先于胸腺再活化的移植物耐受的制作方法

专利名称：先于胸腺再活化的移植物耐受的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞免疫学和移植物移植领域。更具体地，本发明涉及增强骨髓(BM)的造血和功能性、增强造血干细胞移植(HSCT)后的BM植入(engraftment)、以及增加新的和已有的T细胞及免疫系统的其他细胞的功能性。本发明也涉及提高受者对异基因移植物的接受性。
背景技术：
免疫系统免疫系统的主要功能是区分“外来的”(即来源于身体以外的任何来源)抗原和“自身的”(即来源于身体内)抗原，并据此应答以保护身体抵抗感染。更为实用的说法是，免疫应答也已经被描述为对危险信号的应答。这些危险信号可以是细胞或组织性能的任何变化，它们提醒免疫系统的细胞这个有问题的细胞不再是“正常的”。这样的提醒在引起例如对外来因素如病毒、细菌、寄生虫和真菌感染的排斥上是非常重要的，它们也可被用于诱导抗肿瘤应答。但是，这样的危险信号也可以是启动自身免疫性疾病的原因，因为自身细胞内的任一不适当的细胞改变都使得自身细胞成为免疫系统所靶向的细胞(例如糖尿病中的胰腺的β胰岛细胞)。或者，对免疫细胞本身的不适当的刺激除了诱导的初始应答的外来细胞或微生物之外，也能导致对正常的自身细胞的损害。
在正常的免疫应答中，事件的顺序包括专职的抗原呈递细胞(APC)捕获抗原并将它们处理成小的肽片段，这些肽片段位于APC表面的主要组织相容性复合物(MHC)分子的裂隙(cleft)内。MHC分子可以是在所有有核细胞上所表达的I型(被细胞毒T细胞(Tc或CTL)所识别)或是主要在免疫系统的细胞上所表达的II型(辅助T细胞(Th)所识别)。细胞识别APC上的MHC II/肽复合物并应答。然后这些细胞所释放的因子促进了特异于特殊抗原的Tc细胞或产抗体的B细胞之一或两者的活化。事实上，HIV/AIDS最好地说明了Th细胞在所有免疫应答中的重要性，因为经病毒破坏所引起的Th细胞的缺乏造成了严重的免疫缺陷，最终导致机会性感染而死亡。Th(以及在较低的程度上，Tc)的不适当的发育也能导致各种不同的病变例如过敏、癌症和自身免疫。
这些细胞的不适当发育可以是因为异常的胸腺，其中胸腺的结构组成被明显地改变了，例如在许多自身免疫性疾病中，成熟胸腺细胞发育所需的髓质上皮细胞被异位表达于不成熟T细胞所正常位于的皮质中。这可能意味着发育中的不成熟T细胞过早地接受了晚期的成熟信号并因此变得对阴性选择信号不敏感，阴性选择信号正常地将去除潜在的自身反应性细胞。在发生狼疮样症状的NZB小鼠中(Takeoka et al.，(1999)Clin.Immunol.90388)以及更为最近的在发生I型糖尿病的NOD小鼠中(Thomas-Vaslin et al.，(1997)P.N.A.S.USA 944598；Atlan-Gepner et al.，(1999)Autoimmunity 3249-260)的确都发现了这种类型的胸腺异常。还不知道这些形式的胸腺异常是怎样或何时发生的，但是它们的发生可以通过自然的衰老过程或是因为破坏性因素例如病毒感染(在AIDS患者中已经描述了胸腺的变化)、应激、化疗和放射治疗(Mackall et al.，(1995)N.Eng.J.Med.332143；Heitger et al.，(1997)Blood 994053；Mackall andGress，(1997)Immunol.Rev.16091)。出生时即存在缺陷也是有可能的。
T和B淋巴细胞的细胞膜受体具有识别抗原的能力。这些受体是通过一系列复杂的多种可能基因的重排随机生成的，这样每个个体的T或B细胞都具有唯一的抗原受体。这种巨大的潜在的多样性意味着对于任何一种机体可能会遇到的单一抗原，多个淋巴细胞能以不同程度的结合强度(亲和力)将其识别并引发不同程度的应答。既然抗原受体的特异性是随机出现的，那么所出现的问题是为什么机体不会通过抗自身抗原的淋巴细胞而发生自身破坏。幸运的是，有一些机制预防T和B细胞进行这样的自身破坏。总的来说，这些机制产生了一种免疫系统对自身耐受的状态。
自身耐受的最有效形式是在产生潜在的反应性淋巴细胞的部位中将它们全部都物理地去除或杀死。这些部位包括产生T细胞的胸腺和产生B细胞的BM。这被叫做中枢耐受(central tolerance)。一种重要的、附加的耐受方法是通过调节Th细胞，它或直接地或通过产生细胞因子抑制自身反应性细胞。假定所有的免疫应答事实上都需要T辅助细胞的启动和调节，任何耐受诱导方案的一个主要目标就是靶向于这些T辅助细胞。相似地，既然Tc细胞是非常重要的效应细胞，那么它们的产物就是例如抗癌症和抗病毒治疗策略的一个主要目标。另外，T调节细胞(Treg)例如CD4+CD25+和NKT细胞提供了一种工具，因为它们能抑制潜在的自身反应性细胞。
胸腺胸腺主要包括分散在不同间质细胞(主要是上皮细胞亚组)内的发育中的胸腺细胞(胸腺内的T淋巴细胞)，这些间质细胞构成微环境并提供T细胞的最优化发育所必需的生长因子(GF)和细胞相互作用。
胸腺是免疫系统中的一个重要器官，因为它是产生T淋巴细胞的主要部位。胸腺的作用是如下所述的从血液中吸引到合适的BM来源的前体细胞(precursor cells)，并诱导它们定型为T细胞系，包括产生针对抗原的T细胞受体(TCR)所必需的基因重排。每个T细胞都具有单一的TCR类型并在其特异性上是唯一的。与这种TCR生成相关的是细胞分裂，它扩增了具有TCR类型的T细胞数目并因此增加了每种外来抗原都将被识别和清除的可能性。但是，与B细胞不同，T细胞识别抗原的唯一特点是TCR只识别与MHC分子物理相连的肽片段。正常地，这是自身MHC，并且在胸腺中选择识别自身MHC/肽复合物的能力或TCR。这个过程被称为正向选择并是一种皮质上皮细胞的排他性特征。如果TCR不能与自身MHC/肽复合物结合，T细胞将死于“忽略”，因为T细胞为了它的持续存活和成熟需要一定程度的经TCR的信号转导。
既然TCR基因重排的结果是一个随机事件，那么一些T细胞将偶然地发育为能以高亲和力识别自身MHC/肽复合物的T细胞。因此，这些T细胞是潜在的自身反应性的，并涉及自身免疫性疾病，例如多发性硬化(MS)、类风湿关节炎(RA)、糖尿病、甲状腺炎和系统性红斑狼疮(SLE)。幸运的是，如果TCR与自身MHC/肽复合物的亲和力太高并且T细胞在胸腺中遇到了这种特异性复合物，那么发育中的胸腺细胞被诱导为进行自杀性活化并死于凋亡，这个过程被叫做负选择。这个过程也被叫做中枢耐受。这些“对自身具有高亲和力”的T细胞死亡而不是应答，是因为在胸腺中它们仍是不成熟的。胸腺中这种负选择的最有力的诱导物是被叫做树突状细胞(DC)的APC。DC将最强烈的信号传递给T细胞，造成了胸腺内的去除。但是，在外周淋巴器官中，T细胞是更成熟的，给相同的TCR呈递相同的MHC/肽复合物的DC将引起具有TCR的T细胞的活化。
胸腺萎缩和衰老虽然胸腺对于功能性免疫系统是重要的，它每天释放约它的T细胞含量的1％到血流中，但是哺乳动物和其他动物的中一个明显异常是性类固醇(sex steroid)产生所造成的这个器官的严重萎缩。这种萎缩在约5-7年时间内逐步发生，在20岁左右达到最低水平的T细胞输出(Douek et al.，Nature(1998)396690-695)，这种萎缩与在对糖皮质激素的应激应答期间所诱导的可逆性萎缩不同。在结构上，胸腺萎缩包括淋巴细胞含量的进行性缺失、皮质上皮网络的塌陷、细胞外基质材料的增加以及脂肪细胞(脂细胞)和脂类沉积物对腺体的浸润(Haynes et al.，(1999)J.Clin.Invest.103453)。这个过程可以开始于年幼的儿童(例如年龄5岁左右，Mackallet al.，(1995)N.Eng.J.Med.332143)，但是它在性类固醇水平达到最高峰的青春期时是最明显的。
在外周可反映出胸腺萎缩的影响，它减少了胸腺对T细胞池的输出，这造成了较少变化的TCR库(因为只有新的原初T细胞才能提供)。也观察到了改变了的细胞因子值(Hobbs et al.，(1993)J.Immunol.1503602；Kurashimaet al.，(1995)Int.Immunol.797)、CD4+和CD8+亚组的变化、向与原初T细胞相反的记忆T细胞的偏倚(Mackall et al.，(1995)N.Engl.J.Med.332143)、以及对抗原或促有丝分裂刺激的应答能力的下降。
既然胸腺是外周T细胞池的生成和维持的主要部位，这种萎缩已经被广泛地认定为是老年人的基于免疫的疾病的发病率增加的主要原因。特别地，病变例如普遍的免疫缺陷、对机会性感染和疫苗的弱应答性以及自身免疫性疾病频率的增加，如多发性硬化、类风湿关节炎和狼疮(Doria et al.，(1997)Mech.Age.Dev.95131-142；Wey and et al.，(1998)Mech.Age.Dev.102131-147；Castle，(2000)Clin Infect Dis 31(2)578-585；Murasko et al.，(2002)Exp.Gerontol.37427-439)都随着年龄增加了它们的发病率和严重性。经常通过T细胞依赖性免疫功能(例如溶细胞性T细胞活性和促有丝分裂的应答)的减低来说明这些免疫系统的缺陷。虽然稳态机制保持了健康个体的T细胞数目，当例如在AIDS和化疗或放射治疗后有着T细胞的大量丧失时，成人患者高度易感于机会性感染，因为所有的这些病变都包括T细胞和/或其他血细胞(见下)的缺失。淋巴细胞的恢复也是严重滞后的。萎缩的胸腺不能重建在HIV感染期间所缺失的CD4+T细胞(Douek et al.Nature(1998)396690-695)，以及与青春期前患者比较，化疗之后的CD4+T细胞在青春期后患者中要花3到4倍更长的时间才能恢复到正常水平(Mackall et al.(1995)N.Engl.J.Med.332143-149)。因此，这些患者缺少应答感染所必需的细胞，他们出现严重的免疫抑制(Mackall et al.，(1995)N.Eng.J.Med.332143；Heitger etal.，(2002)Blood 994053)。在生命的后期也有癌症和肿瘤负荷的增加(Hirokawa，(1998)″Immunity and Ageing，″inPRINCIPLES ANDPRACTICE OF GERIATRIC MEDICINE，(M.Pathy，ed.)John Wiley andSons Ltd；Doria et al.，(1997)Mech.Age.Dev.95131；Castle，(2000)Clin.Infect.Dis.31578)。
但是，Douek等最近的工作((1998)Nature 396690)已经表明在老年人(例如甚至65岁以上以及老年HIV患者的抗逆转录病毒治疗之后)中仍有胸腺输出的发生，尽管只有非常少量的输出(约为青年人水平的5％)。具有T细胞受体删除环(T Cell Receptor Excision Circles，TREC；TREC是作为针对抗原的TCR的产生过程的一部分而形成的，并且只发现于新产生的T细胞上)的T细胞的存在举例说明了这一点。此外，Timm和Thoman((1999)J.Immunol.162711)已经显示尽管老龄小鼠在骨髓移植(BMT)后再生了CD4+T细胞，但是因为衰老的外周微环境，这些T细胞显示出了向记忆细胞的偏倚并伴有弱的胸腺原初T细胞的产生。也已经分析了造血干细胞移植后的TREC水平(Douek et al.，(2000)Lancet3551875)。
胸腺和神经内分泌轴胸腺很大程度上受其与神经内分泌系统的双向交流的影响(Kendall，(1988)″Anatomical and physiological factors influencing the thymicmicroenvironment，″in THYMUS UPDATEI，Vol.1.(M.D.Kendall，and M.A.Ritter，eds.)Harwood Academic Publishers，p.27)。特别重要的是垂体、肾上腺和性腺之间对胸腺功能的相互作用，包括营养作用(trophic effects)(促甲状腺激素或TSH和生长激素或GH)和萎缩作用(atrophic effects)(促黄体生成激素或LH、促卵泡生成激素或FSH、和促肾上腺皮质激素或ACTH)(Kendall，(1988)″Anatomical and physiological factors influencingthe thymic microenvironment，″in THYMUS UPDATEI，Vol.1.(M.D.Kendall，and M.A.Ritter，eds.)Harwood Academic Publishers，p.27；Homo-Delarche et al.，(1993)Springer Sem.Immunopathol.14221)。事实上，胸腺生理的一个特征性特点是结构和功能的进行性退化，这与青春期时的循环的性类固醇产生的增加是相当的，这在人类通常是从年龄12-14岁之前逐步发生的(Hirokawa and Makinodan，(1975)J.Immunol.1141659；Tosi et al.，(1982)Clin.Exp.Immunol.47497；and Hirokawa，etal.，(1994)Immunol.Lett.40269)。
胸腺主要包括分散于不同间质细胞(主要为上皮细胞亚组)内的发育中的胸腺细胞，这些间质细胞构成了微环境并提供了T细胞的最优化发育所必需的生长因子和细胞相互作用。已经确定出激素的精确靶点以及它们诱导胸腺萎缩和提高免疫应答的机制。然而，对睾丸女性化突变小鼠的检查表明必须在胸腺的间质细胞上表达有功能性的性类固醇受体时才会发生萎缩。胸腺细胞与控制它们的分化和成熟的上皮细胞亚组之间的共发育关系(Boyd et al.，(1993)Immunol.Today 14445)意味着性类固醇抑制能发生在任一种细胞类型的水平，然后这将影响其他细胞类型的状态。在老年患者中，骨髓干细胞的数目被减少并且在质量上是不同的。HSC能重新入巢胸腺，尽管是以比年轻患者更低的程度。因此，影响胸腺萎缩的主要因素似乎是胸腺内因素。此外，老龄动物中的胸腺细胞(例如＞18个月的动物)至少保留有一定程度的分化能力(George andRitter，(1996)Immunol.Today 17267；Hirokawa et al.，(1994)ImmunologyLetters 40269；Mackallet al.，(1998)Eur.J.Ilnmunol.281886)。然而，Aspinall最近的工作已经显示在年老小鼠中，有着胸腺细胞生成的缺陷，它表现为三阴性前体细胞群内的阻断，即CD44+CD25+(TN2)期(Aspinall et al.，(1997)J.Immunol.1583037)。
造血作用骨髓和造血干细胞免疫系统的主要细胞是B和T淋巴细胞(一种白细胞的主要类型)，以及抗原呈递细胞(APC)。所有的免疫细胞都基本上来源于造血干细胞和它们的子代(普通淋巴祖细胞(CLP)和普通髓系祖细胞(CMP)，两者都是在BM中生成的)。一些前体细胞移居到胸腺并转化为T细胞和胸腺DC。DC在诱导自身耐受上发挥着作用。
只有很少比例(在年轻动物中为近0.01％)的HSC从BM中被释放出来并经血液供应找到到达胸腺的途径，在这里它们进行分裂和成熟以形成T细胞，然后返回到体循环中。这些新的新近胸腺迁出(RTE)细胞形成了免疫系统的大部分，以及它们主要是Th和Tc细胞并且在保持新的具有不同的TCR库的T细胞的恒量供应以启动几乎所有的免疫应答上是重要的。在离开胸腺之前，Th和Tc细胞能有效地区分外来抗原，原因如上所述。T细胞在胸腺中被“选择”，使得留下那些将机体内的所有细胞识别为自身的并在正常情况下不会应答对抗自身细胞的T细胞。
B细胞最终也来源于HSC，并在离开BM进入外周免疫系统之前在BM内发育。在与T细胞及免疫系统的其它细胞相互作用之后，B细胞发育成产生并释放大量抗体的浆细胞，这些抗体有助于机体消灭感染性有机体和异常细胞。
BM所产的其它HSC也被用于生成所有的其它血细胞例如NK细胞、调控细胞、普通髓系祖细胞来源的细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、血细胞和红细胞。
造血干细胞移植通常也被称为骨髓移植(BMT)的造血干细胞移植(HSCT)是一种用于增强例如某些严重的癌症病变中的免疫系统的恢复的治疗。可以互换使用“HSCT”和“BMT”和“移植”，它们在此被定义为移植到受者内分移植物，其含有或富集了HSC、BM细胞、干细胞和/或任何其他的能生成血液、胸腺、BM和/或任何其他的免疫细胞的细胞，包括但不限于HSC、上皮细胞、普通淋巴祖细胞(CLP)、普通髓淋巴祖细胞(CMLP)、多系祖细胞(MLP)和/或骨髓的间质干细胞。在一些实施方式中，移植可以是外周血干细胞移植(PBSCT)。可以动员出BM的HSC，然后从血液中收集，或HSC是包含于从供者物理地提取出的BM内。HSC可以被纯化、浓缩，或只是所收集的BM或血液的一部分，然后HSC被注射到受者内。移植可以是异基因的、自体的、同基因的或异种的，以及可以包括任何数目的细胞的移植，包括“小移植(mini-transplants)”，它只包括较少数目.的细胞。在一些实施方式中，在性类固醇抑制之前、与之同时或之后进行HSCT。
HSC是非限制性的可示范的细胞类型，它可以被移植和/或被遗传学修饰，如在本申请书全文中所用的。然而，本领域人员在实践在此所提供的发明时很容易明白，不需要过多的试验，HSC就可以被许多替代细胞类型中的任何一种(或多种)细胞类型所替代，这些细胞包括，但不限于BM细胞、干细胞和/或其他任何的能生成血液、胸腺、BM和/或任何其他的免疫细胞的细胞，这些细胞包括但不限于HSC、上皮干细胞、CLP、CMLP、MLP和/或骨髓的间质干细胞。在一些实施方式中，HSC来源于胎肝和/或胎脾。
化疗和放射治疗都能消灭癌细胞。但是，因为缺乏特异性，这些治疗也杀死了健康细胞，实际上包括所有的白细胞(WBC)以及BM中的HSC。就是因为这种对WBC和HSC的破坏导致了患者对HSCT的需求。HSCT容许例如健康干细胞替代被例如化疗或放射治疗所损伤的干细胞和它们的子代细胞，健康干细胞最终可以生成患者所需的血细胞。
HSCT是多种血液肿瘤例如白血病和淋巴瘤(血液和免疫系统细胞的癌症)以及非恶性免疫疾病例如严重的联合免疫缺陷、Fanconi贫血、骨髓异常增生综合征、淀粉样变、再生障碍性贫血、Diamond Blackfan贫血、噬血细胞性淋巴组织细胞增多症、Kostmann综合征、Wiskott-Aldrich综合征、血小板减少症和血红蛋白病如镰状细胞病和地中海贫血的基本治疗。通常用骨髓清除或骨髓耗竭治疗白血病和淋巴瘤以清除癌细胞体，常常紧接着的是HSCT以恢复免疫功能。本发明的方法单独或联合(同时或依次)施与HSC动员剂例如细胞因子(如G-CSF或GM-CSF)或药物，容许更快的和更好的植入，也可以容许给予更大剂量和/或更频繁的化疗和放射治疗。
现代临床医学操作经常采用来源于另一个供者血液的HSC的移植(异基因HSCT)，其所具有的优点是供者T细胞抗宿主癌细胞的作用(移植物抗白血病(GVL))，但是这个优点通常被其他的T供者T细胞抗宿主的作用(移植物抗宿主(GVH)病)所制约，后者可以是致命的。既然HSCT的成功以及据此的患者的生存率与所注射的HSC的数目及植入的时间都直接相关，使用本发明的方法意味着现有的HSCT方案将会更为成功以及将有比现有可能的更多的患者能接受HSCT。
增强从骨髓中动员出HSC的机制对于保证从供者中收集到尽可能多的HSC是重要的。GM-CSF和G-CSF目前已经被用于这个目的。但是其他的药物例如化疗和细胞因子也已经显示出是有效的。更有效地动员HSC的能力具有超出血液学修复的应用。最近研究已经显示出HSC是多能的并且可以被用于受损组织的修复，例如心肌、骨骼肌、肝脏、骨骼、结缔组织、上皮组织、胰腺和血管系统。
现有HSCT策略的一个限制是与长时间免疫缺陷所造成的感染相关，特别是病毒、真菌和有荚膜细菌的感染，并且这仍是成人移植后发病率和死亡率的重要原因。与HSCT相关的感染通常是非常难以控制的，甚至用现代的抗微生物药物。儿童通常在HSCT后数月内恢复免疫能力(Parkman et al.，(1997)Immunol.Rev.15773)，这与成人受者的淋巴细胞恢复的延迟有着不同，这种延迟可以持续数年并且甚至可以是年轻最适度(young optimum)的非常差的反映。成人的这种延迟依赖于多种因素，但是对感染的易感性主要是因为公认的T和B细胞产生随年龄的退化(Parkman et al.，(1997)Immunol.Rev.15773)。
当所移植的细胞“排斥”供者细胞时，出现了现有HSCT的第二个限制。这在临床上被称作为“移植物抗宿主病”(GVHD)。自体移植可以避免GVHD。但是，与异基因移植比较，自体移植的总抗癌成功率更低。在癌症患者中，自体移植具有的缺点是它们不能产生移植物抗肿瘤(GVT)作用(这与GVH作用相似)，以及具有癌细胞可能随移植回输回到患者中的危险。已经发现在小鼠异基因HSCT模型中的性类固醇抑制和异基因HSCT的阉割受者都提高了髓系和淋巴两系细胞的移植后重建。在此所示的数据显示T和B细胞重建的显著增加，且没有GVHD的恶化和GVT活性的缺失(见例如实施例19)。
HSCT治疗的另一个限制是缺乏治疗所有潜在侯选者的供者。尽管脐带血(UCB)已经被利用到相当受限的程度，但是每个供者都只有很少的细胞，因此这主要已经被用于儿童，其中所需的HSC的总数较少(所需的HSC的数目与患者体重相关)。除了UCB，供者的供应量有限并且必须是可接受的MHC匹配的，否则GVH的危险就高。如果只需要较少的细胞，由于提高的植入或需要较不严格的匹配，因此就减少了排斥或GVH的危险，HSCT可能可以被使用地更为广泛例如用于治疗自身免疫性疾病，以及可以利用例如脐血的供源(例如，1.5×107细胞/kg用于植入受者)。
T细胞T细胞是免疫系统的主要成分，它在胸腺中生成。最重要的T细胞是Th细胞，因为它们事实上是启动所有免疫应答的细胞。这些Th细胞的缺失(例如HIV感染、化疗、照射等所引起的)直接造成了免疫抑制以及对感染和肿瘤的必然的易感性，并且快速地发生死亡。Th细胞亚组的一个重要作用是调节免疫应答。对T和B细胞功能的增强和抑制之间的平衡对例如疫苗是否有效、癌症或肿瘤是否被攻击或移植是否被耐受或排斥都有重要作用。
胸腺在年轻时是非常有效的，随着年龄逐渐出现大小和功能输出上的退化。这在青春期开始时特别突出。因为胸腺输出与胸腺的细胞密度(cellularity)直接相关(Scollay et al.，(1980)Eur.J.Immunol.10210；Berzinset al.，(1998)J.Exp.Med.1871839)，年龄相关的胸腺萎缩造成了新近胸腺迁出(RTEs)的逐步减少(Steffens et al.，(2000)Clin.Immunol.9795；Sempowski et al.，(2002)Mol.Inzmunol.38841-848；Sutherland et al.，(submitted))和原初对记忆T细胞比值的减低(Ernst et al.，(1990)J.Inarnunol.1451295)；Kurashima et al.，(1995)Int.hrznmunol.797；Utsuyamaet al.，(1992)Mech.Ageing Dev.6357)，这造成了有限的CD4+和CD8+T细胞两者的TCR库(Mosley et al.，(1998)Cell.Immunol.18910；LeMaoult et al.，(2000)J.Immunol.1652367)。所以，应答于非特异的和受体介导的(CD3/TCR)刺激的T细胞增殖随着年龄是严重不足的(Hertogh-Huijbregts et al.，(1990)Mech.Ageing Dev.53141-155；Flurkeyet al.，(1992)J.Gerontol.47B115；Kirschmann et al.，(1992)Cell.Immunol.139426)。
随着年龄的增加，人类的免疫功能逐步退化；儿童的应答非常好，较年轻的成人应答适当，但是中年以上的成人的这种应答可能会非常差。这种退化表明了在所有应答中实际所参与的三种主要细胞类型的一或多种细胞类型的缺失或改变的存在(i)抗原呈递细胞(它们捕获抗原并将其呈递，并据此激活T淋巴细胞)；(ii)T淋巴细胞；和(iii)B淋巴细胞。这三种细胞类型的任何一种细胞类型的缺失或改变都可以解释为什么对抗原刺激的免疫应答可能是不满意的。缺失或改变可以是在细胞水平的或可以指的是数量或功能性的。其中，最可能的缺失是包含于T细胞群内，因为性类固醇的影响所造成的胸腺功能随年龄的显著退化。这导致了输出到血流中的新的或“原初”T细胞的缺失，而这是对新抗原的应答所必需的。除了潜在的应答T细胞数目缺失以外，性类固醇的存在可能将已有T细胞抑制到了一定的程度。
癌症治疗如上所述，用于治疗癌症的化疗和放疗对于患者的非癌细胞经常是有害的，特别是对血细胞。增加这些治疗的频率和剂量的主要限制是患者在治疗中幸存的能力并避免低下的免疫系统所造成的对机会性感染的易感性的能力。因此，如果免疫恢复能更快或损伤较轻，这对患者将极为有利。

发明内容
本发明涉及通过增强BM造血作用和功能性、增强HSCT后的BM植入、和经阻断性类固醇及其他激素的信号途径增加已有T细胞和其他免疫细胞的功能性，用于增强供者移植物接受的方法。通过增加经新生的胸腺功能所生成的原初T细胞、以及经活化的BM功能所生成的B淋巴细胞和免疫系统的其他细胞的水平也将增强免疫能力。
已经发现对性类固醇和/或其他激素的信号途径的中断通过直接作用或通过间接作用增强了BM、HSC、T细胞和免疫系统的其他细胞的功能性。这个发现已经被开发形成了本发明，在本发明的一个方面提供了增强BM造血作用和/或功能性的方法。在一些实施方式中，提高了已有的BM造血作用和/或功能性。在另一个实施方式中，患者接受HSCT，并提高了患者的HSC造血作用和/或植入。
在一个方面，本发明提供了增强HSCT后的植入的方法。在一个实施方式中，增强了BM的植入。在另一个实施方式中，增强了胸腺的植入和/或重建，据此最终诱导了胸腺恢复。仍在另一个实施方式中，增强了脾和/或其他淋巴器官、组织、和/或血液的植入和/或重建。在一些实施方式中，HSC是异基因的，以及在其他的实施方式中，HSC是自体的。在一个实施方式中，与在没有进行性类固醇信号途径(sex steroidsignaling)中断的HSCT的患者中已经存在的数目比较，增加了T细胞前体的数目。在其他的实施方式中，与在没有进行性类固醇信号途径中断的HSCT的患者中已经存在的数目比较，增加了总白细胞、供者来源的DC、BM前体细胞、HSC、CLP、MLP、淋巴细胞、髓细胞、粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、NK、NKT、血小板、原初T细胞、记忆T细胞、辅助T细胞、效应T细胞、调控T细胞、RBC、B细胞、供者和/或宿主来源的外周T细胞、APC和/或供者来源的外周B细胞的数目。仍在其他的实施方式中，患者在HSCT之后也接受了细胞因子(例如IL-7、SCF、IL-11、G-CSF、或GM-CSF)或激素(例如生长激素、或它的介导物胰岛素依赖性生长因子(IGF-1)或成纤维细胞生长因子家族的任一成员例如FGF7/角化细胞生长因子)治疗以增强免疫恢复和/或植入。在另一个实施方式中，本发明单独或联合施与促造血药物例如生长因子(例如，G-CSF或GM-CSF)，这容许更快的和/或更好的植入和/或入巢到靶组织中和/或增强免疫细胞的恢复。
在本发明的第二个方面，提供了增强HSCT后的患者的免疫细胞的功能性的方法。在一个实施方式中，免疫细胞是T细胞。在另一个实施方式中，提高了T细胞对T细胞受体(TCR)刺激的增殖应答性。在另一个实施方式中，提高了T细胞对抗原(例如，破伤风毒素(TT)或美洲商陆促有丝分裂剂(PWM))刺激的应答性。在一个实施方式中，提高了T细胞对回忆(recall)抗原的应答性(即提高的T细胞记忆应答)。仍在另一个实施方式中，提高了T细胞与共刺激或第二信号途径相关的增殖应答性。在一些实施方式中，提高了T细胞应答性的动力学。在其他实施方式中，提高了T细胞对APC所呈递的抗原的应答。在本发明的一些实施方式中，在移植后约5、4、3或2个月内提高了免疫细胞应答性。在本发明的特定的实施方式中，在移植后约1个月内提高了免疫细胞应答性。在本发明的其他实施方式中，在移植后2周内提高了免疫细胞应答性。在本发明的另一个实施方式中，在移植后1周内提高了免疫细胞应答性。仍在本发明的其他实施方式中，在移植后3天内提高了免疫细胞应答性。在其他实施方式中，在治疗后3个月或3个月以上提高了免疫应答，包括除了输出已有T细胞外还输出新的胸腺来源的T细胞。
在第三个方面，本发明提供了增强已有的免疫细胞功能性的方法，已有的免疫细胞包括但不限于外周的免疫细胞。在一个实施方式中，细胞是T细胞。在另一个实施方式中，细胞是DC或其他的APC。仍在另一个实施方式中，细胞是NK细胞或调控细胞，例如CD4+CD25+T细胞和自然杀伤T(NKT)细胞。在本发明的一个实施方式中，提高了患者的T细胞对TCR刺激的增殖应答性。在另一个实施方式中，提高了T细胞对抗原(例如TT、PWM或KLH)刺激的应答性。仍在另一个实施方式中，提高了T细胞对共刺激或第二信号途径的增殖应答性。在其他的实施方式中，提高了T细胞对APC所呈递抗原的应答性。在一个特殊的实施方式中，LHRH/GnRH类似物对已有的免疫细胞的应答性有着直接作用或间接作用。在一些实施方式中，本发明的方法使用性类固醇类似物(它的激动剂和拮抗剂)，例如GnRH/LHRH类似物，以阻断免疫细胞或骨髓的性类固醇介导的信号途径。在其他的实施方式中，类固醇类似物直接刺激(即直接增加它的功能活性)胸腺、BM、和/或已有的免疫系统的细胞例如T细胞、B细胞、和DC。
在第四个方面，本发明提供了增强患者中HSC植入和动员、或血液、HSC或BM供者的HSC动员的方法。在一个实施方式中，阻断性类固醇信号途径增加了外周的免疫前体细胞例如HSC、CD34+细胞、CLP、或CMP的数目和功能性。一个实施方式提供了一种用于增强HSC动员的方法，包括阻断性类固醇信号途径，其或单独地进行或联合施与HSC动员剂，例如细胞因子、GM-CSF、G-CSF、CSF、化疗剂、环磷酰胺、flt-3配体、KGF/FGF7或FGF家族的其他成员或IL-7。
在一个实施方式中，本发明提供了容许给予更高剂量和/或更频繁的化疗及放射治疗和/或容许免疫系统在化疗及放射治疗后更快恢复或受到更少损伤的方法。
在第五个方面，本发明提供了对性类固醇介导的对胸腺的信号途径的阻断以及随后的胸腺的再活化(reactivation)。在一个实施方式中，用阉割阻断性类固醇介导的信号途径。在一个特别的实施方式中，使用化学阉割。在另一个实施方式中，使用手术阉割(例如通过去除睾丸或通过卵巢切除术)。在一些实施方式中，发生了对性类固醇信号途径的完全抑制。在另一个实施方式中，发生了对性类固醇信号途径的部分阻断。在一个实施方式中，阉割将胸腺状态逆转到青春期前的状态，据此将其再活化。在另一个实施方式中，阉割改变了其他分子的水平，它们通过，例如对已有免疫细胞的直接作用，增强了免疫细胞应答性和/或增殖和/或活化状态。
在第六个方面，本发明提供了对性类固醇介导的对胸腺的信号途径的阻断以及随后的胸腺的再活化。在一个实施方式中，用阉割阻断性类固醇介导的信号途径。在一个具体的实施方式中，使用化学阉割。在另一个实施方式中，使用手术阉割(例如通过去除睾丸或通过卵巢切除术)。在一些实施方式中，发生了对性类固醇信号途径的完全抑制。在另一个实施方式中，发生了对性类固醇信号途径的部分阻断。在一个实施方式中，阉割将胸腺状态逆转到青春期前的状态，据此将其再活化。在另一个实施方式中，阉割改变了其他分子的水平，它们通过对已有免疫细胞的直接作用增强了免疫细胞应答性和/或增殖和/或活化状态。
在特定的实施方式中，通过施与性激素生成、作用、结合或信号途径的调节物可以直接地或间接地阻断(例如，抑制、灭活或使得无效)性类固醇介导的信号途径，这些调节物包括但不限于与性激素或它的受体结合的药物、性激素的激动剂或拮抗剂，包括但不限于GnRH/LHRH、抗雌激素剂和抗雄激素剂、SERM、SARM、抗雌激素抗体、抗雄激素配体、抗雌激素配体、LHRH配体、被动的(抗体)或主动的(抗原)抗LHRH(或其他的性类固醇)接种、或它们(“阻断物”)的组合。在一个实施方式中，使用一或多种阻断物。在一些实施方式中，通过肽持续释放制剂施与一或多种阻断物。在WO 98/08533中提供了肽持续释放制剂的实例，在此将其全部内容一同并入作为参考。


图1A-B阉割快速地再生了胸腺细胞密度。图1A-B是显示阉割之前和之后的胸腺重量和胸腺细胞数目的变化的图解表述。如胸腺重量(图1A)或每个胸腺的细胞数目(图1B)所测定的那样，胸腺萎缩造成了胸腺细胞数目随年龄的显著减少。对于这些研究，年老的(即2岁大的)小鼠被手术阉割。在年老的(1和2岁)及2-4周大的阉割后(post-cx)雄性小鼠中分析胸腺重量与体重的相关性(图1A)和胸腺细胞密度(图1B)。与年轻成体(2个月大)小鼠比较，看到胸腺重量和细胞密度随年老的显著减低。阉割恢复了这种胸腺重量和细胞数目的减低，尽管在阉割后1周仍有显著的细胞数目的减少(图1C)。在阉割后2周时，发现细胞数目增加到近似在年轻成体小鼠中所能看到的水平(图1B)。在阉割后3周时，细胞数目已经从年轻成体小鼠水平开始显著增加并在阉割后4周保持稳定(图1B)。结果用每组4-8只小鼠(图1A)或每组8-12只小鼠(图1B)的平均值±1SD表示。**＝p≤0.01；***＝p≤0.001，与年轻成体(2个月大)的胸腺及阉割后2-6周的小鼠的胸腺比较。
图2A-D阉割恢复了外周的CD4CD8T细胞的比值。对于这些研究，将年老(2岁大)小鼠手术阉割并在阉割后2-6周分析外周淋巴细胞群。图2A和2B显示了脾内的总淋巴细胞数目。脾的淋巴细胞数目随年龄和阉割后仍保持恒定，因为内环境稳态维持了脾内的总细胞数目(图2A和2B)。但是，枯竭了年老的(18-24个月大)小鼠的淋巴结的细胞数目(图2B)。阉割恢复了这种淋巴结细胞密度的减少。图3C显示脾或淋巴结内的B细胞对T细胞的比值都没有随年龄或阉割后而变化，也没有看到这个比值随年龄或阉割后的变化。但是，在(汇集的)淋巴结和脾内都看到了CD4+CD8+T细胞比值随年龄的显著降低(p≤0.001)(图2E)。在阉割后4-6周时，这种降低被恢复到年轻成体(即2个月大)的水平(图2D)。
结果用每组4-8只小鼠(图2A、2C和2E)或8-10只小鼠(图2B、2D和2F)的平均值±1SD表示。*＝p≤0.05；**＝p≤0.01；***＝p≤0.001，与年轻成体(2个月大)和阉割后小鼠比较。
