重组乙酰辅酶a合成酶的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种重组乙酰辅酶A合成酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；本发明重组乙酰辅酶A合成酶具有高热稳定性、高活性的特性，60℃处理30min后，酶活保留率为59.6%，较原有酶获得大幅度的提高；催化油酸乙酰化反应的表观Km值为1.2*10 -5 M；可以提高酶在试剂盒中的热稳定性，有利于避免或减少试剂盒的运输和使用过程的温度影响。
【专利说明】重组乙酰辅酶A合成酶
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种重组乙酰辅酶A合成酶及其在试剂盒中 的应用。
【背景技术】
[0002] 游离脂肪酸（NEFA)是指血脂中清蛋白携带转运的非酯化脂肪酸，正常人血浆中 的NEFA含量极少，为50?1200 μmol/L，仅占血浆中总脂肪酸的5%?10%，波动范围大。 游离脂肪酸不仅参与机体的构成、能量代谢，还参与机体众多生理功能的调整，比如许多生 理调节物质的合成。
[0003] NEFA的异常在众多疾病检测中均具有重要的诊断价值，其升高常用于糖尿病、肢 端肥大症、甲状腺功能亢进症、肝炎等方面的诊断，其降低常用于甲状腺功能减低症，降糖 药或胰岛素使用过量等方面的检测诊断。
[0004] 目前，临床上检测NEFA的主要方法有气相色谱法和酶法，其中酶法检测由于操作 简单、快速，特别是可以适应于全自动生化仪的批量分析，所以得到的广泛的应用。
[0005] 酶法检测NEFA的反应原理为：待检测的NEFA在乙酰辅酶A合成酶（Acyl-CoA Synthetase、ACS)的作用下，与试剂盒中辅酶A生成乙酰辅酶A(Acyl-CoA)，乙酰辅酶A在 酰基辅酶A氧化酶（Acyl-CoA 0xidase、AC0)的作用下被氧气氧化，反应生成产物过氧化 氢（H2O2)，后者利用Trinder反应即过氧化物酶（Peroxidase, P0D)，显色剂4-氨基安替比 林（4-AAP)存在下和色原物质生成有色的醌亚胺化合物，通过在可见光下的吸收峰变化测 定NEFA的含量。
[0006] 具体反应步骤分为以下三个部分：
【权利要求】
1. 一种重组乙酰辅酶A合成酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
2. -种编码权利要求1所述的重组乙酰辅酶A合成酶的基因，其特征在于：其核苷酸 序列如SEQ ID No. 1所示。
3. -种按权利要求1所述的重组乙酰辅酶A合成酶在NEFA酶法检测试剂盒中的应用； 所述NEFA试剂盒由R1和R2两部分组成；R1组成为：1?500mM Tris-HCl缓冲液或MOPS 缓冲液、〇? 01 ?ImM C〇A、0. 01 ?5mM ATP、0. 001 ?2mM MgCl2、0. 001 ?2% Triton X-100、 0? 5mM?lOmM T00S、0. 05?lOOU/mL重组乙酰辅酶A合成酶，pH7. 2?8. 2 ;R2组成为： 1 ?800mM Tris-HCl 缓冲液或 MOPS 缓冲液、0? 2 ?5mM 4-AAP、0. 01 ?5mM NEM、1 ?200U/ mL P0D、0. 1 ?100U/mL ACO, pH7.2 ?9.2。
【文档编号】C12Q1/25GK104480077SQ201410804903
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月22日 优先权日:2014年12月22日
【发明者】邹炳德, 邹继华, 章玉胜, 贾江花 申请人:宁波美康生物科技股份有限公司