1] (5)将透析袋中的液体分装入冷冻干燥管中，每管中的总蛋白量为0.lyg，冷冻成 粉末，放入-80°C冻存备用。
[0112] (6)SDS-PAGE胶蛋白纯度验证的方法如下:将收集200mM/L咪唑洗脱液的峰值取40 μL，加入1〇μ1的5X上样缓冲液，100°C加热10min，12000转/min离心，取上清15μ1上样，12% SDS-PAGE胶，80伏恒压lOmin，120伏恒压60min，考马斯亮蓝染色，脱色，胶图分析，结果显 不：蛋白纯度2 95 %。
[0113] 实施例4
[0114] 利用实施例1获得的CCNY鼠源性单克隆抗体包被酶标板，得到固化CCNY单克隆抗 体的酶标板，具体步骤如下：
[0115] (1)取实施例1获得的CCNY鼠源性单克隆抗体，用包被缓冲液稀释成lyg/ml，得到
[0116] 包被液，4°C保存，备用。
[0117] (2)将包被液加入至96孔平底聚苯乙烯试剂板，每孔加100yl，4°C过夜。
[0118] (3)洗板三次，拍干板中液体，每孔加入200μ1 5 %胎牛血清封闭液，4°C封闭过夜。
[0119] (4)洗板三次，拍干板中液体，得到包被CCNY的酶标板，4°C保存备用。
[0120] 实施例5
[0121] 本实施例的试剂盒为细胞周期因子Y双抗夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒， 该试剂盒包括:实施例4得到的固化细胞周期因子Y单克隆抗体的酶标板1块、细胞周期因子 Y标准品2瓶，检测抗体1XΙΟμΙ，辣根过氧化物酶标抗体1XΙΟμΙ/管，标准品稀释液1X 20ml，浓洗涤缓冲液(20X) 1X20ml，抗体稀释液1X20ml，底物显色液A1X5ml，底物显色 液B1X5ml，终止液1X6ml。具体说明如下：
[0122] (1)细胞周期因子Y标准品（冻干品）
[0123] 实施例3得到的细胞周期因子Y，2ng，每瓶标准品加入标准品稀释液1ml，盖好后室 温静置大约10分钟，同时反复颠倒以助溶解，浓度为2ng/ml。
[0124] (2)检测抗体
[0125] 兔源性细胞周期因子Y多克隆抗体(购自Sigma，货号:HPA036290)，体积1Ομ1，浓度 为200yg/ml。
[0126] (3)辣根过氧化物酶标抗体
[0127] 山羊抗兔辣根过氧化物酶标抗体，体积ΙΟμΙ，浓度为0.2μg/ml。使用时，用辣根过 氧化物酶标抗体稀释液将1〇μ1抗体稀释成20ml，进行2000倍稀释。
[0128] (4)标准品稀释液
[0129] 组成为：每20ml含有NaCl0.1g，KCl0.0058，1012?040.0058，恥2册040.0368，余量 为去离子水。
[0130] (5)辣根过氧化物酶标抗体稀释液
[0131] 组成为：每20ml含有NaCl0.1g，KCl0.0058，1012?040.0058，恥2册040.0368，余量 为去离子水。
[0132] (6)洗涤浓缩缓冲液
[0133] 组成为：每20ml含有NaCl2g，KCl0.1g，KH2P040.1g，Na2HP040.72gdj^ja-20400y 1，余量为去离子水。使用时，用380ml蒸馏水或去离子水将20ml浓洗涤液稀释至400ml，进行 20倍稀释。
[0134] (7)底物显色液A
[0135] 组成为:每5ml含有醋酸钠0.136g，梓檬酸0.016g，体积百分浓度为30 %的Η2023μ1，余量为去离子水，避光保存。
[0136] (8)底物显色液Β
[0137] 组成为:每5ml含有EDTA-Na0.002g，柠檬酸0.0095g，丙三醇0.5ml，四甲基联苯胺 0.002g，余量为去离子水，避光保存。
[0138] (9)终止液
[0139] 组成为：l-3mol/LH2S〇4 溶液。
[0140] (10)酶标板
[0141] 实施例4制备得到的细胞周期因子Y单克隆抗体包被的酶标板。
[0142] 实施例6
[0143] 检测实施例5的试剂盒的检测范围和灵敏度，具体如下：
[0144] (1)细胞周期因子Y标准品用标准品稀释液倍比稀释10次，浓度从2ng/ml至 0·0039ng/ml，。
[0145] (2)加样：10个浓度的标准品溶液加入酶标板，100μΙ/孔，另设空白孔，加入标准品 稀释液，每个样品3复孔，37°C，孵育2h。