图3虽然有胸腺萎缩或阉割后的再生，但胸腺细胞亚群仍被保持于相似的比例。对于这些研究，将年老(2岁大)小鼠阉割并根据标记物CD4和CD8分析胸腺细胞亚组。显示了年轻成体(2个月大)、年老(2岁)和年老的、阉割后动物(2岁，阉割后4周)的CD4-CD8-DN、CD4+CD8+DP、CD4+CD8-和CD4-CD6+SP胸腺细胞群的CD4(X轴)对CD8(Y轴)的代表性的荧光激活细胞分类器(FACS)值。在每个曲线的上方都给出了每个象限的百分比。任何CD4/CD8所定义的亚组的比例随着年龄或阉割后都没有看到任何的差异。因此，胸腺细胞亚群随着年龄仍为恒定，以及胸腺细胞在阉割后的同步扩增。
图4A-B阉割造成的胸腺细胞增殖的恢复。给小鼠注射一个脉冲量(pulse)的BrdU并分析增殖的(BrdU+)胸腺细胞。对于这些研究，将年老(2岁大)的小鼠阉割并注射一个脉冲量的溴脱氧尿苷(BrdU)以确定增殖的水平。显示了随年龄和阉割后的胸腺内的BrdU+细胞比例的代表性直方形(图4A)。在胸腺内的总体增殖比例中没有观察到差异，这个比例随着年龄和阉割后仍为恒定(图4A和图4B的左侧图形)。但是，看到了BrdU+细胞数目随年龄的显著减少(图4B，右侧图形)。在阉割后2周时，BrdU+细胞数目增加到了在年轻成体(即2个月大)中所能看到的相似的数目(图4B，右侧图形)。结果用每组4-14只小鼠的平均值±1SD表示。***＝p≤0.001，与年轻成体(2个月大)的对照小鼠和阉割后2-6周的小鼠比较。
图5A-H阉割增强了所有胸腺细胞亚组内的增殖。对于这些研究，将年老(2岁)的小鼠阉割并注射一个脉冲量的溴脱氧尿苷(BrdU)以确定增殖的水平。根据胸腺内的CD4和CD8表达进行对胸腺细胞的不同亚组内的增殖的分析。图5A显示BrdU+细胞群内的每种胸腺细胞亚组的比例不随年龄或阉割后而变化。但是，如图5B中所示，看到DN(CD4-CD8-)胸腺细胞增殖的比例随年龄的显著减低。图5C显示没有看到在TN亚组内的BrdU+细胞(即增殖细胞)的总体比例随年龄或阉割后变化。但是看到在TN1(CD44+C25-CD3-CD4-CD8-)亚组内的增殖随年龄的显著减低(图5E)以及TN2(CD44+CD25+C3-CD4-CD8-)亚组内的增殖随年龄的显著增加(图5F)。阉割后恢复了这种变化(图5D-F)。结果用每组4-17只小鼠的平均值±1SD表示。*＝p≤0.05；**＝p≤0.01(显著的)；***＝p≤0.001(非常显著的)，与年轻成体(2个月大)小鼠比较。＾＝显著不同于阉割后2-6周的小鼠(图5-H)。
图6A-C阉割增加了衰老胸腺的T细胞的输出。对于这些研究，将年老的(2岁大的)小鼠阉割并胸腺内注射FITC以确定胸腺的输出率。在24小时后计算外周的FITC+细胞的数目。如图6A所示，观察到在24个小时时段内在外周所检测到的新近胸腺迁出(RTE)细胞数目随年龄的显著减少。阉割后，在阉割后2周时，这些数值已经显著提高。如图6B所示，迁出率(输出/总体胸腺细胞密度)随年龄仍保持恒定，但是在阉割后2周时有着显著的减低。看到了CD4+对CD8+RTE比值随年龄的显著增加，在阉割后1周时达到正常化(图6C)。
结果用每组4-8只小鼠的平均值±1SD表示。*＝p≤0.05；**＝p≤0.01(显著的)；***＝p≤0.001(非常显著的)，图6A为与年轻成体(2个月大)小鼠比较以及图6B和6C为与所有的其他组的比较。^＝p≤0.05与年老的(1岁和2岁大的)非阉割小鼠比较以及与阉割后1周的年老小鼠比较。
图7A-B阉割增强了T细胞耗竭后的胸腺细胞再生。将3个月大的小鼠或用环磷酰胺(2天内两次腹腔内注射200mg/kg体重环磷酰胺)处理(图7A)，或将其暴露于亚致死照射(625Rad)中(图7B)。对于两种所研究的T细胞耗竭的模型，与它们的假阉割的(ShCx)对等实验对象比较，阉割的(Cx)小鼠表示出胸腺再活化率的显著增加。对T细胞耗竭(TCD)后1周和2周时的总胸腺细胞数目的分析显示阉割显著地增加了用环磷酰胺或亚致死照射处理后的胸腺再活化率(分别为图7A和7B)。数据用每组4-8只小鼠的平均值±1SD表示。对于图7A，***＝p≤0.001，与对照(年龄匹配的，未处理的)小鼠比较；＾＝p≤0.001，与两个阉割小鼠组比较。对于图7B，***＝p≤0.001，与对照小鼠比较；＾＝p≤0.001，在照射后1周时与处理前1周阉割的小鼠比较以及在照射后2周时与两个阉割小鼠组比较。
图8A-B环磷酰胺处理后的脾和淋巴结内的总淋巴细胞数目。对于这些研究，利用环磷酰胺(2天内两次腹腔内注射200mg/kg体重环磷酰胺)耗竭(3个月大)小鼠的淋巴细胞并在与最后一次环磷酰胺注射的同一天将小鼠手术阉割或假阉割。分离胸腺、脾和淋巴结(汇集的)并评价总体细胞密度。与对照(年龄匹配的，未处理的)小鼠比较，在处理后1和4周时，假阉割的小鼠的脾内具有显著更少的细胞数目(图8A)。在处理后1周时，两个处理组的淋巴结内都观察到了细胞数目的显著减少(图8B)。在处理后2周时，Cx小鼠比ShCx小鼠具有显著更高的淋巴结的细胞数目(图8B)。每一条都代表每组7-17只小鼠的平均值±1SD。*＝p≤0.05；**＝p≤0.01；与对照(年龄匹配的，未处理的)小鼠比较。^＝p≤0.05；与阉割小鼠比较。
图9在用一种化疗药物环磷酰胺处理以及同一天进行手术或化学阉割之后的胸腺(空条)、脾(灰条)和淋巴结(黑条)的细胞数目的变化。当在处理后1周和2周与非阉割(单用环磷酰胺)组比较时，注意到阉割动物内的胸腺的快速扩增。另外，与单用环磷酰胺组比较，较大地增加了阉割组的脾和淋巴结的细胞数目。(每个处理组和时间点的n＝3-4只)。在环磷酰胺处理后的免疫系统的再生上，化学阉割与手术阉割相当。
图10A-C在手术阉割1周之后的照射(625Rad)后的胸腺(图10A)、脾(图10B)和淋巴结(图11C)的细胞数目的变化。对于这些研究，用亚致死(625Rad)照射耗竭年轻(3个月大)小鼠的T细胞。在照射前1周，小鼠被假阉割或阉割。观察到胸腺再活化随阉割的显著增加(即更快的胸腺再活化率)(图10A)。当在处理后1周和2周与非阉割(单用照射)组比较时，注意到了阉割动物中的胸腺的快速扩增。(每个处理组和时间点的n＝3-4只)。没有看到脾(图10B)或淋巴结(图10C)的细胞数目随阉割小鼠的差异。与对照小鼠比较，淋巴结细胞数目在处理后2周仍是长期缓慢低下的(图10C)。结果用每组4-8只小鼠的平均值±1SD表示。*＝p≤0.05；**＝p≤0.01，与对照小鼠比较。***＝p≤0.001，与对照和阉割小鼠比较。
图11A-C同一天照射及阉割后的胸腺(图11A)、脾(图11B)和淋巴结(图11C)的细胞数目的变化。对于这些研究，用亚致死(625Rad)照射耗竭年轻的(3个月大)小鼠的淋巴细胞。在与照射的同一天，小鼠或被假阉割或被阉割。与假阉割的小鼠比较，阉割小鼠显示出明显更快的胸腺再活化率(图11A)。当在处理后2周与非阉割组比较时，注意到了阉割动物的胸腺的快速扩增。在阉割小鼠中没有看到脾(图11B)或淋巴结(图11C)的细胞数目的差异。与对照小鼠比较，淋巴结的细胞数目在处理后2周时仍是持续低下的(图11C)。结果用每组4-8只小鼠的平均值±1SD表示。*＝p≤0.05；**＝p≤0.01，与对照小鼠比较。***＝p≤0.001，与对照和阉割小鼠比较。
图12A-B照射处理后的脾和淋巴结内的总淋巴细胞数目。在亚致死照射(625Rad)之前，3个月大的小鼠或被阉割或被假阉割。在处理后1周时，脾(图12A)和(汇集的)淋巴结(图12B)内都有显著的严重的淋巴细胞减少。在处理后2周时，脾的淋巴细胞数目恢复到了对照水平(图12A)，而淋巴结的细胞密度仍显著低于对照(年龄匹配的，未处理的)小鼠(图12B)。在处理组之间没有观察到差异。每栏都表示每组6-8只小鼠的平均值±1SD。**＝p≤0.01；***＝p≤0.001，与对照小鼠比较。
图13A-B阉割恢复了对HSV-1免疫接种的应答性。用4×105pfu HSV在后肢免疫接种小鼠。在感染后第5天，分析引流淋巴结(胭淋巴结)的应答细胞。图13A显示了在用单纯疱疹病毒-1(HSV-1)爪垫免疫接种后的淋巴结的细胞密度。与年老的非阉割组比较，注意到了年老的阉割后小鼠内的细胞密度的增加。图13B表明了如FACS设门于CD25对CD8细胞所测定的总活化细胞数目(即活化细胞被设门为CD8+CD25+细胞)。对年老小鼠的阉割恢复了对HSV-1的免疫应答以及与年轻小鼠相等的CTL细胞。结果用8-12只小鼠的平均值±1SD表示。**＝p≤0.01，与年轻(2个月大)且阉割的小鼠比较。
图14A-C在HSV-1接种后的活化LN(淋巴结)的CTL(细胞毒T淋巴细胞)上的Vβ10的表达(HSV特异的)。尽管年老(即18个月大)小鼠总体上都具有正常的Vβ10应答性，但是在一些小鼠中观察到了Vβ10表达的完全缺失。显示了代表性的直方形。注意到年老小鼠的克隆应答的减弱以及阉割后的预期应答的复原。
图15A-B阉割增强了HSV-1感染后的活化。图15A显示了HSV-1感染小鼠的LN内的活化(CD8+CD25+)细胞的代表性FACS图形。没有看到活化CTL的比例随年龄或阉割后的差异。如所示的，对年老小鼠的阉割恢复了对HSV-1的免疫应答以及与年轻小鼠相等的CTL数目。结果用8-12只小鼠的平均值±1SD表示。**＝p≤0.01，与年轻(2个月大)且阉割的小鼠比较。
图16对HSV-1的免疫应答的特异性。从用HSV-1免疫接种的小鼠中取出胭淋巴结细胞(在HSV-1感染后5天取出)，将其培养3天，然后检查其裂解HSV肽激活EL4靶细胞的能力。用未免疫接种的小鼠作为裂解的背景水平的对照进行CTL检测(如用51Cr释放所测定的)。在E∶T比例为10∶1和3∶1时，年老小鼠都显示出显著减低(p≤0.01，**)的CTL活性，说明淋巴结内所存在的特异性CTL百分比的减低。对年老小鼠的阉割将CTL应答恢复到了年轻成体水平，因为阉割小鼠表现出与年轻成体(2个月大)小鼠相当的对HSV-1的应答性。结果用8只小鼠的平均值，三次重复试验±1SD表示。**＝p≤0.01，与年轻成体小鼠比较；^＝与年老的对照小鼠有着显著差异(当E∶T为3∶1时，p≤0.05；当E∶T为0.3∶1时，p≤0.01)。
图17A-B对在对HSV-1的免疫应答中的VβTCR表达和CD4+T细胞的分析。在HSV-1感染后5天取出胭淋巴结，并体外分析它的CD25、CD8和特异的TCR Vβ标记物(图17A)的表达和CD4/CD8T细胞(图17B)。在图17A中将或表达Vβ10或表达Vβ8.1的活化的(CD25+)CD8+T细胞的百分比显示为每组8只小鼠的平均值±1SD。随着年龄或阉割后没有观察到差异。但是，看到了静息LN群中的CD4/CD8比例随年龄的减低(图17B)。阉割后恢复了这种减低。结果用每组8只小鼠的平均值±1SD表示，***＝p≤0.001，与年轻且阉割后小鼠比较。
图18A-D在Ly5同系小鼠的BM移植(BMT)之后，阉割增强了胸腺(图18A)、脾(图18B)和BM(图18D)的再生，但没有增强淋巴结的再生(图18C)。在用C57/BL6Ly5.2+(CD45.2+)成体BM细胞(106个细胞)移植前1天，将3个月大的、年轻成体的、C57/BL6Ly5.1+(CD45.1+)小鼠照射(6.25Gy)、阉割或假阉割。2周和4周后处死小鼠，分析胸腺(图18A)、脾(图18B)、淋巴结(图18C)和BM(图18D)的免疫重建。用抗CD45.2(Ly5.2)确定供者/宿主来源，该抗体只与供者来源的白细胞反应。与假阉割小鼠比较，在BMT后2周和4周，阉割小鼠的胸腺内有着明显更多的供者细胞(图18A)。注意到在处理后的所有时间点当与非阉割组比较时，都有阉割动物胸腺的快速扩增。与假阉割小鼠比较，在BMT后2周和4周，阉割小鼠的这些脾和BM内有着明显更多的细胞(图18B和图18D)在BMT后2、4和6周时，淋巴结的细胞密度之间没有显著差异(图18C)。当与非阉割动物比较，阉割小鼠具有显著增多的同系(Ly5.2)细胞。数据用每组4-5只小鼠的平均值±1SD表示。*＝p≤0.05；**＝p≤0.01，与对照小鼠比较。
图19A-C阉割增加了同系BMT后的BM及胸腺的细胞密度。如图19A所示，在BMT后2周和4周时，阉割小鼠的BM内有着明显更多的细胞。到2周时，假阉割小鼠的骨髓细胞密度达到了未处理的对照水平(1.5×107±1.5×106)。在同系BMT后2周和4周时，阉割小鼠的BM细胞密度超过了对照水平。图19B显示在BMT后2周和4周时，阉割小鼠的胸腺内有着明显更多的细胞。在同系BMT后2周和4周时，假阉割小鼠的胸膜细胞密度低于未处理的对照水平(7.6×107±5.2×106)。在同系BMT和阉割后4周时，胸腺的细胞密度增加超过了对照水平。图19C显示了在BMT后2周和4周时，脾的细胞密度没有显著差异。在2周时，假阉割及阉割小鼠的脾细胞密度都已经达到了对照水平(8.5×107±1.1×107)。每组都含有4到5只动物。空栏代表假阉割；实栏表示阉割。
图20阉割增加了同系BMT后的HSC比例。代表性的FACS点解说明了c-kit(y轴)对sca-1(x轴)的表达。HSC为c-kithisca-1hi。在BMT后2周和4周时，供者来源的HSC的比例在阉割后有了显著增加。
图21A-B阉割增加了同系BMT后的HSC的比例和数目。如图21A所示，在BMT后2周和4周时，HSC的比例在阉割后有了显著增加(*p＜0.05)。图21B显示了在BMT后2周和4周时，与假阉割对照比较，阉割小鼠的HSC数目有着显著增加(*p＜0.05；**p＜0.01)。每组都含有4到5只动物。空栏代表假阉割；实栏代表阉割。
图22A-B在BMT之后，阉割小鼠的BM内有着显著更多的供者来源的B细胞祖细胞和B细胞。如图22A所示，与假阉割对照比较，在阉割小鼠的BM内有着显著更多的供者来源的CD45.1+B220+IgM-B细胞祖细胞(*p＜0.05)。图22B显示了与假阉割对照比较，在阉割小鼠的BM内有着显著更多的供者来源的B220+IgM+B细胞(*p＜0.05)。每组都含有4到5只动物。空栏代表假阉割；实栏代表阉割。
图23阉割不影响同系BMT后的供者来源的胸腺细胞比例。在假阉割和阉割后2周时，有着供者来源的双阴性(CD45.1+CD4-CD8-)的早期胸腺细胞比例的增加。在这个早期时间点上，只有非常少的供者来源的(CD45.1+)CD4和CD8单阳性细胞。在BMT后4周时，假阉割和阉割小鼠的供者来源的胸腺细胞值都与未处理的对照相似。
图24阉割不增加同系BMT后的外周B细胞比例。在同系BMT后2周和4周时，阉割和假阉割小鼠的脾B220表达之间没有差异。
图25阉割不增加同系BMT后的外周B细胞数目。在BMT后2周和4周时，没有B细胞数目的显著差异。在同系BMT后2周时，假阉割和阉割小鼠的脾内的B细胞数目接近于未处理的对照水平(5.0×107±4.5×106)。每组都含有4到5只动物。空栏代表假阉割；实栏代表阉割。
图26增加了在BMT后的阉割小鼠中的供者来源的三阴性、双阳性和CD4及CD8单阳性胸腺细胞的数目。图26A显示在BMT后2周和4周时，与假阉割对照比较，阉割小鼠有着显著更多的供者来源的三阴性(CD45.1+CD3-CD4-CD8-)胸腺细胞(*p＜0.05，**p＜0.01)。图26B显示在BMT后2周和4周时，与假阉割对照比较，阉割小鼠有着显著更多的双阳性(CD45.1+CD4+CD8+)胸腺细胞(*p＜0.05，**p＜0.01)。如图26C所示，在BMT后2周和4周时，与假阉割对照比较，阉割小鼠有着显著更多的CD4单阳性(CD45.1+CD3+CD4+CD8-)胸腺细胞(*p＜0.05，**p＜0.01)。图26D显示在BMT后2周和4周时，与假阉割对照比较，阉割小鼠有着显著更多的CD8单阳性(CD45.1+CD3+CD4-CD8+)胸腺细胞(*p＜0.05，**p＜0.01)。每组都含有4到5只动物。空栏代表假阉割；实栏代表阉割。
图27在同系BMT后2周和4周时只有非常少的供者来源的外周T细胞。如图27A所示，在同系BMT后2周和4周时，在假阉割和阉割小鼠的脾内都有着非常少的供者来源的CD4+和CD8+T细胞的比例。图27B显示在BMT后2周和4周时的供者来源的T细胞数目之间没有显著差异。同系BMT后4周时，与未处理的年龄匹配的对照(CD4+1.1×107±1.4×106，CD8+6.0×106±1.0×105)比较，假阉割和阉割小鼠都有着显著更少的CD4+和CD8+细胞。每组都含有4到5只动物。空栏代表假阉割；实栏代表阉割。
图28阉割增加了同系BMT后4周时的胸腺的供者来源的DC的数目。如图28A所示，供者来源的DC为CD45.1+CD11c+MHCII+。图28B显示在同系BMT后4周时阉割小鼠有着显著更多的供者来源的胸腺DC(*p＜0.05)。在同系BMT后2周时，树突状细胞数目为未处理时的对照水平(1.4×105±2.8×104)。在同系BMT后4周时，阉割小鼠的树突状细胞数目超过了对照水平。每组都含有4到5只动物。空栏代表假阉割；实栏代表阉割。
图29A-C阉割增强了异基因HSCT受者的免疫细胞的重建。经致死性照射(1300cGy)的CBA/J受者(3个月大)接受了B10.BR TCD BM(5×106)的移植。在移植前1天，受者被阉割或被假阉割。在第14、28和42天以人道的方式处死动物，并评价了BM(图29A)、胸腺(图29B)和脾(图29C)器官的细胞密度。*(p＜0.05)。每组含有4到5只动物。
图30A-C阉割增强了异基因HSCT受者的供者来源的HSC和B细胞。如图29所描述的移植阉割和假阉割的受者。如图30A所示，在HSCT后14天时，在假阉割和阉割小鼠内都只有很少的供者来源的HSC(Ly9.1-Lin-Sca+c-kit+)；但是，到第28天时，阉割组的供者HSC数高出了4倍。另外，如图30B-C所示，在阉割小鼠的BM(图30B)和脾(图30C)中都有着显著更多的供者来源的B细胞。利用总的BM或脾细胞计数及多色流式细胞术分析了中心和外周B细胞群。根据CD45R、IgM和CD43的表达，将B细胞分为各个发育期总B细胞(CD45R+)、原B(pro-B)细胞(CD43+CD45R+IgM-)、前B(pre-B)细胞(CD43-CD45R+IgM-)、未成熟B细胞(CD43-CD45R+IgM+)。用抗Ly9.1确定供者/宿主来源，该抗体只与宿主来源的白细胞反应。每组都含有4到5只动物。空栏代表假阉割；实栏代表阉割。*(p＜0.05)表示与假阉割对照比较，阉割组的细胞数目有着显著增加。
图31A-E阉割增强了异基因HSCT受者的胸腺细胞和外周T细胞的重建以及宿主及供者来源的DC的数目。如图29所描述的移植阉割和假阉割小鼠。在第14、28和42天以人道的方式处死动物，并用总的胸腺(图31A-F)和脾(图31G)的细胞计数和多色流式细胞术分析胸腺细胞和T细胞群。DC被定义为CD11chiIa-Khi。图31A描述了TN(CD3-CD4-CD8-)胸腺细胞的数目。图31B描述了DP(CD4+CD8+)胸腺细胞的数目。图31C描述了CD4+(CD3+CD4+CD8-)胸腺细胞的数目。图31D描述了CD8+(CD3+CD4-CD8+)胸腺细胞的数目。如图31E所示，与假阉割的对照受者比较，在异基因HSCT后14天和28天时，阉割受者都有显著更多的宿主来源的DC。另外，如图31F所示，与假阉割的对照比较，在异基因HSCT后28天时，阉割受者有着显著更多的供者来源的DC。图31G描述了用抗CD3、抗CD4和抗CD8所识别出的外周T细胞的数目。用抗Ly9.1确定供者/宿主来源，该抗体只与宿主来源的白细胞反应。供者CD4T细胞为Ly9.1-CD3+CD4+CD8-和供者CD8T细胞为Ly9.1-CD3+CD4-CD8+。每组都含有4到5只动物。空栏代表假阉割；实栏代表阉割。*(p＜0.05)和**(p＜0.01)表示与假阉割对照比较，阉割组的细胞数目有着显著增加。
图32A-G阉割没有改变异基因HSCT后的供者来源的T细胞的功能。如图29所示移植阉割和假阉割受者。在移植后42天测定T细胞功能性。图32A显示了在异基因HSCT6周后的供者来源的T细胞(CD3+CD4+和CD3+CD8+)的数目。图32B显示了阉割对异基因HSCT后的T细胞的增殖能力没有影响。图32C显示了在MLR的异基因反应性T细胞增殖上没有差异。将每个组(n＝5)的脾T细胞与经照射的(20Gy)BALCB/c脾刺激细胞(2×105个细胞/孔)在96孔板中孵育5天，并在培养的最后20个小时内加入[3H]-脱氧嘧啶脱氧核苷。图32D显示在供者来源的T细胞的细胞裂解活性上没有差异。图32E显示了异基因反应性T细胞的细胞内IFNγ的表达。在第42天，从如上所述的假阉割或阉割的受者中收集脾B6T细胞，并将其与经照射的(20Gy)(BALCB/c第三个部分)脾刺激细胞(2×105个细胞/孔)在24孔板中孵育5天。收集细胞，并用TCD、经照射的(20Gy)(BALB/c或B10.BR生物学的内对照)脾刺激细胞再刺激。在照射的第1个小时后加入Brefeldin A(10mg/mL)。用流式细胞术分析测定供者来源的CD3+CD8+细胞的细胞内IFNγ的表达。在图32E中显示了代表性曲线，并在图32F中图解显示了表达IFNγ的供者来源的CD8+T细胞的百分比。图32G显示当小鼠在异基因HSCT的同时被阉割时，T细胞的功能性在攻击后48小时的时候被显著地增强了。在异基因HSCT后6周时，对假阉割和阉割小鼠进行DTH检测，并通过右后爪垫减去左后爪垫肿胀测定出肿胀。空栏代表假阉割；实栏代表阉割。
图33A-B阉割没有加重异基因HSCT受者中的GVHD或减轻其中的GVL。对于在图33A中所述的试验，经致死性照射(1300cGy)的(B6×C3H)F1受者(3个月大)接受B6TCD BM细胞(5×106)+脾细胞(0.5×106)的移植。用Kaplan-Meier曲线描述生存率。空圈代表仅有TCD-BM移植(无T细胞)的对照组(n＝4)。实圈代表假阉割受者，以及空方块代表阉割受者。每组都含有8只动物。对于在图33B中所描述的试验，经致死性照射的、3个月大的B6D2F1/J受者接受了P815(H-2d)细胞(1×103)、C57/BL6TCD BM细胞(5×106)及C57/BL6T细胞(5×105)。用Kaplan-Meier曲线描述生存率。空圈代表仅有TCD-BM移植(无T细胞)的对照组(n＝4)。实圈代表假阉割受者，以及空方块代表阉割受者。每组都含有8-9只动物。
图34A-I阉割和IL-7治疗对异基因HSCT后的胸腺具有累加作用。如图1所描述的移植阉割和假阉割受者。在第14天被处死的受者(图34A)在第0天到13天还接受了经腹腔内注射的10g/天IL-7或PBS(对照)。在第28天被处死的受者(图34B)在第21天到28天接受了10g/天IL-7或PBS(对照)。从总的细胞计数中计算出胸腺的细胞密度。*(p＜0.05)代表与假阉割对照比较时，阉割组的细胞数目有着显著的增加。对照假阉割的，注射PBS的受者；CX阉割的、注射PBS的受者；IL-7假阉割的、注射IL-7的受者；以及IL-7&CX阉割的、注射IL-7的受者。在异基因HSCT和阉割后2周时，对整个BM进行半定量的RT-PCR。在比较了来自阉割和假阉割小鼠的HPRT平衡模板的TGFβ1和KGF的表达(图34C)之后。将KGF-/-和IL-/-小鼠阉割并在2周后分析胸腺、BM和脾的细胞密度。图34D-F显示了来自KGF-/-小鼠的胸腺(图34D)、BM(图34E)、脾(图34F)的结果。图34G-I显示了来自IL-/-小鼠的胸腺(图34G)、BM(图34H)和脾(图34I)的结果。
图35阉割增强了HSCT后的BM、胸腺和脾的植入。在同系HSCT前1天将小鼠阉割。将5×106Ly5.1+BM细胞经静脉内注射到经照射(800Rad)的C57/BL6小鼠中。在移植后的不同的时间点(2-6周)用流式细胞术分析BM、脾和胸腺。如图35B所示，在阉割和HSCT 2周后，与假阉割的对照比较，阉割小鼠的BM内有着显著更多的细胞。相似地，如图35C所示，与假阉割的对照比较，阉割小鼠的胸腺细胞在移植后2、4和6周都有着显著增加。如图35C所示，阉割受者的外周的脾细胞数目在移植后4和6周都明显高于对照。灰栏代表阉割受者。黑栏代表假阉割对照。
图36A-B阉割增强了同系HSCT后HSC在BM内的植入。在同系HSCT前1天将小鼠阉割。将5×106Ly5.1+BM细胞经静脉内注射到经照射(800Rad)的C57/BL6小鼠中。在移植后2周时，用流式细胞术分析BM的lin-c-kit+sca-1+HSC(图36A)。与假阉割的对照比较，在BMT移植和阉割后2周时，阉割小鼠的BM内有着显著更多的供者来源的HSC(图36B)。
图37A-B阉割增强了同系HSCT(2.5×106和5×106)后HSC在BM内的植入。在同系HSCT前1天将小鼠阉割。将2.5×106(图37A-B)和5×106(图37C-D)Ly5.1+BM细胞经静脉内注射到经照射(800Rad)的C57/BL6小鼠中。在移植后2周时，用流式细胞术分析BM的lin-c-kit+sca-1+HSC。图37A-D描述了BM内的普通淋巴祖细胞的百分比。与假阉割的对照比较，在BMT移植和阉割后2周时，阉割小鼠的BM内都有着显著增加的供者来源的HSC的比例。
图38A-B阉割增强了同系HSCT(2.5×106和5×106)后供者来源的DC在胸腺内的植入率。将5×106Ly5.1+BM细胞经静脉内注射到经照射(800Rad)的C57/BL6小鼠中。在移植后2周时，用流式细胞术分析胸腺细胞(图38A)。供者来源的DC被定义为CD45.1+CD11c+MHC II+CD11b+或-。在BMT后2周时，与假阉割的对照比较，在阉割小鼠的胸腺内有着显著增加的供者来源的CD11b+和CD11b-DC(图38B)。
图39A-D阉割增强了同系HSCT(2.5×106和5×106)后供者来源的B细胞在脾内的植入率。将5×106Ly5.1+BM细胞经静脉内注射到经照射(800Rad)的C57/BL6小鼠中。在移植后2周时，用流式细胞术分析脾细胞(图39A-C)。在BMT后2周时，与假阉割的对照比较，在阉割小鼠的脾内有着显著更多的B220+B细胞(图39D)。
图40分析进行抗前列腺癌的LHRH激动剂治疗的人类患者(所有的都＞60岁)的外周血淋巴细胞的表型组成。在治疗前以及开始LHRH激动剂治疗后4个月分析患者的标本。所有患者在治疗前的每ml血的总淋巴细胞数目都在对照值的较低的一端。在治疗后，9例患者中的6例都显示出总淋巴细胞计数的明显增加(在一些病例中观察到了总细胞数目的加倍)。与此相关的是9例患者中6例都有总T细胞数目的增加。在CD4+亚组内，这种增加甚至是更为突出的，9例患者的8例都证实有CD4T细胞水平的增加。在CD8+亚组内看到了这种较不突出的趋势，9例患者的4例显示出水平的增加，虽然这种增加的程度要小于CD4+T细胞。
图41对LHRH激动剂治疗前后的人类患者的血液的分析证实在T细胞、CD4细胞或CD8T细胞的总比例上没有明显变化，以及CD4CD8的比例在治疗后的不同的变化。这说明了尽管在治疗后明显增加了总的T细胞数目，但是治疗对T细胞亚组的稳态维持只有很小的影响。所有的数值都与对照值相当。
图42对进行LHRH激动剂治疗的人类患者的外周血内的B细胞和髓细胞(NK、NKT和巨噬细胞)的比例分析证实了亚组内的不同程度的变化。虽然NK、NKT和巨噬细胞比例在治疗后仍保持相对恒定，但是9例患者中的4例出现了B细胞比例的减少。
图43对治疗后的人类患者的外周血内的B和髓细胞的总细胞数目的分析清楚地显示了治疗后NK(9例患者中的4例)、NKT(9例患者中的4例)和巨噬细胞(9例患者中的3例)的水平的增加。B细胞数目没有显示出明显的趋势，9例患者中的2例显示出水平的增加；9例患者中的4例显示没有变化以及9例中的3例显示水平的减低。
图44A-B人类的化学阉割增强了原初和记忆T细胞。如图44A所示，在LHRH-A治疗后观察到了原初(CD62L+CD45RA+CD45RO-)CD4+T细胞的显著增加。如图44B所示，在LHRH激动剂治疗后增强了原初和记忆(CD62L-CD45RA-CD45RO+)CD8+T细胞的数目。每栏都代表16例患者的平均值±1SD表示。*＝p≤0.05；**＝p≤0.01，与治疗前数值比较。
图45A-B人类的化学阉割增强了外周血淋巴细胞数目。分析了进行作为前列腺癌的常规治疗的一部分的LHRH-A化学阉割的人类患者(所有都＞60岁)的外周血的表型组成。在治疗前和治疗4个月时分析患者。如图45A所示，在LHRH-A治疗后，显著地增加了每μl外周血的总淋巴细胞数目。总T细胞、CD4+和CD8+T细胞的显著增加反映了这一点(图45B)。
图46A-BLHRH-A治疗有效地耗竭了血清睾酮，并增加了胸腺功能和T细胞输出。在图46A的试验中，用LHRH-A治疗前列腺癌患者4个月。在治疗前和LHRH-A治疗4个月后都用FACS分析血液以及用RIA分析血清。如图83A所示，在LHRH-A治疗4个月时，在患者的血清中没有检测到睾酮。栏代表所分析的13例患者的平均值。在图46B的试验中，在分析10例患者的TREC水平之后，发现了胸腺功能和T细胞输出增加的直接证据。在CD4+和CD8+T细胞群内，到LHRH-A治疗4个月时，10例患者中的5例都显示出绝对的TREC水平(每ml血)的增加(超过最初测定值的＞25％)。这一点也被反映于比例的增加(每1×105细胞；数据没有显示)。与之相关的是10例患者中的6例都显示出总TREC水平的总体增加。仅有1例患者显示出总TREC的减少(约30％的减少)。
图47人类的化学阉割增强了NK数目。在LHRH-A治疗之前以及治疗4个月时进行分析。观察到了NK细胞但不是B细胞随LHRH-A治疗的显著增加。结果用13例患者的平均值±1SD表示。**＝p≤0.01，与治疗前数值比较。
图48A-B人类的化学阉割没有增加T细胞的增殖。图48A-B描述了利用Ki-67抗原检测所进行的对细胞增殖的分析。在所有患者中，LHRH-A治疗都没有改变所有CD4+(图48A)和CD8+T细胞(图48B)的原初、活化和记忆细胞亚组内的增殖水平。
图49A-C对对照患者和LHRH-A治疗患者在HSCT后的不同时间点的自然杀伤(NK)细胞恢复的分析。如图49A-B分别所示的，在对照的异基因和自体移植受者中都观察到了相似的趋势。相反，在HSCT前3周给予LHRH-A治疗的异基因患者在移植后14天到5个月都显示出了显著更高的NKT细胞的数目(图49C；数据用6-20例患者的平均值±1SEM表示，**＝p≤0.05)。
图50对对照患者在HSCT后的不同时间点(第14、21、28和35天)的NKT细胞重建的FACS分析。在异基因患者中观察到了早期恢复，主要见于移植后早期的CD8+群，这提示胸腺以外的再生途径。在移植后1个月，CD4+NKT细胞也是明显的。
图51A-B对照患者在HSCT后的不同时间点(2-12个月)的HSCT后的B细胞重建。如图51B所示，与异基因患者比较，自体移植患者的B细胞重建发生得相对更快(图51A)。但是，直到移植后至少6个月，两组中恢复到对照值(阴影)都不明显。
图52A-B对照患者在HSCT后的不同时间点(2-12个月)的HSCT后的CD4+细胞重建。虽然B细胞数目在移植后6个月时恢复到了对照值(见图48A-B)，但是甚至在移植后12个月时，自体(图52B)和异基因(图52A)受者的CD4+T细胞都仍是严重减低的。
图53A-C对照患者在HSCT后的不同时间点(2-12个月)的HSCT后的CD8+细胞重建。如图52A-B所示，在异基因和自体受者中，CD8+T细胞数目在移植后都再生得非常快。但是，如图53所示，如TCRγδ+T细胞、CD8ααT细胞和CD28-CD8+T细胞的增加所提示的那样，CD8+T细胞主要是胸腺外来源的。
图54A-B利用标记物Ki-67对对照患者在HSCT之前(图54A)和之后28天(图54B)的CD4+和CD8+T细胞的不同群的增殖的FACS分析。利用标记物CD45RO和CD27根据原初、记忆的和活化的表型分析细胞。大部分增殖都发生在CD8+T细胞亚组，这还提示这些细胞是胸腺外起源的以及增殖优势发生在外周T细胞亚组内。
图55A-D对照患者和LHRH-A治疗的患者在HSCT后的不同时间点的原初CD4+T细胞的再生。图55A描述了对对照(未LHRH-A治疗)患者的原初CD4+T细胞(CD45RA+CD45RO-CD62L+)的FACS分析，并显示这些细胞在整个研究期间的严重缺失。如图55B-C所示，自体移植患者直到HSCT后12个月，对照患者的原初CD4+T细胞才开始再生(图55C)，但仍明显低于异基因对照患者的对照值(图55B)。这些结果说明因为患者的年龄，对照患者的胸腺在移植后不能恢复足够数目的原初T细胞。相反，在异基因HSCT前3周给予LHRH-A的患者在移植后9个月和12个月都比对照显示出显著更高的数目(图55D)。这说明性类固醇清除治疗增强了胸腺依赖性T细胞途径的再生。数据用6-20例患者的±1SEM表示，**＝p≤0.05。
图56A-D对照患者和LHRH-A治疗患者在HSCT后的不同时间点(1-12个月)的TREC水平。对TREC(仅见于新近胸腺迁出(RTE))水平的分析强调了异基因(图52A)和自体(图52B)移植患者的胸腺在移植后恢复水平的能力。这都是因为患者的年龄以及胸腺萎缩所造成的胸腺功能的缺失，这与这些患者的发病率和死亡率都明显相关。相反，当在异基因移植前用LHRH-A治疗时，进行异基因外周血干细胞移植的患者表现出CD4+TREC+细胞/ml血液的显著增加(移植后9个月与对照(未LHRH-A治疗)比较，p≤0.01)。接受LHRH-A治疗的异基因患者在移植后9个月(图56C)时显示出比对照显著更高数目的CD4+TREC细胞/ml血液。自体的LHRH-A治疗的患者在移植后12个月时也显示出显著更高的水平(图56D)。这说明性类固醇清除治疗增强了胸腺的再生。数据用5-18例患者的±1SEM表示，**＝p≤0.01。
图57A-CLHRH-A给药增强了异基因(图57A-B)和自体(图57C)HSCT后对TCR特异刺激的应答性。在HSCT前3周，给予患者LHRH-A。没有接受激动剂的患者被用作为对照患者。在移植后的不同时间点(1-12个月)，用5μg抗CD3和10μg抗CD28交联进行对TCR特异刺激的分析。如图57A-B所示，异基因LHRH-A治疗的患者在除了6个月和9个月(因为此时所分析的患者数目少)的所有时间点都显示出比对照患者更强的增殖应答(如3H-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入所测定的)。在移植后6个月和9个月时，对照患者有着与治疗前数值相似的应答性。但是，在所有的其他时间点上，它们都是明显更低的。相反，与治疗前比较，LHRH-A治疗的患者在除6个月以外的所有时间点上都有着相等的应答性。LHRH-A治疗的患者在一周后1、3和4个月都显示出比对照患者更强的增殖应答(如3H-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入所测定)。这说明了直接的外周T细胞作用的贡献，因为直到移植后1-2个月，新的CD4+T细胞都是不明显的(图57B；数据用5-12例患者的平均值±1SEM表示，*＝p≤0.05；**＝p≤0.01)。如图57C所示，自体LHRH-A治疗的患者在除5个月外的所有时间点都显示出比对照患者更强的增殖应答(如3H-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入所测定的)。在移植后12个月时，观察到了对照和LHRH-A治疗的患者都恢复到了治疗前的值。
