本发明涉及一种乳酸菌生产β-甘露聚糖酶的方法。
背景技术：
β-甘露聚糖酶(β-mannanase，简称甘露聚糖酶，EC3.2.1.78)，是能够专一性水解含β-1,4-甘露糖苷键的甘露多糖的内切水解酶，属于半纤维素酶类。甘露聚糖酶在工业尤其是食品行业有广泛用途，如用于果汁澄清进而提高出汁率；含有2-10个残基的降解产物，即寡聚糖可促进人体肠道益生菌生长等。微生物甘露聚糖酶具有来源广、活性高、作用条件温和等优点，是基础研究及工业应用的最重要来源。产甘露聚糖酶酶微生物类群主要是真菌中的霉菌和细菌中的芽孢杆菌，但往往因为发酵周期长或生物安全性差等原因，限制了工业化生产规模和应用领域。
乳酸菌是一类发酵糖类产生乳酸的无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。乳酸菌在自然界中分布广泛，具有多种生态学功能。更重要的是，人体中的乳酸菌，具有改善肠胃功能、调节菌群平衡、抑制胆固醇吸收、抗肿瘤预防癌症、消除自由基抗衰老等作用，积极的生理学意义和益生功能不容忽视。
魔芋是多年生天南星科草本根茎植物，主要产自东南亚地区。世界范围内，我国是魔芋种植量最大的国家。因此，以魔芋为原料制成的粉末魔芋粉，廉价易得。魔芋粉中富含葡甘聚糖，是微生物胞外甘露聚糖酶的理想碳源。
目前，真菌产甘露聚糖酶发酵周期较长，细菌产甘露聚糖酶存在生物安全隐患，乳酸菌产甘露聚糖酶的活性较低。
技术实现要素：
本发明是要解决现有真菌产甘露聚糖酶发酵周期较长，产甘露聚糖酶细菌存在生物安全隐患，乳酸菌产甘露聚糖酶活性较低的问题，提供一种利用魔芋粉为碳源培养乳酸菌生产β-甘露聚糖酶的方法。
本发明利用魔芋粉为碳源培养乳酸菌生产β-甘露聚糖酶的方法，包括以下步骤：
一、将-80℃保存的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)HDRS1接种于MRS固体培养基平板上，25～32℃恒温静置倒置培养36～60小时；
二、挑取单菌落至MRS液体培养基中，25～32℃、120～180rpm振荡培养24～48小时；
三、5000～9000转/分离心10～15分钟，弃上清收集菌体，以空白液体MRS培养基调整细胞浓度至108个/mL，作为种子液；
四、以1％～3％(v/v)接种量将种子液接入发酵培养基，30℃、140rpm振荡培养36～48小时，得发酵液；
五、将发酵液于5000～9000转/分离心10～15分钟，弃菌体，上清即为甘露聚糖酶粗酶液。
步骤一所述MRS固体培养基配方为：葡萄糖1g/100mL、蛋白胨1g/100mL、吐温800.1mL/100mL、磷酸氢二钾0.2g/100mL、乙酸钠0.5g/100mL、柠檬酸三铵0.2g/100mL、硫酸镁0.02g/100mL、琼脂2g/100mL和蒸馏水，pH值6.0-6.5。
步骤二所述MRS液体培养基配方为：葡萄糖1g/100mL、蛋白胨1g/100mL、吐温800.1mL/100mL、磷酸氢二钾0.2g/100mL、乙酸钠0.5g/100mL、柠檬酸三铵0.2g/100mL、硫酸镁0.02g/100mL和蒸馏水，pH值6.0-6.5。
步骤四所述发酵培养基配方为：魔芋粉1g/100m、蛋白胨1g/100mL、吐温80 0.1mL/100mL、磷酸氢二钾0.2g/100mL、乙酸钠0.5g/100mL、柠檬酸三铵0.2g/100mL、硫酸镁0.02g/100mL和蒸馏水pH值6.0-6.5。
本发明中甘露聚糖酶活性测定方法为改良的DNS法：以pH 4.0柠檬酸缓冲液配制0.5％去除还原糖的魔芋粉溶液为反应底物。取发酵液上清2mL，加入2mL反应底物，50℃保温15分钟。加入DNS试剂3mL，沸水浴中煮沸5分钟，冷却后加蒸馏水补足体积至25mL。540nm下测定吸光度值，计算还原糖量。一个酶活单位以每分钟产生1微摩尔甘露糖计。
本发明制备的甘露聚糖酶粗酶液，酶活为100-200U/mL。
步骤一所述植物乳杆菌HDRS1为乳杆菌属细菌，2009年4月13日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，编号：CCTCC M209069，已在专利“一种工业发酵酸菜的方法”(授权公告号101697751B)中公布。
本发明的有益效果：
本发明首次提出以植物乳杆菌为出发菌株，以魔芋粉为唯一碳源发酵生产甘露聚糖酶，以液态发酵工艺培养乳酸菌生产甘露聚糖酶，制备含有高活性甘露聚糖酶的粗酶液。
乳酸菌是公认的益生菌，植物乳杆菌也包含在内。以植物乳杆菌生产甘露聚糖酶，可以解决目前产酶微生物带来的生物安全隐患，大大拓展含有该菌株的甘露聚糖酶粗酶液的应用范围，如食品、饲料和保健品领域。
本方法首次提出已魔芋粉作为植物乳杆菌产甘露聚糖酶的发酵底物。相比培养乳酸菌用的碳源葡萄糖，显著降低了成本。因为魔芋粉在我国种植广泛，廉价易得。以魔芋粉为唯一碳源供给植物乳杆菌HDRS1发酵产甘露聚糖酶，使得该方法的工业化应用成为可能。
本发明方法获得的粗酶液中，甘露聚糖酶活性高达100-200U/mL。与真菌发酵产甘露聚糖酶相比，本方法缩短了发酵周期。本发明中植物乳杆菌HDRS1发酵周期仅需1.5～2天，而通常真菌产甘露聚糖酶发酵周期需要4～7天。
综上，本发明拓展了产甘露聚糖酶的微生物来源，确保了生物安全性因为拓展了应用范畴，生产成本低，周期短，生产菌株无生物安全隐患，且本发明方法生产的粗酶液酶活显著高于现有报道。对于拓展产甘露聚糖酶的微生物来源，深入挖掘乳酸菌应用范畴具有重要意义。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式利用魔芋粉为碳源培养乳酸菌生产β-甘露聚糖酶的方法，包括以下步骤：
