Myb99蛋白及其编码基因在调控植物种子萌发中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，涉及一种MYB99蛋白及其编码基因在调控植物种子萌 发中的应用。
【背景技术】
[0002] 植物激素脱落酸(abscisicacid，ABA)早在20世纪60年代被人们发现，因其具有 促进植物叶片脱落而得名。ΑΒΑ是一种重要的植物激素，在种子休眠、种子萌发、幼苗生长、 气孔运动以及营养生长向生殖生长转换等植物生长发育过程中均发挥着重要作用；同时， ΑΒΑ在植物应对外界各种逆境胁迫响应中也起着重要作用，例如干旱、高盐、冷等非生物胁 迫以及病虫害等生物胁迫。
[0003] 近20年里，对ΑΒΑ信号转导的研究取得了很多重大的进展，大量的ΑΒΑ信号通路调 节组分被发现，包括蛋白激酶、蛋白磷酸酶、伴侣蛋白、Ε3连接酶以及各种类型转录因子等 等；同时，几类ΑΒΑ受体也相继被发现，这些发现有力推动了植物中ΑΒΑ信号转导调控机理的 阐明。目前为止，研究人员分别鉴定出了三种不同的ΑΒΑ受体:镁螯合酶Η亚基CHLH/ABAR、G 蛋白偶联受体GTG1和GTG2以及START超家族中的PYR/PYL/RCAR受体。ABAR/CHLH是植物中第 一个被鉴定出来的ΑΒΑ受体；后续的研究发现:ABAR/CHLH介导的ΑΒΑ信号通路非常复杂，转 录因子WRKY18/40/60和伴侣蛋白CPN20被报道参与其中。
[0004] ΜΥΒ类转录因子家族是指含有ΜΥΒ结构域的一类转录因子。ΜΥΒ结构域通常含有1-4 个不完全重复的氨基酸序列(R)，每一个重复序列R中大约有52个氨基酸，形成3个α螺旋;根 据含有R的多少，ΜΥΒ家族转录因子被分为四类，1R-、R2R3-、3R-和4RΜΥΒ转录因子。目前为 止，拟南芥中已鉴定出超过200个以上MYB转录因子，其中含有两个MYB结构域的R2R3-MYB成 员最多。MYB转录因子在动植物中都存在，玉米的ClorlessKCl)基因是植物中第一个被分 离鉴定的MYB转录因子。MYB转录因子广泛参与调控植物响应外界各种逆境胁迫、植物次生 代谢调控、细胞形态发生、胁迫应答、分生组织形成及细胞周期控制等。目前为止，拟南芥中 已发现的参与ΑΒΑ信号通路中的MYB转录因子有：MYB2、MYB7、MYB15、MYB20、MYB30、MYB33、 MYB44、MYB52、MYB96和MYB101;这10个参与调节ΑΒΑ信号转导的MYB转录因子中，只有MYB7、 MYB20和MYB30是负调节子，其余均为正调节子。MYB99在拟南芥tair网站上的基因号为 AT5G62320(https: //www.arabidopsis ·org/)，MYB99被报道参与调节苯丙素代谢。
[0005]植物对ΑΒΑ信号的响应水平还与种子胎萌相关。种子胎萌是指种子收获前早萌现 象，泛指种子收获前在田间母体植株上发芽的现象。水稻、小麦、油菜、玉米等禾本科植物， 收获时如遇雨和高温，种子收获前在田间母体植株上会出现提前发芽的胎萌现象，胎萌会 消耗种子部分营养和贮藏物质，致使种子食用品质、贮藏品质下降，严重劣化了种子的品 质、种用价值和耐贮性，将给农业生产造成较大的损失。种子的胎萌现象取决于种子的休眠 特性，而ΑΒΑ是调控种子休眠的主要因素，对ΑΒΑ反应不敏感可导致种子胎萌的发生;相反， 对ΑΒΑ反应敏感可抑制种子胎萌的发生。
[0006]随着ΑΒΑ信号传导研究的深入及应用的拓展，如何利用发现的正负调节因子改变 植物对ΑΒΑ信号的响应水平，控制植物种子萌发、避免胎萌现象、提高种子品质和耐贮性成 为研究前沿。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种ΜΥΒ99蛋白及其编码基因在调控植物种子萌发中的应 用。
[0008] 本发明所提供的应用，具体为如下Α或Β:
[0009]A:由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质(MYB99蛋白）在如下al)或a2)中的应用：
[0010] al)提高植物的胎萌抗性(或降低植物种子的萌发速率）；
[0011] a2)选育胎萌抗性提高的植物品种(或选育种子萌发速率降低的植物品种）。
[0012] B:由序列表中序列3所不的氣基酸序列组成的蛋白质(MYB99蛋白）的编码基因在 如下al)或a2)中的应用：
[0013] al)调控植物的胎萌抗性(或调控植物种子的萌发速率）；
[0014] a2)选育胎萌抗性提高的植物品种(或选育种子萌发速率降低的植物品种）。
[0015]在本发明中，以上a2)中的所述选育胎萌抗性提高的植物品种(或选育种子萌发速 率降低的植物品种)的方法，具体可包括将所述MYB99蛋白表达量较高的植株作为亲本进行 杂交的步骤。
[0016]本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
[0017]本发明所提供的培育转基因植物的方法，为培育胎萌抗性提高的转基因植物的方 法(或培育种子萌发速率降低的转基因植物的方法），具体可包括如下步骤：向受体植物中 导入由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到转基因植物;所述 转基因植物与所述受体植物相比胎萌抗性提高(或种子萌发速率降低）；