图58A-BLHRH-A给药增强了异基因HSCT后对PWM和TT有丝分裂原刺激的应答性。在HSCT前3周，用LHRH-A治疗患者。将没有接受激动剂的患者用作为对照患者。利用美洲商陆有丝分裂原(pWM)或破伤风毒素(TT)在移植后的不同时间点(1-12个月)进行对有丝分裂原刺激的应答性的分析。在HSCT之前用LHRH-A治疗的患者在所有的时间点都显示出比对照患者更强的对PWM(图58A)和TT(图58B)的应答性。
图59A-BLHRH-A给药增强了自体HSCT后对PWM和TT有丝分裂原刺激的应答性。在HSCT前3周，用LHRH-A治疗患者。将没有接受激动剂的患者用作为对照患者。利用美洲商陆有丝分裂原(PWM)或破伤风毒素(TT)在移植后的不同时间点(1-12个月)进行对有丝分裂原刺激的应答性的分析。在HSCT之前用LHRH-A治疗的患者在大多数时间点都显示出比对照患者更强的对PWM(图59A)和TT(图59B)的应答性(3个月时p≤0.001)。到了移植后12个月时，LHRH-A治疗的患者有着恢复了的应答性。
图60A-DLHRH-A治疗增强了自体HSCT患者中的植入的速度。在HSCT前3周，用LHRH-A治疗患者(图60A、C和D)。将没有接受激动剂的患者用作为对照患者(图60B)。在移植后第14、28和35天测定每μl血的总白细胞(WBC)计数和粒细胞(G)计数。如图60A所示，接受LHRH-A治疗的自体患者在移植后第14天显示出比对照(图60B)显著更高的WBC数目(p≤0.05)。在这个时间点上，比较于对照的45％，87％显示出粒细胞的植入(≥500个细胞/μl血液)。接受LHRH-A治疗的自体患者在移植后第10-12天也比对照显示出显著更高的中性粒细胞的数目(图60C，数据用8-20例患者的平均值±1SEM表示，*＝p≤0.05)。另外，尽管是不显著的，但是LHRH-A治疗的自体患者在所有时间点上都比对照组有着更高的淋巴细胞计数(图60D)。
图61A-DLHRH-A治疗增强了异基因HSCT患者中的植入的速度。在HSCT前3周，用LHRH-A治疗患者(图61A、C和D)。将没有接受激动剂的患者用作为对照患者(图61B)。在移植后第14、28和35天测定每μl血的总白细胞(WBC)计数和粒细胞(G)计数。如图61A所示，接受LHRH-A治疗的异基因患者在移植后第14天显示出比对照(图61B)显著更高的WBC数目(p≤0.05)，在这个时间点上有着87％显示出粒细胞的植入(≥500个细胞/μl血液)，比较于对照的44％。接受LHRH-A治疗的异基因患者在移植后第9、12&19天也比对照显示出显著更高的中性粒细胞的数目(图61C，数据用8-20例患者的平均值±1SEM表示，*＝p≤0.05)。另外，对进行外周血干细胞移植的患者的分析证实当在异基因移植前用LHRH-A治疗时淋巴细胞计数的显著增加(在移植后10、12、13和17-21天时，p≤0.05)(图61D)。
图62A-F在阉割的1周内增强了TCR特异的外周T细胞增殖应答。将8周大的小鼠阉割并在手术后第3天(图61A、C和E)和第7天(图62B、D和F)分析抗CD3/抗CD28刺激的T细胞增殖应答。用不同浓度的抗CD3刺激以及用恒定浓度的10μg/ml抗CD28共刺激外周(颈部、腋下、肱和腹股沟)淋巴结(图62A和B)、肠系膜淋巴结(图62C和D)和脾细胞(图62E和F)48个小时。然后用脉冲量的氚化胸腺嘧啶处理细胞18个小时并根据3H-T掺入测定增殖。棱形表示阉割动物，方块表示假阉割对照动物，n＝4，*p≤0.05(非参数的、非配对的、Mann-Whitney统计检验)。
图63LHRH-A给药增强了慢性癌症受害者治疗后对TCR特异性刺激的应答性。用LHRH-A治疗慢性恶性肿瘤患者。在LHRH-A给药后的不同时间点(第7-12个月)用抗CD3和抗CD28交联进行对TCR特异性刺激的分析。LHRH-A治疗的患者显示出比治疗前水平更强的周期式的增殖应答(用3H-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入所测定)。这反映了每月长效注射的激动剂的给药。这些结果说明对外周T细胞的直接影响。但是，在治疗后12个月时所看到的增强的应答反映了胸腺来源的T细胞的变化，因为从4个月开始就停止了所有患者的激动剂的给药。
图64A-E是显示胸腺切除没有影响性类固醇抑制/BMT对BM的普通淋巴祖细胞(图72A)、总的BM B细胞(图72B)、BM的未成熟的B细胞(图64C)、脾的总的细胞数目(图72D)或对脾脏的总的B细胞(图72E)的作用。
具体实施例方式
在此所引用的专利和科学文献构成了本领域人员所能获得的知识。在此所引用的已公开的美国、申请、已出版的外国申请和参考文献，包括基因库序列的全部内容都被以相同的程度一同并入作为参考，如同每个都被具体地和个别地指出在此并入作为参考。
本发明包括在没有胸腺再活化、先于胸腺再活化或联合胸腺再活化的情况下，通过性类固醇去除和/或中断性类固醇信号途径而增加BM功能性的方法。“增加BM功能”和“增强BM功能性”在此被定义为BM的免疫细胞包括前体细胞例如HSC(以及因此增加了血细胞)的产量和/或输出的提高，包括造血作用的提高和/或HSCT后植入的增强。输出的提高可以包括但不限于，提高的动员免疫细胞包括HSC到外周或到靶组织特别是免疫或受损组织)的能力。在一个实施方式中，提高了HSC的造血作用。在另一个实施方式中，提高了HSC的输出。在特定的实施方式中，增加了血和/或免疫细胞的数目。仍在另一个实施方式中，提高了HSCT后的HSC的植入。在另一个实施方式中，提高了HSC动员到外周或入巢到靶组织。仍在另一个实施方式中，提高了增殖能力和/或分化为造血或非造血的子代的能力。
本发明也包括在没有胸腺再活化、先于胸腺再活化或联合胸腺再活化的情况下，通过性类固醇去除和/或中断性类固醇信号途径而增加T细胞和其他免疫细胞的能力的方法。术语“免疫细胞”和“免疫系统的细胞”在此可被互换使用，并在此被定义为HSC、T细胞、B细胞、DC、和/或其他血细胞，包括但不限于HSC子代、CLP、MLP、淋巴细胞、髓细胞、中性粒细胞、粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、NK、NKT、血小板、红细胞、单核细胞、巨噬细胞、原初T细胞、和上面所提及的前体细胞。细胞可以是或可以不是外周的，可在BM、血液、脾、淋巴结、胸腺、粘膜、皮肤或其他组织的任何一或多种组织中发现这些细胞。
免疫细胞的“增加的功能性”或“增强的功能性”是指当与没有性类固醇去除所通常预期的免疫应答比较时，免疫细胞能提供更多的所需的免疫应答。在一种情况中，免疫细胞是T细胞。在其他实例中，免疫细胞是B细胞、DC和/或HSC。“增加的功能性”包括但不限于提高的对靶细胞的杀伤、增加的淋巴细胞增殖应答、提高的信号转导能力、提高的入巢能力、提高的APC活化、增加的受体、细胞粘附分子或共刺激分子的水平或活性、减低的凋亡、增加的细胞因子、白介素和其他生长因子的释放、增加的血浆的抗体水平以及增加的血液和全身的天然免疫力(例如自然杀伤(NK)细胞、DC、中性粒细胞、巨噬细胞等)的水平。
为了生成新的T淋巴细胞，胸腺需要前体细胞；在短时间内，这些前体细胞可以来源于器官本身的前体细胞，但是在3-4周后，这些细胞被清除并且必须经血液从骨髓中摄取新的造血干细胞(HSC)。但是，甚至在正常功能的年轻胸腺中，对这些细胞的摄取也是低的，即足以保持T细胞产量在稳态调节的水平并有效地限定为HSC或至少是已经具有沿T细胞系优先分化的前胸腺细胞。在性类固醇抑制期间，胸腺变得非常善于接受循环在血液中的新的前体细胞。通过增加血液前体细胞的水平，来源其中的T细胞将逐步进入T细胞池。这意味着引入到前体细胞(例如HSC)内的基因可以被传递给所有的子代T细胞并最终存在于T细胞池的大多数细胞中。通过增加所转移的外源HSC的数目可以增加这些细胞对来源于内源的宿主HSC的那些细胞的显性水平。
本发明成形于在施与供者细胞(例如HSC)之前、与之同时或之后阻断需要供者异基因移植物移植的患者的性类固醇信号途径促进了患者对供者异基因移植物的接受的发现。在一些实施方式中，患者也接受了来自供者的例如HSC的细胞的转移。当胸腺再活化时，形成了新的或经修饰的免疫系统，它不再识别和/或应答于异基因移植物上的抗原。也就是说，异基因移植物被看作是“自体的”，不再是外来的。
在一个实施方式中，胸腺移植物可以被用于本发明的方法以提高供者细胞的植入或对供者移植物的耐受性。在一些实施方式中，胸腺移植物是患者为无胸腺时、患者的胸腺对再生有抵抗时、或对快速再生有抵抗时。在某些实施方式中，使用了胸腺的异种移植物以诱导耐受性(见，例如美国No.5,658,564)。在其他实施方式中，使用了异基因的胸腺移植物。
所移植的细胞可以是HSC、淋巴祖细胞、髓系祖细胞、上皮细胞、或其组合。本发明也提供了用于输送这些促进细胞摄取和/或分化为T细胞的细胞的新方法。所移植的细胞可以或不可以被遗传学修饰的。将细胞注射到患者中，患者的胸腺正处于被本发明的方法所再活化的过程中。胸腺可以摄取任意修饰的干细胞和祖细胞并转化为T细胞、树突状细胞、NK细胞和其他的胸腺所产的细胞。当所移植的细胞存在遗传学修饰时，这些新细胞的每个细胞都含有干细胞/祖细胞的遗传学修饰。
在一些实施方式中，当胸腺开始再活化时，给患者施用细胞。在其他实施方式中，或在没有胸腺再活化的情况下、或先于胸腺再活化、或在胸腺再活化的同时，施与细胞。而在其他实施方式中，当开始阻断性类固醇介导的信号途径时，施与细胞。在一个实施方式中，干细胞被移植到受者内。干细胞可以是造血干细胞、上皮干细胞、或其组合。在另一个实施方式中，祖细胞被移植到受者内。祖细胞可以是淋巴祖细胞、髓系祖细胞、或其组合。仍在其他实施方式中，细胞是CD34+或CD34loHSC。在一些实施方式中，所移植的细胞是自体的。在其他实施方式中，所移植的细胞不是自体的。
对于使用非自体(供者)细胞的情况，在胸腺再活化过程中形成对这些细胞的耐受性。在开始阻断性类固醇介导的信号途径期间或之后，将相关的(遗传学修饰的(GM)或非遗传学修饰的)供者细胞转移到受者内。
胸腺可以接受供者细胞作为属于受者的细胞并成为胸腺所产的新的T细胞和DC的一部分。所形成的T细胞群都将受者和供者识别为自体，据此形成了对供者的移植物的耐受性。移植物可以是供者的细胞、组织或器官、或它们的组合。
如在此所定义的那样，用语患者“形成耐受性”或“诱导耐受性”和其他相似的用语指的是完全以及部分耐受性诱导(例如，与没有用本发明的方法所治疗的患者比较，患者可能变得对移植物更为耐受或完全耐受)。例如利用本领域已知的方法例如用MLR反应可以测定耐受性诱导。
在一个实施方式中，本发明的方法使用遗传学修饰的HSC、淋巴祖细胞、髓系祖细胞、上皮干细胞、或其组合(一起被称为GM细胞)产生对抗特殊抗原攻击的免疫系统。
如下面更为详细描述的那样，用阻断性类固醇介导的信号途径的方法最终可以再活化受者的胸腺。这种阻断逆转了受者的激素状态。在某些实施方式中，受者是青春期后的。根据发明的方法，受者的激素状态被逆转，使得受者的激素接近于青春期前的水平。通过降低受者内的性类固醇激素水平，可以降低这些激素对胸腺的信号途径，据此容许胸腺被再活化。
如上所述，衰老(青春期后)的胸腺造成身体的免疫细胞以低于峰值水平(例如可见于年轻的、青春期前胸腺)的水平工作。“青春期后”在此被定义为胸腺已经达到明显萎缩的时期。在人类，这发生在约20-25岁，但在一个给定的个体中，这可以发生得更早或更晚。“青春期”在此被定义为期间胸腺开始萎缩的时期，但可以是在胸腺完全萎缩之前。在人类，这发生开始于10-20岁，但在一个所给定的个体中，这可以发生得更早或更晚。“青春期前”在此被定义为先于个体中的性类固醇增加的时期。在人类，这发生在约0-10岁，但在一个所给定的个体中，这可以发生得更早或更晚。
“受者”、“患者”和“宿主”在此可被互换使用，以及在此被定义为接受性类固醇去除治疗和/或阻断性类固醇介导的信号途径的治疗的对象，在适当的时候，为接受了HSC移植的对象。“供者”在此被定义为移植的来源，它可以是同基因的、异基因的或异种的。在一些情况中，患者可以提供用于在晚些的时间点上被移植到患者内的例如他的或她的自体细胞。可以使用异基因SHC移植物，以及这些异基因移植物是发生在同一物种的不匹配成员之间的移植物，而在异种HSC移植物中，供者和受者是不同物种的。也可以使用匹配动物之间的同基因HSC移植物。参照于HSC移植物的术语“匹配的”、“不匹配的”、“错配的”和“不完全一致的”在此被定义为供者和受者的MHC和/或次要组织相容性标记物是相同的(匹配的)或不是(不匹配的、错配的和不完全一致的)相同的。
术语(患者对移植物或其他外来抗原的)“提高的”或“增强的”或“升高的”耐受性是指，与没有阻断性类固醇信号途径的患者中可能出现的耐受性相比，患者对移植物或其他外来抗原的耐受性被提高。
术语胸腺“再生”、“再活化”和“重建”以及它们的衍生物在此可以互换使用，以及在此被定义为萎缩的或受损的(例如被化学物、照射、移植物抗宿主病、感染、遗传倾向)胸腺恢复到它的活化状态。“活化状态”在此被定义为意思是其中性类固醇激素介导的信号途径已经被阻断的患者的胸腺所完成的T细胞输出是青春期前胸腺(没有到达青春期的患者的胸腺)的输出的至少10％、或至少20％、或至少40％、或至少60％、或至少80％、或至少90％。
本发明可被用于任何具有性类固醇驱动的成熟和免疫系统的动物物种(包括人)，例如哺乳动物和有袋类动物。在一些实例中，本发明被用于大型哺乳动物例如人。
在本说明书的全文中，术语“包括”和“包含”将被理解为意思是包含所述的元素、成分、或步骤、或元素、成分、或步骤的组，但不排除其他任何的元素、成分、或步骤、或元素、成分、或步骤的组。
性类固醇介导的信号途径的阻断本发明还提供了阻断患者的性类固醇介导的信号途径的方法，其中患者的胸腺随后可以被或不被再活化。另外，本发明提供了提高患者的免疫细胞(例如T细胞)的功能状态的方法。就T细胞而言，胸腺开始增加早期前体细胞(CD3-CD4-CD8-细胞)的增殖速度并将它们转化为CD4+CD8+以及随后的新的成熟的CD3hiCD4+CD8-(T辅助(Th)淋巴细胞)或CD3hiCD4-CD8+(细胞毒T淋巴细胞(CTL))。复活的胸腺也增加了其对血流中的HSC、或其他干细胞或能形成T细胞的前体细胞的摄取，并将它们转化为新的T细胞和胸腺内DC。所增加的胸腺的活性在很多方面都类似于在正常的更年轻的胸腺(例如青春期前)中所发现的活性。这种更新的胸腺输出的结果增加了血液中的原初T细胞(那些还没有遇到过抗原的T细胞)的水平。这也增加了外周T细胞对刺激例如通过与抗CD28Ab的交联、或通过用例如抗CD3抗体的TCR刺激、或有丝分裂原例如美洲商陆有丝分裂原(PWM)的刺激的应答的能力，并且这种增加的T细胞应答性可以发生在胸腺再活化之前，例如2、3、4、5、6、7、14或21天内。
另外，对于将非自体(供者)细胞移植到受者患者内的情况，在胸腺再活化过程中形成对这些细胞的耐受性。在开始阻断性类固醇介导的信号途径期间或之后，将相关的(遗传学修饰的(GM)或非遗传学修饰的)供者细胞转移到受者内。胸腺可以接受供者细胞作为属于受者的细胞并成为胸腺所产的新的T细胞和DC的一部分。所形成的T细胞群都将受者和供者识别为自体，据此形成了对供者的移植物的耐受性。
如在此所用的，“性类固醇清除”、“性类固醇介导的信号途径的抑制”、“性类固醇阻断”、性类固醇信号途径的中断”和其他相似的术语在此被定义为至少部分阻断性类固醇(和/或其他激素的)的产生和/或性类固醇(和/或其他激素的)信号途径，无论是直接或间接的作用。在一个实施方式中，中断了到胸腺的性类固醇信号途径。容易理解的是，用本领域人员熟知的各种方法可以阻断性类固醇介导的信号途径，在此描述了一些方法。例如，对性激素产生的抑制或阻断一或多种性激素受体将达到所需的阻断，如施与性类固醇激动剂和/或激动剂，或主动的(抗原)或被动的(抗体)抗性类固醇接种。
一种非限制性的用于形成性类固醇介导的信号途径的阻断的方法是通过阉割。用于阉割的方法包括但不限于化学阉割和手术阉割。
“阉割”在此被定义为性类固醇产生、活性和/或体内的分布的减少或消除。这最终有效地将患者恢复到青春期前状态，此时胸腺比阉割前即刻是更为有功能的。手术阉割去除了患者的性腺。用于手术阉割的方法对于受常规训练的兽医和医生都是熟知的。在下面的实施例中描述了用于阉割雄性动物的一种非限制性的方法。其他用于阉割人类患者的非限制性的方法包括子宫切除术或卵巢切除术操作(阉割女性)和手术阉割去除睾丸(阉割男性)。在一些临床病例中，经物理阉割永久地去除性腺可能是合适的。
化学阉割是一种较不永久的阉割形式。如在此所定义的，“化学阉割”是施与一种化学物一段时间，造成了性类固醇产生、作用和/体内分布的减少或消除。多种化学物能以这种方式发挥作用。这些化学物的非限制性实例是性类固醇抑制物和/或下面所描述的类似物。在给予化学物期间和在给予一段时间之后，患者的激素产生可以被停止或减少。终止化学物的给予或通过给予相关的性激素可以逆转阉割。
术语“性类固醇类似物”、“性类固醇清除剂”、“性类固醇抑制剂”、“性类固醇信号途径的抑制剂”、“性类固醇信号途径的修饰剂”和其他相似的术语在此被定义为任何一或多种能减少、阻断、预防或终止性类固醇(和/或其他激素)介导的信号途径的药用试剂。GnRH(在此也被叫做LHRH或GnRH/LHRH)和它们的类似物是在本申请书的全文中所用的性类固醇信号途径的抑制剂的非限制性的实例。然而，本领域人员容易理解的是，在实践在此所提供的发明时，可以用多种替代的性类固醇抑制剂或类似物中(或其他阻断剂或物理阉割)的任何一种(或多种)替代在此所描述的GnRH/LKRH或它们的类似物，而不需要过多的试验。
任何可以阻断性类固醇或阻断性类固醇介导的信号途径的药物或其他的阉割方法都可以被用于本发明的方法。例如，抑制性类固醇信号途径、再活化胸腺和/或增强BM和免疫细胞的功能性的一个非限制性方法是通过修饰GnRH对垂体的正常作用(即释放促性腺激素，FSH和LH)并最终减少性腺产生或释放正常的性类固醇。因此，在一种情况中，性类固醇清除是通过施与一或多种性激素类似物例如GnRH类似物实现的。GnRH是一种刺激垂体分泌促性性腺激素，促黄体激素(LH)和促卵泡激素(FSH)的下丘脑的十肽。因此，GnRH激动剂(例如Synarel或Lupron的形式)最初造成受体的过度刺激并经反馈机制通过LHRH受体的失敏将抑制垂体生成FSH和LH。这些促性腺激素正常地作用于性腺以释放性类固醇，特别是女性的雌激素和男性的睾酮，FSH和LH的缺失显著地减少了这些性激素的释放。它的直接结果是性类固醇的血浆水平的下降以及因此对胸腺的抑制信号的逐步释放。例如通过使用GnRH拮抗剂可以实现循环的性类固醇水平的更快速的下降。
在一些实施方式中，通过施与性类固醇类似物例如促黄体激素释放激素(LHRH)的类似物阻断了性类固醇介导的信号途径。性类固醇类似物和它们在治疗及化学阉割中的应用是熟知的。性类固醇类似物是产品化的以及它们在治疗和化学阉割上的应用是熟知的。这些类似物包括但不限于，下面的LHRH受体(LHRH-R)的激动剂布舍瑞林(例如醋酸布舍瑞林，商品名Suprefact(例如0.5-02mg/天，皮下用)，SuprefactDepot、和Suprefact喷鼻剂(例如2μg/鼻孔，每8小时)，Hoechst，也被描述于美国No.4,003,884、4,118,483和4,275,001)、Cystorelin(例如双乙酸促性腺激素四水化合物，Hoechst)、地洛瑞林(例如，醋酸地洛瑞林，Deslorell，Balance Pharmaceuticals)、戈那瑞林(例如，盐酸戈那瑞林，商品名Factrel(100μg静脉或皮下用)，Ayerst Laboratories)、戈舍瑞林(醋酸戈舍瑞林，商品名Zoladex，AstraZeneca，Aukland，NZ，也被描述于描述于美国No.4,100,274和4，128,638、GB 9112859和GB9112825)、组氨瑞林(例如，醋酸组氨瑞林，Supprelin(皮下10μg/kg/d)，Ortho，也被描述于EP 217659)、亮丙瑞林(leuprolide)(亮丙利德，商品名Lupron，或Lupron Depot，Abbott/TAP，Lake Forest，IL，也被描述于美国No.4,490,291、3,972,859、4,008,209、4,992,421、和4,005,063、DE 2509783)、亮丙瑞林(leuprorelin)(例如，亮丙利德，商品名ProstapSR(例如，每月单次剂量3.75mg皮下或肌注)、Prostap3(例如每3个月单次剂量11.25mg皮下)，Wyeth，USA，也被描述于Plosker et al.，(1994)Drugs 48930)、黄体瑞林(Wyeth，USA，也被描述于美国No.4,089,946)、美替瑞林(例如，Avorelina(10-15mg缓释剂型)，也被描述于EP 23904和WO 91/18016)、那法瑞麟(例如，商品名Synarel(i.n.200-1800μg/d)，Syntex，也被描述于美国No.4,234,571、WO 93/15722、和EP 52510)、以及曲普瑞林(例如，扑酸曲普瑞林，商品名Trelstar LA(3个月内11.25mg)、Trelstar LA Debioclip(预先填充的，单次剂量给予)、LATrelstarDepot(1个月内3.75mg)、和Decapeptyl，Debiopharm S.A.，Switzerland，也被描述于美国No.4,010,125、4,018,726、4,024,121、和5,258,492、EP364819)。LHRH类似物也包括但不限于下面的LHRH-R的拮抗剂阿巴瑞克(商品名PlenaxisTM(例如，在第1、15和29天肌注100mg，之后每4周肌注100mg)，Praecis Pharmaceuticals，Inc.，Cambridge，MA)和西曲瑞克(例如，醋酸西曲瑞克，商品名CetrotideTM(例如，皮下0.25或3mg)，Zentaris，Frankfurt，Germany)。另外的性类固醇类似物包括Eulexin(例如，氟他胺(例如，2个胶囊，每天2次，总量750mg/d)，Schering-PloughCorp.，也被描述于FR 7923545、WO 86/01105和PT 100899)、以及二噁烷衍生物(例如，在EP413209中所描述的)、以及例如在EP 181236、美国No.4,608,251、4,656,247、4,642,332、4,010，149、3,992,365、和4,010，149中所描述的其他LHRH类似物。也包括激动剂的组合、拮抗剂的组合、以及激动剂和拮抗剂的组合。本发明的一种非限制性的类似物是地洛瑞林(美国No.4,218,439所描述的)。对于类似物的更广泛的列表，见Vickeryet al.(1984)LHRH AND ITS ANALOGSCONTRACEPTIVE &THERAPEUTIC APPLICATIONS(Vickery etal.，eds.)MTP Press Ltd.，Lancaster，PA。也可以使用每种类似物的修饰形式，例如它的醋酸、柠檬酸和其他的盐，这些对于本领域人员是熟知的。
性类固醇清除药物的给药的一个非限制性的实例是皮下/皮内注射GnRH激动剂的“缓释的”储存剂(depot)(例如，1、3或4个月的Lupron注射剂)或皮下/皮内注射“缓释的”含GnRH的植入物(例如，1或3个月的Zoladex，例如3.6mg或10.8mg植入物)。根据合适的剂型，也可以肌肉内(i.m.)、静脉内(i.v.)或口服给予这些药物。另一个实例是通过皮下注射含有约30mg Lupron(例如，Lupron Depot(亮丙利德的储存悬浮液)，TAP Pharmaceuticals Products，Inc.，Lake Forest，IL)的“储存剂”或“浸透性植入物”。30mg Lupron足以清除性类固醇4个月以容许胸腺恢复并往血流内输出新的原初T细胞。
在此所描述的许多移植性类固醇信号途径的机制是熟知的，以及其中的一些药物特别是GnRH激动剂已经被用于治疗生殖器官疾病例如一些激素敏感性癌症包括乳腺癌和前列腺癌、子宫内膜异位症、生殖疾病、多毛症、早熟、性变异以及控制生育很多年。
在某些实例中，性类固醇清除和/或性类固醇介导的信号途径的中断或阻断最终再活化了患者的胸腺。在一些情况中，阻断逆转了患者的激素状态。根据本发明的方法，受者的激素状态被逆转了，使得受者的激素状态接近青春期前水平。通过降低受者的性类固醇激素的水平，降低了这些激素对胸腺的信号途径，据此容许再活化胸腺。患者可以是青春期的或青春期后的，或患者有过(或曾有过)至少部分萎缩胸腺的疾病。同样的，患者有过(或曾有过)疾病的治疗，其中对疾病的治疗至少部分导致患者胸腺萎缩。这些治疗可以是抗病毒的、免疫抑制、化疗和/或放射治疗。在其他的实施方式中，患者是绝经的或已经采取其他方式例如外伤、药物等所减少了性类固醇(或其他激素水平)。
性类固醇清除或对性类固醇介导的信号途径的阻断对BM和/或免疫系统的细胞具有一或多种直接作用，其中提高了功能性。这些作用可以在胸腺再活化之前或与之同时发生。
在一些实施方式中，通过单独地或联合一种LHRH类似物或任何其他的阉割方法施与一种抗雄激素例如雄激素阻断剂(例如，比卡鲁胺，商品名Cosudex或Casodex，例如5-500mg，例如50mg口服QID，AstraZeneca，Aukland，NZ)实现性类固醇清除或对性类固醇信号途径的抑制。也可以通过单独地或联合一种LHRH类似物或任何其他的阉割方法施与醋酸环丙氯地孕酮(商品名，Androcor，Shering AG，Germany，例如10-1000mg，100mg bd或tds，或每周IM 300mg)、作用为孕酮的醋酸17-羟孕酮实现性类固醇清除或对性类固醇信号途径的阻断。可以使用其他的抗雄激素(例如，咪唑类的抗真菌药物，例如利阿唑(Liazol，例如，150mg/天，一种芳香酶抑制剂)和酮康唑、氟他胺(商品名Euflex和Eulexin，Shering Plough Corp，N.J，例如250或750mg口服QID)、醋酸甲地孕酮(Megace，例如480-840mg/天，或尼鲁米特(商品名Anandron和Nilandron，Roussel，France，例如150-300mg/天)。抗雄激素在治疗上经常是重要的，因为它们通常被用于缓解GnRH类似物所造成的短期增强作用。一些抗雄激素通过抑制雄激素受体的移位发挥作用，这干扰了负反馈，造成了睾酮水平的增加和性欲/能力的最小缺失。用于本发明的另一种类型的抗雄激素是选择性雄激素受体调节物(SARMs)(例如，喹啉衍生物、比卡鲁胺(商品名Cosudex或Casodex，同上)、和氟他胺(商品名Eulexin，例如口服250mg/天))。其他熟知的抗雄激素包括5α还原酶抑制剂(例如，度他雄胺(例如，口服0.5mg/天)，它抑制了两种5α还原酶同功酶并造成更多和更快的DHT抑制；非那雄胺(商品名Proscar，0.5-500mg，例如每天口服5mg)，它抑制了5α还原酶2并最终抑制DHT的产生，但是对睾酮或LH水平只有很小的或没有作用)。
在其他的实施方式中，通过单独地或联合一种LHRH类似物或任何其他的阉割方法施与抗雌激素实现类固醇耗竭或对性类固醇介导的信号途径的抑制。一些抗雌激素(例如，阿那曲唑(商品名Arimidex、和氟维司群(商品名Faslodex，10-1000mg，例如每月250mg IM)通过以类似于雌二醇的高亲和力与雌激素受体(ER)结合发挥作用，并最终抑制了雌激素与受体的结合。Faslodex的结合也靶向于受体的构象变化以及下调雌激素受体，而FSH或LH水平没有显著变化。抗雌激素的其他非限制性的实例是他莫昔芬(商品名Nolvadex)；氯米芬(商品名Clomid)，例如50-250mg/天，一种具有混和的激动剂/拮抗剂性能的非类固醇的ER配体，它刺激了促性腺激素的释放；己烯雌酚(商品名Stilphostrol)，例如1-3mg/天，它显示出与雌酮相似的但更强的雌激素活性，因此它被认为是一种雌激素激动剂，但它可与雄激素和雌激素受体结合以诱导对垂体的FSH和LH产生的反馈抑制，己烯雌酚二磷酸盐例如50到200mg/天；以及达那唑、屈洛昔芬和Iodoxyfene，每一种都作用为拮抗剂。可以单独或联合其他的阉割方法使用的另一类抗雌激素是选择性雌激素受体调节物(SERMs)(例如，托瑞米芬(商品名Fareston，5-1000mg，例如60mg口服QID)、Raloxofene(商品名Evista)、和他莫昔芬(商品名Nolvadex，1-1000mg，例如20mg口服bd)，它作用为骨和心血管系统的雌激素受体的激动剂以及乳腺的雌激素受体的拮抗剂)。雌激素受体下调物(ERD)(例如他莫昔芬(商品名Nolvadex))也可被用于本发明。
可以单独地或联合其他的阉割方法使用的抑制性类固醇信号途径的方法的其他非限制性的实例包括芳香酶抑制剂和其他的性腺阻断剂(例如，氨鲁米特、福美坦、vorazole、依西美坦、阿那曲唑((商品名Arimidex；0.1-100mg，例如1mg口服QID)，它降低了雌二醇并增加了LH和睾酮)、来曲唑(商品名Femarat，例如2.5mg口服QID)、和依西美坦(商品名Aromasin，1-2000mg，例如25mg/天)；醛固酮拮抗剂(例如，螺内酯(商品名Aldactone)，例如100到400mg/天)，它作用为阻断雄激素细胞色素P-450受体)；和依普利酮，一种选择性醛固酮受体拮抗剂)；抗孕激素(例如醋酸甲羟孕酮，例如5mg/天，它抑制了睾酮合成和LH合成)；以及黄体酮和抗黄体酮例如选择性黄体酮应答调节物(SPRM)(例如，醋酸甲地孕酮，例如160mg/天，米非司酮(RU486，Mifeprex，例如200mg/天)；以及其他的具有雌激素/抗雌激素活性的化合物(例如，植物雌激素、黄酮、异黄酮和coumestan衍生物、木脂素和具有酚环的工业化学物(例如DDT)。也可以使用抗GnRH疫苗(见，例如Hsu et al.，(2000)Cancer Res.603701；Talwar，(1999)Immunol.Rev.171173-92)或其他任何的能模拟上述药物所产生的作用的药品。另外，也可以发展并使用基于类固醇受体的调节物，它可以被靶向于胸腺和/或BM特异的。这些抑制性类固醇信号途径的机制中的多种机制都是熟知的。也可以使用每种药物的修饰形式，例如它们的醋酸、柠檬酸和其他的盐，这些对于本领域人员是熟知的。
因为激素系统的复杂的和交互编织的反馈机制，性类固醇的施与可能造成性类固醇信号途径的抑制。例如，雌二醇减少了促性腺激素的产生以及对GnRH作用的敏感性。但是，更高水平的雌二醇造成促性腺激素大量释放(surge)。同样的，孕酮影响LH释放的频率和数目。在男性，睾酮抑制了促性腺激素的产生。施与到男性中的雌激素降低了LH和睾酮，以及抗雌激素增加了LH。
在其他实施方式中，抑制了患者的泌乳素。抑制性类固醇介导的信号途径的另一个方法可以是通过直接或间接调节泌乳素水平的方法。泌乳素是一种合成作为激素原的单链蛋白激素。雄性和非孕雌性的泌乳素的正常值范围通常是从约0到20ng/ml，但是在怀孕雌性中，范围通常是约10到300ng/ml。已经报道了泌乳素的总的数百种不同的作用。泌乳素刺激雌性的乳腺发育和乳汁产生。已知异常泌乳素涉及于垂体肿瘤、月经不调、不育、阳痿和泌乳(乳汁生成)。相当数量的研究正在逐步地探讨泌乳素在正常及病理的免疫应答中的作用。发现泌乳素在免疫功能的多个方面都有调节作用，还有证据说明高泌乳素血症是免疫抑制的(Matera L，Neuroimmunomodulation.1997Jul-Aug；4(4)171-80)。施与药用剂量的泌乳素与感染小鼠的生存率的下降以及细胞免疫功能的抑制相关(Oberbeck R，J Surg Res.2003Aug；113(2)248-56)。也有多种药物能损害对泌乳素的多巴胺能的抑制并造成高泌乳素血症。抗多巴胺能药物包括氟哌啶醇、氟奋乃静、硫苯酰胺、甲氧氯普胺和促胃肠动力药物(例如，溴必利、氯波必利、多潘立酮和左舒必利)，它们已经被临床用于治疗上胃肠道的运动病变。
应答于促性腺激素在性腺中所生成的抑制素A和B肽下调了垂体并抑制FSH。活化素(Activin)通常上调GnRH受体并刺激FHS合成，但是过量的产生可以终止性类固醇的产生。因此这些激素也可以是对性类固醇介导的信号途径的抑制的靶点。
在某些实施方式中，将一种LHRH-R拮抗剂施用给患者，随后是一种LHRH-R激动剂。例如，可以以足够剂量的单次注射施与拮抗剂以造成5-8天内的阉割(这对于例如Abarelix是正常的)。当性类固醇已经达到了这个阉割水平时，给予激动剂。这个方案消除或限制了在性类固醇产生减少之前的性类固醇产生的任何尖峰，施与激动剂可能产生这样的尖峰。在另一个替代实施方式中，使用了产生很小的或不产生性类固醇产生尖峰的LHRH-R激动剂，这可以预先施用或不施用LHRH-R拮抗剂。
对性类固醇信号途径的抑制性激素包括大量的雄激素、雌激素和黄体酮家族的激素分子。C21类固醇的黄体酮家族的非限制性的成员包括孕酮、17α-羟孕酮、20α-羟孕酮、孕二酮、孕二醇和孕烯醇酮。C19类固醇的雄激素家族的非限制性的成员包括睾酮、雄烯二酮、双氢睾酮(DHT)、雄烷二酮、Androstandiol、脱氢表雄酮和17α-羟雄烯二酮。C17类固醇的雌激素家族的非限制性的成员包括雌酮、雌二醇-17α、和雌二醇-17β。
性类固醇的信号途径是包括生物合成、分泌、代谢、区室化(compartmentalization)和作用的途径组成部分的复杂后果的净结果。这个途径的一部分还没有被完全了解，然而，仍有多种已有的和潜在的机制用于实现对性类固醇信号途径的抑制。在本发明的一个方面，通过在细胞水平即所谓的“游离”水平修饰生物可获得的性类固醇水平、通过改变生物合成或代谢、与靶细胞上或内的性类固醇受体的结合、和/或性类固醇的细胞内信号途径都可以实现对性类固醇信号途径的抑制。
直接或间接地影响信号途径是有可能的。直接方法包括影响性类固醇的生物合成和代谢、与相应受体的结合以及信号的细胞内修饰的方法。间接方法包括那些已知影响性类固醇激素的产生和作用的方法例如垂体腺体和性腺中所存在的肽激素和生长因子。后者包括但不限于垂体腺体所生成的FSH、LH和活化素、以及性腺所生成的抑制素、活化素和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)。
