本发明涉及基因工程菌技术领域，尤其涉及一株热稳定性好的产乙酰辅酶A氧化酶基因工程菌株及其构建方法和应用。
背景技术：
乙酰辅酶A氧化酶能够催化乙酰辅酶A氧化生成二羟酰辅酶A和过氧化氢，是临床检验中检测血清游离脂肪酸的重要工具酶之一。
人体中的游离脂肪酸是中性脂肪分解生成的，血清中含量很少。游离脂肪酸与脂类代谢、糖代谢、内分泌等功能均有关，其浓度会因为糖尿病、重症肝障碍、甲状腺功能亢进等疾病而上升。
游离脂肪酸检测试剂盒的主要原理为：游离脂肪酸在乙酰辅酶A合成酶的作用下与辅酶A生成酰基辅酶A，酰基辅酶A在乙酰辅酶A氧化酶作用下与氧反应生成2，3-反式-烯酰基辅酶A和过氧化氢，利用Trinder反应即过氧化氢在催化剂过氧化物酶、显色剂4-氨基安替比林存在下与色原物质生成红色醌亚胺化合物，其与游离脂肪酸的含量成正比，因而可通过比色法得出游离脂肪酸的含量。
由此可见，乙酰辅酶A氧化酶是游离脂肪酸检测试剂盒中的关键酶之一，然而目前应用于生产中的产品很少，只有日本旭化成公司有相应产品，但其热稳定性不好，不能满足试剂运输中产生的高温问题。
技术实现要素：
针对现有技术的上述缺陷和问题，本发明的目的是提供解决现有的乙酰辅酶A氧化酶的热稳定性差的技术问题。提供了一种热稳定性好的产乙酰辅酶A氧化酶基因工程菌株及其构建方法和应用。
为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明的一株热稳定性好的产乙酰辅酶A氧化酶基因工程菌株，所述乙酰辅酶A氧化酶基因工程菌株的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的一株热稳定性好的产乙酰辅酶A氧化酶基因工程菌株的构建方法，包括以下步骤：
a、从热带假丝酵母菌的培养物中提取基因组DNA；
b、将步骤a中的基因组DNA与广宿主质粒连接，得到重组载体；将重组载体转化至大肠杆菌感受态中，从转化板中筛选出具有产乙酰辅酶A氧化酶能力的克隆；
c、将步骤b的克隆进行PCR扩增反应，得到DNA片段；将该DNA片段与广宿主质粒连接，构建得到乙酰辅酶A氧化酶表达载体；然后将该乙酰辅酶A氧化酶表达载体转化至大肠杆菌感受态中，得到乙酰辅酶A氧化酶表达菌株；
d、基因的热稳定性突变：将步骤c得到的乙酰辅酶A氧化酶表达菌株用易错PCR进行随机突变，回收得到突变的DNA片段，将该突变的DNA片段与广宿主质粒连接，构建重组载体；然后将该重组载体采用热激方法转化至大肠杆菌感受态中，得到转化产物，并将其进行扩大培养得转化产物培养菌液；
e、突变株筛选:将步骤d中的转化产物培养菌液，再扩大培养并诱导后，进行破胞，然后在多个不同的递增的温度下，水浴加热，然后对不同温度加热后的破胞液进行测活，得到在65℃加热下有变红反应的克隆；该克隆即为热稳定性好的乙酰辅酶A氧化酶基因工程菌株，其基因序列表如SEQ ID NO.1所示。
具体地，步骤a中，热带假丝酵母菌采用Candida tropicalis ATCC 13803。
进一步地，步骤b中筛选出具有产乙酰辅酶A氧化酶能力的克隆，其基因序列如SEQ ID NO.2。
进一步地，步骤b和步骤d中，所述大肠杆菌感受态均采用大肠杆菌JM109；
步骤c中，所述大肠杆菌感受态均采用大肠杆菌DH5α。
进一步地，步骤b、步骤c和步骤d中，所述广宿主质粒均采用质粒pUC19。
进一步地，步骤c和步骤d的PCR扩增反应中，采用如下引物：
ACOF:AAGCTTATGTTGGGTGATTTGC；
ACOR:GGATCCTCACTTTTGTCTTGGCA。
进一步地，步骤d中，所述易错PCR方法进行随机突变的条件如下：
5μl 10×易错PCR缓冲液(500mM KCl，70mM MgCl2，100mM Tris-HCl PH8.3,0.1％明胶)；20μM dATP,20μM dGTP,20μM dTTP和20μM dCTP；500nM引物ACOF、500nM引物ACOR、0.5mM MnCl2，2.5U Taq DNA聚合酶(Promega，USA)，20ng质粒DNA，无菌水调至反应体积达50μL；
扩增程序为:将上述反应体系95℃5min；30个循环的“94℃30s，52℃1min，72℃1min”；72℃10min；将得到的PCR扩增基因产物用1％琼脂糖凝胶电泳分离，并回收DNA片段。
进一步地，步骤e的测活中采用如下测活试剂：
A液与B液以1:1比例混合。
利用本发明的一株热稳定性好的产乙酰辅酶A氧化酶基因工程菌株发酵生产乙酰辅酶A氧化酶的应用。
在本发明的应用的中，将乙酰辅酶A氧化酶基因工程菌株过夜培养后，再接种在发酵培养基中发酵；其中发酵培养基的组成如下：
磷酸二氢钠：0.03-0.3％；
磷酸氢二钠：0.1-1％；
酵母粉：0.5-5％；