一、将-80℃保存的植物乳杆菌HDRS1接种于MRS固体培养基平板上，25～32℃恒温静置倒置培养36～60小时；
二、挑取单菌落至MRS液体培养基中，25～32℃、120～180rpm振荡培养24～48小时；
三、然后于5000～9000转/分离心10～15分钟，弃上清收集菌体，以空白液体MRS培养基调整细胞浓度至108个/mL，作为种子液；
四、以1％～3％接种量将种子液接入发酵培养基，30℃、140rpm振荡培养36～48小时，得发酵液；
五、将发酵液于5000～9000转/分离心10～15分钟，弃菌体，上清即为甘露聚糖酶粗酶液。
步骤一所述植物乳杆菌HDRS1为乳杆菌属细菌，2009年4月13日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，编号：CCTCC M209069。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一所述MRS固体培养基配方为：葡萄糖1g/100mL、蛋白胨1g/100mL、吐温80 0.1mL/100mL、磷酸氢二钾0.2g/100mL、乙酸钠0.5g/100mL、柠檬酸三铵0.2g/100mL、硫酸镁0.02g/100mL、琼脂2g/100mL和蒸馏水，pH值6.0-6.5。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤一中28～31℃恒温静置倒置培养40～55小时。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤一中30℃恒温静置倒置培养48小时。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤二所述MRS液体培养基配方为：葡萄糖1g/100mL、蛋白胨1g/100mL、吐温80 0.1mL/100mL、磷酸氢二钾0.2g/100mL、乙酸钠0.5g/100mL、柠檬酸三铵0.2g/100mL、硫酸镁0.02g/100mL和蒸馏水，pH值6.0-6.5。其它与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤二中于28～31℃、130～160rpm振荡培养30～40小时。其它与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤二中于30℃、140rpm振荡培养24小时。其它与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤三中于8000转/分离心10～15分钟。其它与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：步骤四中以2％接种量将种子液接入发酵培养基。其它与具体实施方式一至八之一相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是：步骤四所述发酵培养基配方为：魔芋粉1g/100mL、蛋白胨1g/100mL、吐温80 0.1mL/100mL、磷酸氢二钾0.2g/100mL、乙酸钠0.5g/100mL、柠檬酸三铵0.2g/100mL、硫酸镁0.02g/100mL和蒸馏水pH值6.0-6.5。其它与具体实施方式一至九之一相同。
具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式一至十之一不同的是：步骤五中将发酵液于8000转/分离心10～15分钟。其它与具体实施方式一至十之一相同。
下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：本实施例利用魔芋粉为碳源培养乳酸菌生产β-甘露聚糖酶的方法，包括以下步骤：
一、将-80℃保存的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)HDRS1接种于MRS固体培养基平板上，30℃恒温静置倒置培养48小时；
二、挑取单菌落至MRS液体培养基中，30℃、140rpm振荡培养24小时；
三、然后于8000转离心10分钟，弃上清收集菌体，以空白液体MRS培养基调整细胞浓度至108个/mL，作为种子液；
四、以2％(v/v)接种量将种子液接入发酵培养基，30℃、140rpm振荡培养72小时，得发酵液；
五、将发酵液于8000转离心10分钟，弃菌体，上清即为甘露聚糖酶粗酶液。
步骤一所述植物乳杆菌HDRS1为乳杆菌属细菌，2009年4月13日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，编号：CCTCC M209069。
本方法中甘露聚糖酶活性测定方法为改良的DNS法：以pH 4.0柠檬酸缓冲液配制0.5％去除还原糖的魔芋粉溶液为反应底物。取发酵液上清2mL，加入2mL反应底物，50℃保温15分钟。加入DNS试剂3mL，沸水浴中煮沸5分钟，冷却后加蒸馏水补足体积至25mL。540nm下测定吸光度值，计算还原糖量。一个酶活单位以每分钟产生1微摩尔甘露糖计。
本实施例制备的粗酶液甘露聚糖酶活力为195.6U/mL。
本实施例以廉价原料魔芋粉为唯一碳源培养基，以植物乳杆菌为生产菌株，发酵生产甘露聚糖酶。该方法生产成本低、发酵周期短仅为1.5天、生产菌株无生物安全隐患。