本领域人员将认识到通过在相关的激素、酶、受体、结合分子和/或配体的水平或通过对分子的直接作用或通过对分子的前体包括编码或调节它的核酸、或能修饰性类固醇作用的分子的作用上进行上述的修饰可以发生对性类固醇信号途径的抑制。
抑制信号途径的直接方法生物合成生物合成的速度是类固醇激素产生以及血清“游离”激素的生物利用度的主要限速步骤。对途径中早期的关键酶例如P450胆固醇侧链裂解(P450scc)的抑制将减少所有主要性类固醇的产生。在另一方面，对途径中后面的酶例如将雄激素转化为雌激素的P450芳香酶(P450arom)或将睾酮转化为DHT的5α还原酶的抑制，将仅仅分别影响雌激素或DHT的产生。性类固醇激素生物合成的另一个重要的方面是催化非活化的与生物活性的类固醇之间相互转换的氧化还原酶家族，例如17-羟类固醇脱氢酶(17-HSD)催化雄烯二酮与睾酮或雌酮与雌二醇-17的相互转换。这些酶是组织和细胞特异的并通常催化还原或氧化反应，例如只在睾丸的Leydig细胞内发现了3型17β HSD，而在卵巢内发现了1型17β HSD。因此它们提供了特异地减少雄激素或雌激素的活性形式的产生的可能性。
有许多种已知的类固醇生物合成途径中的酶的抑制剂已经被用于临床应用或在发展中。下面罗列了这些抑制剂中的一些实例以及它们的治疗模式。重要的是这些酶抑制剂的作用没有过度地影响其他类固醇例如对代谢稳定是重要的肾上腺的糖皮质激素和盐皮质激素的产生。当使用这些抑制剂时，给患者提供替代的糖皮质激素和有时提供盐皮质激素可能是必需的。
性类固醇的生物合成发生在多个部位并利用多种途径，主要是在卵巢和睾丸中产生，但是有一些是在肾上腺内产生，以及在其他的组织例如脂肪内合成衍生物。因此，可能需要抑制性类固醇信号途径的多个机制以保证充分的抑制实现本发明。
代谢和区室化(compartmentalization)性类固醇在血液中的半衰期短，通常仅为数分钟，这是因为快速代谢，特别是肝脏，以及肾脏和脂肪的清除。代谢包括糖基化和硫酸化的结合反应，以及还原反应。这些代谢物中的一些保留有生物学活性，这生物学活性或是激素原的例如雌激素硫酸盐，或是通过内在的生物学活性例如还原雄激素。对代谢速度的任何干扰都能影响性类固醇激素的“游离”水平。但是，还没有得到与影响生物合成的方法一样的实现这一点的方法。
减少“游离的”性类固醇激素水平的另一个方法是通过性类固醇激素与血清中的蛋白例如性激素结合球蛋白、皮质醇激素结合球蛋白、白蛋白和睾酮-雌二醇结合球蛋白的结合的区室化。与性类固醇配体例如载体分子的结合使得不能获得与受体结合的性类固醇。载体水平例如SHBG的增加或引入其他的与性类固醇结合的配体例如可溶性受体可以造成结合的增加。或者，降低水平的载体分子可以使得性类固醇对降解更为敏感。
抗特殊的性类固醇激素的主动或被动的免疫接种是一种形式的区室化。在这种方法在抗雌激素或雄激素的免疫接种之后成功地增加了动物的排卵率的文献中有着实例。从分泌囊泡中分泌出性类固醇。对分泌机制的抑制或修饰是抑制性类固醇信号途径的另一种方法。
受体和细胞内信号途径性类固醇经在细胞内或如最近所示的在靶细胞膜上的特异受体作用于细胞。
细胞内受体是核受体超家族的成员。它们位于细胞的细胞浆内并在与性类固醇激素结合后被转运到核内，在这里它们改变了特异基因的转录。性类固醇激素的受体以多种形式存在。在文献中熟知的是两种形式的孕酮受体，PRA和PRB，以及三种形式的雌激素受体，ERα、ERβ1和ERβ2。可以以多种方法修饰应答于性类固醇激素受体与基因启动子区域内的类固醇应答元件结合的基因的转录。存在于靶细胞核内的辅激活物和辅抑制物都能修饰性类固醇-受体复合物与DNA的结合并据此影响转录。对这些辅激动物和辅抑制物中的多种的鉴定是已知的，以及修饰它们对性类固醇受体的作用的方法是目前研究的热点。性类固醇激素作用中所包含的转录因子的实例是NF-1、SP1、Oct-1和TFIID。类固醇的完全作用需要这些辅助调节物。修饰这些核调节物的作用的方法可能涉及激动物和抑制物之间的平衡，通过使用拮抗剂或经过控制编码调节物的基因的表达。
在细胞膜上已经鉴定出雌激素和孕酮的特异受体，它们的结构不同于细胞内PR。不象经典的作用于基因组的类固醇受体，这些受体通过还没有被完全认识的细胞内途径传递快速的、非基因组的作用。与膜受体相互作用的雌激素激活了与细胞增殖相关的鞘氨醇途径。
已经有可获得的或发展中的经性类固醇的细胞浆受体改变性类固醇的作用的方法。在这个情况中，与特异的类固醇受体相互作用的抗雄激素、抗雌激素和抗孕激素在文献中是熟知的并被用于临床应用中，如上所描述的。它们的作用可能是竞争或阻断受体、修饰受体的水平、敏感性、构象、联合或信号途径。这些药物可以是各种形式的，类固醇的和非类固醇的、竞争性的和非竞争性的。特别相关的是选择性受体调节物，SARM、SERM和SPRM，它们是靶向于特殊组织的并被如上说明的。
有两种方法可以实现对受体的下调第一，通过过量的激动剂(类固醇配体)，以及第二，通过抑制编码受体的相应基因的转录。通过使用选择性激动剂例如他莫昔芬可以实现第一种方法。
抑制信号途径的间接方法生物合成其中一种抑制性类固醇信号途径的间接方法包含通过对负责驱动性腺内的性类固醇激素的生物合成的垂体促性腺激素FSH和LH的利用度或作用的修饰下调相关类固醇的生物合成。一种已建立的FSH分泌的抑制剂是抑制素，一种性腺应答于FSH所产生的激素。已经显示给动物施与抑制素减少了血清的FSH水平，因为垂体分泌FSH的减少。实现两种促性腺激素的减少的最好的已知方法是经下丘脑激素GnRH/LHRH，它驱动垂体合成并分泌FSH和LH。减少了FSH和LH的分泌并因此减少了性腺的类固醇产生的GnRH的激动剂和拮抗剂现在已经被用于临床应用，如在此所描述的。
另一种减少性类固醇激素的生物合成的间接方法是在性腺水平修饰FSH和LH的作用。通过使用直接对抗FSH和LH的抗体、或设计用于与FSH和LH竞争产性类固醇激素的性腺细胞上的它们的相关受体的分子可以实现这一点。另一种修饰FSH和LH对性腺细胞的作用的方法是通过一种促性腺激素作用的辅助调节物。例如，活化素可以减弱卵巢的膜细胞和睾丸的Leydig细胞应答LH产生雄激素的能力。
修饰可以发生在激素前体的水平例如对信号肽例如GnRH的信号肽的裂解的抑制。
受体和细胞内信号途径改变性类固醇激素的信号途径作用的间接方法包括下调导致类固醇的基因组和非基因组作用的受体途径。它的一个实例是孕酮下调靶组织的ER水平的能力。未来的方法包括利用对已知影响细胞核内的受体的辅助调剂物的分子的处理，导致细胞对类固醇的应答的能力的降低。
其他因素虽然用于对BM功能性、BM淋巴细胞生产和免疫细胞功能性的直接及间接作用的刺激主要是依据于对性类固醇的作用的抑制和/或LHRH类似物的直接作用，可作用为一起增强或增加(累加、协同或补充)胸腺、BM、和/或免疫细胞作用和功能性的附加物也可能是有用的。可以使用或不使用附加物。这些化合物包括，但不限于细胞因子和生长因子，例如白介素-2(IL-2,100,000到1,000,000IU，例如600,000IU/kg，每8小时重复剂量)、白介素-7(IL-7，10ng/kg/天到100ng/kg/天，根据治疗的需要)、白介素-15(IL-15；0.1-20mμg/kg/天)、白介素-11(IL-11；1-1000μg/kg)；上皮和成纤维细胞生长因子家族成员，干细胞因子(SCF；也已知为青灰因子(steel factor)或c-kit配体；0.25-12.5mg/ml)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF；1和15μg/kg/天，IV或SC)、粒细胞巨核集落刺激因子(GM-CSF；50-1000μg/平方米/天，SC或IV)、胰岛素依赖性生长因子(IGF-1)、和角化细胞生长因子(KGF；1μg/kg到100mg/kg/天)(见例如Sempowski et al.，(2000)J.Immunol.1642180；Andrew和Aspinall，(2001)J.Immunol.1661524-1530；Rossi et al.，(2002)Blood 100682)；促红细胞生成素(EPO；10-500单位/kg，IV或SC)。用于与本发明同时或连续地共施与的其他合适的造血因子、CSF、细胞因子、淋巴因子、造血生长因子和白介素的非排它性的实例包括Meg-CSF(巨核细胞集落刺激因子，最近被称为c-mpl配体)、MIF(巨噬细胞抑制因子)、LIF(白血病抑制因子)、TNF(肿瘤坏死因子)、IGF、血小板衍生生长因子(PDGF)、M-CSF、IL-1、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、LIF、flt3/flk2、人生长激素、B细胞生长因子、B细胞分化因子和嗜酸性粒细胞分化因子或它们的组合。
在最初的LHRH类似物(或其他的阉割方法)应用时，可以给予一次这些附加化合物的一或多种。可以联合激动剂、拮抗剂或性类固醇阻断的其他任何形式给予每种治疗。因为生长因子具有相对快的半衰期(例如数小时)，它们可能需要每天给药(例如每天给药共7天或更长时间)。如生产商所规定的，可以给予最佳形式的生长因子/细胞因子以保存它们的生物活性，如纯化蛋白的形式。但是，可以在任何时间给予这些物质的任何一种或组合的附加剂量以进一步刺激BM和其他免疫细胞的功能性。在某些情况中，与附加的细胞因子、生长因子、或它们的组合的给药同时进行性类固醇清除或对性类固醇信号途径的阻断。在其他情况中，与附加的细胞因子、生长因子、或它们的组合的给药依次进行性类固醇清除或对性类固醇信号途径的阻断。
术语“动员剂”在此被定义为是指例如SDF(例如AMD3100)、生长激素、GM-CSF、G-CSF和化疗(例如环磷酰胺)等药剂，它们增强了BM干细胞的动员。
已知G-CSF和GM-CSF能分别动员粒细胞(主要是中性粒细胞)和巨噬细胞的产生，以及也造成增加了BM的DC的产生，这有助于给处于抗原攻击中的患者提供非特异性免疫应答(Janeway et al.，(2001)Immunobiology 5th Ed.，p.325)。例如，临床上使用G-CSF和GM-CSF减少了接受骨髓抑制性抗肿瘤药物的非髓系恶性肿瘤患者的感染(表现为发热性粒细胞缺乏症)的发生率，这通常与严重的粒细胞缺乏症以及发热的显著的发病率相关。另外，临床上证实这两种药物都能预防接受HSCT患者的感染。G-CSF和GM-CSF两者目前都被用于进行外周血前体细胞收集或治疗的患者。刺激BM干细胞的分化和/或增殖的集落刺激因子(CSF)已经产生了很多兴趣，因为它们对恢复造血干细胞来源的细胞的受抑制水平的治疗能力。根据它们的活性，已经鉴定并区别出人和小鼠系统的CSF。例如，粒细胞-CSF(G-CSF)和巨噬细胞-CSF(M-CSF)分别刺激中性粒细胞和巨噬细胞集落的体外形成，而GM-CSF和白介素-3(IL-3)具有更广泛的活性，它们刺激巨噬细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞集落的形成。IL-3也刺激肥大细胞、巨核细胞和纯的及混和的红系集落(当加入促红细胞生成素时)的形成。GM-CSF加速了中性粒细胞的恢复并保留其功能性，但对血小板恢复只有很小的可证实的作用。相反地，IL-3促进了中性粒细胞和单核细胞的更为缓慢增加的恢复，但加速了血小板的恢复。
因此，在本发明方法的一些实施方式中使用了G-CSF和/或GM-CSF。与G-CSF和/或GM-CSF治疗一起的性类固醇清除(依次的或同时的)造成了BM的淋巴及髓细胞输出的增加，这反过来显著地提高了患有或可能患有感染的患者的短期及长期结果。在另一个方法中，在化疗或放射治疗后3-4天施与CSF。通过对性类固醇信号途径的中断也极大地增强了与应用CSF所已经相关的临床结果。特别地，与CSF一起使用本发明的方法容许更好地控制对接受例如肿瘤放疗或化疗的患者的感染。另外，如果可以有效地和迅速地“重启”免疫系统，可以使用增加了剂量和频率的化疗药物或放射治疗。这可以发生于有或没有异基因或自体HSC的引入，HSC的引入将进一步地增强免疫系统功能性的及时恢复。阉割也将造成更低数目的必需被移植的HSC，当只能从供者中得到有限数量的HSC或当脐血干细胞被用于移植时，这将是有用的。
例如，同时使用两种不同类型的药物(例如一种GnRH类似物，例如Lupron；和一种雄激素阻断剂，例如Cosudex)可以容许相同的免疫系统的再生，但可能需要减少了剂量的G-CSF或GM-CSF。相似地，当利用相同剂量的G-CSF或GM-CSF时，同时使用这两种不同类型的药物可以容许免疫系统细胞的更大的或更长时间的复壮(rejuvenation)。另外，同时使用两种不同类型的药物同样可以容许免疫系统细胞复壮，但利用了减少了剂量(即与用于治疗前列腺癌、子宫内膜异位症或乳腺癌的“通常”使用的剂量比较时有所减少)的能耗竭或中断性类固醇信号途径的药物、或药物的组合。另外，当利用了减少剂量了的用于耗竭或中断性类固醇信号途径的药物或药物的组合时，同时使用两种不同类型的药物容许免疫系统细胞的更大程度或更长时间的复壮。
适应证已知引起性类固醇去除或阻断性类固醇信号途径的药物，可单独或与或不与上面所提及的生长因子和细胞因子联合使用，用于作为一种促进HSC植入的辅助治疗(见，例如实施例22)、作为一种异基因或自体器官或细胞移植的有效处理的辅助治疗(见例如，实施例21和22，以及共同未决、共拥有的美国No.10/419,039和10/749,119)这些药物在这些疾病中的应用将造成更有效的治疗结果或将造成更有效的总体治疗方案。另外，如实施例25和26所描述的，可以改变各种化疗药物的剂量或给药(或放射治疗的剂量)，使得它们现在产生更少的副作用和/或造成患者的更好的生活质量的结果。此外，各种细胞因子和生长因子的共施与可以容许减少移植所必需的HSC数目。例如，利用本发明的方法，使用人脐血的成人HSCT现在可能是可能的，因为减少了获得植入所需的细胞数目。
药用组合物可以以任何可药用的载体施用或者可以无载体施用本发明所用的化合物。根据标准的方法可以制备药用组合物的剂型(见，例如Remington，The Science and Practice of Pharmacy.Gennaro A.R.，ed.，20th edition，Williams & Wilkins PA，USA(2000))。可药用载体的非限制性的实例包括生理上相兼容的包膜、溶剂和稀释剂。对于肠外、皮下、静脉内和肌肉内给药，组合物可以受例如封装的保护。或者，可以与保护活性成分(复数)的同时容许这些成分缓慢释放的载体一起提供组合物。本领域已知有很多种聚合物和共聚物被用于制备定时释放的剂型，例如乳酸/乙醇酸共聚物的各种版本。见，例如美国No.5,410,016，它将经修饰的聚乙二醇聚合物用作为生物可降解的涂层。
拟用于口服给药的剂型可以被制备为液体、胶囊、片剂等等。这些组合物可以包括例如，赋形剂、稀释剂、和/或保护活性成分不被降解的涂层。这样的剂型是熟知的(见，例如Remington，The Science and Practiceof Pharmacy，Gennaro A.R.，ed.，20th edition，Williams & Wilkins PA，USA(2000))。
在本发明的任何一种剂型中，都可以包括不会负性影响LHRH类似物的活性的其他化合物(即不会阻断LHRH类似物阻断性类固醇激素信号途径的能力的化合物)。实例是在此所描述的各种生长因子和其他细胞因子。
剂量经常规训练的医生或兽医可以容易地确定出本发明所用的性类固醇类似物或抑制剂阻断性类固醇激素信号途径的剂量，也可以通过查询医学文献将其确定(例如，THE PHYSICIAN′S DESK REFERENCE，52NDEDITION，Medical Economics Company，1998)。
主治医师结合各种将修饰药物作用的因素例如患者的病变、体重、性别和饮食、任何病变的严重度、给药时间和其他临床因素将确定出用于治疗上述病变的方法所相关的剂量方案。通过定期测定血液指标例如血细胞分类计数等等可以监测所治疗患者的进展。
调整上面所叙述的剂量以补偿治疗组合物中的其他成分。这些成分包括与其他CSF、细胞因子、淋巴因子、白介素、造血生长因子的共同给药、与化疗药物和/或放射的共同给药、以及主治医师所识别到的各种患者相关的内容例如修饰药物作用的因素，例如患者的病变、体重、性别和饮食、任何病变的严重度、给药时间和其他临床因素。
除了上述的剂量外，例如，可以以将持续一段时间(例如3到6个月)的单次剂量施与LHRH类似物和其他的性类固醇类似物。在某些情况中，剂型将有效1到2个月。标准剂量随所用类似物的类型而有所不同，但是这对本领域人员是容易决定的，不需过多的试验。一般而言，剂量是在约0.01mg/kg和约10mg/kg之间，或约0.01mg/kg和约5mg/kg之间。
性类固醇抑制或LHRH/GnRH类似物的治疗时间的长度随着胸腺萎缩和损伤的程度而有所不同，这对本领域人员是容易决定的，不需过多的试验。患者越老，或他们已经被暴露于T细胞耗竭物例如化疗或放疗越多，他们需要例如GnRH的治疗似乎就越长。四个月通常被认为足以检测到血液中的新的T细胞。检测血液中的新的T细胞的方法在本领域是已知的。例如，通过确定T细胞受体删除环(TREC)的存在是一种T细胞检测的方法，当在TCR形成时形成了TREC，而当细胞分裂时它从细胞内缺失。因此，TREC只见于新的(原初)T细胞中。TREC水平是人类胸腺功能的一个指示。在WO/00230,256中详细地描述了这些及其他的方法。
剂量因所用的性类固醇抑制剂或例如抗性类固醇疫苗或其他阻断剂而不同。在某些情况中，一个剂量可以被制备为持续与所需的持续时间一样长的时间。例如，如在此所述的制备并给予一种LHRH类似物剂型2个月以上的时间，按需每2个月以上给予附加剂量。
可以制备出增强免疫系统的制剂。或者，可以与性类固醇类似物或LHRH类似物一起或在空间上和/或时间上都分开地施与GM细胞。与用非GM细胞一样，可以按需随着时间给患者施用多次剂量以形成对给定的外来抗原的耐受性。
本领域人员可以明白，至少一些阻断性类固醇信号途径的方法的有效时间只与施与合适化合物的时间一样长。因此，本发明的某些实施方式的优点是一旦已经实现了本发明所需的免疫效应，就可以终止治疗(2-3个月)，并且这些对象的生殖系统将恢复到正常。
化学阉割药物的施用可以通过任何将药物给予到体内的方法施与性类固醇清除除药物。因此，根据发明，可以用任何途径包括但不限于静脉内、皮内、皮下、肌肉内、局部和口服的给药途径施与性类固醇清除药物。
除了上述的方法外，经本领域人员已知的多种方法可以完成用于本发明的方法的化合物的给予。一个用于施与化学抑制剂以抑制性类固醇介导的信号途径的标准方法利用了有效3个月的单次剂量的LHRH激动剂。对此，单个时间的简单的静脉内或肌肉内注射都是不够的，因此早在三个月过去之前激动剂就已经被从患者的体内清除出去。取而代之的是，可以使用储存剂注射液或植入物、或任何其他的给予容许缓慢释放抑制剂的工具。同样地，可以使用用于增加抑制剂在体内的半衰期同时保留在此所需的功能的方法，例如通过修饰化学物。
有用的施用机制包括，但不限于，对皮肤的激光照射。在共拥有的、共同未决美国No.10/418,727以及也在美国No.4,775,361、5,643,252、5,839,446、6,056,738、6,315,772、和6,251,099中更详细地描述了这个实施方式。另一种有用的施用机制包括在皮肤上产生高压脉冲暂态(也叫做应力波或脉冲暂态)。在共拥有的、共同未决美国No.10/418,727以及也在美国No.5,614,502和5,658,822中更详细地描述了这个实施方式。通过将化合物与载体或没有载体放置在相同的位置可以完成或进行每种方法。这种放置的一个方法是被放置在并在皮肤上被保持一段治疗的持续时间的垫片内。
时机在一个情况中，耗竭性类固醇或阻断性类固醇信号途径的药物(或其他的阉割方法)的给药发生在例如可能引起一些BM骨髓细胞耗竭和/或损伤循环的免疫细胞的化疗或照射方案之前。
细胞或在没有胸腺再活化的情况下、或先于胸腺再活化、或在胸腺再活化的同时，注射造血前体细胞例如被明确定义为CD34+的造血细胞(理想的是自体的)能增强胸腺再活化的程度和动力学和/或增加免疫细胞和BM功能性以及植入。HSC也还可以被定义为低Thy-1和CD38-、CD34+CD38-；缺少其他细胞系(lin阴性)的标记物的低Thy-1的细胞是更为原始的HSC，它可以更长时间地持续或具有更长期的重新入巢的能力。
通过添加例如CD34+HSC和/或上皮干细胞可以补充在此所述的各种发明的方法。在一种情况中，这些细胞是自体的或同基因的并在胸腺再活化之前已经从患者或孪生子中得到的。通过分选患者的血液和/或BM的CD34+或CD34lo细胞可以得到HSC。可以有多种方法用于增强HSC的数目，包括(但不限于)通过在收集细胞之前给患者施用G-CSF(Neupogen，Amgen)、将所收集的细胞培养在SCSF中、和/或在补充CD34+细胞之后给患者施用G-CSF。或者，如果通过之前给患者施用G-CSF增强了CD34+细胞群，那么就不必从血液或BM中分选出CD34+。
HSC可被用于遗传学修饰。这些HSC可以来源于BM、外周血或脐带、或任何其他的HSC来源、以及可以是自体的或非自体的。也有用的是淋巴或髓系祖细胞、也在骨髓中发现的间质干细胞以及上皮干细胞，也可以是自体的或非自体的。干细胞也可以包括脐带血。它们也可以包括具有分化成多种不同的细胞类型的潜能的干细胞，例如胚胎干细胞和现在在许多组织例如BM、胰腺、脑和嗅系统中所发现的成人干细胞。
在使用非自体的(供者)细胞的情况中，在胸腺再活化期间或之后产生了对这些细胞的耐受性。在开始阻断性类固醇介导的信号途径期间或之后，将相关的(经遗传学修饰的(GM)或未经遗传学修饰的)供者细胞移植到受者内。这些细胞，理想的是干细胞或祖细胞被胸腺所结合并接受，其中它们通过消除任何偶尔可以有活性对抗供者细胞的新产生的T细胞生成了对供者的耐受性。然后它们“属于受者”并可以称为胸腺的新的T细胞和DC的产生的一部分。所形成的T细胞都把受者和供者识别为自身的，据此生成了对来自供者的移植物的耐受性(见，共拥有的、共同未决美国No.10/419,039和PCT/IBOI/02740)。
在另一个实施方式中，所施与的受者干细胞或祖细胞(经遗传学修饰的或未经遗传学修饰的)包括来自多个个体的细胞，使得受者发展出对一组MHC类型的耐受性，使得受者被认为是更容易的或快速的细胞、组织或器官移植的合适的侯选者，因为它们具有与更大范围的供者匹配的MHC。
本发明也提供了用于将外来DC整合到患者胸腺内的方法。通过给受者施与供者细胞以形成受者内的耐受性可以实现这一点。供者细胞可以是DC、上皮干细胞、成体或胚胎干细胞、或造血前体细胞。供者细胞可以是CD34+HSC、淋巴祖细胞、或髓系祖细胞。在一些情况中，供者细胞是CD34+或CD34lo HSC。供者HSC在受者中可以发育为DC。供者细胞可以被施与到受者并通过外周血液系统或直接或经BM迁移到再活化的胸腺内。为了增强诱导耐受性的胸腺整合，也可以联合通过使用性类固醇抑制剂例如LHRH/GnRH类似物对胸腺再活化的活化，往胸腺内注射干细胞。在胸腺的微环境及其中合适的细胞生长因子的含量内，甚至非HSC似乎也可被诱导形成DC。
对性类固醇的抑制或缺失显著地增加了胸腺对造血前体细胞的摄取。这些细胞被整合到胸腺内并按与受者细胞相同的方式产生DC、NK、NKT、和T细胞。结果是T细胞、DC和其他细胞的嵌合体。供者细胞在受者胸腺内的整合意味着这个胸腺所产生的T细胞将被选择，使得它们能耐受供者细胞。这样的耐受性容许从受者中进一步移植它的细胞、组织和器官，减少了对免疫抑制药物的需要，因为所移植的材料将被受者的免疫系统识别为自身的材料。
任选地对干细胞或祖细胞的遗传学修饰本发明也包括利用遗传学修饰的造血干细胞、淋巴祖细胞、髓系祖细胞、上皮干细胞、或其组合(GM细胞)的基因治疗的方法。其他人所进行的先前的输送这些细胞作为基因治疗的尝试已经是不成功的，造成修饰细胞的不可计数的水平。本说明书提供了一种新的用于输送这些细胞的方法，它促进了细胞的摄取并分化为所需的T细胞。将修饰的细胞注射到患者内。胸腺摄取修饰的干细胞和祖细胞并转化为T细胞、树突状细胞和其他胸腺内产生的细胞。这些新细胞的每一个细胞都含有亲代干细胞/祖细胞的遗传学修饰。
在阉割步骤期间或之后，可以将来自供者的造血干细胞或祖细胞、或上皮干细胞移植到受者患者内。胸腺接受这些细胞为属于受者的细胞并开始成为胸腺的新的T细胞和DC产物的一部分。
所形成的T细胞群将供者和受者(对于非自体移植的情况)都识别为自身的。在受者中也可以生成对来自供者的移植物的耐受性。移植物可以是供者的细胞、组织或器官、或它们的组合。在开始阻断性类固醇介导的信号途径的3到4周内(开始LHRH治疗后的近2到3周内)，在血流中可以出现最初的新的T细胞。T细胞池的完全发育可能要3到4个月。所形成的T细胞群都把受者(和供者，对于非自体移植的情况)识别为自体。在受者中也可以形成对供者移植物的耐受性。
将一种生成患者对供者移植物的耐受性的合适的基因或多核苷酸(即，定义特异蛋白的核酸序列)遗传工程地加工到干细胞和/或祖细胞内。通过将特异基因引入到HSC内，细胞分化成例如APC，它表达作为在MHC I型或II型背景中所表达的肽的蛋白。
患者可以被给予性类固醇类似物以激活他们的胸腺，和/或提高他们的骨髓功能，这包括增加了摄取并产生HSC的能力。在一种情况中，在胸腺再活化之前或与之同时给患者提供造血细胞，它增强了患者机体的免疫力。在一种实施方式中，患者在阉割期间或之后接受HSCT。患者被注射了他们自身的HSC，或被注射了来自合适供者的HSC，例如已经用G-CSF预处理供者三天(每天两次皮下注射)，随后在第4和5天从血液中收集HSC。HSC可以被基因(例如编码来自病因的蛋白、肽或抗原)转染或转导以产生所需的蛋白或抗原。在注射到患者体内后，HSC从血液中进入骨和骨髓，然后一些回到血液最终转化成全身各处的T细胞、DC、APC。抗原被表达于这些APC的表面的I型MHC和/或II型MHC分子的背景中。
本领域人员熟知用于分离和转导干细胞和祖细胞的方法。例如在PCT文献No.WO 95/08105、WO 96/33281、WO 96/33282、美国No.5,681,559、5,199,942、5,559,703、5,399,493、5,061,620中描述了这些类型方法的实例。
反义多核苷酸术语“反义”在此被定义为互补于本发明的多核苷酸的多核苷酸序列。多核苷酸可以是DNA或RNA。可以用任何方法生成反义分子，方法包括通过将反向定位的相关基因连接到允许互补链合成的病毒启动子上的合成。一旦被引入到细胞内，这个转录链与细胞所生成的天然序列结合形成双链体。然后这些双链体阻断了进一步的转录或转译。通过这种方式，可以生成突变的表型。
催化核酸术语“催化核酸”在此被定义为特异地识别一种特殊底物并催化底物的化学修饰的DNA分子或含DNA的分子(在本领域也被叫做“脱氧核酶”或“DNA酶”)或RNA分子或含RNA的分子(也叫做“核酶”)。催化核酸中的核酸碱基可以是碱基A、C、G、T和U，以及它们的衍生物。这些碱基的衍生物在领域是熟知的。
催化核酸通常含有用于特异识别靶核酸的反义序列以及裂解酶的活性的核酸。催化链裂解靶核酸内的特异位点。在本发明中特别有用的核酶类型是锤头状核酶(Haseloff and Gerlach(1988)Nature 334585)，Perrimanet al.，(1992)Gene 113157)和发夹结构核酶(Shippy et al.，(1999)Mol.Biotechnol，12117)。
dsRNA双链RNA(dsRNA)对于特异地抑制特殊蛋白的产生是特别有用的。虽然不愿被理论所限制，但是一个小组已经提供了一种用于通过其可以用dsRNA减少蛋白产生的机制的模型(Dougherty and Parks，(1995)，Curr.Opina.Cell Biol.7399)。最近这个模型已经被修饰并扩展(Waterhouse etal.，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9513959)。这个技术依赖于存在含有与相关基因的mRNA基本一致的序列的dsRNA，其中mRNA编码本发明的第一个方面的多肽。便利地，可以在重组载体或宿主细胞的单个开发阅读框中生成dsRNA，其中用无关序列侧面连接有义和反义序列，这使得有义和反义序列杂交形成dsRNA分子，具有与无关序列形成的环结构。对本发明的合适的dsRNA分子的设计及产生都是在本领域人员的能力范围内，特别是结合于Dougherty和Parks，(1995)，Curr.Opin.Cell Biol7399；Waterhouse et al.，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9513959；和PCT出版物No.WO 99/32619、WO 99/53050、WO 99/49029、和WO 01/34815。
基因在本发明的方法中，有用的基因和基因片段(多核苷酸)包括那些编码耐受特殊的外来抗原，例如供者抗原或甚至是过敏原的基因。在本发明的一个非限制性的实例中，其中供者与受者相关，但表达其他的MHC分子或Y染色体所表达的分子(例如，受者是男性和供者是女性)，在供者HSC重建受者之前，编码分子的基因可以被转染并表达于供者HSC中，或可以被转染并表达于受者自身的HSC中(例如，在性类固醇清除之前或与之同时从受者中所收集到的HSC)。
使用这些基因或基因片段的可稳定表达形式。可以使用这些基因或基因片段的可稳定表达的形式。术语“可稳定表达的”在此被定义为在基因或基因片段被转移到细胞之后，能够至少在宿主细胞的半永久性基础上以及在分裂和/或分化后的细胞子代中表达基因或基因片段(“功能片段”)的产物(RNA和/或蛋白)。这要求无论是否是包含在载体中的基因或基因片段都要具有合适的用于将DNA转录为RNA的信号序列。另外，当基因或基因片段所编码的蛋白是影响患者的状态的活性分子时，DNA也编码转译信号。
在绝大多数情况中，基因或基因片段被包含于载体中。本领域一般人员都知道可以被用于表达所需的RNA或蛋白的表达载体。表达载体是能指导在此所含的DNA序列的转录及所形成的RNA的转译的载体。表达载体能在细胞内复制，能被遗传学修饰，它包括质粒、噬菌体、病毒和微型染色体。同样地，基因或基因片段可以成为细胞的染色体DNA的整合部分。重组载体和方法学通常是熟知的。
用于表达本发明的蛋白的表达载体可以包括复制起点。适当构建的表达载体包括用于细胞内的自主复制的复制起点，或能整合到宿主细胞的染色体中。这些载体也可以包含选择性标记物，有限数目的有用的限制性酶位点、高拷贝数目和强启动子。启动子是指导RNA聚合酶与DNA结合并启动RNA合成的DNA序列；强启动子引起了高频率的启动。
在一个实施方式中，DNA载体构建体包括一个启动子、增强子和多腺苷酸化信号。启动子可以选自由HIV，例如长末端重复(LTR)、猴病毒40(SV40)、Epstein Bar病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、Rous肉瘤病毒(RSV)、莫洛尼病毒、小鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)、人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酐、人金属硫蛋白(metalothionein)所构成的非限制性的组。在另一个实例中，使用了诱导型启动子，使得可以控制所插入的基因或多核苷酸的表达的数目和时机。
增强子可以选自包括但不限于人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酐和病毒增强子例如那些来自CMV、RSV和EBV的增强子的组。启动子和增强子可以来自相同的或不同的基因。
可以从由LTR多腺苷酸化信号和SV40多腺苷酸化信号、特别是其中的SV40最小腺苷酸化信号所组成的组中选出多腺苷酸化信号。
本发明的表达载体可以被可操纵地连接到编码本发明所用的RNA或蛋白的DNA上，即载体能指导所连接的DNA分子的复制以及DNA分子所编码的RNA或蛋白的表达。因此，对于蛋白，表达载体必须在所连接的DNA分子的上游具有转录起始信号，保持正确的阅读框以容许DNA分子在控制序列的控制下的表达和DNA分子所编码的所需蛋白的产生。表达载体可以包括但不限于，克隆载体、经修饰的克隆载体和特别设计的质粒或病毒。可以使用诱导型启动子，使得可以控制所插入的基因或多核苷酸的表达的数目和时机。
本领域人员能生成在细胞内有功能的DNA构建体。为了测试表达，利用对与被遗传学修饰的那些细胞相同类型的细胞的组织培养可以在体外测定遗传构建体的表达水平。
遗传学修饰的方法可以用标准的重组方法将遗传学修饰引入到正被用于基因治疗的细胞内。例如，对培养的HSC的逆转录病毒载体的转导是一种本领域已知的成功方法(Belmont and Jurecic(1997)″Methods for EfficientRetrovirus-Mediated Gene Transfer to Mouse Hematopoietic Stem Cells，″inGene Therapy Protocols(P.D.Robbins，ed.)Humana Press，pp.223-240；Bahnson et al.，(1997)″Method for Retrovirus-Mediated Gene TransfertoCD34+-Enriched Cells，″in Gene Therapy Protocols(P.D.Robbins，ed.)，Humana Press，pp.249-263)。其他的载体包括但不限于那些腺病毒来源的或慢病毒来源的、和莫洛尼小鼠白血病病毒来源的载体。
下面的方法对HSC的遗传学修饰也是有用的颗粒介导的基因转移例如用基因枪(Yang，N.-S.and P.Ziegelhoffer，(1994)″The ParticleBombardment System for Mammalian Gene Transfer，″In PARTICLEBOMBARDMENT TECHNOLOGY FOR GENE TRANSFER(Yang，N.-S.and Christou，P.，eds.)，Oxford University Press，New York，pp.117-141)、脂质体介导的基因转移(Nabel et al.，(1992)Hum.Gene Ther.3649)，coprecipitation of genetically modified vectors with calcium phosphate(Graham and Van Der Eb，(1973)Virol.52456)、电穿孔(otter et al.，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 817161)、和微注射(Capecchi，(1980)cell22479)，以及其他的能稳定地将可能是在载体内的基因或寡核苷酸转移到HSC和其他被遗传学修饰的细胞内使得基因被表达至少部分时间的方法。
