专利名称：一种枯草芽孢杆菌菌株a97、菌剂及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及ー种枯草芽孢杆菌菌株A97、菌剂及制备方法和应用。
背景技术：
水果和蔬菜因富含碳水化合物、有机酸、维生素及无机盐而受到人们的欢迎，但是由于自身低PH值、高水分、高养分以及采收时易受机械创伤等特点，在采收后极易受真菌病害侵染，由此导致的腐烂会严重地影响到产品的最終消费。据统计，我国作为世界第一果蔬生产大国(产量约占全球总量的14%)，毎年由于采收后真菌侵染导致果蔬产品的经济损失率高达产值的20% 30%，价值超过700多亿元。针对果蔬采收后病害的防治，国内外常用的方法主要有低温法、气调法、化学杀(抑)菌剂处理等方法。前两种方法投资大、能耗高，且对于病害真菌的抑制作用有限，所以目前仍然以施用化学杀菌剂为主要防治手段，常用的方法有50%抑霉唑乳剂500倍液、50%扑海因可湿性粉剂500倍液浸果I 2min ；50%多菌灵、50%托布津或75%代森锰锌500 800倍液喷施等。但随着全世界对于食品安全和环境污染的日益关注，以及长期使用化学农药处理导致大量病原菌产生耐药性等问题的出现，使得开发新型防治技术的呼声不断高涨。利用生防菌进行果蔬采后病害的生物防治具有无毒害、无污染、环境可控性強、使用方法简便等优点，该技术已经成为目前国内外果蔬贮藏保鲜研究的热点。在这ー领域中，美国、以色列和南非等国处于领先地位，并已有相关的成果被商品化应用，如Aspire，Bio-save, Yield Plus 等。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)具有生长迅速,易分离培养,能产生抗逆性强的芽孢，贮藏期长及使用方便等特点，此外作为自然界中广泛存在的非致病菌，枯草芽孢杆菌对人畜无害且不会造成环境污染，以上优势使其成为ー种理想的生防微生物。自1945年Johnson发现枯草芽孢杆菌可以产生抗菌物质后，芽孢杆菌便成为各国学者广泛关注的一类生防细菌，并在多种农作物上进行了广泛的抗病实验。大量的研究实验表明枯草芽孢杆菌对于多种农作物具有显著的抗病增产作用，而且与化学农药的相容性也明显优于非芽孢杆菌和真菌生防菌。而且由于芽孢杆菌能够形成内生芽孢，具有极强的抗逆能力，利于菌剂的生产和使用。因此，筛选对于病原菌具有抑制作用的枯草芽孢杆菌是防治有关植物病害的最有效方法之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种枯草芽孢杆菌菌株A97，具有高效、广谱杀菌活性，用于防控果蔬采后储藏期真菌侵染。本发明的目的还在于提供基于枯草芽孢杆菌菌株A97的微生物菌剂、该微生物菌剂的制备方法以及使用方法和该微生物菌剂在防治果蔬采后病害上的应用。本发明所采用的技术方案是,一种枯草芽孢杆菌菌株A97 (Bacillus subtilisA97)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.5840。ー种微生物菌剂，活性成分为权利要求I所述的枯草芽孢杆菌A97菌体及其胞外代谢产物。所述微生物菌剂为液态菌剂。所述微生物菌剂的制备方法，具体步骤如下步骤I、菌种活化将低温保存的枯草芽孢杆菌菌株A97接种在营养琼脂平板培养基上进行活化培养，在28°C 33°C下培养20 24小时；然后挑取单菌落接种于营养琼脂斜面培养基上进行扩增培养，在28°C 33°C下培养20 24小时；再用无菌水将菌体洗脱，获得的洗脱液作为种子培养的接种液；步骤2、种子液的制备在经过高压湿热灭菌的种子培养基中接入步骤I得到的接种液，所用种子培养基和接种液的体积比为I =0. 1% I :1%，在28°C 33°C且初始pH值为7. O 8. O的条件下震荡培养12 16小时，得到种子液；步骤3、发酵培养将步骤2得到的种子液接入发酵培养基中，所用发酵培养基和种子液的体积比为I 1% I :10%，在28°C 33°C且初始pH值在7. O 8. O条件下进行搅拌状态下的液体发酵，直至发酵液中芽孢产生率不低于90%且菌体浓度不低于101(lCFU/ml ；步骤4、液体菌剂制备将步骤3得到的发酵液与添加剂混匀溶解后制成微生物菌剂，所用添加剂中各组分分别与发酵液的比例为几丁质O. 1% O. 5%Kg/L，普鲁兰多糖O. 5% 5%Kg/L，羧甲基纤维素钠 O. 5% 2%Kg/L, CaCl2O. 5% 3%Kg/L。 步骤2中，所用种子培养基的组分及其质量百分比为葡萄糖2% 4%，可溶性淀粉 2% 4%,蛋白胨 2% 5%,NaCl O. 3% O. 5%, CaCO3O. 01% O. 03%,MgSO4 ·7H20 O. 02% O. 04%，余量为水，以上各组分的重量百分比总和为100%。步骤3中，所用发酵培养基的组分及其质量百分比为玉米粉2% 4%，豆饼粉2% 4%,鱼骨粉 O. 5% 1%，NaCl O. 3% O. 5%, KH2PO4O. 01% O. 03%, MgSO4 · 7H20 O. 02%
