、0E5和0E6的纯合系植株，作为实验材料进行后续试验分析。
[0067] 三、转基因拟南芥0E1、0E2、0E5和0E6纯合系中MYB99基因表达量分析
[0068] 提取拟南芥野生型（Col-Ο生态型）及过表达植株0E1、0E2、0E5和0E6的总RNA，利用 实时荧光定量PCR检测材料中MYB99基因在转录水平上表达情况。具体如下：
[0069] 1、转录水平分析(RNA表达量）
[0070] 以上述获得的转基因拟南芥0E1、0E2、0E5和0E6纯合系以及拟南芥野生型（Col-0 生态型）平皿中生长12天的幼苗做为实验材料。提取各实验材料的总RNA，反转录成单链cDNA，然后通过实时荧光定量PCR方法分析MYB99基因在各实验材料中的表达情况。
[0071]其中，扩增MYB99基因的引物序列为：
[0072] MYB99RT-F1:5'-CATTGATCTTCATGCTCGCCTTG-3'（序列2的第405-427位）；
[0073] MYB99RT-R1:5 ' -TGACCAATATCGTTTCCTCCTCGTT-3'（序列2的第574-598位的反向互 补序列）。
[0074]以Actin2/8作为内参基因，扩增内参Actin的引物序列为：
[0075]Actin-F:5 '-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3'；
[0076]Actin-R:5'-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3'。
[0077]上述引物的反应条件如下：
[0078] (1)反应体系的建立
[0079]实时荧光定量PCR反应体系
[0081 ] (2)三个重复，轻甩混匀，用Bio-RadCFX96荧光定量PCR仪进行实验。
[0082] (3)反应程序的设定：
[0083] 实时荧光定量PCR反应程序
[0086] (4)数值分析，以作为衡量基因转录水平的相对差值，对各个基因的表达进行 分析比较。Ct值为PCR反应荧光信号达到设定阈值时的循环数，△Ct值为特异引物Ct值与Actin2/8引物Ct值之差。
[0087] MYB99过表达株系的实时荧光定量PCR检测结果如图1和图3所示，MYB99基因的表 达均为相对值，图1中以拟南芥野生型(Co 1 -0)中MYB99基因的表达为1;图3中将0E6中MYB99 基因的表达为100。从图中可以看出，相比拟南芥野生型(Col-ο)，步骤二获得的转基因拟南 芥ΟΕ1、ΟΕ2、ΟΕ5和OE6中MYB99mRNA表达量均显著高于野生型(Col-ο)中。
[0088]实施例2、MYB99转基因植物种子萌发分析试验[0089]一、ΑΒΑ对MYB99过表达株系种子萌发的影响
[0090] ΑΒΑ在促进种子休眠、抑制种子萌发中发挥重要调节作用。遗传学研究表明，种子 萌发过程中发生的染色质重建及组蛋白甲基化、去乙酰化等过程均受ΑΒΑ调节。随着外源 ΑΒΑ浓度的增加，拟南芥野生型(Col-Ο生态型）种子的萌发率会逐渐降低。统计种子萌发实 验是研究ΑΒΑ信号转导的重要方法之一。实验重复3次。
[0091]以拟南芥野生型(Col-Ο生态型)及实施例1得到的单拷贝插入的Τ3代纯合体ΜΥΒ99 转基因株系0Ε1、0Ε2、0Ε5和0Ε6为实验材料。将各实验材料的种子播种在含有不同浓度ΑΒΑ 的MS培养基上(ΟμΜ，〇 . 5μΜ，ΙμΜ和3μΜ)(每种实验材料播种80-100粒）。4°(3下低温层积3 天后移入光照培养箱中。记录野生型(Col-Ο生态型)及ΜΥΒ99转基因株系(0Ε1和0Ε5)种子在 层积后24h到72h之间的萌发数，每隔12h记录一次，并对结果进行统计；另外，记录野生型 (Col-Ο生态型）及MYB99转基因株系（ΟΕ1、ΟΕ2、ΟΕ5和OE6)种子在层积后第48h时的萌发数。 实验同时设置实施例1中得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的植株[Col-0(35SGFP)]作 为对照。t检验用于分析差异显著性(*?〈0.05，**卩〈0.01)。实验重复3次，结果取平均值。 [0092]野生型（Col-Ο生态型）及MYB99转基因株系（0E1和0E5)种子在层积后24h到72h之 间的萌发数统计结果如图2所示，在含有ΟμΜΑΒΑ的培养基上，转基因株系0E1和0E5相对于 野生型(Col-Ο生态型）种子萌发速率变慢。但是，在含有不同浓度ΑΒΑ的培养基上，实施例1 得到的单拷贝插入的Τ3代纯合体ΜΥΒ99转基因株系(0Ε1和0Ε5)相对于拟南芥野生型(Col-0 生态型）种子萌发速率更慢，均明显的表现出ΑΒΑ超敏的表型(胎萌抗性增强）。而对于实施 例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株，无论是在含有ΟμΜΑΒΑ的培养基上， 还是在含有不同浓度ΑΒΑ的培养基上，其种子萌发情况均与拟南芥野生型(Col-Ο生态型)基 本一致，无统计学差异。以上结果显示：转基因株系0E1和0E5在种子萌发过程中表现出对 ΑΒΑ超敏的表型；因此，转基因株系0E1和0E5对胎萌抗性增强。