蛋白胨：0.1-1％；
葡萄糖：0.001-0.05％；
甘油：2.5％-10％；
乳糖：0.1％-0.8％；
调节pH至6.0-8.0；
发酵条件如下：30℃发酵18h—24h。
本发明的应用中，发酵得到的乙酰辅酶A氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的产乙酰辅酶A氧化酶基因工程菌株从一株热带假丝酵母菌中克隆出一段编码乙酰辅酶A氧化酶的基因，将此基因用易错PCR进行随机突变，并通过自己构建的载体在大肠杆菌中进行预表达与筛选，得到的产乙酰辅酶A氧化酶基因工程菌的热稳定好的，能耐65℃高温。在用于发酵法生产得到乙酰辅酶A氧化酶的应用中，生产能力高，酶活能达到3KU/L。经检测，酶学性质为：分子量约51.0KD；等电点5.3；热稳定性：60℃，30min。而且，在发酵生产乙酰辅酶A氧化酶的应用中，能够在不改变原有的生产过程，工艺步骤的情况下，使微生物发酵法生产乙酰辅酶A氧化酶的生产能力提高，适合乙酰辅酶A氧化酶大规模工业化生产,具有很高的应用价值和工业实用性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明的产乙酰辅酶A氧化酶基因工程菌株发酵生产得到的乙酰辅酶A氧化酶的“温度-残存酶活与最大残存酶活的比值百分数”的曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1构建产乙酰辅酶A氧化酶基因工程菌株
本实施例1的产乙酰辅酶A氧化酶基因工程菌株的基因序列如SEQ ID NO.1所示。其构建方法包括以下步骤：
a、从热带假丝酵母菌的培养物中提取基因组DNA。具体操作如下：
选取Candida tropicalis ATCC 13803的热带假丝酵母菌，将冻存管中的热带假丝酵母菌菌种用接种针接种于YPD培养基中，25℃培养，得热带假丝酵母菌的培养物。其中，YPD培养基的组成如下：1％酵母粉，2％蛋白胨和2％葡萄糖，将酵母粉、蛋白胨与葡萄糖分别115℃20min灭菌后混合，即得。
取上述培养物，使用天根公司酵母基因组DNA提取试剂盒(DP307)提取基因组DNA。
b、获得产乙酰辅酶A氧化酶能力的基因
步骤a得到的基因组DNA用Ava I 37℃酶切1h，同时以相同条件酶切质粒pUC19，65℃水浴放置10min灭活内切酶后将两者用NEB公司的T4连接酶连接12h，转化大肠杆菌JM109。从转化平板中筛选出具有产乙酰辅酶A氧化酶能力的克隆，测序并分析出乙酰辅酶A氧化酶的基因片段(见SEQ ID NO.2)。具体操作如下：
挑取在LB固体培养基上37℃培养16h的大肠杆菌JM109的单菌落，于液体LB培养基中在37℃、150rpm的摇床再培养16h。取1ml所得液体培养物转接于100ml新鲜液体LB培养基中，在37℃摇床上以200-250rpm的转速剧烈振荡培养2.5h。吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟后，在4℃、3000g下离心5分钟。弃去上清，加入100μl在冰上预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液，重悬细胞，在冰上放置20分钟。然后在4℃、3000g下离心5分钟，弃去上清，加入100μl冰预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，重悬细胞，得到感受态的宿主细胞。
取100μl上述感受态的大肠杆菌JM109置于1.5ml离心管中，加入体积为10μl的连接产物溶液轻轻摇匀，冰上放置30分钟。然后在42℃水浴中热激120秒，迅速置于冰上冷却5分钟。向离心管中加入1ml LB液体培养基(不含氨苄青霉素)，混匀后37℃振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的氨苄青霉素抗生素抗性基因。将上述菌液摇匀后取100μl涂布于含氨苄青霉素(100mg/L)、乙酰辅酶A钠盐(1mM)、辣根过氧化物酶(5kU/L)、4-氨基安替比林(1mM)和TOOS(N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐)(1mM)的LB筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养20h。在筛选平板上出现了大肠杆菌的菌落，即pUC19重组质粒已经转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中；并且存在具有变色圈的克隆，说明得到了包含有乙酰辅酶A氧化酶基因的重组质粒的大肠杆菌JM109。将变色圈克隆在LB中37℃200rpm培养20h，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行DNA序列测定，分析序列得到乙酰辅酶A氧化酶的基因序列。