O.04%，余量为水，以上各组分的重量百分比总和为100%。步骤4中，所用几丁质、普鲁兰多糖、羧甲基纤维素钠以及CaCl2均为食品级。所述微生物菌剂的使用方法，将微生物菌剂按I :10 I :100的体积比例用水稀释，然后将稀释后的微生物菌剂液体于果实采收前进行喷雾，或在果实采收分拣后浸果处理 Imin 3min。所述的微生物菌剂在防治果蔬采后病害上的应用。本发明的有益结果是本发明枯草芽孢杆菌菌株A97和微生物菌剂能用于广谱高效防治多种病原菌引起的果蔬腐烂，为果蔬储藏期的防腐保鲜提供了ー种生物防治的新途径。其抑菌效果显著，对病原真菌的抑菌效果达到了 60. 58% 95. 30% ;抑菌谱广，对于多种植物(包括单子叶植物和双子叶植物)的常见真菌病害都有较好的抑制作用；无污染，无毒害，无残留，对环境友好，对于减少果蔬采后损失和提高产品质量具有重要作用，同时可提高我国农产品的国际竞争力。本发明制备方法简单、成本低廉、易于推广应用。
图I是本发明枯草芽孢杆菌菌株A97的对于靶标菌的抑菌效果图；图2是本发明枯草芽孢杆菌菌株A97的16SrRNA序列构建的系统发育树；图3是本发明枯草芽孢杆菌菌株A97的在果实伤ロ处对病原菌的抑制作用图。本发明枯草芽孢杆菌菌株A97在2012年3月2日提交中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No. 5840，生物学命名Bacillus subtilis,保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。
具体实施例方式以下实施例用于对本发明作进ー步的详细说明。实施例I本发明枯草芽孢杆菌菌株A97的筛选分离过程枯草芽孢杆菌菌株A97由陕西省微生物研究所从秦岭野生银杏树组织中分离得至IJ。2008年陕西省微生物研究所自太白山自然保护区内采集野生银杏组织样本，将所采样品以蒸馏水清洗干净后进行表面除菌，用经过灭菌处理的枝剪、解剖刀及打孔器将经过表面消毒的叶片、树皮打孔成约lcm2的小块，根、茎、枝则切成约O. 5cm Icm左右的小段(两端均需有切ロ)。组织块表面消毒采用三步法，表面消毒方法及处理时间具体如下表所示。
步骤I步骤2步骤3
75%乙醇(min) 3.5%次氯酸钠(min) 75%乙,(min)
根、茎·5.102-;----
叶35I
枝条3102
果实3102将经过表面消毒的组织块用无菌研钵研磨，并用4层灭菌纱布过滤。滴加200 μ L滤汁与MEA培养基平板上，涂布均匀后于28°C培养3 15天，分别进行细菌、真菌和放线菌的分离纯化，并以拓展青霉(Penicillium expansum)、尖孢铼刀菌(Fusarium oxysporum)以及番爺早疫病(Alternaria solani)为祀标菌进行拮抗菌的筛选,结果从中筛选出ー株对各供试病原菌均具有明显抑菌效果的菌株，定名为枯草芽孢杆菌菌株A97。本发明枯草芽孢杆菌菌株A97的特征(I)形态特征在营养琼脂培养基上培养菌体为杆状，具鞭毛，大小约O. 8X3. O μ m ;芽孢为柱状，中生或近中生，孢子囊无明显膨胀。培养初期菌落为淡乳白色，脓状，圆形，边缘整齐，菌落隆起成馒头状，表面湿润，直径Imm 2mm ;培养后期菌落呈淡黄色，边缘不规则，表面干燥有褶皱；在液体培养基中静置培养，表面形成白色菌膜。(2) 16S rRNA 序列测定用于扩增细菌16S rRNA的引物为Primer A:5/ -AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'；Primer H:5/ -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'；PCR 扩增反应条件为95 °C 2min ；95 °C Imin ；50°C 2min，72°C 2. 5min，共 35 次循环；72°C延伸5min。PCR扩增产物以I. 5%的琼脂糖凝胶电泳检查，并以QIAEX II GelExtraction System(Qiagen)回收纯化后进行序列測定。米用 DDBJ (DNA Date Bank ofJapan)中FASTA程序对所测DNA序列与Bacillus subtilis的16S rRNA进行同源性比较， 并利用ClustalX I. 83及MEGA 4. O软件进行系统发育分析。