基因治疗本说明书也提供了用于经患者胸腺再活化的基因治疗的方法。通过给予受者GM细胞以及经过阻断性类固醇介导的信号途径实现这一点。通过在此所述的方法，在所有的目前可确定的方面，性类固醇诱导的萎缩胸腺最终都被结构地和功能地恢复到接近于它的最佳的青春期前的能力。这些方面包括所有T细胞亚组的数目、类型和比例。也包括复杂的间质细胞和它们的三维结构，它们构成了产生T细胞所需的胸腺微环境。新生成的T细胞从胸腺迁出并恢复了外周T细胞的水平和功能。
通过稍微在胸腺开始再生之前或与之同时添加CD34+造血干细胞(HSC)和/或上皮干细胞可以补充胸腺的最终再活化。这些细胞可以是自体的或同基因的，并且在胸腺再活化之前已经从患者或孪生子中得到。通过从患者的血液和/或骨髓中分选CD34+细胞可以得到HSC。通过一些方法可以增强HSC的数目，包括(但不限于)通过在收集细胞之前给患者施用G-CSF(Neupogen，Amgen)、将所收集到的细胞培养在干细胞生长因子中、和/或在CD34+细胞补充之后给患者施用G-CSF。或者，如果通过预先给患者注射G-CSF增强了CD34+细胞群，就不必从血液中分选出CD34+细胞。
在一个实施方式中，在胸腺再活化之前或与之同时给患者补充造血细胞，胸腺再活化增强了患者机体的免疫能力。可以或可以不遗传学修饰造血细胞。遗传学修饰的细胞可以是HSC、上皮干细胞、胚胎或成体的干细胞、或髓系或淋巴祖细胞。在一个实施方式中，遗传学修饰的细胞是CD34+或CD34lo HSC、淋巴祖细胞或髓系祖细胞。在另一个实施方式中，遗传学修饰的细胞是CD34+HSC。遗传学修饰的细胞被施与到患者内并经外周血液系统迁移到胸腺中。在没有性类固醇时，显著地增加了胸腺对这些造血前体细胞的摄取。这些细胞变得整合到胸腺内产生了携带有来自改变细胞的遗传学修饰的树突状细胞和T细胞。结果是具有所需的遗传改变的T细胞群循环在受者的外周血中，以及伴有再活化的患者胸腺所引起的细胞、组织和器官群的增加。
在开始阻断性类固醇介导的信号途径的3-4周(开始LHRH治疗后的近2-3周)内，首批新的T细胞出现在血流中。但是，T细胞池的完全发育可能需要3-4(或更长)个月。
耐受性的诱导通过本发明的方法可以改变个体的T细胞群。具体的，可以诱导将形成对非同一的(即异基因的或异种的)移植物的耐受性的修饰。如果供者来源的树突状细胞被整合到受者的胸腺内，可以最好地实现对外来性抗原、特别是临床移植物情境中的非自体的供者抗体的耐受性的建立。通过使用抑制性免疫调节细胞(例如，CD25+CD4+T细胞、NKT细胞、γδT细胞)也可以使得这种形式的耐受性是更为有效的。但是，对后者发生的机制了解的还很少，但是再一次涉及了树突状细胞。
假定预防T细胞对抗自体抗原的主要机制是因为胸腺树突状细胞对这些细胞的负选择(通过克隆去除)，形成具有来自可能的器官或组织供者的树突状细胞的胸腺的能力对预防移植物排斥有着重要作用。这是因为可能排斥移植物的T细胞在胸腺内会遇到供者树突状细胞，并在它们有机会进入血流之前就被去除。发育为树突状细胞的血液前体细胞与发育为T细胞本身的那些前体细胞是相同的细胞。
在一些实施方式中，所移植的HSC可以在完全的骨髓清除或骨髓耗竭之后，因此造成了完全的HSC移植(例如，每次移植每kg体重5×106细胞)。在一些实施方式中，只需要实现较小的骨髓清除，例如在2-3Gy照射(或300Rad)后施与约3-4×105个细胞/kg体重。在一些实施方式中，使用了T细胞清除(TCD)、和/或另一种免疫细胞清除的方法(见，例如实施例2)。最小到10％嵌合体就可能足以缓解患者的过敏或自身免疫性疾病的症状。在一些实施方式中，供者HSC是来自脐带血(例如，1.5×107细胞/kg用于植入受者)。
HSC首先入巢到BM并转化为血细胞(植入)的能力与所注射的HSC的绝对数目和质量、和受者骨髓微环境的功能能力和HSC巢都直接相关。本发明的方法单独或联合(与之同时或依次)施与HSC动员剂例如细胞因子(例如G-CSF或GM-CSF)、或药物(例如环磷酰胺)容许更快和/或更好的植入，以及也可以容许给予更高剂量和/或更多频率的化疗和放射治疗。
在其他实施方式中，直到骨髓清除化疗前45天，患者开始接受Lupron并与BMT同时连续接受Lupron，使得暴露于药物的总长在9个月左右(等于3次注射，每次注射给药可维持3个月)。在研究期间的不同的间隔内，可以收集血样分析T细胞的数目(特别是新近胸腺迁出)和功能(具体的是体外对T细胞刺激的应答)。这个实施方式也通常适用于在此所描述的其他目的的HSCT。
在其他实施方式中，可以在淋巴清除之后移植HSC。在一些实施方式中，可以选择性清除T细胞和/和B细胞，按需去除细胞(例如那些涉及自身免疫性和过敏的细胞)。选择可以包括去除活化细胞或涉及自身免疫或过敏应答的细胞类型。可以根据细胞表面标记物例如CD4、CD8、B220、thy1、TCR、CD3、CD5、CD7、CD25、CD26、CD23、CD30、CD38、CD49b、CD69、CD70、CD71、CD95、CD96、抗体特异性或Ig链、或上调调细胞因子受者例如IL-2R B链和TGFβ选择细胞。一种熟知的用于耗竭的方法是使用抗淋巴细胞球蛋白。其他选择和分选细胞的方法是熟知的，包括磁性和荧光细胞分离、离心和更具体的是血浆置换、白细胞分离术和淋巴细胞分离术。
在一些实施方式中，在没有骨髓清除、骨髓耗竭、淋巴耗竭、T细胞清除和/和其他选择性的免疫细胞清除时进行HSCT。
在其他实施方式中，本发明的方法还包括通过例如施予免疫抑制剂(例如，环孢菌素、强的松、Ozothioprine、FK506、依木兰和甲氨碟呤)将患者免疫抑制(见美国No.5,876,708)。在一个实施方式中，在无HSCT时进行免疫抑制。在一个实施方式中，结合HSCT(例如在其之前、与之同时和之后)进行免疫抑制。在另一个实施方式中，在不存在骨髓清除、淋巴清除、T细胞清除和/和其他选择性的免疫细胞清除、去除和耗竭时进行免疫抑制。仍在另一个实施方式中，结合骨髓清除、淋巴清除、T细胞清除和/和其他选择性的免疫细胞清除、去除和耗竭进行免疫抑制(例如在其之前、与之同时和之后进行)。
如上所述，骨髓清除、骨髓耗竭、淋巴清除、免疫抑制、T细胞清除和/和其他选择性的免疫细胞清除是在本申请书的全文中都被使用的免疫细胞清除的非限制性的实例类型。通用术语“免疫细胞耗竭”在此被定义为包括这些方法中的每一种方法，即骨髓清除、骨髓耗竭、淋巴清除、T细胞清除和/或其他的选择性的免疫细胞清除(例如B细胞和NK细胞耗竭)。本领域人员容易理解的是，在实践在此所提供的发明时，可以用任何一种(或多种)其他的“耗竭”方法取代这些“耗竭”方法中的任何一种。
在一个实施方式中，耗竭了NK细胞。NK抗体用于耗竭NK细胞群在本领域是已知的。例如，抗NK抗体的一个来源是抗人胸腺细胞的多克隆抗血浆。美国No.6,296，846描述了NK和T细胞耗竭的方法以及非骨髓清除治疗和嵌合淋巴造血细胞群的形成，所有的这些都可被用于本发明的方法。
在一些实施方式中，本发明的方法还包括例如在HSCT之前，通过血流灌注从供者中所获得的器官(例如肝或肾)中吸附受者血液中的天然抗体。
在另一个实施方式中，本发明还包括减少T辅助细胞的治疗(T cellhelp-reducing treatment)，例如增加直接和间接(例如通过对第二细胞因子活性水平的刺激或抑制)促进对移植物的耐受性的细胞因子(例如IL-10、IL-4和TGFβ)的活性水平，和减低促进对移植物的排斥的细胞因子的活性(例如，一种抵抗和抑制耐受性的细胞因子(例如，IFNβ、IL-1、IL-2和IL-12)。在一些实施方式中，施予细胞因子以促进耐受性。细胞因子可以来源于供者物种和来源于受者物种(见，例如，美国No.5,624,823，它描述了用于这种用途的编码猪白介素-10的DNA)。辅助诱导治疗的持续时间可以近似等于和少于受者物种的成熟T细胞在首次被抗原刺激之后启动对抗原的排斥所需的时间(在人类这通常是8-12天)。在其他实施方式中，持续时间是近似等于或少于受者的成熟T细胞在首次被抗原刺激之后启动对抗原的排斥所需的时间的2、3、4、5和10倍。在存在和缺少可以刺激受者的成熟T细胞释放细胞因子的治疗时，例如缺少强的松(17，21-dihydroxypregna-1，4-diene-3，11，20-trione)时可以施予短期的辅助减少治疗。可以在引入移植物之前或大致时间时，开始辅助减少治疗。短期的辅助减少治疗可以是术前和术后的。在一些实施方式中，供者和受者是I型匹配的。
此外，增强胸腺摄取造血干细胞的能力意味着可以操作树突状细胞的性能和类型。例如，可以用特异基因转染干细胞，特异基因最终成为表达于胸腺(或身体的其他部位)的树突状细胞内。在本发明的一个非限制性的实例中，其中供者与受者有关，但表达Y染色体(例如，其中受者是女性和供者是男性)所表达的附加的MHC分子或分子，编码分子的基因可以或者在用供者HSC重建受者之前被转染并表达于供者的HSC内，或可以被转染并表达于受者自身的HSC内(例如在性类固醇清除之前或与之同时从受者中收集到的HSC)。遗传学修饰细胞例如插入MHC(HLA或SLA)基因的方法在本领域是已知的(见，例如，美国No.5,614,187、6,030,833、6,306,651和6,558,663)。无论供者或受者的一些HSC都发育成树突状细胞，并因此训练新形成的T细胞使得附加分子为“自体”。当如此训练的T细胞遇到了这样的供者移植物组织所表达的分子时，将识别组织为自体组织并不会尝试去排斥它。使上，阳性选择可以包括多种细胞类型皮质上皮细胞提供了特异的分化分子以及第三部分细胞提供了MHC/肽配体。
对BM和HSC的作用本发明提供了用于增加患者的BM的功能包括增加HSC的产生和增强造血作用的方法。这些方法在多个应用中都是有用的。例如，无论是用于癌症或其他的目的，化疗和放疗的其中一种困难的副作用就是它们对患者BM的负性影响。根据化疗的剂量，BM可以被损伤或清除以及血细胞的产生可以被阻碍。根据本发明，在化疗治疗后施予一个剂量的性类固醇类似物(例如LHRH类似物)有助于化疗对BM和血细胞的损伤的恢复。同样的，在给予化疗前数周施予LHRH类似物增加了HSC和其他的血细胞群，使得减少了化疗的一些有害作用。
例如，BM功能的提高可以应用于患有血液疾病的患者。术语“血液疾病”在此被定义为直接或间接地累及血液系统的细胞的任何疾病和病，包括但不限于与造血相关的疾病例如白血病。因此，例如，本发明的方法可用于在异基因HSCT中用来自受者的新细胞(匹配的和不匹配的)，或在自体HSCT后用患者自己的细胞取代血液系统的癌细胞。
BM所增加的HSC产生引起了红细胞的增加，反过来它对处理RBC产生是有用的。通过寻找例如增加的红细胞比容可以容易地确定出这一点。
在一些实例中，所增加的HSC是CD34+或CD34lo HSC。所动员的HSC(例如用G-CSF)能有助于“修复”和复壮组织例如心脏组织和肺组织。HSC具有生成非造血组织的能力。虽然在体外已经进行了很多这方面的工作，一项在Mayo Clinic Rochester的研究已经显示在BMT之后的少量心肌细胞是供者来源的。相似的，密西根的Beuamont医院已经用HSC修复受损的心肌，尽管HSC是否成为肌细胞和血管还不清楚。小鼠试验也已经显示出HSC变成产胰岛素的β细胞的能力。其他工作已经显示出HSC能成为骨骼肌(肌细胞)、肝脏(肝细胞)、骨骼、结缔组织、上皮组织(例如肺、胃肠道和皮肤的上皮组织)、血管、神经元和胰岛β细胞。
在此所述的方法可用于修复对BM的损害和/或有助于取代已经被各种治疗(例如癌症化疗药物、放射治疗)和疾病(例如HIV、慢性肾功能衰竭)所损害或破坏的血细胞。
在一些化疗方案中，例如治疗任何血液肿瘤的大剂量化疗，对BM的清除是必需的作用。在清除发生后可以马上使用发明的方法以刺激BM并增加HSC和它们的子代血细胞的产生，以缩短患者的恢复时间。在施予化疗之后，从患者体内清除化疗药物通常需要一天或更多天，给患者施予在此所述的方法的一个剂量的LHRH类似物。这可以联合施予自体或异基因BM或造血干细胞或祖细胞、以及其他的因子例如集落刺激因子(CSF)和干细胞因子(SCF)。
或者，患者可以具有不好的(或“疲劳的”)BM功能并可能不能产生足够多的或正常数目的HSC及其他的血细胞。多种病变都可以造成这一点，包括正常的衰老、长时间的感染、化疗后、放疗后、慢性疾病状态包括癌症、遗传异常和移植诱导的免疫抑制。另外，照射例如全身照射可以对BM的生产能力有着重大影响。这些病变也可以或被预先治疗以最小化负面作用(例如化疗和/或放射治疗的负面作用)，或在发生后被治疗以逆转作用。
对T细胞的作用通过摄取性类固醇介导的信号途径的阻断剂(例如GnRH激动剂)可以暂时地抑制雄性和雌性的性类固醇。已知类固醇的缺失造成了胸腺功能的再活化并增强了原初T细胞的产生。此外，甚至在那些新的T细胞有机会离开胸腺之前，原有的T细胞对刺激是更为敏感的，造成了更为有效的免疫应答。所增加的应答性在缺失性类固醇的数天内是明显的(见，例如实施例23)。这可能是因为没有了性类固醇的抑制作用。这可能是因为再活化的和被再活化的胸腺所产生的“辅助”和“辅佐”因子，它们能联合外来刺激共刺激T细胞。也因为免疫系统的许多细胞都具有GnRH的表面受体，GnRH本身可以给T细胞提供其他的刺激。因为性类固醇的缺失对外周T细胞的作用是如此的快，可以与给予例如疫苗的同时给予GnRH作为单次治疗。一个月的剂型是有用的，它具有刺激免疫应答的好的作用但没有性类固醇的更长时间缺失的副作用。也可以施予随后的抗原的“强化”注射。
性类固醇抑制剂(例如GnRH类似物)对于强化癌症患者的所有形式的免疫治疗都是有用的，特别是对逃离化疗和手术的癌细胞的清除，对预防抵抗机会性感染也是有用的。可以预防性使用这些类似物以提高设计用于预防例如感染或癌症的疫苗接种计划的免疫应答。
本发明的方法利用了对性类固醇信号途径的抑制。性类固醇抑制了胸腺、BM和全身的T及B淋巴细胞的功能，这些淋巴细胞聚集在身体的主要淋巴区域内，包括但不限于血液、淋巴结、粘膜组织(例如呼吸道的、胃肠道的和生殖道的)。已经惊奇地发现对性类固醇的清除和/或对性类固醇介导的信号途径的阻断不仅可以被用于再生胸腺(以及因此的T细胞的数目和“质量”)，还可以被用于或在没有胸腺再活化的情况下、或先于胸腺再活化、或在胸腺再活化的同时，提高原有的和新产生的T细胞(和免疫系统的其他细胞)的功能性。
差的免疫应答可以有着快速的和临床重要的结果。这可以意味着对常见感染(例如流感)的易感性增加、对癌症和肿瘤的易感性增加、和/或对疫苗接种的应答性差。
总T细胞池中的原初T细胞的数目和/或比例的增加对多种临床(亚临床)病变和疾病都有着正面的快速的治疗作用，这些病变和疾病包括但不限于癌症、免疫缺陷(特别是病毒感染，例如获得性免疫缺陷综合症(AIDS)和严重急性呼吸综合症(SARS)和流感)、自身免疫性、移植、过敏以及提高疫苗接种计划的一般效率。在共拥有的和共同未决美国申请No.10/418,747、10/419,039、10/418,953、10/418,727、10/419,066、和10/419,068中都详细地描述了这些申请中的每个申请。
在多种场合中也可以给予性类固醇信号途径的抑制(例如，用LHRH/GnRH类似物)。即刻的作用是因为增强了预先存在的淋巴(和非淋巴)细胞的功能性。随着时间，性类固醇的减少增加了T细胞、B细胞和APC的产生和功能性，它累加地、协同地或互补地连续地增强了应答。新的APC、以及T细胞、B细胞和其他免疫细胞的增加，和预先存在的T细胞、B细胞和APC对刺激的敏感性的增加一起可以被用于增强患者对供者移植物的耐受性。
因此，根据本发明的方法可以使用对性类固醇信号途径的阻断剂，甚至在这些药物能引起显著的胸腺再活化之前，通过启动这些免疫细胞的活性或功能性的增加可以引起临床阳性的作用。
对DC的作用本发明也提供了增加DC功能性和/或DC数目的方法。在性类固醇清除之后(例如给予LHRH类似物之后)，增加了胸腺和外周的DC，外周DC可能也有助于T细胞刺激。
实施例下面的实施例部分提供了发明的方法的具体实施例，但其不能被解释为将发明限制为实施例的内容。
实施例1逆转衰老造成的胸腺萎缩材料和方法动物从Monash大学的中心动物服务处得到CBA/CAH和C57B16/J雄性小鼠，并将其在常规条件中圈养。从Monash大学的中心动物服务处、Walterand Eliza Hall医学研究研究所(Parkville，Vicotoria)和A.R.C.(Perth，Western Australia)得到C57B 16/J Ly5.1，并将其在常规条件中圈养。年龄从4-6周到26个月大不等，在相关的地方会指示出年龄。
手术阉割经腹腔注射0.3ml 0.3mg甲苯噻嗪(Rompun；BayerAustralia Ltd.，Botany NSW，Australia)和1.5mg盐酸氯胺酮(Ketalar；Parke-Davis，Caringbah，NSW，Australia)的盐水溶液将小鼠麻醉。通过阴囊切口进行手术阉割显露睾丸，用缝线将其结扎，然后与外周脂肪组织一起将其取出。用手术订关闭伤口。假阉割就是在上述步骤后没有取出睾丸，并被用作为所有研究的对照。
溴代脱氧尿苷(BrdU)掺入小鼠接受了两次BrdU(Sigma ChemicalCo.，St.Louis，MO)的腹腔内注射，每次剂量为100μl PBS内的100mg/kg体重的BrdU，隔开4小时(即4小时的间隔)。对照小鼠只接受载体注射。在第二次注射1个小时后，切开胸腺，或制成细胞悬浮液用于FACS分析，或即刻将其包埋在Tissue Tek中(O.C.T.compound，Miles Inc.，Indiana)，在液氮中瞬间冷冻并在储存-70℃直到使用。
流式细胞术分析用CO2窒息处死小鼠，并取出胸腺、脾和肠系膜淋巴结。经一个200μm筛在冷PBS/1％FCS/0.02％Azide轻轻地洗涤器官，离心(650g，5分钟，4℃)，并重悬于任一的PBS/FCS/Az中。将脾细胞在红细胞裂解缓冲液中4℃孵育10分钟，洗涤并重悬于PBS/FCS/Az中。利用血细胞计数器和溴化乙啶/吖啶橙以及在荧光显微镜(Axioskop；CarlZeiss，Oberkochen，Germany)下的观察重复测定细胞浓度和活力。
对于三色免疫荧光，用抗αβTCR-FITC、抗CD4-PE和抗CD8-APC(都购自Pharmingen，San Diego，CA)标记细胞，随后是流式细胞术分析。或用αβTCR-FITC/CD4-PE/CD8-APC或用B220-B(Sigma)和CD4-PE及CD8-APC标记脾和淋巴结悬浮液。用购自Caltag Laboratories，Inc.，Burlingame，CA的抗生物素蛋白链菌素-三色结合体(conjugate)显示出B220-B。
对于细胞的BrdU检测，用CD4-PE和CD8-APC表面标记细胞，随后是如前所述的固定和透化作用(Carayon and Bord，(1989)J.Imm.Meth.147225)。简单地，将染色细胞在4℃，1％多聚甲醛(PFA)/0.01％Tween-20中固定过夜。将洗涤后的细胞在500μl DNA酶(100Kunitz units，Roche，USA)，37℃下孵育30分钟以变性DNA。最后，将细胞与抗BrdU-FITC(Becton-Dickinson)在室温下孵育30分钟，洗涤并重悬细胞用于FACS分析。
对于TN亚组的BrdU分析，将细胞全体设门在APC的Lin细胞之外，随后在BrdU检测之前检测CD44-生物素和CD25-PE。所有的抗体都来自Pharmingen(San Diego，CA)。
对于四色免疫荧光，将胸腺细胞标记CD3、CD4、CD8、B220和Mac-1，用抗鼠Ig-Cy5(Amersham，U.K.)共同检测，并设门分析阴性细胞(TN)。它们还被染色CD25-PE(Pharmingen，San Diego，CA)和CD44-B(Pharmingen，San Diego，CA)，随后是如前所述的抗生物素蛋白链菌素-三色(Caltag，CA)(Godfrey and Zlotnik，(1993)Immunol.Today 14547)。然后如上所述的进行BrdU的检测。
在FACSCaliburTM(Becton-Dickinson)上分析标本。根据0度和90度散射光数值将不同的淋巴细胞设门，并用CellQuestTM软件(Becton-Dickinson)分析数据。
免疫组织学用恒冷切片机(Leica)切割出冷冻的胸腺切片，并将其马上固定于100％丙酮中。
对于两色免疫荧光，用一组单克隆抗体双染切片在该实验室所产的MTS6、10、12、15、16、20、24、32、33、35和44(Godfrey et al.，(1990)Immunol.7066；表1)，以及用多价的兔抗细胞角蛋白抗体(Dako，Carpinteria，CA)测定上皮细胞决定物的共表达。用FITC结合的羊抗鼠Ig(Silenus Laboratories，Victoria，Australia)显示出所结合的mAb，以及用TRITC结合的山羊抗兔Ig(Silenus Laboratories，Victoria，Australia)显示出抗角蛋白抗体。
对于切片的BrdU检测，或用抗角蛋白抗体和紧接着的抗兔TRITC或用能用抗鼠Ig-Cy3(Amersham，Uppsala，Sweden)所显示出的特异的mAb染色切片。然后如前所述进行BrdU检测(Penit et al.，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci，USA 865547)。简单地，将切片在70％乙醇中固定30分钟。将半干的切片孵育于4M HCl中，通过在硼酸缓冲液(Sigma)中洗涤中和，随后是在PBS中洗涤两次。用抗BrdU-FITC(Becton-Dickinson)检测BrdU。
对于三色免疫荧光，用特异的MTS mAb和抗角蛋白抗体一起标记切片。然后如上进行BrdU检测。
用Leica荧光和Nikon共聚焦显微镜分析切片。
迁移研究(即对新近胸腺迁出(RTE)的分析)经腹腔注射0.3ml0.3mg甲苯噻嗪(Rompun；Bayer Australia Ltd.，Botany NSW，Australia)和1.5mg盐酸氯胺酮(Ketalar；Parke-Davis，Caringbah，NSW，Australia)的盐水溶液将小鼠麻醉。
对FITC标记胸腺细胞的技术细节与其他地方所描述的那些计数相似(Scollay et al.，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci，USA 865547；Berzins et al.，(1998)J.Exp.Med.1871839)。简单地，暴露出胸腺叶，每叶注射近10μl350μg/ml FITC(PBS中)。用手术订关闭伤口。加温小鼠直到从麻醉中完全复苏。在注射后近24个小时，用CO2窒息处死小鼠，并取出淋巴器官进行分析。
在细胞计数之后，用抗CD4-PE和抗CD8-APC染色标本，然后用流式细胞术分析。迁移细胞被识别为表达CD4或CD8的活(live)的设门的FITC+细胞(以略去自发荧光的细胞和双联体)。加入FITC+CD4和CD8细胞的百分比以分别给淋巴结和脾提供总的迁移百分比。如Berzinset al.，((1998)J.Exp.Med.1871839所描述的进行对每日输出率的计算。
使用非成对的学生t检验或非参数的Mann-Whitney U检验所分析的数据被用于确定对照和至少进行过三次的试验的测试结果之间的统计学显著性。用下面的表示试验数值与对照熟知有着显著差异*p≤0.05；**p≤0.01和***p≤0.001.
结果I.年龄对胸腺细胞群的作用(i)胸腺重量和胸腺细胞数目随着年龄的增加，小鼠的胸腺重量(图1A)和总的胸腺细胞数目(图1B)都有着非常显著的下降(p≤0.001)。年轻成体的相对胸腺重量(mg胸腺/g身体)的平均值为3.34，而18-24个月的小鼠就下降到0.66(脂肪的沉积限制了精确的计算)。胸腺重量的下降可以归结于总的胸腺数目的减少1-2个月大(即年轻成体)的胸腺含有约6.7×107胸腺细胞，到了24个月时减少到了约4.5×106。通过阉割去除了性类固醇对胸腺的作用，恢复了胸腺细胞的数目，在阉割后4周时，胸腺在重量(图1A)和细胞密度(图1B)上都等于年轻成体。有趣的是，在阉割后2周时，显著地增加了胸腺细胞数目(1.2×108)(p≤0.001)，到了阉割后4周时，胸腺数目恢复到了正常的年轻小鼠的水平。
在外周没有反映出胸腺所产的T细胞数目的减少，脾细胞数目随着年龄仍是恒定的(图2A和2B)。外周的内环境稳态机制是显而易见的，因为脾和淋巴结的B细胞对T细胞的比例不受年龄的影响，以及到达外周的T细胞数目的随之减少(图2C)。但是，CD4+对CD8+T细胞的比例随着年龄显著下降，从2个月大时的2∶1到2岁大时的1∶1(图2D)。在阉割以及到达外周的T细胞数目随之增加之后，没有观察到外周T细胞数目的变化脾T细胞数目和脾及淋巴结的B∶T细胞的比例随着阉割都没有改变(图2A-C)。随着年龄减少的外周的CD4∶CD8比例在阉割后2周仍是明显减低的，但是到了阉割后4周就完全恢复了(图2D)。
(ii)随着年龄和阉割后的胸腺细胞亚群为了确定所看到的胸腺细胞数目随着年龄的减少是否是特异的细胞群的耗竭的结果，用特定的标记物标记胸腺细胞以分析不同的亚群。另外，这容许对阉割后的胸腺复群的动力学的分析。将主要胸腺细胞亚群的比例与那些年轻成体(2-4个月)的胸腺的细胞亚群比例进行比较(图3)，发现该比例随着年龄仍保持一致。另外，通过αβTCR的表达对胸腺细胞的进一步亚组分型发现这些群的比例随着年龄没有变化。在阉割后2周和4周时，胸腺细胞亚群仍为相同的比例，虽然阉割后的胸腺细胞数目增加了100倍，这说明是所有胸腺细胞亚组的同步扩增，而不是不同进度的扩增。
因此，在年老(2岁)动物的胸腺中所见的细胞数目的减少表明是所有细胞亚型的平衡减少，并没有所检测的T细胞群的显著变化。胸腺再活化以同步的方式出现，同时而不是依次再补充所有的T细胞亚群。
II.胸腺细胞的增殖如图4A-4B所示，在2-4个月时，有15-20％的胸腺细胞正在增殖。这些细胞中的大部分(约80％)是双阳性的(DP)(即CD4+CD8+)，以及三阴性(TN)(即CD3-CD4-CD8-)亚组构成了占约6％的第二大群(图5A)。这些TN细胞是胸腺内的最不成熟的细胞并包括胸腺内前体细胞。因此，免疫组织学可见绝大多数的分裂在包膜下和皮质中。一些分裂可见于FACS分析所定位的髓质区域，FACS分析显示了年轻(2个月)的、分裂的胸腺的单阳性(即CD4+CD8-或CD4-CD8+)细胞的比例(9％CD4+T细胞和25％CD8+T细胞)(图5B)。
尽管年老小鼠胸腺(2岁大)内的细胞数目被限制地减少了，增殖的胸腺细胞的总比例仍是恒定的(图4B和5C)，但是CD4-CD8-中的分裂细胞的比例有着下降，以及也显著地减少了CD4-CD8+T细胞的增殖(数据没有显示)。免疫组织学显示分裂细胞在1岁时的分布反映了在年轻成体(2-4个月)中的所见，但是，到了2岁时，增殖主要见于皮质外层以及在血管外周，在髓质内的分裂很少。
最早到阉割后1周时，有着增殖的CD4-CD8-细胞和CD4-CD8+细胞的比例的显著增加(数据没有显示)。阉割明显克服了年龄对这些细胞的增殖的阻断。阉割后有着增殖CD4+CD8-细胞的相应的比例下降(数据没有显示)。在阉割后2周时，尽管显著地增加了胸腺细胞数目，但是正在增殖的胸腺细胞的总比例没有变化，在此说明了细胞的同步扩增(图4A、4B和5C)。免疫组织学显示了阉割后2周时的胸腺细胞扩增的位置和分裂细胞的程度都接近于2个月大的胸腺的状态。
除了胸腺前体细胞外，DN亚群还包括αβTCR+CD4-CD8-胸腺细胞，认为它们在转化为SP细胞的过程中，已经都下调了两种共受体(Godfreyand Zlotnik，(1993)Immunol.Today 14547)。通过对这些成熟细胞的设门，分析真正的TN部分(CD3-CD4-CD8-)和它们的表达CD44及CD25的亚群是有可能的。图5E-H说明了年轻、年老和阉割小鼠中的每个TN亚组内的增殖程度。这显示了TN1亚组(CD44+CD25-CD3-CD4-CD8-)的增殖的显著减低(p＜0.001)，从正常年轻小鼠中的10％到18个月大的约2％(图5)，在阉割后1周就恢复了。
III.胸腺细胞迁出在年轻小鼠中，每天都有近1％的T细胞从胸腺内迁出(Scollay et al.，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci，USA 865547)。发现阉割小鼠发生迁出的比例率等于14个月大的正常年轻小鼠以及甚至2岁大的小鼠，尽管数目上已经被显著地减少了(p≤0.0001)(图6A和6B)。新近胸腺迁出的CD4∶CD8比例有所增加，从2个月大的3∶1到26个月大的7∶1(图6C)。在阉割后1周时，该比例已经正常化(图6C)。到阉割后2周时，迁出到外周的细胞数目已经显著增加，总的迁出率减少到了0.4％，这反映了胸腺的扩增(图6B)。
讨论已经显示衰老的胸腺尽管是严重萎缩的，但随着年龄仍保持着它的功能能力，发生T细胞增殖、分化和迁出的水平等于年轻成体小鼠。尽管胸腺功能受神经-内分泌-免疫轴中间的一些复杂的相互作用的调节，但是阉割后的胸腺再活化的程度说明了性类固醇产生所诱导的萎缩有着最显著的和长时间的作用。
如前所示，胸腺重量随着年龄被显著的降低了(Hirokawa andMakinodan，(1975)J.Immunol.1141659，Aspinall，(1997)J.Immunol.1583037)，这与胸腺细胞数目的显著减少有关。阉割操作所诱导的应激可以因为糖皮质激素的作用造成胸腺的进一步的萎缩，这一点可以被在阉割后2周对性类固醇去除的影响所忽略，它使得胸腺的细胞密度增加到了阉割前的20-30倍。到了阉割后3周，衰老的胸腺显示出胸腺大小和细胞数目上的显著增加，优于年轻成体的胸腺，预测是因为性类固醇已经对2个月大的小鼠本身所施加的作用。
数据确认了先前的发现，注重于胸腺随着年龄持续分化并保持恒定的亚组比例的能力(Aspinall，(1997)J.Immunol.1583037)。另外，胸腺细胞分化已经显示与阉割后同时发生，说明了胸腺细胞亚组的同步扩增。因为胸腺细胞数目随着年龄的显著减少，分析了胸腺细胞的增殖以确定它是否是胸腺萎缩的引发因素。
年龄诱导的胸腺萎缩或阉割后对性类固醇去除的影响都没有影响到胸腺细胞的增殖，约所有胸腺细胞的14％是正在增殖的。但是，这种分裂的位置随着年龄而所有不同2个月大小鼠胸腺显示出整个包膜下和皮质区域内的丰富的分裂(TN和DPT细胞)，以及也有着一些分裂发生在髓质。因为胸腺上皮结构随着年龄的瓦解，增值的位置是难以区别的，但表现为比年轻的小鼠更少统一的模式，并移行到皮质外层。在阉割后2周时，分裂细胞在整个皮质中都能检测到，以及在髓质内是明显的，有着与2个月大的胸腺相似的分布。
如用CD4和CD8分析所确定的增殖群的表型没有随年龄和阉割后而改变。但是，对胸腺亚群内的增殖的分析发现TN和CD8+细胞的增殖随年龄的显著减低。根据标记物CD44和CD25对T细胞亚组内的进一步分析发现了TNl(CD44+CD25-)群增殖的显著减低，通过TN2(CD44-CD25+)群的增加弥补了这一点。TN群内的这些异常反映了Aspinall((1997)J.Immunol.1583037)的发现。惊奇的是，到阉割后2周时，TN亚组以正常水平增殖，这说明了该群对性类固醇作用的抑制的快速反应。另外，在阉割后2周和4周时，增殖的CD8+T细胞的比例要明显高于对照胸腺，可能说明了它们在外周T细胞池的建立中的作用。
显示随着年龄，恒定比例的胸腺细胞发生了胸腺迁移，这一点与Scollay et al.，((1980)Proc.Natl.Acad.Sci，USA 865547)的先前的数据矛盾，他们显示胸腺细胞迁移到外周的迁移率的10倍的减少。这些结果的差异可能是因为对2岁大的胸腺的胸腺内FITC标记的难度或脂肪沉积对FITC摄取的作用。但是，如Scollay所发现的一样，迁移的T细胞的绝对数目被显著地减少了，造成了RTEs到外周T细胞池的比例的显著减低。这将造成外周主要影响T细胞库的改变(Mackall et al.，(1995)N.Eng.J.Med.332143)。先前的文章(例如，Mackall et al.，(1995)N.Eng.J.Med.332143)已经显示T细胞库随着年龄偏倚向记忆而不是原初T细胞表型。但是如果个体遇到了新的抗原，被缩小的T细胞库可能不能应付，这可能造成年老者中的免疫缺陷。显而易见的是，有着重建免疫功能不全的个体中的T细胞池的需要。阉割容许胸腺通过显著地增加原初T细胞的产量而实现外周再生。
如脾和淋巴结的B∶T比例所显示的，外周的T细胞数目仍为恒定水平，可能是因为外周的内环境稳态。(Mackall et al.，(1995)N.Eng.J.Med.332143；Berzins et al.，(1998)J.Exp.Med.1871839)。但是，对外周细胞组成的干扰随着衰老的胸腺是明显的，表现为CD4∶CD8比例的显著下降，从年轻成体的2∶1到2岁小鼠的1∶1，可能说明了CD4+T细胞对年龄的更为敏感的性能或胸腺外来源的CD8+T细胞产生的增加。到了阉割后2周时，这个比例已经被正常化，在此反映了免疫系统对手术阉割的快速应答。
上述发现已经首次显示了衰老的胸腺能行使功能，其性质等同于青春期前胸腺。在这个方面，虽然T细胞数目被显著地减少了，但胸腺细胞分化的能力却没有被阻断。它们的总的增殖和最终迁移到外周的能力也不受年龄相关的胸腺萎缩的影响。但是，注意到了两个重要的发现。第一，在对T细胞增殖能力上显示出对T细胞的有害作用，这与Aspinall((1997)J.Immunol.1583037的发现相关。这个缺陷可以归结于胸腺细胞本身的内在缺陷。仍在此显示的数据以及先前的工作已经显示尽管胸腺细胞的分化有所减少但仍有发生，以及来自BM的干细胞的迁入不受年龄的影响(Hirokawa，(1998)，″Immunity and Ageing″in PRINCIPLES ANDPRACTICE OF GERIATRIC MEDICINE，(M.Pathy，ed.)John Wiley andSons Ltd；Mackall and Gress，(1997)ImmunoL Rev.16091)。第二，随着年龄显著地减少了CD8+T细胞的增殖能力，以及在阉割后、与2个月的小鼠比较，显著地增加了增殖CD8+T细胞的比例。成熟T细胞的增殖被认为是迁移前的最后步骤(Suda and Zlotnik，(1991)J.Immunol.1463068)，因此CD8+增殖的显著减少可能说明它们的迁移能力的减低。RTEs中的CD4CD8T细胞比例随着年龄的增加的发现支持了这种假说，这提示了迁移的CD8T细胞的减少。同样的，如果胸腺上皮给CD8T细胞维持提供了关键因素，无论是淋巴间质分子或细胞因子的影响，通过增加的性类固醇产生可能阻断了这个因素。通过去除性类固醇的影响，可以在此最优化地增殖CD8T细胞群。
