述加强免疫后的哺乳动物的脾细胞，并将所述脾细胞与骨髓瘤细胞融合，以便 得到杂交瘤细胞； 将所述杂交瘤细胞腹腔接种至经降植烷预处理的哺乳动物，其中，每只哺乳动物接种 的所述杂交瘤细胞的数量为5.0X106_5.0X107，以便得到腹水;以及 将所述腹水进行纯化，以便获得所述单克隆抗体。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述载体-多肽连接体溶液的浓度为3毫 克/_升， 任选地，所述载体-多肽连接体溶液与所述弗氏佐剂的体积比为1:1。6. -种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括固相载体，其中，所述固相载体上携带权 利要求2或3所述的单克隆抗体。7. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括:识别细胞周期因子Y的多克 隆抗体， 任选地，所述多克隆抗体为兔源性细胞周期因子Y多克隆抗体， 任选地，所述多克隆抗体的浓度为100-300微克/毫升。8. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括:细胞周期因子Y标准品、标 准品稀释液、辣根酶标记抗体、辣根酶标记抗体稀释液、洗涤浓缩液、底物显色液和终止液， 任选地，所述细胞周期因子Y标准品的成份为:0.01-0.03微克细胞周期因子Y; 所述标准品稀释液的成份为：基于20毫升所述标准品稀释液，含有0.05-0.15克的NaCl，0 · 003-0 · 008克的KC1，0 · 003-0 · 007克的KH2P〇4和0 · 02-0 · 05克的Na2HP〇4; 所述辣根酶标记抗体的成份为:〇. 1-0.3微克/毫升辣根酶标记的羊抗兔IgG; 所述辣根酶标记抗体稀释液的成份为:基于20毫升所述辣根酶标记抗体稀释液，含有 0 · 05-0 · 15克的NaCl，0 · 002-0 · 008克的KC1，0 · 003-0 · 007克的KH2P〇4和0 · 02-0 · 05克的 Na2HP〇4； 所述洗涤浓缩液的成份为:基于20毫升所述洗涤浓缩液，含有1-3克的NaCl，含有0.05-〇 · 15克的KC1，0 · 05-0 · 15克的KH2P〇4,0 · 5-1 克的Na2HP〇4 和 200-600微升的吐温-20; 所述底物显色液包括底物显色液A和底物显色液B，其中，所述底物显色液A的成份为： 基于5毫升所述底物显色液A，含有0.1-0.15克的醋酸钠，0.01-0.02克的柠檬酸和1-5微升 的体积百分浓度为30 %的H2〇2;所述底物显色液B的成份为:基于5毫升所述底物显色液B，含 有0.001-0.003克的EDTA-钠，0.005-0.015克的柠檬酸，0.3-0.8毫升的丙三醇和0.001- 0.003克的四甲基联苯胺；以及 所述终止液的成份为：l-3mol/LH2S〇4溶液。9. 一种用于检测细胞周期因子Y的方法，其特征在于，包括： (1) 包被权利要求2或3所述的单克隆抗体至试剂板，4°C过夜后洗板，以便得到包被所 述单克隆抗体的固相载体； (2) 向所述包被细胞周期因子Y的固相载体中加入2-10%胎牛血清封闭液，4°C封闭过 夜后洗板，以便得到封闭后的固相载体； (3) 将细胞周期因子Y和待检测的样品进行梯度稀释，并加入到所述封闭后的固相载体 中，孵育后洗板； (4) 向步骤(3)得到的固相载体中加入识别所述细胞周期因子Y的多克隆抗体，孵育后 洗板； (5) 向步骤(4)得到的固相载体中加入辣根酶标记抗体，孵育后洗板； (6) 向步骤(5)得到的固相载体中加入底物显色液；以及 (7) 向步骤（4)得到的固相载体中加入终止液，终止反应，检测0D450的值，通过分析 0D450值的大小，判断人细胞周期因子Y的浓度。10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述多克隆抗体为兔源性细胞周期因子Y 多克隆抗体， 任选地，所述多克隆抗体的浓度为100-300yg/ml， 任选地，所述辣根酶标记抗体为辣根酶标记的羊抗兔IgG， 任选地，所述方法是利用权利要求6-8任一项所述的试剂盒进行的。
【专利摘要】本发明公开了一种分离的多肽、单克隆抗体及其制备方法以及用于检测血清中细胞周期因子Y的试剂盒和方法。其中，多肽具有SEQ？ID？NO：1所示氨基酸序列、利用该多肽制备单克隆抗体，利用该单克隆抗体包被试剂板，进而制备用于检测血清中细胞周期因子Y的试剂盒，并利用包被单克隆抗体的试剂板检测血清中细胞周期因子Y。
【IPC分类】G01N33/574, G01N33/535, G01N33/577, G01N33/68, C07K14/47, C07K16/18
【公开号】CN105461793
【申请号】CN201510809763
【发明人】岳文涛, 滕宇, 马丽, 赵晓婷, 江妹, 王子宇
【申请人】首都医科大学附属北京胸科医院, 北京市结核病胸部肿瘤研究所
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2015年11月20日