[0093]另外，利用一系列ΜΥΒ99过表达株系(0Ε1、0Ε2、0Ε5和0Ε6)，研究发现，ΜΥΒ99各过表 达株系（(^1、(^2、(^5和(^6)在含有484培养基上的种子萌发率与各过表达株系中 MYB99mRNA表达量成负相关（图3)，证明ΜΥΒ99正向调节ΑΒΑ信号转导，并且过表达ΜΥΒ99产生 的种子萌发表型与ΜΥΒ99基因是连锁的。
[0094]以上结果表明，无论是在含有ΟμΜΑΒΑ的培养基上，还是在含有不同浓度ΑΒΑ的培 养基上(0.5μΜ，1μΜ和3μΜΑΒΑ)，ΜΥΒ99转基因株系相对于野生型种子萌发速率均变慢，对 ΑΒΑ更加敏感，这正是农业生产所需要的，能够很好的抑制种子过早萌发，抑制胎萌，减少胎 萌所消耗营养和贮藏物质，使种子食用品质、贮藏品质提升，使种子质量提高，给作物生产 提高更大的经济利益。
【主权项】
1. 由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质在如下al)或a2)中的应用： a1)提尚植物的胎明抗性； a2)选育胎明抗性提尚的植物品种。2. 由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因在如下al)或a2)中的 应用： a1)提尚植物的胎明抗性； a2)选育胎明抗性提尚的植物品种。3. 培育胎萌抗性提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入由序列 表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到转基因植物;所述转基因植物 与所述受体植物相比胎萌抗性提高。4. 根据权利要求1或2所述的应用或权利要求3所述的方法，其特征在于:所述由序列表 中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是如下1)至5)中任一所述的DNA分子： 1) 编码序列为序列表中序列2自5 '末端第148至885位核苷酸所示的DNA分子； 2) 序列表中序列2所示的DNA分子； 3) 序列表中序列1所示的DNA分子； 4) 在严格条件下与1)-3)任一所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列3所示的氨 基酸序列组成的蛋白质的DNA分子； 5) 与1)_4)任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码由序列表中序列3所示的氨 基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。5. 根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于:所述由序列表中序列3所示的氨基酸序 列组成的蛋白质的编码基因是通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述 受体植物中的。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于:所述重组表达载体中启动所述蛋白质的编 码基因转录的启动子为35S启动子。7. -种降低植物种子萌发速率的方法，具体可包括如下步骤： (1) 向受体植物中导入由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因， 得到转基因植物； (2) 将所述转基因植物的种子播种于含有ΑΒΑ的基质中。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于:所述ΑΒΑ在所述基质中的含量为0.5-3μΜ。9. 根据权利要求1-8中任一所述的应用或方法，其特征在于:所述植物为双子叶植物或 单子叶植物。10. 根据权利要求9所述的应用或方法，其特征在于:所述双子叶植物为十字花科植物。
【专利摘要】本发明公开了一种MYB99蛋白及其编码基因在调控植物种子萌发中的应用。本发明所提供的应用具体为由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质(即MYB99蛋白)在如下a1)或a2)中的应用：a1)调控植物的胎萌抗性；a2)选育胎萌抗性提高的植物品种。本发明可通过调节MYB99的表达水平控制植物种子的萌发率，通过基因工程手段获得MYB99基因高表达、抗胎萌转基因作物。本发明符合可持续农业发展需求，对于提高种子食用品质和贮藏品质等方面具有重要的实用价值和市场前景。
【IPC分类】A01H5/00, C12N15/82, C07K14/415, C12N15/29
【公开号】CN105461790
【申请号】CN201610007117
【发明人】张大鹏, 于泳涛, 王小芳
【申请人】清华大学
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2016年1月6日