c、表达载体的构建
设计引物克隆乙酰辅酶A氧化酶基因
ACOF:AAGCTTATGTTGGGTGATTTGC
ACOR:GGATCCTCACTTTTGTCTTGGCA
乙酰辅酶A氧化酶基因扩增条件为：20mM Tris-HCl(pH 8.8)、10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、2mM MgSO4、0.1％Triton X-100、50μM dATP、50μM dGTP、50μM dTTP、50μM dCTP、500nM引物ACOF、500nM引物ACOR、1.5U Pfu DNA聚合酶(Promega，USA)，20ng质粒DNA模板加入反应体系，用无菌水调至反应体积达50μL。
扩增反应程序为：将上述反应体系在95℃下反应5分钟，然后进行30个循环的“95℃30s、55℃30s和72℃1min”，最后在72℃下保持10分钟。将得到的PCR扩增基因产物用1％琼脂糖凝胶电泳分离，并回收700bp左右单一条带的DNA片段。
将此得到的DNA片段经Hind III和BamH I双酶切4h，同时以Hind III和BamH I双酶切pUC19载体，将二者通过T4连接酶连接，构建成为乙酰辅酶A氧化酶表达载体。
将此表达载体转化大肠杆菌DH5α，得到乙酰辅酶A氧化酶表达菌株。
d、基因的热稳定性突变
将步骤c得到的乙酰辅酶A氧化酶表达菌株用易错PCR进行随机突变，条件如下：
5μl 10×易错PCR缓冲液(500mM KCl,70mM MgCl2,100mM Tris-HCl PH8.3,0.1％明胶)；20μM dATP,20μM dGTP,20μM dTTP和20μM dCTP；500nM引物ACOF、500nM引物ACOR、0.5mM MnCl2,2.5U Taq DNA聚合酶(Promega，USA)，20ng质粒DNA,无菌水调至反应体积达50μL
扩增程序为:将上述反应体系95℃5min；30个循环的“94℃30s,52℃1min,72℃1min”；72℃10min。将得到的PCR扩增基因产物用1％琼脂糖凝胶电泳分离，并回收DNA片段。
将回收得到的PCR产物以Hind III和BamH I双酶切，用T4连接酶连接Hind III和BamH I双酶切后的pUC19载体，并以热激方法转化大肠杆菌JM109。酶切、连接等过程与上步相同。
将平板上转化产物用灭菌的牙签分别接种到3ml LB(含终浓度100μg/ml的Amp)中，37℃培养20h，得转化产物培养菌液。
e、突变株筛选
将步骤d的转化产物培养菌液以1:100的比例再次接种于3ml LB培养基中，37℃200rpm培养至OD600＝1.0，加入终浓度1mM的IPTG，30℃诱导6h。分别超声波破胞后，在55℃、60℃、65℃、70℃水浴加热30min。
配制如下测活试剂：
A:Tris-HCl 50mM PH8.0
Triton X-100 0.1％
4-氨基安替比林 1mM
POD 5KU/L
B:Tris-HCl 50mM PH8.0
TOOS 1mM
乙酰辅酶A钠盐 1mM
将A液与B液以1:1比例混合，每孔200μl置于96孔板中，将上述加热过的破胞液每孔4μl加入，37℃温浴5min，挑选变红的孔中对应的克隆。
其中，55℃加热过的酶液中有5个孔有反应，60℃加热过的酶液中有2个孔有反应，65℃加热过的酶液中有1个孔有反应，70℃加热过的酶液均无反应。
测序检验65℃加热有反应的孔中所对应克隆(命名为ACO5E3)，序列表如SEQ ID NO.1所示。
实施例2应用
利用本发明实施例1构建得到的一株热稳定性好的产乙酰辅酶A氧化酶基因工程菌株发酵生产乙酰辅酶A氧化酶的应用。
在本发明的应用的中，将实施例1构建得到的热稳定性好的乙酰辅酶A氧化酶基因工程菌株在LB培养基中30℃过夜培养，第二天1：100接种于3L的发酵培养基中发酵生产，发酵得到的乙酰辅酶A氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
其中，发酵培养基的组成如下：
磷酸二氢钠：0.03-0.3％；
磷酸氢二钠：0.1-1％；
酵母粉：0.5-5％；
蛋白胨：0.1-1％；
葡萄糖：0.001-0.05％；
甘油：2.5％-10％；
乳糖：0.1％-0.8％；
调节pH至6.0-8.0；
发酵条件如下：30℃发酵18h—24h。
收集菌液超声波破碎，测其酶活为3KU/L。
酶活定义：1个酶活单位等于在以下反应条件下1分钟生成1毫摩尔过氧化氢(1/2毫摩尔醌染料)的酶量。