所观察到的TN1亚组的增殖缺陷提示皮质上皮的缺失影响胸腺细胞在TCR基因重排的关键阶段上的发育，其中皮质上皮提供了胸腺细胞生成所必需的因子例如IL-7和SCF(Godfrey and Zlotnik，(1993)Immunol.Today 14547；Aspinall，(1997)J.Immunol.1583037)。事实上，IL-7-/-和IL-7-/+小鼠显示出与在年老小鼠中所见的相似的胸腺形态(Wiles et al.，(1992)Eur.J.Immunol.221037；Zlotnik and Moore，(1995)Curr.Opin.Immunol.7206)；von Freeden-Jeffry，(1995)J.Exp.Med.1811519)。
总而言之，衰老的胸腺仍保持它的功能能力，但是年老小鼠中的胸腺细胞的发育不处于在正常年轻小鼠中所见的胸腺上皮细胞的严格控制之下，这是因为胸腺微环境的结构完整性的缺失。因此，这些细胞的增殖、分化和迁移将不在最优化的调节之下，并可能造成增加了外周的自身反应性/免疫功能不全的T细胞的释放。TN以及特别是CD8+群内的缺陷都可能造成在外周T细胞池内的随年龄的变化。阉割对胸腺功能的重建将提供了一种用于再生外周T细胞池并因此用于重建免疫抑制的、免疫缺陷的、或免疫失代偿的个体的重要工具。
实施例2逆转化疗或放疗诱导的胸腺萎缩材料和方法材料和方法是如在实施例1中所描述的那样。另外，使用了以下的方法。
BM重建受者小鼠(3-4个月大的C57BL6/J)接受了5.5Gy照射两次，间隔3个小时。在第二次照射剂量后1个小时，给小鼠静脉内注射5×106供者BM细胞。通过将RPMI-1640培养基流经供者(2个月大的同系的C57BL6/J Ly5.1+)小鼠的胫骨和股骨，然后收获在培养基中所收集到的细胞得到BM细胞。
照射3-4个月大的小鼠接受625Rad的全身照射。
使用环磷酰胺的T细胞耗竭给年老小鼠(例如2岁大)注射环磷酰胺(200mg/kg体重，2天内)并将其阉割。
结果阉割增强了严重T细胞耗竭(TCD)后的再生。对于两种所研究的T细胞耗竭的模型(使用环磷酰胺的化疗或使用625Rad的亚致死照射)，与它们的假阉割(SHCx)的对照比较，阉割小鼠都显示出胸腺再活化率的显著增加(图7A和7B)。到了治疗后1周，阉割小鼠甚至在早期就显示出胸腺的再生(图7和9-11)。在比较中，未阉割动物显示出DN和DP胸腺细胞(快速分裂细胞)的严重缺失以及随后的CD4和CD8细胞(耐放射的)比例的增加。与甚至在治疗后1周就显示出胸腺大小至少增加4倍的阉割后动物的胸腺细胞数目的差异最好地例证了这一点。在2周时，未阉割动物显示出相对的胸腺细胞的正常化，伴有DN和DP胸腺细胞的再生。但是，胸腺细胞的比例仍没有等同于年轻的成体对照的胸腺。事实上，在2周时，阉割和未阉割小鼠之间的调节率之间的巨大差异是最大的(到4周时，治疗组之间的胸腺细胞的数目相同)。
在环磷酰胺治疗1周后，SHCx小鼠的胸腺细胞密度要显著地少于对照(未治疗的、年龄匹配的；p≤0.001)和Cx小鼠(p≤0.05)(图7A)。在这个时间点上，1周前阉割的小鼠和与治疗同一天阉割的小鼠之间没有观察到胸腺再活化率上差异，两组都显示出它们的细胞数目至少是SHCx小鼠的两倍(图7A和7B)。相似的，在环磷酰胺治疗后2周时，两组Cx小鼠具有比SHCx小鼠显著更高的(5-6倍)胸腺细胞的数目(p≤0.001)(图7A)。在对照小鼠中，在4周时间内逐渐恢复了胸腺细胞数目，但是阉割明显增强了这一点，甚至在1周内(数据没有显示)。在阉割后1周，相似地增加了阉割小鼠内的脾和淋巴结的细胞数目(数据没有显示)。
通过在照射前1周(图10)或与照射同一天(图11)的阉割检测了阉割时机对胸腺恢复的作用。当在1周前进行阉割时，阉割对胸腺恢复具有更快的作用(图10A与图11的比较)。在2周时，同一天的阉割已经“赶上了”在治疗前1周阉割的小鼠中的胸腺再活化。在两种情况中，各自对脾或淋巴结都没有大的作用(图10B和10C、及图11B和11C)。
在照射之后，都在与治疗同一天被假阉割和阉割的小鼠显示出胸腺细胞密度要显著地少于对照小鼠(p≤0.001)(图7B和11A)和在治疗前1周被阉割的小鼠(p≤0.01)(图7B)。在治疗后2周时，阉割方案对胸腺细胞数目的恢复没有区别，两组阉割小鼠都表现出照射后的胸腺细胞比SHCx小鼠中的显著增强(p≤0.001)(图7B、10A和11A)。因此，阉割显著地增强了严重T细胞耗竭后的胸腺再活化，可以在先于免疫系统受损前至少1周进行阉割。
有趣的是，胸腺大小表现出“超过了”对照胸腺的基线。这提示了胸腺内的快速扩增，这些新形成的胸腺细胞还没有迁移(胸腺细胞需约3-4迁出并进入外周)。因此，尽管在被释放到外周之前每个亚群内的比例是相同的，但是建立了胸腺细胞的数目。
在对年轻小鼠(约2-3个月大)环磷酰胺处理之后，尽管减少了Cx小鼠的脾内的总淋巴细胞数目，但是在整个分析的时相内与对照小鼠都没有显著的差异(数据没有显示)。但是，ShCx小鼠在治疗后1周和4周都显示出总脾细胞数目的显著减少(p≤0.05)(图8A)。在淋巴结内，在治疗后1周，假阉割和阉割小鼠内都观察到了细胞密度的显著减少(p≤0.01)(图8B)，可能反映了应激类固醇的影响。到治疗后2周时，阉割小鼠的淋巴结细胞密度与对照小鼠相当，但是假阉割小鼠直到治疗后4周也没有恢复它们的淋巴结细胞数目，其细胞密度要显著地少于(p≤0.05)对照和治疗后2周的Cx小鼠(图8B)。这些结果表明阉割可以增强总淋巴细胞数目在环磷酰胺治疗后的恢复的速度。
亚致死照射(625Rad)诱导了严重的淋巴细胞减少，这样在治疗后1周时，治疗组(Cx和SHCx)都显示出脾和淋巴结的细胞密度要显著地少于(p≤0.001)对照小鼠(图12A和12B)。到照射后2周时，阉割和假阉割小鼠的脾细胞数目与对照值相似(图12A)，而淋巴结细胞数目仍显著地低于对照值(假阉割小鼠p≤0.001；阉割小鼠p≤0.01)(图12B)。在Cx和ShCx小鼠之间没有观察到显著差异。
图19举例说明了化学阉割的用法与手术阉割在增强T细胞再生上的比较。注射在这个实施例中所用的化学物地洛瑞林(LHRH-A)4周，并显示出环磷酰胺治疗后的再生速度与手术阉割的相当。增强作用在胸腺扩增上是相等的，在脾和淋巴结的恢复上也是相等的。化学阉割的动力学比手术慢，也就是说，小鼠需要花约3周以上的时间降低它们的性类固醇水平。但是，化学阉割仍与手术阉割一样有效，可以认为是具有相同的作用。
讨论在免疫耗竭的动物模型中探讨了阉割对胸腺的结构和T细胞产生的影响。具体的，实施例2检查了阉割对亚致死照射和环磷酰胺治疗后的免疫系统的恢复的作用。这些形式的免疫耗竭作用于抑制DNA合成并因此靶向于快速分裂的细胞。在胸腺中，这些细胞是非常不成熟的皮质胸腺细胞，但是所有的亚组都受到了影响(Fredrickson and Basch，(1994)Dev.Comp.Immunol 18251)。在正常健康的年老动物中，外周T细胞的定量及定性的差异很少导致病理状态。但是，在T细胞的严重耗竭之后出现了严重的问题，因为减少了胸腺的T细胞再生的能力。这些结果发生在HIV/AIDS中，特别是在癌症治疗的化疗及放疗后(Mackall et al.，(1995)N.Eng.J.Med.332143)。
在亚致死照射和环磷酰胺治疗的小鼠中，阉割明显增强了胸腺再活化。为了评价主要是糖皮质激素诱导的作用、手术阉割对胸腺再活化的应激应答，在免疫耗竭的同一天以及7天之前进行阉割。尽管最早到免疫耗竭后的1周就看到了胸腺细胞密度和组织结构的增加，但是在阉割后2周观察到了较大的差异。这是是否在免疫耗竭的同一天或1周前进行阉割的情况。
免疫组织学证实，在所有情况中，阉割后2周的胸腺组织结构表现为表型正常的，而未阉割小鼠的组织结构被瓦解了。全上皮标记物表明免疫耗竭引起了皮质上皮的塌陷和对未阉割小鼠的胸腺中的胸腺组织结构的普遍阻断。髓质标记物支持这个发现。有趣的是，阉割诱导的再生的其中一种首发特征是MTS 16所鉴定的细胞外基质的明显上调。
流式细胞术分析数据表明了阉割小鼠内的所有胸腺细胞亚组的细胞数目的显著增加。在每个时间点上，有在免疫耗竭和阉割后的所有CD4、CD8和αβTCR所定义的亚组的同步增加。这是罕见的但一致的结果，因为T细胞发育是一个进行性的过程，预计将有着前体细胞(包含在CD4-CD8-门内)的最初增加以及它可能发生在第一个时间点之前。而且，因为前体细胞代表着非常小比例的总胸腺细胞，可能没有检测到在它们的数目上的转换。也分析了阉割对其他细胞包括巨噬细胞和粒细胞的作用。通常，胸腺内的巨噬细胞和粒细胞数目只有很小的变化。
在免疫耗竭的照射和环磷酰胺的模型中，胸腺细胞数目都在治疗后2周达到高峰并在4周后减少。几乎在或化疗后的即刻，胸腺重量和细胞密度戏剧化地减低并在近5天后开始胸腺再活化的第一期。耐照射的胸腺细胞的再生引起了重建的第一波(第5-14天)，它可生成所有的胸腺亚组(Penit and Ezine，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci，USA 865547)。在第16和22天之间所观察到的第二个减低是因为耐放射的细胞的受限的增殖能力伴有BM减少了胸腺前体细胞的产生(也受照射的影响)。第二个再生期是因为BM起源的前体细胞对胸腺的再补充(Huiskamp et al.，(1983)Radiat.Res.95370)。
在成体小鼠中，从HSC到成熟T细胞的发育要花近28天(Shortmanet.al.，(1990)Sem.immunol.23)。因此，一直到治疗后4周才看到外周T细胞的很小变化。外周受一些胸腺输出的支持，但预计一直到治疗后4周在外周所发现的T细胞的大部分是增殖的耐环磷酰胺或照射克隆在不存在被耗竭细胞时的扩增。预计阉割后的外周的一些长期变化包括最重要的胸腺输出增加所引起的TCR库的多样化。
实施例3抑制性类固醇后的胸腺再活化使得有缺陷的外周T细胞功能恢复材料和方法材料和方法如实施例1和2中所描述的。另外，使用了下面的方法。
HSV-1免疫接种手术阉割年老(≥18个月)小鼠。在阉割后6周(胸腺再活化后)。麻醉后，用20号针头在小鼠后肢上注射无菌PBS中的4×105噬斑形成单位(pfu)的HSV-1(KOS株)。将感染后的小鼠圈养在独立的笼子中，并在免疫接种后第5天以人道的方式处死小鼠，同时取出胭(引流)淋巴结用于分析。
病毒来自Assoc.Prof.Frank Carbone(Melbourne University)。将病毒储存株生长并滴定于加有5％FCS(Gibco-BRL，Australia)的MEM中的VERO单层细胞上。
在感染后第5天进行对引流(胭)淋巴结的分析。对于HSV-1研究，用抗CD25-PE、抗CD8-APC和抗Vβ10-生物素染色胭淋巴结细胞。对于DC的检测，在用CD45.1-FITC、I-Ab-pE和CD11c-生物素染色之前使用FcR阻断。用抗生物素蛋白链菌素-PerCP检测所有的生物素化的抗体。对于HSC的检测，通过用抗CD3、CD4、CD8、Gr-1、B220和Mac-1(所有的都与FITC结合)共同染色将BM细胞设门于Lin-细胞。通过用CD11c-APC和Sca-1-PE的染色检测HSC。对于TN胸腺细胞分析，将所有细胞设门于Lin-群并通过用CD44-生物素、CD25-PE和c-kit-APC的染色检测。
对淋巴结细胞的细胞毒性检测将淋巴结细胞在37℃、6.5％CO2中孵育3天。用加有gB498-505肽(gBp)的非转染细胞株(EL4)确定特异性，单独EL4细胞作为对照。使用30∶1的起始效应物靶比。将板在37℃、6.5％CO2中孵育4个小时，然后在650gmax下离心5分钟。从每个孔中收集上清液(100μl)并转移到玻璃发酵管中，用于Packard Cobra自动伽玛计数器的测定。
结果为了确定胸腺再活化的功能性后果(例如阉割是否能增强免疫应答)，检测了单纯疱疹病毒(HSV)免疫接种，它容许对疾病进展及CTL作用的研究。发现阉割小鼠具有定量和定性提高的对病毒的应答性。
在爪垫免疫接种小鼠并在免疫接种后第5天分析胭(引流)淋巴结。另外，取爪垫并匀浆化以确定在整个试验期间的特殊时间点上的病毒滴度。检测了区域(胭)淋巴结对HSV-1感染的应答(图13-17)。
观察到了淋巴结细胞密度随年龄的显著减少(图13A、13B和14)。在免疫接种后第5天(即5天)，阉割小鼠具有比年老小鼠显著更高的淋巴结细胞密度(数据没有显示)。尽管没有看到活化(CD8+CD25+)细胞的比例随年龄或阉割后的差异，但是当与年老的对照比较时，淋巴结内的活化细胞数目随着阉割显著地增加了(数据没有显示)。另外，活化细胞数目与年轻成体中所发现的相当(数据没有显示)，提示阉割小鼠中的CTL正被活化到更大的程度，但是因为B细胞活化，年轻成体可能具有一个增大了的淋巴结。用检测随年龄和阉割后出现的特异裂解的比例的CTL检测确认了这一点(图16)。与年轻成体(2个月大)小鼠比较，年老小鼠显示出在效应物靶为10∶1和3∶1时的靶向细胞裂解的显著减少(图16)。阉割恢复了小鼠生成HSV感染后的特异的CTL应答的能力(图16)。
另外，虽然活化细胞的Vβ的总表达随着年龄仍保持恒定(数据没有显示)，但是年老(18个月)小鼠的一个亚组显示出这种克隆应答的减少(图14A-C)。到阉割后6周时，浸润的淋巴结细胞的总数目和活化CD25+CD8+细胞的数目已经增加到了年轻成体水平(数据没有显示)。但是，更重要的是阉割显著地增强了在年老小鼠中被极大地减低了的对HSV感染的靶细胞的CTL应答性(图16)并恢复了淋巴结内的CD4∶CD8比例(图17B)。事实上，与年轻成体和阉割小鼠比较，随着年龄都看到了引流淋巴结内的CD4+T细胞的减少(图17B)，因此说明了在整个生命中，对增加胸腺的T细胞的产生的极为重要的需要，为了达到最大的免疫应答性。
实施例4对性类固醇的抑制增强了胸腺对新的造血前体细胞的摄取，造成了宿主和供者淋巴细胞(T、B和DC)的嵌合混合物材料和方法如实施例1-3中所描述的。另外，使用了下面的方法。
先前的试验已经显示微嵌合体形成在器官移植接受上起到了重要作用。DC也已经显示在对移植物抗原的耐受性上有着整合作用。因此，研究了阉割对胸腺嵌合体形成和树突状细胞数目的影响。
为了测定干细胞摄取对胸腺再活化的作用，如实施例2所述的进行了BM重建。
对于同基因动物的试验，每个治疗组都使用3个月大的小鼠(n＝4)。所有的对照都是年龄匹配的和未治疗的。
结果比较了阉割和假阉割重建小鼠与未治疗的年龄匹配的对照的总胸腺细胞数目，在图18A中概括了这一点。在重建前1天阉割的小鼠中，与假阉割对照小鼠比较，有着胸腺再活化率的显著增高(p≤0.01)。假阉割小鼠的胸腺细胞密度要低于同系BMT后2周和4周的未治疗的对照水平(7.6×107±5.2×106)，而阉割小鼠的胸腺密度在BMT后4周时已经增加到超过了对照水平(图18A)。在6周时，细胞数目仍低于对照水平。但是，阉割小鼠的细胞数目比假阉割小鼠高3倍(p≤0.05)(图18A)。
在BMT 4周后，阉割小鼠的BM内也有着显著更多的细胞(p≤0.05)(图18D)。到了2周时，假阉割的BM细胞密度达到了未治疗的对照水平(1.5×107±1.5×106)，而阉割小鼠的BM细胞密度在同系BMT后2周和4周都超过了对照水平(图18D)。在照射和重建后2周，阉割和未阉割的小鼠中的肠系膜淋巴结细胞数目都减少了；但是，到了4周的时间点时，细胞数目已经达到了对照水平。在阉割和未阉割治疗组之间的淋巴结细胞数目没有统计学显著差异(图18C)。假阉割和阉割的脾细胞密度在2周时到达了未治疗的对照水平(1.5×107±1.5×106)，但是假阉割组在4-6周后出现减少，而阉割小鼠仍有高水平的脾细胞(图18B)。与未阉割的小鼠比较，阉割小鼠在这些时间点(即重建后4周和6周)都显示出更多的淋巴细胞(p≤0.05)，尽管在2周时没有看到阉割和未阉割治疗组之间的总脾细胞的差异(图18B)。
因此，在重建前1天阉割的小鼠中，与假阉割(ShCx)对照小鼠比较，有着胸腺再活化率的显著增加(p≤0.01)(图18A)。在同系BMT后2周和4周时，假阉割小鼠的胸腺细胞密度要低于未治疗的对照水平(7.6×107±5.2×106)，而在BMT后4周时，阉割小鼠的胸腺细胞密度已经增加超过了对照水平(图18A)。阉割小鼠比未阉割动物有着显著更多的同系细胞(Ly5.2)。
在未阉割小鼠中，在4周的时间内有着胸腺细胞数目的显著减少，有着很少或没有再生的证据(数据没有显示)。但是在阉割组中，到2周时已经存在广泛的胸腺细胞生成，到4周时已经恢复到了对照水平，这比未阉割小鼠高10倍多。对胸腺的CD45.2(供者来源的抗原)的流式细胞术分析证实4周时在未阉割组中没有检测到供者来源的细胞，但是实际上明显地是，在这个时间点上的阉割小鼠的所有胸腺细胞都是供者来源的(数据没有显示)。假定这种胸腺细胞生成的广泛增强来自供者来源的造血前体细胞，那么确定T细胞分化是否已经正常进行是重要的。用流式细胞术分析了CD4、CD8和TCR所定义的亚组。在重建后2周的胸腺细胞亚组比例上没有相称的差异(数据没有显示)。这种观察在4周时是不可能的，因为未阉割小鼠仍没有供者来源的细胞的重建。但是，在这个时间点上，阉割小鼠的胸腺细胞比例表现为正常。
在一组平行试验中，在BMT前1天阉割或假阉割3个月大的、年轻成体C57/BL6小鼠。对于同系BMT，小鼠接受了800RAD TBI及IV注射5×106Ly5.1+BM细胞。2周和4周后处死小鼠，并分析BM、胸腺和脾的免疫重建。用抗CD45.1抗体确定供者/宿主来源，该抗体只与供者来源的白细胞反应。
在图19-28中显示了来自这组平行试验的结果。图20和21显示了阉割动物的BM中的供者来源的HSC的数目和比例的增加。这说明了提高的植入并提示BMT的更快的恢复。
图22显示了阉割小鼠的BM中的供者来源的B细胞前体细胞和B细胞的增加。但是，图24和25显示了阉割没有改变阉割后2周和4周时的外周B细胞的数目或比例。
图26显示阉割增加了胸腺的供者来源的TN、DP、CD4和CD8细胞的数目。但是，图23显示阉割没有改变供者胸腺细胞的CD4和CD8细胞的比例。在外周，有着非常少的CD4或CD8细胞，以及在所考虑到的时间点上，这些细胞没有随阉割而增加。
重要的是，图28显示了到阉割后4周时胸腺的供者DC的数目的增加。
讨论实施例4显示了阉割对同基因和同系BM移植的影响。Starzl et al.，(1992)Lancet 3391579报告了淋巴和非淋巴组织的明显的微嵌合体是异基因移植的好的预后指标。已经公认为它们对于诱导对移植物的耐受是必要的(Starzl et al.，(1992)Lancet 3391579)。供者来源的DC存在于这些嵌合体中并被认为是在避免移植物排斥上发挥着整合的作用(Thomson and Lu，(1999)Immunol.Today 2020)。已知DC是胸腺的阴性选择步骤中的关键因素，如果供者来源的DC存在与受者胸腺内，就可以去除移植物反应性T细胞。
为了确定阉割是否能增加嵌合体形成，用同基因的胎肝移植进行了一项研究。结果显示了阉割小鼠的胸腺的再生被增强了。当用同系的(Ly5)小鼠重复试验时，再次看到了这些趋势。因为同系标记物的存在，测定小鼠的嵌合体状态是有可能的。早到胎肝重建后2周时，在胸腺内就能检测到供者来源的树突状细胞，阉割小鼠的数目是未阉割小鼠的4倍。在重建后4周时，未阉割小鼠没有表现出供者来源的细胞的重建，说明阉割事实上可以增加嵌合体形成的可能性。假定阉割不仅能增加致死性照射和胎肝重建后的胸腺再活化，它还增加了胸腺内供者来源的树突状细胞的数目，对于干细胞移植，这种方法增加了移植物接受的可能性。
实施例5免疫细胞耗竭为了预防潜在的移植物受者患者中的现有T细胞对移植物的干扰，患者进行了T细胞耗竭(清除)。这个步骤的一个标准方法如下。患者接受每日注射15mg/kg Atgam(异种的抗T细胞球蛋白，Pharmacia Upjohn)形式的抗T细胞抗体10天，联合应用T细胞活化抑制剂环孢菌素A，3mg/kg连续输注3-4周，接着是按需服用每日9mg/kg的片剂。这个治疗不影响患者胸腺内的早期T细胞发育，因为具有这样作用所必需的量的抗体因为人类胸腺的尺寸和构型而不能被转运到胸腺内。持续治疗近4-6周以容许性类固醇缺失后的胸腺重建。
也可以联合应用第二信号水平的抑制剂进行对T细胞反应性的预防，这些抑制剂例如白介素、附加分子(例如阻断例如CD28的抗体)、增强T细胞清除或其他免疫细胞清除的信号途径分子或细胞粘附分子。胸腺重建期将与供者HSC的注射结合(与取得相关器官或组织的同时从血液中得到的，用G-CSF(每天皮下注射2次，共3天)从血液中预先动员的；或直接从供者BM中所采集的)。增强了的循环HSC的水平将促进胸腺的摄取(性类固醇的缺失和/或提高的GnRH水平所激活的)。这些供者HSC将发育成胸腺内DC并引起任何新形成的偶尔将是“供者反应性的”T细胞的去除。这将建立对供者细胞和组织的中枢耐受并据此预防或最大程度地最小化宿主的任何排斥。新的T细胞库的发育也将克服T细胞耗竭方案所引起的免疫缺陷。
外周T细胞的耗竭使得移植物排斥的危险最小化，因为它非特异性地耗竭了所有的T细胞包括那些潜在地与外来供者反应的T细胞。但是，同时因为T细胞的缺失，这个方法诱导了普遍的免疫缺陷状态，这意味着患者对感染特别是病毒感染是高度易感的。
实施例6性类固醇耗竭治疗患者接受了给予LHRH激动剂形式的性类固醇耗竭治疗。给予了Leucrin(储存剂注射液；22.5mg)或Zoladex(植入物；10.8mg)形式的LHRH激动剂，每一种都是单次剂量有效3个月。这能有效地将性类固醇水平减少到足以再活化胸腺的水平。在一些情况中，施与性类固醇的肾上腺产物的抑制剂也是必要的。也可以在性类固醇耗竭治疗的持续时间内每天给予一片Cosudex(5mg/天或50mg/天)。或者，给予患者GnRH拮抗剂例如皮下注射的西曲瑞克或阿巴瑞克。
在手术阉割后，血液中的性类固醇减少到最低只需要1-3周，而化学阉割后要花3-4周。在一些情况中，需要将治疗延长到第二个3个月的注射/植入。作为异基因供者(对于外来组织的移植物)或自体的HSC的血液HSC的同时增强(通过给宿主注射G-CSF以将这些HSC从BM中动员到胸腺)可以增加胸腺扩增。
实施例7其他的给药方法可以用其他的方法取代LHRH激动剂的3个月储存剂或植入物的给药方法。在一个实例中，可以用例如ErYAG激光的激光照射患者的皮肤，以消融或改变皮肤，以减少角质层的阻抗作用。
在美国No.6,251，100、6,419,642和4,775,361中描述了激光消融或变更。
在另一个实例中，给药是通过激光产生的压力波的方式。将合适容器例如塑料柔软垫圈(直径约1英寸及厚度约1/16英寸)内的一个剂量的LHRH激动剂放置在皮肤的产生压力波的位点上。然后用例如约1mm厚的黑色聚苯乙烯片的靶材料覆盖该位点。用Q转换的固态红宝石激光(20ns脉冲持续时间，每个脉冲能产生最大到2焦耳的能量)生成单个脉冲暂态，该暂态冲击靶材料。黑色聚苯乙烯靶材料完全吸收激光照射，使得皮肤仅仅暴露于脉冲暂态，而不暴露于激光照射。可以每天重复操作，或按所需的经常重复，以保持激动剂的循环的血液水平。
实施例8供者细胞的施用在可行的情况下，通过在细胞采集之前给供者注射10μg/kg粒细胞集落刺激因子(G-CSF)2-5天(例如，每天注射10μg/kg一次或两次，共2-5天)增强供者血液中的造血干细胞(HSC)的水平。也可以在采集之前(7-14天前)给供者注射LHRH激动剂和/或细胞因子例如G-CSF或GM-CSF，以增强血液中的干细胞的水平或质量。例如通过流式细胞术或免疫磁珠从供者血液或BM中纯化出CD34+供者细胞。与人CD34特异性结合的抗体是商品化的(来自例如Research Diagnostics Inc.，Flanders，NJ；Miltenyi-Biotec，Germany)。流式细胞术将供者来源的HSC确定为是CD34+细胞。也可以通过使用喂养细胞(例如成纤维细胞)、生长因子例如干细胞因子(SCF)和预防分化为特异细胞类型的LIF的体外培养扩增这些CD34+HSC。在给予LHRH激动剂后近3-4周(即胸腺刚刚开始再生的之前或同时)时，给患者注射供者HSC，最优化剂量约为2-4×106细胞/kg。也可以给受者注射G-CSF以有助于供者HSC的扩增。如果因为临床病变的严重程度使得这个时间方案不可能时，可以同时施与HSC和GnRH。近2-3周后给予第二个剂量的HSC可能是必要的，这有助于胸腺再活化及供者DC的发育(特别是在胸腺内)。一旦HSC已经植入到(即结合到)和/或迁移到BM和胸腺，作用将是明显的，因为HSC是自我更新的。
正再活化的或已再活化的胸腺摄取供者HSC并将它们转化为供者型的T细胞和DC，而将受者的HSC转化为受者型T细胞和DC。通过细胞死亡诱导去除，或通过经免疫调节细胞诱导耐受性，供者和宿主DC能耐受能与供者或受者细胞可能反应的任何新的T或NK细胞。
实施例9移植物的移植在本发明的一个实施方式中，当受者仍进行持续的T细胞耗竭和/或其他的免疫细胞耗竭和/或免疫抑制治疗时，一个器官、或一组已经被部分耗竭供者T细胞的细胞被从供者移植到受者患者内。受者胸腺已经被GnRH治疗所活化并被外来的HSC所浸润。
在LHRH治疗约3-4周内，首批新的T细胞出现在了受者的血流内。但是，为了容许产生宿主和供者造血细胞的稳定的嵌合体，可以持续免疫抑制资料约3-4个月。因为在再活化胸腺内存在着供者和宿主的DC，去除了新T细胞内的可能的供者反应性和宿主反应性的细胞。已经经宿主胸腺上皮的阳性选择，T细胞通过识别受者的外周血中的宿主APC所呈递的肽，保留了对正常感染的应答的能力。供者DC对受者淋巴器官的结合建立了事实上与单独宿主的免疫系统一致的免疫系统状态，除了对供者细胞、组织和器官的耐受性以外。因此，存在着正常的免疫调节机制。这些也可以包括调节T细胞的发育，它利用细胞因子例如IL-4、5、10、TGF-β、TNFα打开或关闭免疫应答。
实施例11可供选择的方案在缩短供者细胞、组织或器官的移植所需的时间方面，修改了实施例1-10中所用的时间线。同时开始T细胞清除或其他免疫细胞耗竭及性类固醇清除。T细胞清除或其他免疫细胞耗竭持续约10天，而性类固醇清除持续3个月左右。在一个实施方式中，在开始联合治疗后10-12天左右，当胸腺开始再活化时，进行HSC移植。
在一个甚至更短的时间表中，同时开始两种类型的耗竭和HSC移植。在这种情况中，T细胞清除或其他免疫细胞耗竭持续了3-12个月，例如3-4个月。
实施例12免疫抑制的终止当建立了胸腺嵌合体以及新的成熟T细胞群开始离开胸腺时，从患者中取血，并在标准的混和淋巴细胞反应中体外检查T细胞的对供者细胞的应答性的缺失(见，例如，Current Protocols InImmunology.John E.Coligan et al.，(eds)，Wiley and Sons，New York，NY(1994)，和每年更新版本包括2002年)。如果没有应答，逐步减少免疫抑制治疗以容许对感染的防御作用。如果没有排斥的征象，如血液中所存在的活化T细胞的存在所部分提示的那样，最终完全停止免疫抑制治疗。因为HSC具有很强的自我更新的能力，所形成的造血嵌合体理论上将在患者的终生都是稳定的(也就是正常的、未耐受的和未植入的人)。
实施例13使用LHRH激动剂再活化人胸腺材料和方法为了显示人胸腺可以被本发明的方法所再活化，这些方法被用于已经用化疗治疗前列腺癌的患者。
患者选择了16例I-III期前列腺癌患者(用他们的前列腺特异性抗原(PSA)积分所评价)。所有的对象都是年龄在60和77岁之间的男性，这些患者在按需接受前列腺癌的局部放疗之前，都经受了标准的联合的雄激素阻断治疗，治疗依据每月注射GnRH激动剂，每月3.6mg醋酸戈舍瑞林(Zoladex)或7.5mg亮丙瑞林(Lupron)治疗共4-6个月。
FACS分析将合适的抗体鸡尾酒(20μl)加入到200μl全血中，并在室温下暗处孵育30分钟。裂解RBC，洗涤剩余细胞并将其重悬于1％PFA中用于FACS分析。用CD19-FITC、CD4-FITC、CD8-FITC、CD27-FITC、CD45RA-PE、CD45RO-CyChrome、CD62L-FITC和CD56-PE(都来自Pharmingen，San Diego，CA)的抗体染色标本。
统计学分析通过比较治疗前和治疗后结果，每个患者都作为内对照，并用配对学生t检验或Wilcoxon标记的秩和检验分析结果。
结果在性类固醇清除治疗之前和4个月后评价前列腺癌患者。在图19-23中概述了结果。数据共同地证实了许多患者内的T细胞状态的定量和定性的提高。
1.LHRH治疗对淋巴细胞和其中T细胞亚组的总数的作用分析了进行前列腺癌的LHRH激动剂治疗的患者(都＞60岁)的外周血淋巴细胞的表型组成(图40)。在治疗前和在开始LHRH激动剂治疗后4个月分析患者的标本。所有患者在治疗前的每ml血的总淋巴细胞数目都在对照值的低限。
在治疗之后，9例患者中的6例显示出总淋巴细胞计数的显著增加(在一些病例中观察到了总细胞数目的翻倍)。与此相关的是9例患者中的6例有总T细胞数目的增加。在CD4+亚组内，这种增加在9例患者的8例中甚至是更为明显的，证实了CD4+T细胞水平的增加。在9例患者的4例患者中看到了CD8+亚组内的较不突出的趋势，表现为水平的增加，虽然通常增加的程度要小于CD4+T细胞。
II.LHRH治疗对T细胞亚组的比例的作用对在LHRH激动剂治疗之前和之后的患者血液的分析证实在T细胞、CD4+或CD8+T细胞的总体比例上没有显著变化以及CD4+CD8+比例在治疗后有着不同的变化(图41)。这说明治疗对T细胞亚组的内环境稳态的保持上有着很小的作用，尽管治疗后显著地增加了总T细胞数目。所有数值都与对照值相当。
III.LHRH治疗对B细胞和髓细胞的比例的作用对进行LHRH激动剂治疗的患者的外周血内的B细胞和髓细胞(NK、NKT和巨噬细胞)的比例的分析证实在亚组内有着不同程度的变化(图42)。NK、NKT和巨噬细胞比例在治疗后仍保持相对恒定，而9例患者中的4例出现了B细胞比例的下降。
IV.LHRH激动剂治疗对B细胞和髓细胞总数的作用对治疗后的外周血内的B和髓细胞的总细胞数目的分析清楚地显示治疗后增加了NK(9例患者中的5例)、NKT(9例患者中的4例)和巨噬细胞(9例患者中的3例)的细胞数目的水平(图43)。B细胞数目没有显示出突出的趋势，其中9例患者中的2例显示出水平的增加，9例患者中的4例显示出没有变化，以及9例患者中的3例显示出水平的减少。
V.LHRH治疗对原初细胞相对于记忆细胞的水平的作用LHRH激动剂治疗后所看到的主要变化是在外周血的T细胞群内。特别是，有着原初(CD45RA+)CD4+细胞的比例的增加，以及在CD4+T细胞亚组内，9例患者中的6例出现了原初(CD45RA+)对记忆(CD45RO+)的比例的增加(数据没有显示)。
VI.结论因此可以推论对动物例如具有萎缩胸腺的人的LHRH激动剂治疗能诱导胸腺的再生。已经显示了已经接受性类固醇清除治疗的这些前列腺癌患者的血T淋巴细胞状态的普遍提高。似乎这些细胞是来源于胸腺，因为已经描述了没有主流的(TCRαβ+CD8αβ链)T细胞的其他来源。胃肠道T细胞主要是TCRγδ或CD8αα链。
实施例14对人体耐受性的诱导给需要皮肤或器官移植的一位男性患者施与一种标准的基于GnRH激动剂(Lucrin，3.6mg)治疗的联合雄激素阻断剂(CAB)0-6个月，如在实施例10中上述的那样。当进行雄激素阻断治疗时，患者被给予静脉注射从异基因供者的外周血中收集到的CD34+细胞。为了收集CD34+细胞，收集供者(即，将他的/她的器官或皮肤提供给受者的人)的外周血，并根据标准的方法从外周血中分离出CD34+细胞。一个非限制性的方法是将外周血与特异地与人CD34结合的抗体(例如，商业化从Abcam Ltd，Cambridge，UK得到的小鼠的单克隆抗人CD34+抗体)一起孵育，之后用可检测标记的抗小鼠抗体(例如，FITC标记的山羊抗小鼠抗体)染色细胞，并通过荧光活化细胞分选器(FACS)分离FITC标记的CD34+细胞。因为在循环的外周血中只发现少量数目的CD34+细胞，可能需要对供者进行多次的采集和细胞分选。CD34+细胞可以被冷冻保存直到用于重建受者患者。在一个实例中，给予受者患者至少每kg体重5×105个HSC。
监测受者患者以检测在他的/她的外周血中的供者血细胞和树突状细胞的存在。当检测到这些供者细胞时，进行供者组织的移植(即皮肤和/或组织)。受者以比还没有胸腺再活化和还无供者CD34+细胞重建的受者更大的程度(即，在受者中的存活时间更长)接受供者组织。
实施例15遗传学修饰的HSC细胞促进了移植物接受用MHC匹配的雄性和雌性小鼠评价对HSC的遗传学修饰是否能促进移植物接受。
为了做到这一点，将年老的(2岁大)雌性Balb/cJ(H-2d)小鼠手术阉割(例如通过标准方法去除卵巢)或化学阉割。对于化学阉割，给小鼠皮下注射10mg/kg 1个月缓释剂型的Lupron(一种GnRH激动剂)。或者给小鼠注射GnRH拮抗剂(例如，Cetrorelix或Abarelix)。根据产品说明书，用对血浆标本的标准放射免疫检测进行对性类固醇缺失的确认，并可以在整个过程中进行监测。正常地应当在注射后3-4周达到阉割水平(＜0.5ng雌激素/ml)。
在适用于表达的条件下，用编码在雄性而不是雌性Balb/cJ小鼠的细胞内表达的H-Y蛋白的基因转染来自雌性Balb/cJ小鼠的骨髓细胞。也就是说，将H-Y蛋白编码基因(或cDNA)插入到表达载体中(例如质粒或病毒载体，例如逆转录病毒载体)，然后将其转染到雌性Balb/cJ骨髓细胞内(见，例如，Bonyhadi等(1997)，J.Virol.714707)。用标准方法(例如Western印迹法、Northern印迹法、细胞表面染色)确定出H-Y抗原在转染细胞上的表达。
然后如上所述，将转染的骨髓细胞施与到骨髓清除或免疫抑制的、阉割的(化学或手术)雌性小鼠内，以重建它们的胸腺。与之同时，或在重建后1周到1个月，将来自雄性Balb/cJ小鼠的皮肤移植物移植到重建的阉割的雌性小鼠上。
结果将显示用H-Y蛋白编码基因转染的雌性Balb/cJ小鼠骨髓细胞所重建的阉割的雌性小鼠比还没有用H-Y蛋白编码基因转染的雌性Balb/cJ小鼠骨髓细胞所重建的阉割的雌性小鼠能更好地“接收”来自雄性Balb/cJ小鼠的皮肤移植物。
一旦受者雌性Balb/cJ小鼠完全接受了来自雄性Balb/cJ小鼠的移植物，如果它是被化学阉割的，就可以停止施与化学物，容许它的胸腺萎缩以及恢复它的生育力。