[0146] (3)弃去步骤(2)中酶标板的液体，洗涤缓冲液300μ1/孔，洗板三次，拍干。
[0147] (4)向步骤(3)得到的酶标板中，每孔加入检测抗体100yl，37°C，lh。
[0148] (5)弃去步骤(4)得到的酶标板中的液体，洗涤缓冲液300μ1/孔，洗板三次，拍干。
[0149] (6)向步骤(5)得到的酶标板中，每孔加入酶标抗体100μ1，37°C，1h。
[0150] (7)弃去步骤(4)得到的酶标板中的液体，洗涤缓冲液300μ1/孔，洗板五次，拍干。 [0151 ] (8)底物显色液Α和Β等体积充分混合，向步骤(5)得到的酶标板中，依次加入混合 液100μΙ/孔，37°C避光显色 15-30min。
[0152] (9)向步骤（8)得到的酶标板中，依次加入终止液50μ1，终止反应，用酶标仪在 450nm波长读数(0D值），具体结果如下，结果表明，试剂盒的检测灵敏度为0.0078ng/ml，检 测范围为 0·〇〇78ng/ml_2ng/ml。
[0153]
[0154] 实施例7
[0155] 测定实施例5的试剂盒的批内和批间的变异系数。
[0156] (1)批内变异系数：
[0157] 将3个浓度分别为0.25ng/ml的细胞周期因子Y标准品溶液，按照实施例6的方法， 在一块酶标板上分别测定25次，具体结果如下：
[0158]
[0159] 批内变异系数计算公式:CV=(批内标准差/平均值）X100%
[0160] 结果：按上述批内变异系数计算公式，经计算，该试剂盒的批内变异系数CV= 0.01637/0.2601*100% =6.28% ;CV〈10%，符合规定。
[0161] (2)批间变异系数：
[0162] 将浓度为0.25ng/ml，的细胞周期因子Y标准品溶液，按照实施例6的方法，由4名工 作人员共测定25次，具体结果如下：
[0163]
[0164] 批间变异系数计算方法:CV=(批间标准差/平均值）X100%
[0165] 结果：按上述批间变异系数计算公式，经计算，批间变异系数CV= 0.0212/0.2731 X100%=7.77%;CV〈10%，符合规定。
[0166] 通过测定血清细胞周期因子Y蛋白检测试剂盒批内和批间的变异系数均小于 10%，表明该试剂盒具有很好的稳定性。
[0167] 实施例8
[0168] 实施例5的试剂盒可用于测定血清、血浆中细胞周期因子Y蛋白的含量，具体如下：
[0169] 1、标本的采集及保存：
[0170] (1)血清:将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4°C过夜，然后离心 1000gX20分钟，取上清分装，将分装好的上清置于_80°C保存，但应避免反复冻融。
[0171] (2)血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于4 °C离心1000gX15分钟，取上清分装，将分装好的上于-80°C保存，但应避免反复冻融。
[0172] 2、试剂准备：
[0173](1)使用前将所有的试剂和标本缓慢均衡至室温（18_25°C)，试剂不能直接在37°C溶解。
[0174] (2)标准品（冻干品）：每瓶标准品加入标准品稀释液ΙΟΟΟμΙ，盖好后室温静置大约 10分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为2ng/ml。然后准备7个稀释标准品的ΕΡ管， 每个EP管中加入500yL的标准品稀释液，依次倍比稀释成lng/ml;0.5ng/ml;0.25ng/ml; Ο· 125ng/ml;Ο· 0625ng/ml;Ο· 03125ng/ml;Ο· 015625ng/ml，Ο· 0078ng/ml，标准品稀释液 (Ong/ml)直接作为空白孔。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。
[0175] (3)辣根过氧化物酶标抗体：用辣根过氧化物酶标抗体稀释液将ΙΟμΙ辣根过氧化 物酶标抗体稀释成20ml，进行2000倍稀释。
[0176](4)浓缩洗涤缓冲液:用380ml蒸馏水或去离子水将20ml浓洗涤液稀释至400ml，进 行20倍稀释。
[0177] 3、操作步骤：
[0178] (1)加样:分别设标准孔、待测样品孔、空白孔。设