[0018]在上述应用或方法中，所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的 编码基因（即MYB99基因）是如下1)至5)中任一所述的DNA分子：
[0019] 1)编码序列为序列表中序列2自5'末端第148至885位核苷酸所示的DNA分子；
[0020] 2)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0021] 3)序列表中序列1所示的DNA分子；
[0022] 4)在严格条件下与1)-3)任一所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列3所示 的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子；
[0023] 5)与1)-4)任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码由序列表中序列3所示 的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。
[0024] 上述严格条件可为用6 X SSC，0.5 % SDS的溶液，在65°C下杂交，然后用2 X SSC， 0 · 1 % SDS和 1 X SSC，0· 1 % SDS各洗膜一次。
[0025]其中，序列1由1218个核苷酸组成，为所述MYB99基因在拟南芥基因组中序列，其中435-598位为内含子序列；序列2由1054个核苷酸组成，为所述MYB99基因的cDNA序列，其中 第148-885位为编码序列(0RF);序列1和序列2均编码序列表中序列3所示的蛋白质，序列3 由245个氨基酸残基组成。
[0026]在所述方法中，所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基 因是通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述受体植物中的。
[0027] 所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农 杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA-1 300-221、pGreen0029、 pCAMBIA3301、pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。 所述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它 参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体 的3'端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强 型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因 1]1^911；[1:;[11启动子化1]13；〇、胁迫诱导型启动子1(1294等，它们可单独使用或与其它的植物启 动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译 增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但 必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密 码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区 域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载 体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具 有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接 以逆境筛选转化植株。
[0028]在本发明中，所述重组表达载体中启动所述蛋白质的编码基因转录的启动子为 35S启动子。
[0029]更为具体的，所述重组表达载体为将所述MYB99基因插入pCAMBIA-1300-221载体 的多克隆位点XbaI与ΚρηI之间后得到的重组质粒。
[0030]在上述方法中，将携带有所述ΜΥΒ99基因的所述重组表达载体导入所述受体植物， 具体可为:通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌 介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
[0031]本发明的再一个目的是提供一种降低植物种子萌发速率的方法。
[0032]本发明所提供的降低植物种子萌发速