实施例16人的外周免疫细胞池在造血干细胞移植后的再生I.异基因和自体HSCT这个实施例涉及用HSCT患者所进行的临床试验。为了评价恢复人的胸腺和骨髓功能的临床可能性，已经分析了常规进行基于LHRH激动剂(化学阉割)的性类固醇清除治疗的前列腺癌患者(＞60岁)。在治疗开始时和在此时所有患者的血清睾酮浓度都处于阉割水平的治疗后4个月，检查患者。
材料和方法患者82例患者都因为恶性疾病或骨髓衰竭进行了大剂量化疗(HDT)和PBSCT(异基因对照患者22例，异基因LHRH-A治疗患者20例；自体对照20例；自体LHRH-A治疗患者20例)。在自体或异基因干细胞移植前3周，给予测试患者3.6mg(有效4周)Zoladex(LHRH-A)，然后每月注射共4个月。在治疗前、移植后5周内的每周、和此后的每个月直到12个月分析所有患者。从Alferd人体研究伦理委员会得到伦理许可(试验编号01/006)。
对全外周血的FACS分析将合适的抗体鸡尾酒(20μl)加入到200μl全血中，并在室温下暗处孵育30分钟。裂解RBC，洗涤剩余细胞并将其重悬于1％PFA中用于FACS分析。用CD19-FITC、CD4-FITC、CD8-FITC、CD27-FITC、CD45RA-PE、CD45RO-CyChrome、CD62L-FITC和CD56-PE(都来自Pharmingen，San Diego，CA)的抗体染色标本。
Ki67分析为了检测增殖细胞，用CD27-FITC、CD45RO-CyChrome、and CD4-或CD8-APC(Pharmingen，San Diego，CA)表面染色标本。在红细胞裂解后，将标本在500μl 1×FACS透化溶液(Becton-Dickinson，USA；从RO水的10X溶液中制得1X溶液)中暗处，RT下孵育20分钟，将洗涤过的标本(2ml FACS缓冲液，5分钟，600gmax，RT)与抗Ki-67-PE或抗Ki67-FITC(或合适的同型对照)在室温下暗处一起孵育30分钟。然后洗涤标本并将其重悬于1％PFA中用于分析。
PBMC的制备通过聚蔗糖-泛影葡胺分离和随后的离心制备出纯化的淋巴细胞用于T细胞刺激检测和TREC分析，取出血浆层，在分析性类固醇水平之前将其储存在-20℃。没有被用于T淋巴细胞刺激检测的细胞被重悬于冷冻培养基中，并在TREC分析之前将其储存在液氮中。
T淋巴细胞刺激检测对于促有丝分裂原刺激，按每孔100μlRPMI-FCS内的1×105个细胞的浓度将纯化的淋巴细胞平铺在96孔圆底板中。将细胞与剂量从1-10μg/ml的PHA在37℃，5％CO2下一起孵育。对于TCR特异性刺激，将细胞在预先用纯化的抗CD3(1-10μg/ml)和抗CD28(10μg/ml)涂层的板中孵育48个小时。在空斑形成后(48-72个小时)，往每孔内加入1μCi3H-胸腺嘧啶核苷，并将板再孵育16-24个小时。收集板到过滤包(mats)中，并在β计数器(Packard-Coulter，USA)上用液态闪烁法测定3H-胸腺嘧啶核苷的掺入情况。
TREC分析细胞分选将冷冻的标本快速融化并用抗CD4-FITC和抗CD8-APC在冰中染色30分钟，将其洗涤(2ml FACS缓冲液)以及用3％福尔马林PBS溶液固定(搅拌下)。再孵育标本30分钟，洗涤并将其重悬在500μl用于分选的FACS缓冲液中。在MoFlo细胞分选仪(Cytomation Inc.)中分选出CD4+和CD8+细胞群。
DNA分离分选细胞并将其重悬于蛋白酶K(PK)消化缓冲液中(2×105个细胞/20μl 0.8mg/mL溶液)。将标本在56℃下孵育1个小时，随后在95℃下孵育10分钟以灭活蛋白酶。
利用分子信标的实时PCR如先前所述的(Zhang et al.，(1999)J.Exp.Med.190725)进行用于分析所选细胞内的TREC含量的实时PCR。引物为有义引物，5′-GGATGGAAAACACAGTGTGACATGG-3′(SEQ IDNO4)，反义引物，5′-CTGTCAACAAAGGTGATGCCACATCC-3′(SEQ IDNO5)。进行1个循环的变性(95℃10分钟)，随后是45个循环的扩增(94℃30秒，60℃30秒和72℃30秒)。为了标准化输入DNA中的细胞等价物，用分开的实时PCR检测定量CCR5编码序列，它不含有假基因。
统计学分析用Instat II软件进行统计学分析。对于前列腺癌HSCT研究，进行Mann-Whitney U检验。对于人体研究，通过比较治疗前和治疗后的结果，每个患者都作为内对照，并用配对的学生t检验或wilcoxonsigned秩合检验分析结果。
结果图49描述了在HSCT后的不同时间点(2-8周)对对照患者的自然杀伤(NK)细胞恢复的分析。如图49A-B分别所示的，在两个对照的异基因和自体移植受者中都观察到了相似的趋势。相反地，在HSCT前3周接受LHRH-A治疗的异基因患者从移植后第14天到5个月都显示出了显著更高的NKT细胞(Vα24+Vβ11+)数目(图49C，数据表示为6-20例患者的平均值±1SEM，*p≤0.05)。根据它们的Vα24+Vβ11+表型分析NKT细胞。
图50描述了在HSCT后的不同时间点(第14、21、28和35天)对对照患者的NKT细胞重建的FACS分析。在异基因患者中观察到了早期恢复，这主要见于移植后早期的CD8+群内，这说明了胸腺外途径的再生。从移植后1个月开始，CD4+NKT细胞也是明显的。
图51描述了在HSCT后的不同时间点(2-12个月)的对照患者的B细胞重建。如图51B所示，自体移植患者中的B细胞重建比异基因患者中的发生得相对更快(图51A)。但是，直到移植后至少6个月，两组内的向对照值(阴影部分)的恢复仍不明显。
图52描述了在HSCT后的不同时间点(2-12个月)的对照患者的CD4+重建。当B细胞数目在移植后6个月恢复到对照值时(见图48A-B)，自体的(图52B)和异基因的(图52A)受者中的CD4+T细胞数目仍是严重减低的，甚至在移植后12个月时。
图53描述了在HSCT后的不同时间点(2-12个月)的对照患者的CD8+细胞再生。如图53A-B所示，相应地在异基因和自体受者中，CD8+T细胞数目在移植后都再生得非常快。但是，如图53C所示，CD8+T细胞主要是胸腺外来源的，如TCRγδ+T CD8+T细胞、CD8ααT细胞和CD28-CD8+T细胞的增加所提示的那样。
图54描述了利用标记物Ki-67对HSCT之前(图54A)和28天后(图54B)的对照患者的不同的CD4+和CD8+T细胞群的增殖的FACS分析。利用标记物CD45RO和CD27，根据原初、记忆和活化表型分析细胞。大多数的增殖发生在CD8+T细胞亚组，这还说明这些细胞是胸腺外来源的以及主要的增殖都发生在外周T细胞亚组内。
图55描述了在HSCT后的不同时间点(2-12个月)的对照患者及LHRH-A治疗患者的原初CD4+T细胞再生。图55描述了对原初CD4+T细胞(CD45RA+CD45RO-CD62L+)的FACS分析，并显示这些细胞在整个研究过程中的严重缺失。如图55B-C所示，自体移植患者中的原初CD4+T细胞到HSCT后12个月时开始再生(图55C)，但异基因患者中的仍显著地低于对照值(图55B)。这些结果说明胸腺因为患者的年龄而不能在移植后恢复足够多的原初T细胞的数目。相反地，在异基因前3周接受LHRH-A的患者中，到移植后9&12个月时都显示出比对照显著更高数目的原初CD4+T细胞(与对照(未LHRH-A治疗的)比较，移植后9&12个月的p≤0.05)(图55D)。这说明胸腺依赖性T细胞途径的再生随着性类固醇清除治疗而增强。
图56描述了在HSCT后不同时间点(1-12个月)的对照患者的TREC水平。对仅见于新近胸腺迁出细胞(RTE)的TREC水平的分析着重于异基因(图52A)和自体(图52B)患者的胸腺在移植后恢复水平的无能。这再次被归结于患者的年龄，以及因为胸腺萎缩所造成的胸腺功能的缺失，已经认为这对这些患者的发病率和死亡率都有着相当的影响。相反地，当在异基因移植前接受LHRH-A治疗时，进行异基因外周血干细胞移植的患者都表现出CD4+TREC+细胞/ml血的显著增加(与对照(未LHRH-A治疗的)比较，移植后9个月的p≤0.01)。接受LHRH-A治疗的异基因患者在移植后9个月时显示出比对照显著更高数目的CD4+TREC+细胞/ml血。自体的LHRH-A治疗的患者在移植后12个月也显示出显著更高的水平(图56D)。这说明胸腺再活化随性类固醇清除治疗的增强。数据表示为5-18例患者的平均值±1SEM，*p≤0.01。
LHRH-A给药显著地增加了外周血的NK但不是B细胞的数目。总体而言，没有观察到B细胞数目随LHRH-A治疗的显著变化(图47)。但是，观察到了NK细胞数目随治疗的显著增加(p≤0.01)(图47)。因此，性类固醇的去除造成了T细胞和NK细胞数目的显著增加。
与对用LHRH-激动剂所治疗的患者的先前研究一致(Garzetti et al.，(1996)Obstet.GynecoL 88234-40；Oliver et al.，(1995)Urol.Int，54226-229；Umesaki et al.，(1999)Gynecol.Obstet.Invest.4866-8)，观察到了总淋巴细胞、T细胞(主要是CD4+)和NK细胞的显著增加(图45和47)。对T细胞群的更为详细的分析发现了原初CD4+T细胞以及原初和记忆CD8+T细胞数目在LHRH-A治疗后的显著增加(图44)。
为了确定原初T细胞的增加是否是通过外周扩增(见例如用IL-7给药的实例(Soares et al.，J.Immunol.(1998)1615909-5917))或是作为胸腺再活化的直接结果，进行了对细胞增殖(Ki-67抗原+)以及TREC水平的分析(Hazenberg et al.，(2001)J.Mol.Med.79631-40)。在CD4+(图48A)和CD8+T细胞(图48B)的原初、活化或记忆细胞群中，都没有看到增殖水平随激动剂治疗的任何变化(仍为2-4％的低水平)。这说明治疗没有直接诱导T细胞的增殖，以及外周的过度增殖不会影响TREC的水平。这没有除外在更早时间点的外周扩增的可能性。但是，预计这将仅仅造成活化/记忆细胞水平的增加。在对10例患者的TREC水平的分析之后，发现了胸腺功能和T细胞数目的增加的直接证据(图46B)。在CD4+和CD8+T细胞群内，10例患者中的5例到LHRH-A治疗4个月时显示出绝对的TREC水平(每ml血)的增加(超过最初显示值的＞25％)。这也被反映于比例的增加(每1×105个细胞)。与此相关的10例患者中的6例都显示出总TREC水平的总体增加。仅仅1例患者显示出总TREC (减少约10％)的减少。因为能在胸腺内发生作为正常T细胞发育的一部分或输出后的有丝分裂(Hazenberg et al.，(2001)J.Mol.Med.79631-40)稀释了TREC(Zhang et al.，(1999)J.Exp.Med.190725-732)，绝对TREC水平将表示对T细胞输出的非常的低估值。因此，激动剂治疗后的外周的总TREC+细胞的显著增加与胸腺依赖性T细胞途径的再生(Douek et al.，(1998)Nature 396690-695(1998)；Douek et al.，(2001)J.Immunol.1676663-8；Hochberg et al.，(2001)Blood 981116-21)完全一致。总的，这些数据证实了性类固醇抑制提高了成人的胸腺输出的能力并提供了恢复在多种临床病变中的严重T细胞耗竭后的原初T细胞数目的基础。
实施例17性类固醇清除增强了小鼠的造血干细胞移植后的免疫重建进行这个试验是为了检验异基因HSCT受者的性类固醇抑制能提高它们的移植后免疫重建的假说。因此，这些试验旨在建立性类固醇清除是否影响异基因HSCT后的造血恢复。在HSCT后14天时，阉割小鼠比假阉割对照显著地增加了胸腺细胞数目。到28天时，这些细胞仍在增多，此时阉割小鼠的脾细胞密度也有增加。在胸腺中，T细胞前体和DC在HSCT和阉割后都有着显著增加。在HSCT和阉割后，也显著地增加了BM前体细胞和发育中的B细胞。这些中心增加转变为异基因HSCT后的供者来源的外周T和B细胞的显著增加。每一种免疫增强策略都带来了加重发生移植物抗宿主病(GVHD)的危险。在异基因组中，在诱导GVHD的同时阉割小鼠。当比较阉割和假阉割小鼠时，GVHD发生率或严重度都没有显著差异。此外，在缺乏性类固醇时，GVT活性没有消失。先前已经显示在IL-7治疗后增强了异基因HSCT受者的淋巴细胞恢复。IL-7治疗和阉割的联合表现出对HSCT后的胸腺具有累加作用。这些结果说明阉割及所造成的性类固醇的清除增强了异基因HSCT后的造血恢复，且没有加重GVHD并保留了GVT。
材料和方法试剂抗小鼠CD16/CD32FcR封闭剂(2.4G2)和所有下面的荧光团标记的抗小鼠抗原的抗体都来自Pharmingen(San Diego，CA)Ly-9.1(30C7)、CD3(145-2C11)、CD4(RM4-5)、CD8.2(53-5.8)、T细胞受体β(TCR-β；H57-597)、CD45R/B220(RA3-6B2)、CD43(S7)、IgM-FITC(R6-60.2)、CD11b(M1/70)、Ly-6G(Gr-1)(RB6-8C5)、c-kit(2B8)、Sca-1(D7)、CD11c(HL3)I-Ak(11-5.2)、同型对照物鼠IgG2a-k(R35-95)、鼠IgG2a-1(B39-4)、鼠IgG2b-(A95-1)、鼠IgGl-k(R3-34)、仑鼠IgG-group l-k(A19-3)、仑鼠IgG-group 2-1(Ha4/8)、和2.4G2及Fcr(FcR封闭剂)。抗生物素蛋白链球菌-FITC、PercP-藻红蛋白(PE)也来自Pharmingen(SanDiego，CA)。重组人IL-7由Michel Morre博士(Cytheris，Vanves，France)提供。
为了确认人重组IL-7能刺激小鼠细胞，用IL-7依赖性小鼠前B细胞株2E8进行了胸腺嘧啶核苷掺入增殖检测，并发现在研究中所用的人IL-7对小鼠细胞具有与小鼠IL-7相等的增殖作用。组织培养基由加有10％热灭活胎牛血清、100U/ml青霉素、100mg/mL链霉素和2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640(以及用于培养32Dp210细胞和增殖检测的50mM 2-巯基乙醇)构成。
小鼠和HSCT雄性C57BL/6J(B6，H-2b)、C3FeB6F1/J([B63C3H]F1；H-2b/k)、B10.BR(H-2k)、B6D2F1/J(H-2b/d)、CBA/J(H-2k)、Balb/c(H2-d)、IL7-/-和KGF-/-小鼠都来自Jackson实验室(Bar Harbor，ME)，并当它们为8到12周大之间时将其用于试验中。使用4个月到7个月中间大的KGF-/-和IL7-/-小鼠。HSCT方案得到了Memorial Sloan-Kettering癌症中心研究所的动物照顾和使用委员会的许可。从股骨和胫骨中无菌取出BM细胞。通过与抗Thy-1.2抗体在4℃孵育30分钟，紧接着与低TOX-M兔补体(Cedarlane Laboratories，Homby，ON，Canada)在37℃孵育1个小时，取出了供者BM的T细胞。通过在尼龙绒毛柱上的纯化及随后用氯化氨红细胞裂解缓冲液去除红细胞，得到了脾T细胞(用于GVHD分析)。将细胞(有或没有脾T细胞和白血病细胞的5×106个BM细胞)重悬于Dulbecco改良基本培养基(Life Technologies，Grand Island，NY)中，并在第0天将其通过尾部静脉输注(0.25mL总体积)移植到致死性照射的受者中。在移植前的第0天，受者接受了1300cGy全身照射(137Cs源)，分次给予，每次剂量之间间隔3小时(以减少胃肠道毒性)。将小鼠圈养在无菌的微隔离笼中，并接受正常的食物和高压灭菌的次氯酸化的饮用水(pH 3.0)。
手术阉割将小鼠麻醉并切出小的阴囊切口以显露睾丸，将睾丸结扎并与外周的脂肪组织一起取出。用手术订关闭伤口。假阉割除了取出睾丸外要求相同的手术操作。在BM移植前1天进行阉割，用于免疫重建和GVHD研究。
IL-7的给药或从第0到13天或从第21到27天腹腔内给予10μg/天IL-7，用于免疫重建研究。在相同的时间点给对照小鼠注射PBS。
流式细胞术分析在FACS缓冲液(磷酸缓冲盐水(PBS)/2％小牛血清蛋白(BSA)/0.1％叠氮化合物)中洗涤BM细胞、脾细胞或胸腺细胞，并将1-3×106个细胞与CD16/CD32FcR封闭剂在4℃下一起孵育30分钟。然后将细胞与第一抗体在4℃下孵育30分钟，并用FACS缓冲液洗涤两次。根据需要，将细胞与结合的抗生物素蛋白链菌素在4℃下再孵育30分钟。将所染色的细胞重悬在FACS缓冲液中并在FACSCaliburTM流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)上用CellQuestTM软件进行分析。
增殖检测将脾细胞(4×105个细胞/孔)在96孔内与作为刺激物的经照射的(2000cGy)BALB/C脾细胞(2×105个细胞/孔)孵育5天，并用αCD3(145-2c11)和αCD28(37.51)(终浓度为2.5mg/mL)刺激脾细胞(4×105个细胞/孔)4天。在最后18个小时期间，用1mCi/孔[3H]胸腺嘧啶核苷激动(pulse)培养物，并用Harvester 96(Packard)收集DNA。将刺激指数(SI)计算为刺激细胞(cpm)对未刺激细胞(cpm)的比值。
51Cr释放测定法在37℃和5％CO2下，用100mCi51Cr标记2×106个细胞/mL的靶细胞2个小时。在洗涤三次后，将所标记的靶细胞按2.5×103个细胞/孔平铺在U底板(Costar，Cambridge，MA)中。将终体积为200mL的与经照射的BALB/C脾细胞(1∶2比例)培养2天的脾细胞按不同的效应物靶细胞比例加入到4到6个孔中，并在37℃和5％CO2下孵育4到6个小时。最后，从每个孔中取出35mL上清液，并在伽马计数仪上计数以确定出试验释放。从只接受靶细胞和培养基的孔中得到自发释放，从接受5％Triton X-100的孔中得到总释放。用下面的公式计算出细胞毒性百分比毒性百分比＝100×[(试验释放-自发释放)/(总释放-自发释放)]。
用细胞内IFN-γ染色对异基因反应性T细胞克隆的检测简单地，将细胞与布雷菲德菌A(10mg/mL)孵育12到15个小时(对于用T细胞耗竭的[TCD]、经照射的刺激型细胞的异基因刺激)，收集并洗涤细胞，然后用第一(表面)荧光团(FITC、PerCP、和APC)结合的抗体染色、固定、并用Cytofix/Cytoperm试剂盒(Pharmingen)透化细胞，以及最后用αIFNγ-PE染色。通过给所设定的群设门进行FACS分析。使用如下面所提及的流式细胞仪和软件。
迟发型过敏发应检测在异基因BMT后42天时，经尾部静脉注射200μl 0.01％羊红细胞(Colorado Serum，Denver，CO)的PBS溶液致敏假阉割和阉割小鼠。在第46天时，用50μl 20％羊RBC悬液攻击致敏动物的右后爪垫，同时左后爪垫接受了相同体积的50μl PBS溶液作为对照。用标识厚度的计量器(Mitutoyo，Kanagawa，Japan)测定24小时和48小时后的爪垫肿胀。通过试验右侧的爪垫测定值减去PBS注射的左侧爪垫的测量值测定出反应的强度。
对GVHD的判定用首先由Cooke et al.((1996)Blood 883230-9)所描述的临床GVHD积分系统判定GVHD的严重度。简单地，每周给编码笼内的耳部标记的动物个体化地计分5个临床参数(体重减轻、姿态、活力、皮毛和皮肤)，分值从0到2分。通过累加整个5个条件的积分(0-10)得出临床GVHD指标。每日监测生存率。积分大于等于5分的动物被认为是濒死的，并被以人道的方式处死。
对GVT-P815(H-2d)肥大细胞瘤诱导作用的评价以及对肥大细胞瘤死亡对GVHD造成的死亡的评价B6D2F1/J受者在异基因HSCT(5×106个T细胞耗竭的(TCD)BM细胞和5×105个C57/BL6来源的T细胞)的第0天静脉内接受了1×103个P815(H-2d)细胞。每日检测生存率，如先前所述的用尸解确定HSCT后的死亡原因。简单地，死于白血病的特征是肝脾肿大以及显微镜检查在肝和脾内发现有肥大细胞瘤细胞，而死于GVHD被定义为缺少肝脾肿大及肝和脾内的白血病细胞，以及在死亡时存在有临床GVHD积分系统所评价的GVHD的临床症状。
半定量RT-PCR用Superscript II逆转录酶(Life Technologies，Rockville，USA)逆转录全BM的总细胞RNA。用PCR Master Mix(Promega，Madison，USA)PCR扩增cDNA 35个循环(94℃30秒；56℃30秒；72℃60秒)。HPRT5′CACAggACTAgAACACCTgC3′和gCTggTgAAAAggACCTCT3′；TGFβ15′CTACTgCTTCAgCTCCACAg3′和5′TgCACTTgCAggAgCgCAC3′；KGF5′gCCTTgTCACgACCTgTTTC3′和5′AgTTCACACTCgTAgCCgTTTg 3′。
对IL7-/-胸腺的酶消化IL7-/-小鼠包含有很大比例的CD45-胸腺间质细胞，每个胸腺都在0.125％(w/v)胶原酶/分散酶(Roche AppliedSciences，Indianapolis，USA)和0.1％(w/v)DNA酶中接受酶消化，从胸腺中释放出绝大多数的间质和造血细胞，以容许精确地计算胸腺的细胞密度。用抗CD45抗体鉴别CD45-间质细胞。
统计学所有的数据都被表示为平均值±SEM。用Mantel-Cox对数秩合检验分析生存数据，用非参数的、非配对的Mann-Whitney U检验进行所有其他的统计学分析。小于0.05的P值被认为是统计学显著的。
结果I.阉割增加了异基因HSCT后的BM、胸腺和脾的细胞密度。在异基因HSCT前1天阉割胸腺CBA小鼠。小鼠接受了1300cGy全身照射，和随后的5×106个B10.BR TCD BM细胞。在早到HSCT后14天时(图29A-B)，与假阉割的对照比较(分比为9.5×106±3.0×105和25×106±2.6×106)，阉割小鼠的BM(16×106±1.4×106)和胸腺内(55.4×106±1.8×106)有着显著更多的细胞。在HSCT后28天时，这些数目在阉割小鼠中仍有显著的提高(BM22×106±4.0×106对14×106±2.2×106；胸腺72×106±5.9×106对45×106±2.9×106)。在第28天时，阉割小鼠中的脾细胞密度也显著地增高超过了假阉割的脾细胞数目(253×106±28.4×106对126×106±13.9×106)(图29C)。到28天时，阉割小鼠开始接近移植前的细胞密度。到了HSCT后42天时，阉割小鼠和假阉割小鼠之间的胸腺及脾细胞密度不再有显著的差异。因为假阉割受者都是年轻小鼠，它们具有活跃的移植后淋巴细胞生成，但是与阉割受者比较，显著地延长达到生成初级和二级淋巴组织的正常细胞密度所需的时间。
II.在HSCT后28天的阉割小鼠的BM中有着显著更多的供者来源的HSC。一些研究已经显示性类固醇抑制了早期造血前体细胞的增殖和/或分化(Thurmond et al.，(2000)Endocrmol.1412309-2318；Medina et al.，(2001)Nat.Immunol.2718；Kouro et al.，(2001)Blood 972708)。因此，已经探讨了阉割对异基因移植组中的HSC数目的影响。供者来源的HSC数目在异基因HSCT后14天的假阉割和阉割小鼠中都是非常低的(分别为2.98×102±1.25×102和2.66×102±8.8×101)(图30A)。但是，到第28天时，与假阉割对照比较(1.1×103±4.1×102)，阉割小鼠有着显著更多的Ly9.1+Lin-Sca-1+c-kit+供者来源的HSC(4.8×103±1.1×103)(图30A)。
III.先于异基因HSCT的阉割增强了供者来源的B细胞的恢复。在对B细胞恢复的分析中，区分开B细胞发育的三个阶段原B细胞(CD45R+CD43+IgM-)、前B细胞(CD45R+CD43-IgM-)和未成熟B细胞(CD45R+CD43-IgM+)。在异基因HSCT后14天时，与假阉割对照(2.08×106±5.0×104)比较，阉割小鼠的BM内有着显著更多的前B细胞(5.5×106±1.7×106)(图30B)。在28天时，在阉割小鼠的BM内也有显著更多的前B细胞(sham-cx3.1×106±3.7×105c.f.cx6.6×106±6.6×105)和未成熟B细胞(sham-cx1.3×106±2.6×105c.f.cx3.0×106±3.4×105)(图30B)。在HSCT后28天时，BM B细胞和它们的前体细胞的增加转化为阉割小鼠的脾的未成熟B细胞数目的显著增加(sham-cx64.9×106±6.4×105c.f.cx112.0×106±10.0×105)(图30C)。这些结果与先前的结果吻合，说明阉割增强了BM的B细胞产生及输出。
IV.阉割增强了异基因HSCT后的T细胞重建。根据CD3、CD4和CD8的表达，将胸腺细胞和外周细胞分成发育阶段三阴性(TN)(CD3-CD4-CD8-)、双阳性(DP)(CD4+CD8+)、单阳性CD4(SP CD4)CD3+CD4+CD8-和单阳性CD8(SP CD8)CD3+CD4-CD8+(图31A-D)。早到异基因HSCT后14天时，与假阉割对照比较，阉割小鼠内有着显著更多的TN、DP、SP CD4和SP CD8胸腺细胞。在HSCT后28天时，阉割组内的DP和CD4SP细胞数目仍有显著地提高。到第42天时，假阉割和阉割小鼠内的所有的胸腺细胞亚群都相同。宿主和供者来源的DC都被认为在避免移植物排斥上发挥着完全的作用(Morelli et al.，(2001)Semin.Immunol.13323-335)。在异基因HSCT后14天时，在阉割小鼠的胸腺内有着显著更多的宿主来源的CD11chiDC。在异基因HSCT后28天时，阉割小鼠的胸腺内的宿主和供者来源的DC都有着显著地增加(图31E-F)。在第28天时，与假阉割对照比较，阉割小鼠内的胸腺细胞数目的增加转化为了阉割小鼠的脾内的供者来源的成熟CD4+和CD8+T细胞数目的显著增加(图31G)。
V.就每个细胞而言，假阉割和阉割小鼠的T细胞之间没有显著差异。为了确定异基因HSCT后的阉割小鼠的外周T细胞的功能潜能，进行了一系列的体外检测。图32A展示了异基因HSCT后6周的阉割小鼠和假阉割对照的供者来源的T细胞的数目。以两种方式测定了脾T细胞的增殖能力αCD3/αCD8交联(图32B)和3rd部分MLR(用经照射的BALB/C脾细胞作为刺激物)(图32C)。当在这两个组中比较假阉割和阉割小鼠时，在外周T细胞的增殖能力上都没有显著差异。异基因HSCT后6周，将脾细胞与经照射的BALB/C脾细胞(3rd部分)培养5天。在异基因刺激5天后，培养中的绝大多数细胞都是CD8+T细胞。这些细胞的半数被用于CTL(51Cr)检测以确定出假阉割和阉割小鼠的脾细胞的细胞毒性。测试了在不同的效应物靶细胞比值的脾细胞杀伤带有51Cr的A20(BALB/C B细胞淋巴瘤肿瘤细胞株)细胞的能力(图32D)。在细胞毒性方面，假阉割和阉割小鼠之间没有显著差异。用3rd部分(BALB/C)或同基因的(B10.BR)经照射的脾细胞和布雷菲德菌素A重新刺激培养了5天的其他一半的细胞以确定出IFNγ的产量。图32E显示了供者来源的CD8+T细胞在BALB/C原初刺激和BALB/C或B10.BR二次刺激(对照)后的IFNγ的产量。图32F图解地展示了这一点。当比较假阉割和阉割小鼠时，产IFNγ的供者来源的CD8+细胞的比例没有显著差异。
为了体内评价免疫功能，使用了DTH检测，其中在阉割和异基因BMT后42天时，用sRBC致敏小鼠。在第46天，攻击小鼠并在24和48小时后，测定爪垫肿胀。当与异基因HSCT同时被阉割的小鼠与假阉割对照比较时，显著地增强了攻击后48小时的DTH应答(图32G)。
这些功能性检测证实，就每个细胞而言，阉割受者的T细胞与假阉割受者的T细胞相当，并能应答于新的抗原，具有完整的增殖、细胞毒性和细胞因子的产生。但是，甚至在移植后6周，阉割受者中的显著更快的T细胞重建转变为了DTH应答的增强。
VI.先于异基因HSCT的阉割没有加重GVHD并保留了GVT活性。GVHD和GVT都是主要由异基因移植物所转入的异基因反应性供者来源的T细胞所介导的。任何用于增强免疫重建的治疗都有可能加重GVHD或相反地减弱GVT活性。为了建立阉割对供者来源的异基因反应性T细胞没有刺激作用，通过往异基因移植物内加入异基因供者T细胞诱导GVHD。当比较阉割和假阉割小鼠时，因为GVHD所造成的发病率或死亡率都没有显著差异(图33A)。为了评价阉割对GVT活性的作用，在移植的同时将肥大细胞瘤细胞株P815(H-2d)注射到B6D2F1/J受者中。尸解在试验期间死亡的动物，并确定出死亡的原因(肿瘤对GVHD)。肥大细胞瘤所造成的死亡率在阉割后仍未改变(9只小鼠中的6只)，当与假阉割对照比较时(8只小鼠中的5只)。这说明阉割没有消除HSCT后的GVT应答(图33B)。
VII.异基因HSCT后的IL-7和阉割具有累加作用。先前已经显示IL-7治疗能增加没有其他治疗的动物的T和B细胞的数目，以及也能增强环磷酰胺、照射、同基因和异基因HSCT治疗后的淋巴系的复原(Alpdogan et al.，(2001)Blood 982256；Bolotin et al.，(1996)Blood 881887；Faltynek etal.，(1992)J.Immunol.1491276；Morrissey et al.，(1991)J.Immunol.1461547)。已知IL-7通过增加胸腺活性和外周扩增增加了T细胞数目。
因此，决定在异基因HSCT的受者中联合阉割施与IL-7。治疗后14天时，在阉割小鼠和那些接受联合治疗(阉割和IL-7给药)的小鼠的胸腺中有着显著更多的细胞。在这早期时间点上，在PBS治疗的、假阉割对照和IL-7治疗的、假阉割小鼠中都没有看到差异。在阉割组和接受联合治疗的小鼠之间也没有看到显著差异，说明在异基因HSCT、IL-7治疗和阉割后14天时，这仅仅是阉割所造成的作用(图34A)。在异基因HSCT后28天的这个较晚的时间点上，单独阉割组和单用IL-7组的胸腺的细胞密度都显著地高于对照组。当在异基因HSCT后28天分析时，IL-7治疗和阉割的联合治疗对胸腺细胞密度具有累加作用(图34B)。
VIII.对IL-7、TGFβ1和KGF的半定量RT-PCR发现异基因HSCT和阉割后的KGF的增加和TGFβ1的减少。对全骨髓细胞的RT-PCR发现晚到异基因HSCT后6周时在假阉割和阉割小鼠中都没有可检测到的IL-7转录的水平。当使用来自对照的、未移植的小鼠的模板时，检测到了IL-7(数据没有显示)。已知TGFβ1和KGF是造血的关键介导物。在阉割和异基因BMT后2周时，使用HPRT equibrated模板显示TGFβ1的减少和KGF的增加(图34C)。
IX.在KGF-/-小鼠而不是在IL-7-/-小鼠中看到了阉割后所发生的变化。为了进一步地研究隐藏在阉割后所增强了的免疫重建后面的可能机制，阉割了KGF-/-和IL-7-/-小鼠，2周后分析了胸腺、脾和BM(TGFβ1-/-小鼠在青春期前死亡，Shull et aL(1992)Nature 359693)。当比较假阉割和阉割的KGF-/-小鼠时，显著地增加了胸腺的细胞密度。尽管在这个早期时间点上没有看到BM和脾的总细胞密度上的差异，如先前在野生型小鼠中所看到的一样，在BM的B细胞组内看到了变化(Ellis et al.(2001)Int.Immunol.13553；数据没有显示)。因为IL-/-小鼠的胸腺内的细胞的大部分都是CD45-间质细胞的事实，当使用这些小鼠时，用酶消化得到了细胞悬浮液。通过进行酶消化，更多的细胞被释放到悬浮液中，这造成了这个试验中所看到的比先前文献中的稍微更高的胸腺细胞密度(vonFreeden-Jeffry et al.(1995)J.Exp.Med.1811519)。当比较阉割小鼠和假阉割对照时，在IL-/-小鼠的胸腺(图34G)、脾(图34H)或BM(图34I)中都没有看到差异。这些发现说明IL-7在阉割和异基因HSCT后所看到的增强了的免疫重建中的重要作用。
讨论异基因HSCT的受者经历了一段长时间的免疫缺陷期，这与致命性的感染相关。随着受者年龄的增加，这种感染的危险增加，因为完全的免疫学重建所需的时间更长。HSCT后的免疫缺陷期可以超过1年，最近长期的研究证实更老的HSCT患者比他们的供者减少了TREC+CD4+T细胞(Storek et al.，(2001)Blood 983505；Lewin etal.，(2002)Blood 1002235)。这说明胸腺的损伤和随后的T细胞产量的下降可能比所想象的更长。绝大部分的HSCT后的感染与外周CD4+T细胞的缺乏相关(Storek etal.，(1997)Am.J.Hematol.54131)。因此，阉割后所发生的外周T细胞数目的增加可能减少这些感染的发病率，导致移植患者的总生存率的增加。
多个小组都已经把它们的研究的重点集中在HSCT后的造血重建上，绝大多数有希望的结果都来自造血生长因子和细胞因子的应用。例如，G-CSF被用于动员供者干细胞(Dreger et al.，(1993)Blood 811404)。Noach等显示用SCF和IL-1II或SCF和Flt-3配体的预处理造成了供者细胞植入的增强((2002)Blood 100312)。KGF表现出增强了同基因和异基因组的植入和重建并改善了GVHD(Panoskaltsis-Mortari et al.，(2000)Blood 964350；Krijanovski，et al.，(1999)Blood 94825)。IL-7增强了同基因HSCT后的免疫重建(Bolotin et al.，(1996)Blood 881887)，并能增强异基因HSCT后的免疫重建和保持GVT活性而不加重GVHD(Alpdoganet al.，(2001)Blood 982256)。
一些研究已经显示手术或化学阉割所造成的雄性小鼠的性类固醇清除增加了BM和脾B细胞的数目(Ellise et al.，(2001)Int.Immunol.13553；Erben et al.，(2001)Hor7n.Metab.Res.(2001)33491；Wilson et al.，(1995)Blood 851535；Masuzawa et al.，(1994)J.Clin.Invest.941090)。外周B细胞数目的增加主要是因为B220loCD24hi新近BM迁出的增加(Ellis et al.，(2001)Int.Immunol.13553)。Olsen等已经证实雄激素增强了BM内间质细胞的TGFβ的产量，这反过来抑制了B细胞发育(J.Clin.Invest.(2001)108697)。另外，对TGFβ的体外中和逆转了二氢睾酮对B细胞的抑制。TGFβ也已经显示出下调了间质的IL-7产生并随后抑制了B细胞前体的增殖(Tang et al.，(1997)J.Immunol.159117)。因此，在这个情况中，对阉割/雄激素清除的作用的一个可能的解释是它在异基因HSCT后抑制了TGFβ的产生，反过来增强了B细胞发育，解释了阉割小鼠比假阉割对照增加了BM和脾的B细胞数目。