测活方法：
B液:Tris-HCl 50mM PH8.0
TOOS 1mM
乙酰辅酶A钠盐 1mM
依次加入A液0.5ml，B液0.5ml，酶液0.02ml。
测定波长为550nm，37℃反应5min，测定4-5min内吸光度的变化率。
上式中，
Vt：反应液总体积(1.04ml) e：39.2(摩尔吸光系数)
Vs待测酶液的体积(0.02ml) d：比色杯光径(1cm)
D：稀释倍数 △A/min：ABS/min
线性范围为200～600U/L。
经测定，酶学性质如下：分子量：约51.0KD；等电点：5.3；热稳定性：60℃，30min。
为了本发明的热稳定性好的产乙酰辅酶A氧化酶基因工程菌株的热稳定性好，将实施例2中利用其发酵生产的乙酰辅酶A氧化酶放置在不同温度下进行热处理，热处理参数为：将1KU/L酶活单位的乙酰辅酶A氧化酶分别在10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、55℃、60℃、65℃保持15min。然后按上述测活方法测定热处理后的乙酰辅酶A氧化酶的残余比活性，并以旭化成公司商品酶作为对照。按残存酶活与最大残存酶活的比值百分数为纵坐标，温度为横坐标绘制曲线，如图1所示，其中，“—■—”为本实施2的曲线，“—◆—”为对比的旭化成公司商品酶的曲线。可见，本发明实施例2的发酵生产的乙酰辅酶A氧化酶具有更好的热稳定性。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 北京利德曼生化股份有限公司
<120>一株热稳定性好的产乙酰辅酶A氧化酶基因工程菌株及其构建方法和应用
<160> 3
<210> 1
<211> 1368
<212> DNA
<213> 热带假丝酵母菌属 (Candida tropicalis)
<400> 1
ATGTTGGGTG ATTTGCCATT GACTTCTTTG GCTTTGGTTT TGTCTAACGT TAGAGTTTAC 60
ACTAACTCTA ACGGTTCTCC ATTCGTTTTG AAGCCAGTTT TGGAAATTAC TGGTGGTAGA 120
ACTTTGGCTT TGTCTGATTT CAACTTGGTT GATTCTTTGG CTCACTTCGA AGAAAACATG 180
CCAGAAAGAG ATTCTTTGGC TCACTTCAAC AGAGAAAAGA TTCCACAAAG AGCTGTTCAC 240
GCTCACGGTT CTGGTGCTTA CGGTCCAAAG GTTGCTGATA TTTCTGAAAA GGAAATTATG 300
GATGCTGCTG GTATGTTGAC TGAATTGGGT CACAGAACTA ACGTTATGAC TTTGTTCTCT 360
ACTACTGATT ACGATCCAGG TTCTGATGAA TTCATTATTA GAGATCCAAA GGGTATGGCT 420
ACTAAGTACT ACATTGAAGA AGGTAACCAC GATTGGGTTT GTTCTGTTTT CCCAGTTTAC 480
TTCATTAGAG ATGGTAAGCC AGGTAAGTTC CCATGTTTCA TGCACGCTCA AAGAAGAGAT 540
CCAAGAACTA ACTTGTTGCC AGCTAACATG TACTGGGATG TTTTGACTTC TAACCCAGAA 600
TCTGCTCACA ACGTTTGGAT TCAATTCTCT AACGTTGGTA CTCCAGCTTC TTGGAGAAAG 660
TTCTCTGGTT ACATGGGTCA CGCTTACAAG TGGCCATTGG CTAACGGTTC TACTTTCTAC 720
GTTTTCGCTA ACGTTGATCC AGATAGAGGT AGAAAGACTT TGAACAACGA AGAAGCTGGT 780
GCTAACTCTG GTGATGATGT TAAGAGAACT CAATTGTTGT TGGAAATTGC TAAGAAGGAA 840
GCTAAGTTGG GTATTACTGC TTGGACTGTT TACGTTCAAA CTCAATTGAC TACTATTATG 900
CCAATGATTG CTTCTTTCAC TGTTTTCGAT TTGGAAGATT GGGATGATGA TTTGGAACCA 960
GGTGTTTTGA ACGAAATTCC AGATGCTTGT ACTTGGTTGG CTGCTGAAGT TATTGATAAC 1020