结果表明，枯草芽孢杆菌菌株A97与Bacillus subtilis的16S rDNA核苷酸序列的同源性均在99%以上。(3)生理生化特征参考《伯杰氏细菌鉴定手册(第八版中文)》(R. E.布坎南等科学出版社，1984年)所述方法对枯草芽孢杆菌菌株A97进行生理生化检测。结果如下表所示，枯草芽孢杆菌菌株A97的生理生化特征与文献所述枯草芽孢杆菌生理生化特征基本一致。同时，如图2所示，16S rDNA序列同源比对及所构建的系统发育树进ー步确认生理生化鉴定結果，鉴定该菌株为属于一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
鉴别特征枯草芽孢杆菌菌株A97
革兰氏染色+
芽孢染色+
运动性+
厌氧生长+
接触酶+
D-葡萄糖产酸+
葡萄糖产气
V. P+
淀粉水解+
硝酸盐还原+
明胶液化+
权利要求
1.一种枯草芽孢杆菌菌株A97 (Bacillus subtilis A97),保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 5840。
2.ー种微生物菌剂，其特征在干，活性成分为权利要求I所述的枯草芽孢杆菌A97菌体及其胞外代谢产物。
3.按照权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为液态菌剂。
4.一种权利要求2或3所述微生物菌剂的制备方法，其特征在于，具体步骤如下步骤I、菌种活化将低温保存的枯草芽孢杆菌菌株A97接种在营养琼脂平板培养基上进行活化培养，在28°C 33°C下培养20 24小时；然后挑取单菌落接种于营养琼脂斜面培养基上进行扩增培养，在28°C 33°C下培养20 24小时；再用无菌水将菌体洗脱，获得的洗脱液作为种子培养的接种液；步骤2、种子液的制备在经过高压湿热灭菌的种子培养基中接入步骤I得到的接种液，所用种子培养基和接种液的体积比为I :0. 1% I :1%，在28°C 33°C且初始pH值为7. O 8. O的条件下震荡培养12 16小时，得到种子液；步骤3、发酵培养将步骤2得到的种子液接入发酵培养基中，所用发酵培养基和种子液的体积比为I :1% I :10%，在28°C 33°C且初始pH值在7. O 8. O条件下进行搅拌状态下的液体发酵，直至发酵液中芽孢产生率不小于90%且菌体浓度不低于101(lCFU/ml ；步骤4、液体菌剂制备将步骤3得到的发酵液与添加剂混匀溶解后制成微生物菌剂，所用添加剂及其分别与发酵液的比例为几丁质O. 1% O. 5%Kg/L，普鲁兰多糖O. 5% 5%Kg/L，羧甲基纤维素钠O. 5% 2%Kg/L, CaCl2O. 5% 3%Kg/L。
5.按照权利要求4所述的微生物菌剂制备方法，其特征在于，步骤2中，所用种子培养基的组分及其质量百分比为葡萄糖2% 4%，可溶性淀粉2% 4%，蛋白胨2% 5%，NaClO. 3% O. 5%, CaCO3O. 01% O. 03%, MgSO4 · 7H20 O. 02% O. 04%，余量为水，以上各组分的重量百分比总和为100%。
6.按照权利要求4所述的微生物菌剂制备方法，其特征在于，步骤3中，所用发酵培养基的组分及其质量百分比为玉米粉2% 4%，豆饼粉2% 4%，鱼骨粉O. 5% 1%，NaClO. 3% O. 5%, KH2PO4O. 01% O. 03%, MgSO4 · 7H20 O. 02% O. 04%,余量为水，以上各组分的重量百分比总和为100%。
7.按照权利要求4所述的微生物菌剂制备方法，其特征在于，步骤4中，所用几丁质、普鲁兰多糖、羧甲基纤维素钠以及CaCl2均为食品级。
8.权利要求2所述的微生物菌剂的使用方法，其特征在于，将微生物菌剂按I:10 I :100的体积比例用水稀释，然后将稀释后的液体微生物菌剂于果实采收前进行喷雾，或在果实采收分拣后浸果处理Imin 3min。
9.权利要求2所述的微生物菌剂在防治果蔬采后病害上的应用。
全文摘要
本发明公开了一种枯草芽孢杆菌菌株A97，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5840。本发明还提供了基于枯草芽孢杆菌菌株A97的微生物菌剂、该微生物菌剂的制备方法以及使用方法和该微生物菌剂在防治果蔬采后病害上的应用。本发明具有高效、广谱杀菌活性，能用于防控果蔬采后储藏期真菌侵染。
文档编号C12R1/125GK102827790SQ201210249549
公开日2012年12月19日 申请日期2012年7月19日 优先权日2012年7月19日
发明者李勃, 柯杨, 马瑜 申请人:陕西省微生物研究所