GCTACTGTTC CAGGTGGTCA CGGTTACGGT TCTTACTCTA GAGGTAAGTT GGTTGCTGCT 1080
GAAGTTGCTA CTACTATTGA AGGTGATAAC CACCACCAAG TTAAGAACTT GTGTCCACAA 1140
ATTGTTAGAA AGGATGAATT CAAGCAAGCT GGTGAATTGA AGATTGCTAA GACTAGATCT 1200
ACTGAAACTA TTATTCAAGA TAACTTGGCT CACAACATTG CTGAAGAAAA GGATTTGGAA 1260
TTGGCTTCTA TTCAAGATAG AGTTGAATTC GTTTACCACT TGTTCCACTT GGTTGATCCA 1320
GAATTGTCTG CTAGATTCTT CAGAGAAACT TTGCCAAGAC AAAAGTGA 1368
<210> 2
<211> 1368
<212> DNA
<213> 热带假丝酵母菌属 (Candida tropicalis)
<400> 2
ATGTTGGGTG ATTTGCCATT GACTTCTTTG GCTTTGGTTT TGTCTAACGT TAGAGTTTAC 60
ACTAACTCTA ACGGTTGTCC ATTCGTTTTG AAGCCAGTTT TGGAAATTAC TGGTGGTAGA 120
ACTTTGGCTT TGTCTGATTT CAACTTGGTT GATTCTTTGG CTCACTTCGA AGAAAACATG 180
CCAGAAAGAG ATTCTTTGGC TCACTTCAAC AGAGAAAAGA TTCCACAAAG AGCTGTTCAC 240
GCTCACGGTT CTGGTGCTTA CGGTCCAAAG GTTGCTGATA TTTCTGAAAA GGAAATTATG 300
GATGCTGCTG GTATGTTGAC TGAATTGGGT CACAGAACTA ACGTTATGAC TTTGTTCTCT 360
ACTACTGATT ACGATCCAGG TTCTGATGAA TTCATTATTA GAGATCCAAA GGGTATGGCT 420
ACTAAGTTCT ACATTGAAGA AGGTAACCAC GATTGGGTTT GTTCTGTTTT CCCAGTTTTC 480
TTCATTAGAG ATGGTAAGCC AGGTAAGTTC CCATGTTTCA TGCACGCTCA AAGAAGAGAT 540
CCAAGAACTA ACTTGTTGCC AGCTAACATG TACTGGGATG TTTTGACTTC TAACCCAGAA 600
TCTGCTCACA ACGTTTGGAT TCAATTCTCT AACGTTGGTA CTCCAGCTTC TTGGAGAAAG 660
TTCTCTGGTT ACATGGGTCA CGCTTACAAG TGGCCATTGG CTAACGGTTC TACTTTCTAC 720
GTTTTCGCTA ACGTTGATCC AGATAGAGGT AGAAAGACTT TGAACAACGA AGAAGCTGGT 780
GCTAACTCTG GTGATGATGT TAAGAGAACT CAATTGTTGT TGGAAATTGC TAAGAAGGAA 840
GCTAAGTTGG GTATTACTGC TTGGACTGTT TACGTTCAAA CTCAATTGAC TACTATTATG 900
CCAATGATTG CTTCTTTCAC TGTTTTCGAT TTGGAAGATT GGGATGATGA TTTGGAACCA 960
GGTGTTTTGA ACGAAATTCC AGATGCTTGT ACTTGGTTGG CTGCTGAAGT TATTGATAAC 1020
GCTACTGTTC CAGGTGGTCA CGGTTACGGT TCTTACTCTA GAGGTAAGTT GGTTGCTGCT 1080
GAAGTTGCTA CTACTATTGA AGGTGATAAC CACCACCAAG TTAAGAACTT GTGTCCACAA 1140
ATTGTTAGAA AGGATGAATT CAAGCAAGCT GGTGAATTGA AGATTGCTAA GACTAGATCT 1200
ACTGAAACTA TTATTCAAGA TAACTTGGCT CACAACATTG CTGAAGAAAA GGATTTGGAA 1260
TTGGCTTCTA TTCAAGATAG AGTTGAATTC GTTTACCACT TGTTCCACTT GGTTGATCCA 1320
GAATTGTCTG CTAGATTCTT CAGAGAAACT TTGCCAAGAC AAAAGTGA 1368
<210> 3
<211> 455
<212> PRT
<213> 热带假丝酵母菌属 (Candida tropicalis)
<400> 3
Met Leu Gly Asp Leu Pro Leu Thr Ser Leu Ala Leu Val Leu Ser 15
Asn Val Arg Val Tyr Thr Asn Ser Asn Gly Cys Pro Phe Val Leu 30
Lys Pro Val Leu Glu Ile Thr Gly Gly Arg Thr Leu Ala Leu Ser 45
Asp Phe Asn Leu Val Asp Ser Leu Ala His Phe Glu Glu Asn Met 60
Pro Glu Arg Asp Ser Leu Ala His Phe Asn Arg Glu Lys Ile Pro 75
Gln Arg Ala Val His Ala His Gly Ser Gly Ala Tyr Gly Pro Lys 90
Val Ala Asp Ile Ser Glu Lys Glu Ile Met Asp Ala Ala Gly Met 105
Leu Thr Glu Leu Gly His Arg Thr Asn Val Met Thr Leu Phe Ser 120
Thr Thr Asp Tyr Asp Pro Gly Ser Asp Glu Phe Ile Ile Arg Asp 135
Pro Lys Gly Met Ala Thr Lys Phe Tyr Ile Glu Glu Gly Asn His 150
Asp Trp Val Cys Ser Val Phe Pro Val Tyr Phe Ile Arg Asp Gly 165
Lys Pro Gly Lys Phe Pro Cys Phe Met His Ala Gln Arg Arg Asp 180
Pro Arg Thr Asn Leu Leu Pro Ala Asn Met Tyr Trp Asp Val Leu 195
Thr Ser Asn Pro Glu Ser Ala His Asn Val Trp Ile Gln Phe Ser 210
Asn Val Gly Thr Pro Ala Ser Trp Arg Lys Phe Ser Gly Tyr Met 225
Gly His Ala Tyr Lys Trp Pro Leu Ala Asn Gly Ser Thr Phe Tyr 240
Val Phe Ala Asn Val Asp Pro Asp Arg Gly Arg Lys Thr Leu Asn 255
Asn Glu Glu Ala Gly Ala Asn Ser Gly Asp Asp Val Lys Arg Thr 270
Gln Leu Leu Leu Glu Ile Ala Lys Lys Glu Ala Lys Leu Gly Ile 285
Thr Ala Trp Thr Val Tyr Val Gln Thr Qly Leu Thr Thr Ile Met 300
Pro Met Ile Ala Ser Phe Thr Val Phe Asp Leu Glu Asp Trp Asp 315
Asp Asp Leu Glu Pro Gly Val Leu Asn Glu Ile Pro Asp Ala Cys 330
Thr Trp Leu Ala Ala Glu Val Ile Asp Asn Ala Thr Val Pro Gly 345
Gly His Gly Tyr Gly Ser Tyr Ser Arg Gly Lys Leu Val Ala Ala 360
Glu Val Ala Thr Thr Ile Glu Gly Asp Asn His His Gln Val Lys 375
Asn Leu Cys Pro Gln Ile Val Arg Lys Asp Glu Phe Lys Gln Ala 390
Gly Glu Leu Lys Ile Ala Lys Thr Arg Ser Thr Glu Thr Ile Ile 405
Gln Asp Asn Leu Ala His Asn Ile Ala Glu Glu Lys Asp Leu Glu 420
Leu Ala Ser Ile Gln Asp Arg Val Glu Phe Val Tyr His Leu Phe 435
His Leu Val Asp Pro Glu Leu Ser Ala Arg Phe Phe Arg Glu Thr 450
Leu Pro Arg Gln Lys 455