TGFβ也调节了造血干细胞的增殖。Batard等已经证实生理浓度的TGFβ抑制了HSC的体外增殖和分化((2000)J.Cell.Sci.113383-90)。此外，对HSC的TGFβ信号途径的阻断(经突变的II型受体的暂时表达)增强了这些细胞的存活和增殖(Fan et al.，(2002)J.Immunol.168755-62)。因此，异基因HSCT和阉割后28天所看到的HSC数目的增加可能是因为BM间质细胞的TGFβ产量的减少是可能的。
雌激素和雄激素都能影响HSC的分化和增殖(Thurmond et al.，Endocrinol.，(2000)1412309-18；Medina et al.，(2001)Nat.Immunol.2718-24；Kouro et al.，(2001)Blood 972708-15)。雌激素直接地抑制了HSC和一些淋巴祖细胞亚组的增殖和分化(Medina et al.，(2001)Nat.Immunol.2718；Kouro et al.(2001)Blood 972708)。HSC表达功能性的雌激素受体(ER)以及雌激素给药减少了Lin-c-kit+Sca-1+HSC的数目(Thurmond et al.，(2000)Endocrinol.1412309；Kouro et al.，Blood(2001)972708)。Thurmond等所进行的研究说明当BM(Endocrinol.(2000)1412309)的造血细胞中存在有ERoc时，阻断了c-kit+Sca-1+祖细胞和更成熟的亚组(c-kit+Sca-1-和c-kit-Sca-1-)之间的转化。ER也存在与BM间质细胞中(Girasole et al.，(1992)J.Clin.Invest.89883；Smithson et al.，(1995)J.Immunol.1553409)，说明雌激素也可能对间质细胞产生生长因子有着作用，这反过来影响了HSC增殖和/或分化。尽管绝大多数证据说明雌激素经BM间质对HSC的间接作用，BM的淋巴系中存在有功能性雌激素受体并没有排除直接作用。
Olsen等已经显示功能性雄激素受体存在于胸腺上皮上而不是胸腺细胞上，该受体对于年龄相关的胸腺退化以及随后的经性类固醇清除的再生都是关键的(Olsen et al.，(2001)Endocrinol.1421278)。
尽管胸腺退化和/或再生的分子机制仍不清楚，但这里有着一些可能的侯选机制。胸腺IL-7水平随着年龄而减低(Aspinall，et al.，(2000)Vaccine 181629；Andrew et al.，(2002)Exp.Gerontol.37455；Ortman et al.，(2002)Int.Immunol.14813)。仍不清楚是否这是因为产IL-7的细胞数目的减少或已有细胞产细胞因子的能力减低。但是，对老年小鼠的IL-7治疗可以逆转年龄相关的胸腺凋亡的增加并增强造血作用(Andrew et al.，(2001)J.Immunol.1661524)。小鼠胸腺的干细胞因子(SCF)和M-CSFmRNA表达也随着年龄而减少(Andrew et al.，(2002)Exp.Gerontol.37455)。在细胞内的信号途径水平，减少了对DN胸腺发育关键的转录因子E2A，也减少了存在于胸腺上皮细胞上，并涉及该细胞的增殖和发育的转录因子Foxnl(whn)(Ortman et al.，(2002)Unit.Immunol.14813)。Sempowski等已经监测了老年人的mRNA稳态水平，并显示出白血病抑制因子(LIF)、制瘤素M、IL-6和SCF mRNA的显著增加(J.Immunol.(2000)1642180)。
上述研究说明了对阉割的应答是多因素的。阉割IL-/-小鼠的试验说明IL-7产生的增加是阉割作用的重要组成部分。但是，当用大剂量IL-7和阉割治疗小鼠时，观察到了对胸腺细胞密度的累加作用，这说明阉割提供了比单独增加IL-7水平更多的胸腺生成的作用。
DC是胸腺内的阴性选择的关键媒介物(Jenkinson et al.，(1985)Transplantat.39331；Matzinger et al.，(1989)Nature 33874-60)，以及在暂时设定中，已经被涉及于通过移植后呈递胸腺的异基因抗原和去除供者特异性T细胞诱导移植物接受性。Tomita已经证实MHCI型错配的受者的胸腺的供者来源的细胞介导了供者反应性细胞的去除(Tomita et al.，(1994)J.Immunol.1531087-1098)。他们也显示静脉内注射的胸腺来源的DC被转运到了宿主胸腺内。此外，已经显示胸腺内注射宿主细胞加上异基因的抗原、供者细胞、或供者可溶性肽都增加了移植物接受性(GalTovillo et al.，(1999)Transplantation681827；Ali et al.，(2000)Transplantation 69221；Garrovillo et al.，(2001)Am.J.Transplant.1129；Oluwole et al.，(1993)Transplantation 561523-1527)。这些结果显示阉割显著地增加了异基因HSCT后的胸腺的宿主和供者来源的DC的数目。也就是说，性类固醇清除增强了胸腺DC的分化和/或增殖。因此，与造血干细胞和实体器官移植联合应用的阉割增加了移植物接受性。
结论当前的研究已经发现阻断性类固醇对骨髓清除和HSCT后的免疫重建具有显著的正向作用。HSC、和B和T祖细胞被明显地增强。这提供了一个用于增加植入的效率的重要平台和依赖于完整的造血系统的移植后策略，例如抗肿瘤或微生物抗原的疫苗接种或靶向于供者HSCT的基因治疗。胸腺内DC的增加对诱导和保持对异基因抗原的耐受性是重要的。另外，在阉割受者中没有加重GVHD和消除GVT活性。这些结果证实暂时的性类固醇清除(例如用LHRH类似物)作为增强免疫重建的预防性治疗是有用的。
实施例18性类固醇清除增强了造血干细胞移植后的TCR特异性刺激为了评价再生的T细胞的功能特性，分析了患者对TCR特异性刺激的应答性。
材料和方法患者在干细胞移植前3周给予测试患者Zoladex(LHRH-A)，然后每月注射1次共4个月。在治疗前、移植后5周内的每周和每个月直到12个月分析了所有的患者。从Alfred人体研究伦理委员会得到伦理许可(试验编号01/006)。
PBMC的制备将纯化的淋巴细胞用于T细胞刺激检测和TREC分析，并如上制备。
T淋巴细胞刺激检测除非有其他的说明，从移植后1-12个月起利用抗CD3和抗CD28交联进行对TCR特异性刺激的分析。对于TCR特异性刺激，在预先用纯化的抗CD3(1-10μg/ml)和抗CD28(10μg/ml)涂层的板上孵育细胞48个小时。在形成空斑后(48-72个小时)，往每个孔内加入1μCi的3H-胸腺嘧啶核苷，并将板再孵育16-24个小时。将板收集到过滤包上并在β计数仪(Packard-Coulter，USA)上用液态闪烁法确定出3H-胸腺嘧啶核苷的掺入程度。
I.LHRH-A给药增强了异基因干细胞移植后的对TCR特异性刺激的应答性。LHRH-A治疗的患者比对照患者在所有的时间点都表现出增强了的增殖应答(如3H-胸腺嘧啶核苷掺入所评价的)，除了在第6个月和9个月，因为此时所分析的患者数目少；(图57A-B)。在用LHRH-A所治疗的异基因移植患者中，在移植后4和5个月时观察到了比对照患者显著增加了的对抗CD3/CD28刺激的应答性。虽然对照患者在移植后6和9个月显示出增强了的应答，而LHRH-A治疗的患者在移植后12个月显示出更强的应答性。在移植后6和9个月，对照患者具有与治疗前数值相似的应答性。但是，在所有的其他时间点上，他们都是明显更低的。相反地，LHRH-A治疗的患者在所有的时间点上都具有与治疗前相同的应答性，除了移植后6个月。LHRH-A治疗的患者在移植后1、3和4个月显示出比对照患者增强了的应答性(如3H-胸腺嘧啶核苷掺入所评价的)。这提示了外周T细胞的直接作用的结果，因为直到移植后1-2个月，新的CD4+T细胞仍是不明显的(图57A-B)。
II.LHRH-A给药增强了自体干细胞移植后的对TCR特异性刺激的应答性。用自体移植的受者也观察到了在异基因移植受者中所看到的相似的应答(图57C)。那些用LHRH-A治疗的患者证实了在移植后4和9个月都具有增强了的对TCR刺激的增殖应答。LHRH-A治疗的患者在所有时间点都显示出比对照患者更强的增殖应答(如3H-胸腺嘧啶核苷掺入所评价的)，除了移植后5个月。在移植后12个月，在对照和LHRH-A治疗患者中都观察到恢复到了治疗前数值。
III.LHRH-A给药增强了慢性癌症患者治疗后的TCR特异性刺激的应答性。
在本研究中入选了患有慢性血液恶性肿瘤且为免疫抑制的患者，其免疫状态被如下确定有资料证实的与CD4＜0.4×109/L相关的严重感染；或淋巴增殖性疾病(例如，CLL、骨髓瘤、淋巴瘤)并接受常规的预防性静脉内免疫球蛋白(有资料证实的低伽马球蛋白血症)；或先前4年内有氟达拉滨、deoxycorfomycin和2-CdA的治疗；或先前2年内有异基因干细胞移植或自体干细胞移植。从Alfred人体研究伦理委员会得到伦理许可(试验编号01/006)。如下给予患者LHRH-A，展示一直到LHRH-A给药后6周的结果。
d-1(或之前)签署知情同意，以及进行治疗前调查；d0施与Zoladex(男性10.8mg，女性3.6mg)；d+28女性-施与Zoladex 3.6mgd+56女性-施与Zoladex 3.6mgd+84女性和男性-施与Zoladex 3.6mg从给药后第7天起，用抗CD3和抗CD28交联进行对TCR特异性刺激的分析。与治疗前水平比较，LHRH-A治疗的患者显示出“循环”方式的增殖应答的增强(如3H-胸腺嘧啶核苷掺入所评价的)(图63)。也就是说，在注射的当天就观察到了T细胞增殖的增加，以及该增殖在下次注射之前表现为轻度减少。这也说明LHRH-A对已有的外周T细胞的直接影响的可能性。这反映了用每月储存剂注射液的激动剂的给药。这些结果提示了对外周T细胞的直接影响。但是，在治疗后12个月所看到的增强了的应答反映了胸腺来源的T细胞的变化，因为所有患者从4个月起就停止了激动剂的给药。
结论因为早到移植后第35天就观察到了增加的对TCR特异性刺激的应答性，这主要是因为已有的T细胞，因为新来源的T细胞仅在这个阶段才开始离开胸腺。仅仅在这个时间点后才观察到新来源的胸腺生成的T细胞的影响，所以可以得出的结论是所增加的T细胞功能是因为已有T细胞的提高而不是来源于再生胸腺的T细胞。
实施例19性类固醇清除增强了造血干细胞移植后的促有丝分裂刺激为了评价再生T细胞的功能特性，分析了患者的对促有丝分裂刺激的应答性。
材料和方法患者患者为如上所入选于No.01/006临床试验方案的那些患者。在干细胞移植之前，给予患者LHRH-A(3周之前)。没有接受激动剂的患者被用作为对照患者。
PBMC的制备将纯化的淋巴细胞用于T细胞刺激检测和TREC分析，并如上制备。
促有丝分裂剂刺激检测从移植后1-12个月起，用美洲商陆有丝分裂原(PWM)和破伤风毒素(TT)进行对促有丝分裂应答性的分析。对于促有丝分裂剂刺激，将PBMC以100μl RPMI-FCS内1×105个细胞/孔的密度平铺在96孔圆底板中。将细胞与TT(2LFAU/ml)或PWM(10μg/ml)在37℃，5％CO2下孵育。在空斑形成之后(48-72小时)，往每个孔内加入1μCi的3H-胸腺嘧啶核苷，并将板再孵育16-24个小时。将板收集到过滤包上并在β计数仪(Packard-Coulter，USA)上用液态闪烁法确定出3H-胸腺嘧啶核苷的掺入程度。
I.LHRH-A给药增强了异基因干细胞移植后对促有丝分裂刺激的应答性。对促有丝分裂应答性的分析显示进行LHRH-A治疗的异基因患者在移植后所有的时间点上都比对照具有增强了的对PWM的应答性(图58A)。也就是说，先于干细胞移植用LHRH治疗的患者在所有的时间点上都显示出比对照患者增强了的对PWM刺激的应答性。
在分析对TT的应答性之后，相似的结果是显而易见的(图58B)。LHRH-A治疗的患者在所有的时间点上都比对照患者具有增强了的应答性，除了在移植后12个月。
II.LHRH-A给药增强了自体干细胞移植后对促有丝分裂刺激的应答性。先于干细胞移植用LHRH-A治疗的患者在所研究的大多数时间点上都显示出比对照患者增强了的对PWM刺激的应答性(3个月时的P≤0.001)(图59A)。到了移植后12个月时，LHRH-A所治疗的患者已经将应答性恢复到了治疗前水平，而对照患者仍是相当减低的。
与上述的异基因患者相似(图58B)，当在治疗前给予LHRH-1时，自体移植患者也显示出增强了的对TT的应答。先于干细胞移植用LHRH-A治疗的患者在所研究的大多数时间点上都显示出比对照患者增强了的对TT刺激的应答性(图59B)。到了移植后12个月时，LHRH-A所治疗的患者已经将应答性恢复到了治疗前水平，而对照患者仍是相当减低的。
因为早到移植后第35天就观察到了增加的对促有丝分裂刺激的应答性，这主要是因为已有的T细胞，因为新来源的T细胞仅仅在这个阶段才开始离开胸腺。仅仅在这个时间点后才观察到新来源的胸腺生成的T细胞的影响。
实施例20性类固醇清除增强了造血干细胞移植患者中的植入的速度材料和方法上面描述了用于这些试验的材料和方法。附加的材料和方法如下分析了异基因和自体患者(对照或LHRH-A治疗的)的HSCT后的总WBC和总粒细胞或中性粒细胞数目。在HSCT前3周，用LHRH-A治疗患者。没有接受激动剂的患者作为对照患者。确定出每μl血的总白细胞(WBC)计数、粒细胞(G)或中性粒细胞计数，一直到移植后35天。或用Cell-Dyn 1200自动化细胞计数仪(Abbott)或血细胞计数器重复两次分析全外周血标本。这容许计算出移植后的全白细胞、淋巴细胞和粒细胞数目。从移植后第14到35天起进行对植入的分析。
结果I.先于移植进行LHRH-A治疗的自体干细胞移植患者增强了植入的速度。在移植后第14、28和35天，确定出每μl血的总白细胞(WBC)计数和粒细胞(G)计数。如图60A-D所示，接受LHRH-A治疗的自体患者在移植后第14天显示出比对照显著更高的WBC数目(图60B)(P≤0.05)，其中在这个时间点上，与对照的45％比较，87％显示出粒细胞植入(≥500细胞/μl血)(P≤0.05)。接受LHRH-A治疗的自体患者在移植后第10-12天也显示出比对照显著更高数目的中性粒细胞(图60C，数据被表示为8-20例患者的平均值±1SEM，*P≤0.05)。另外，尽管没有显著差异，LHRH-A治疗的自体患者在整个时间点都比对照组具有更高的淋巴细胞计数(图60D)。这说明LHRH-A治疗显著地增加了干细胞移植后的淋巴细胞水平。
II.先于移植进行LHRH-A治疗的异基因干细胞移植患者增强了植入的速度。如图61A、C和D所示，接受LHRH-A治疗的异基因患者在移植后第14天显示出比对照显著更高的WBC数目(图61A)(P≤0.05)，其中在这个时间点上，与对照的44％比较，64％显示出粒细胞植入(≥500细胞/μl血)。另外，接受LHRH-A治疗的自体患者在移植后第9、12和19天也显示出比对照显著更高数目的中性粒细胞(图61C，数据被表示为8-20例患者的平均值±1SEM，*P≤0.05)。另外，对进行外周血干细胞移植的患者的分析证实当在异基因移植之前用LHRH-A治疗时，有着淋巴细胞计数的显著增加(移植后第10、12、13和17-21天时的P≤0.05)(图61D)。
在异基因和自体移植的模型中，都观察到了LHRH-A治疗患者在移植后第14天的WBC和粒细胞数目要显著地高于对照(图60和61)。这种增强了的植入的速度对于有着预示感染率增加的粒细胞缺乏(≤200中性粒细胞/ml血)的患者的总死亡率是重要的。因此，WBC和粒细胞数目的早期恢复表明了LHRH-A治疗患者的更好的生存率。对性类固醇的抑制增强了完全胸腺再活化或完全胸腺再活化所造成的新T细胞释放之前的植入和重建。
实施例21性类固醇清除在1周内增加了T细胞增殖应答。
进行这些研究以确定小鼠的性类固醇清除是否早到阉割后3到7天就能增强增殖应答。
材料和方法阉割8周大的小鼠，并分析手术3天(图62A、C和E)和7天(图62B、D和F)后的抗CD3/抗CD28所刺激的T细胞增殖应答。用不同浓度的抗CD3刺激以及用恒定浓度10μg/ml的抗CD28共刺激外周(颈部、腋窝、肱骨和腹股沟)淋巴结(图62A和B)、肠系膜淋巴结(图62C和D)、和脾细胞(图62E和F)48个小时。然后用氚化胸腺嘧啶激活细胞18个小时，并将增殖测定为3H-T掺入。对照小鼠为假阉割，n＝4，*P≤0.05(非参数的、非配对的、Mann-Whitney统计检验)。
结果性类固醇清除的小鼠显示在阉割后第3天(图62A、C、和E)和7天(图62B、D和F)就增强了CD28/CD3刺激的T细胞的增殖。在阉割后第3天(10μg/ml抗CD3)和7天(2.5μg/ml和1.25μg/ml抗CD3)从外周LN所分离到的T细胞显示出增殖应答的显著增加。
另外，在阉割后第3天从肠系膜淋巴结(图62C和D)和脾(图62E和F)所分离到的T细胞也显示出抗CD3刺激的增殖的显著增加超过了假阉割小鼠。
早到阉割后第3-7天(先于新T细胞从胸腺迁出)，就有着T细胞对抗CD3和CD28交联刺激的应答性的增加。这些数据提示在胸腺再活化之前，性类固醇清除对外周血T细胞池的功能性具有直接作用。
为了确定LHRH-A对人类患者的外周T细胞的直接作用的程度，进行了研究。将对照患者的T细胞与各种剂量的LHRH-A一起孵育，并在不同的时间点(D3、D7和D14)分析相比较于对照标本(只用培养基)的增殖水平。这容许确定出是否LHRH-A通过引起已有T细胞的活化而直接作用于这些细胞，如在小鼠模型中所观察到的那样。
实施例22性类固醇清除增强了同系HSCT后的造血作用结果I.阉割增强了HSCT后的BM、胸腺和脾的植入。在同系HSCT前1天阉割小鼠。将5×106个Ly5.1+BM细胞静脉内注射到经照射(800Rad)的C57/BL6小鼠中。在移植后的不同时间点(2-6周)分析BM、脾和胸腺(图35)。如图35B所示，在阉割和HSCT后2周，当与假阉割对照比较时，阉割小鼠的BM内有着显著更多的细胞。相似地，如图35C所示，在移植后2、4和6周，阉割小鼠比假阉割对照有着显著增加的胸腺细胞数目。如图35C所示，在外周，阉割受者在移植后4和6周的脾细胞数目也显著地高于对照。
II.阉割增强了同系HSCT后的HSC在BM内的植入。
在同系HSCT前1天阉割小鼠。将5×106个Ly5.1+BM细胞静脉内注射到经照射(800Rad)的C57/BL6小鼠中。在移植2周时，用流式细胞术分析BM的lin-c-kit+sca-1+HSC(图36)。在BMT移植和阉割后2周，在阉割小鼠的BM内比假阉割对照有着显著更多的供者来源的HSC。
III.阉割增强了同系HSCT(2.5×106)后的HSC在BM内的植入。在同系HSCT前1天阉割小鼠。将2.5×106个Ly5.1+BM细胞静脉内注射到经照射(800Rad)的C57/BL6小鼠中。在移植2周时，用流式细胞术分析BM的lin-c-kit+sca-1+HSC(图37A-B)。图37A描述了BM内的普通淋巴祖细胞的百分比。图37B描述了BM内的普通淋巴祖细胞的数目。BMT移植和阉割后2周，阉割小鼠的BM内比假阉割对照显著地增加了供者来源的HSC的比例。
IV.阉割增强了同系HSCT(5×106)后的HSC在BM内的植入。在同系HSCT前1天阉割小鼠。将5×106个Ly5.1+BM细胞静脉内注射到经照射(800Rad)的C57/BL6小鼠中。在移植2周时，用流式细胞术分析BM的lin-c-kit+sca-1+HSC(图37C-D)。图80A描述了BM内的普通淋巴祖细胞的百分比。图37D描述了BM内的普通淋巴祖细胞的数目。BMT移植和阉割后2周，阉割小鼠的BM内比假阉割对照显著地增加了供者来源的HSC的比例。
V.阉割增强了同系HSCT后的供者来源的DC在胸腺内的植入的速度。将5×106个Ly5.1+BM细胞静脉内注射到经照射(800Rad)的C57/BL6小鼠中。在移植2周时，用流式细胞术分析胸腺细胞。供者来源的DC被定义为CD45.1+CD11c+MHC I型+CD11b+或-。在BMT后2周时，与假阉割对照比较，显著地增加了阉割小鼠的胸腺内的供者来源的CD11b+和CD11b-DC(图38)。
VI.阉割增强了同系HSCT后的供者来源的B细胞在脾内的植入的速度。将5×106个Ly5.1+BM细胞静脉内注射到经照射(800Rad)的C57/BL6小鼠中。在移植2周时，用流式细胞术分析脾细胞。在同系BMT后2周时，与假阉割对照比较，在阉割小鼠的脾内有着显著更多的B220+B细胞(图39)。
实施例23LHRH-A治疗有效地耗竭了血清睾酮材料和方法利用125I-睾酮放射免疫测定法(RIA)进行对患者血清中的性类固醇水平的检测。在检测之前，将所有试剂、标本和对照都放在室温。对照管或有单独缓冲液-非特异结合(NSB)管或有0ng/ml标准睾酮(B0)。将单独缓冲液、标准液(0-10ng/ml睾酮)或测试标本加入到每个管中，随后加入性结合球蛋白抑制剂(SBGI)以限制放射性标记的睾酮的非特异性结合。往每个管中加入125I-睾酮，随后加入抗睾酮抗体(除了NSB管外)。然后将管在37℃下孵育2个小时。之后，往所有管中加入第二抗体，涡旋并再孵育60分钟。将管离心(1000gmax)15分钟，去除上清液，在Packard Cobra自动贝塔计数仪上计数沉淀物。平均三次cpm结果并用结合睾酮百分比(B/B0)的公式构建出标准曲线％B/B0＝(标本-NSB)/B0-NSB标本＝特定测试标本的平均cpmNSB＝非特异性结合管的平均cpmB0＝0ng/ml标准液的平均cpm(总结合管)从标准曲线中确定出每个测试标本的睾酮水平。
结果给前列腺癌患者施与LHRH-A造成了阉割水平的血清睾酮。为了确定LHRH-A治疗的有效性，在治疗前和LHRH-A治疗4个月时，分析了所有患者的血清睾酮水平。利用125I-睾酮的放射免疫测定法(RIA)进行分析。在激素治疗之前，血清睾酮的浓度是在1-3ng/ml睾酮(平均值＝2.3ng/ml)的范围之内(图46A)。在治疗4个月时，患者基本上没有可测定到的血清睾酮，提示对性类固醇释放的成功清除。
LHRH-A给药没有影响外周血内的淋巴细胞亚组的百分比。在用LHRH-A治疗4个月后，与治疗前数值比较，没有观察到任何淋巴细胞亚组的比例的任何变化。这些数值都在正常范围内(数据没有显示)。用FACS分析了外周血淋巴细胞的T、B和髓系来源的(NK和巨噬细胞)的比例和细胞数目。在LHRH-A给药后没有观察到任何细胞亚组的比例的任何变化。此外，所有淋巴细胞亚组的比例都在整个年龄组的正常范围内(图84C)；Hannet et al.，1992；Xu et al.，1993。
实施例24在用醋酸戈舍瑞林(Zoladex)对性类固醇的暂时清除后进行自体或异基因干细胞移植患者的胸腺再活化在这个实施例中，在自体或异基因外周血干细胞移植(PBSCT)之前给予醋酸戈舍瑞林(Zoladex)。主要终点是如体外检测所测定的胸腺再活化。患者在移植后随诊6个月。20例患者(10例异基因移植和10例自体移植)将进入研究。这个实施例探讨了在LHRH水平抑制性类固醇产生的作用，利用LHRH的激动剂脱敏垂体并因此阻止了LH和FSH的释放。反过来，这造成了性腺的雄激素和雌激素产生的阻断，这就去除了对胸腺功能的抑制作用。在这个试验中所检测的组是进行大剂量化放疗(HDT)和PBSCT的患者。
醋酸戈舍瑞林(Zoladex)是一种LHRH的有效的、合成的十肽类似物。当急性给药时，醋酸戈舍瑞林将从垂体中释放出LH。但是，在慢性给药后，醋酸戈舍瑞林是一种促性激素激素产生的有效的抑制剂，造成了性腺抑制以及最终造成了性器官退化。在动物和人类中，在对垂体的最初刺激、LH分泌和血清睾酮的短暂提高之后，慢性给药造成了对促性腺激素分泌的抑制。结果是发生在最初治疗的近3周之内的对垂体LH的持续抑制以及男性中的血清睾酮水平减少到了如在手术阉割男性中正常所看到的范围。然后保持这种抑制与持续治疗一样长的时间。
患者是男性或女性，年龄大于等于18岁，因恶性疾病或BM衰竭进行了大剂量治疗(HDT)和PBSCT。10.8mg Zoladex的植入物剂型(男性用)被分散在生物可降解的和生物兼容的聚乙酸乳酸聚酯的圆柱形棒内，在皮下注射后持续释放超过12周。3.6mg植入物(女性用)被分散在生物可降解的和生物兼容的聚乙酸乳酸聚酯的圆柱形杆内并在皮下注射后持续释放超过28天。植入物是商品化的，置于用专用目的设计的带有14-16号针头的给样器内。
血液中的性类固醇减少到最小值可能要花费数周。因此，在PBSC输注(第0天)前21天，给患者注射LHRH激动剂Zoladex(植入物)形式的性类固醇清除治疗。对于男性，在第-21天给予单一剂量的10.8mg戈舍瑞林(有效3个月)以及在第63天再次注射3.6mg(有效28天)。对于女性，在第-21天、第7、35和63天施与3.6mg(有效28天)。这对于减少性类固醇水平到足以再活化胸腺的水平应当是有效的(预计在PBSCT后4个月)。因此，在这个实施例中，仅仅给予4-6个月的治疗。本领域人员容易确定出可被接受的其他剂量。
在第0天输注PBPC。再活化的胸腺摄取所输注的前体细胞并将它们转化为新的T淋巴细胞和上皮胸腺细胞。最大的性类固醇“清除”是在PBSCT输注的时候，因此所输注的PBSC能有助于胸腺重建。预计在PBSCT后3-4周内，最初的新的T细胞将出现在血流中，但是治疗应当在PBSCT后维持3个月以容许免疫系统的完全正常化。
通过流式细胞术、体外T细胞应答和TREC的产生对T细胞的评价确定出胸腺功能。
在开始研究之前，进行了常规的HDT前的调查，记录基础的FBE、电解质和LFT。其他治疗前分析包括血清HCG(女性)、胸腺CT、骨密度研究、蛋白电泳和免疫电泳、激素研究TFT、FSH、LH、雌激素、孕激素、睾酮。另外，进行了各种基线的T细胞检测。从50ml血液中纯化出白细胞，并如下检测(a)流式细胞术原初T细胞对记忆T细胞CD27-FITC、CD45RA-PE、CD45RO-PerCP、CD4-或CD8-APCCD27-FITC、CD45RO-PerCP、CD4/CD8-APC、Ki-67-PECD62L、CD45RO-PerCP、CD 103、CD4/CD8-APCT细胞亚组CD4-FTTC、CD8-APC、αβTCR-PE、γ6TCR-B/S-PerCPCD25-PE、CD69-CyChrome、CD4-FITC、CD8-APCCD28-CyChrome、αβTCR-PE、CD4-FITC、CD8-APCB细胞/髓系细胞CD19-FITC、CD3-PerCP、CD56-PE、CD34-APCCD11b-CyChrome、CD11c-PE、CD4-FITC、CD8-FITC
细胞因子IL-4-PE、IFNγ-APC、CD4-FITC、CD8其他标记物CD11a、CD95、HLA-DR、CD2、CD5所有患者都作为内对照，因为在治疗前和后都检查他们。染色特异性对照将包括FITC/PE/APC等的同型物对照，并在染色前阻断FcR。
(b)T细胞功能将体外检查血淋巴细胞的对CD3交联的应答的能力。
(c)TREC分析分离并探查原初T细胞的T细胞受体删除环的存在，它是因为上述的TCR基因重排所形成的。它们的存在是胸腺输出的非常强的提示(因为这是主流的T细胞产生的唯一来源)。因为细胞分裂与TCR基因的重排后的胸腺发育相关，TREC水平可能低估了胸腺的迁出(实际水平的约10％)。
在此一同并入参考在上面说明书中所提及的所有文献。只要不脱离发明的范围和精神，对所述的本发明的方法和系统的各种修饰和变异对于本领域人员是显而易见的。尽管已经结合特殊优选的实施方式描述了发明，但应当明白所要求的发明不应当被过度地限制于这些特殊的实施方式。事实上，对生物学或相关领域的人员显而易见的是对所述的实施发明的方式的各种修饰都在下面的权利要求书的范围内。
实施例25阉割诱导了对异基因移植物的耐受性下面的小鼠购自Jackson Laboratory(Bar Harbor，ME)，并在常规条件下饲养C57BL/6J(黑色，H-2b)；DBA/1J(浅褐色，H-2q)；DBA/2J(浅褐色，H-2d)；和Balb/cJ(白化色，H-2d)。年龄范围从4-6周到26个月大，并在相关处有所说明。
C57BL/6J小鼠被用作为供者BM重建的受者。如上所述，受者小鼠(年龄大于9个月的C57BL/6J，因为这是胸腺开始显著萎缩的年龄)在3个小时的间隔内接受了两次5.5Gy的照射。在第二次照射剂量后1个小时，给受者小鼠静脉内注射5×106个来自DBA/1J、DBA/2J、或Balb/cJ小鼠的供者BM细胞。通过将RPMI-1640培养基流经供者(2个月大的DBA/1J、DBA/2J、或Balb/cJ)小鼠的胫骨和股骨得到BM细胞，然后富集在培养基中所收集到的细胞。
如上所述，与重建同时或直到重建前1周的时候阉割受者小鼠，与假阉割(ShCx)对照小鼠比较，阉割小鼠有着胸腺再活化率的显著增加。另外，当与假阉割小鼠比较时，在BMT之后，发现阉割小鼠有着增加的胸腺细胞密度，在它们的骨髓内有着更多的细胞、以及已经增强了它们的BM中的B细胞前体和B细胞的产生。因为受者小鼠的MHC(即，小鼠的H-2位点)不同于供者小鼠，与假阉割小鼠比较，在阉割小鼠中检测到增加数目的供者来源的血细胞是直截了当的。在嵌合体的胸腺内也有着宿主和供者来源的DC的正常的水平和分布，它对宿主和供者施加了阴性选择(耐受性诱导)。
在用供者BM细胞重建受者小鼠的4到6周之后，根据标准方法(见，例如，Current Protocols InImmunology.John E.Coligan et al.，(eds)，Wileyand Sons，New York，NY(1994)，和每年更新版本包括2002年)从受者小鼠中取得皮肤移植物并放置到受者小鼠上。简单地，去除麻醉的受者小鼠(例如，用Balb/cJ BM重建的C57BL/6J小鼠)的真皮和表皮，并用来自Balb/cJ的真皮和表皮取代。因为供者皮肤的毛是白色的，这与受者C57BL/6J小鼠的天然的黑色毛是容易区分的。在手术后每日评价所移植的供者皮肤的健康情况。
结果显示移植到已经被阉割的供者重建的C57BL/6J小鼠上的供者Balb/cJ皮肤比移植到被假阉割的供者重建的C57BL/6J小鼠上的供者皮肤被接收(及被接受)得更好，例如因为假阉割小鼠没有足够多的供者HSC被摄取到宿主胸腺内以产生DC。在没有被Balb/cJ BM重建的假阉割的C57BL/6J小鼠受者上发现没有接收供者的皮肤移植物。
也进行了一项试验以确定用供者BM所移植的受者小鼠是否能诱导对MHC匹配的但仍有不同的皮肤移植物的耐受性。简单地，将雄性C57BL/6J小鼠(H-2b)阉割或假阉割。在第二天，如上所述的用Balb/cJBM(H-2d)重建小鼠。在重建后4周时，将两种皮肤移植物(即包括真皮和表皮)放置到受者C57BL/6J小鼠中。第一个皮肤移植物是来自DBA/2J(浅褐色，H-2d)小鼠。第二个皮肤移植物是来自Balb/cJ(白化色；H-2d)小鼠。因为C57BL/6J小鼠、Balb/cJ小鼠和DBA/2J小鼠的表面颜色都不同，彼此的皮肤移植物和受者小鼠的皮肤都是容易区分的。
如上所述，发现Balb/cJ BM重建的阉割受者小鼠能比Balb/cJ BM重建的假阉割受者小鼠或已经被假阉割以及还没有用供者BM重建的受者小鼠更好地“接收”来自Balb/cJ小鼠的皮肤移植物。另外，发现Balb/cJBM重建的阉割受者小鼠能比Balb/cJ BM重建的假阉割受者小鼠或已经被假阉割以及还没有用供者BM重建的受者小鼠更好地“接收”来自DBA/2J小鼠的皮肤移植物。
实施例26阉割对胸腺切除小鼠的BM和脾的作用进行这些预试验是为了确定阉割作用在胸腺切除的患者(小鼠)中是否是明显的。结果说明对性类固醇信号途径的阻断对免疫系统(例如BM和胸腺内的免疫细胞)具有直接或间接的作用，无论是否存在再生的胸腺。
材料和方法利用本领域已知的常规方法将小鼠阉割和胸腺切除。小鼠被分到下面的组中未治疗(即天然的、“未治疗的”)、假阉割(“sham-cx”)、和阉割(“cx”)，以及这三组的每一组都被胸腺切除(“tx”)或假胸腺切除(“shtx”)，总共有6个被分析的组。在骨髓清除和BMT(见上面的方法)后2周和4周时，分析6组中的每一组。
结果I.胸腺切除没有影响性类固醇抑制对BM的作用如图64A所示，在BMT后4周时，Tx/Cx小鼠具有增加了数目的BM普通淋巴祖细胞(CLP)，该数目与ShTx/Cx小鼠的相当。
如图64B所示，在BMT后4周时，Tx/Cx小鼠具有增加了总数目的BM B细胞，该数目与ShTx/Cx小鼠相当。与ShamCx/Tx或ShamCx/ShTx对照比较，Tx/Cx小鼠和ShTx/Cx小鼠小鼠也具有增加了数目的BM B细胞。
如图64C所示，在BMT后4周时，Tx/Cx小鼠也具有增加了总数目的BM未成熟B细胞，该数目与ShTx/Cx小鼠相当。与ShamCx/Tx或ShamCx/ShTx对照比较，Tx/Cx小鼠和ShTx/Cx小鼠小鼠也具有增加了数目的BM未成熟B细胞。
因此，图64A-C的结果支持这样的结论，就是阉割对增加BM细胞的数目和功能性包括增加植入的作用不需要再活化的胸腺，取而代之的是因为对BM和免疫系统的其他细胞的直接作用。
II.胸腺切除不影响性类固醇抑制对脾的作用如图64D所示，在BMT后4周时，Tx/Cx小鼠也表现出具有脾的细胞总数的增加，这与ShTx/Cx小鼠相当。当与ShamCx/Tx或ShamCx/ShTx小鼠比较时，Tx/Cx小鼠和ShTx/Cx小鼠也具有增加了总数目的脾细胞。
如图64E所示，在BMT后4周时，Tx/Cx小鼠也表现出脾的B细胞总数的增加，这与ShTx/Cx小鼠相当。与ShamCx/Tx或ShamCx/ShTx对照比较，Tx/Cx小鼠和ShTx/Cx小鼠小鼠也具有增加了数目的脾的B细胞。
因此，图64D-E的结果支持这样的结论，就是阉割对增加脾的免疫细胞的数目和功能性包括增强重建的作用不需要再活化的胸腺，取而代之的是因为对BM和免疫系统的其他细胞的直接作用。
在此一同并入参考在上面说明书中所提及的所有文献。只要不脱离发明的范围和精神，对所述的本发明的方法和系统的各种修饰和变异对于本领域人员是显而易见的。尽管已经结合具体优选的实施方式描述了发明，但应当明白所要求的发明不应当被过度地限制于这些特殊的实施方式。事实上，对生物学或相关领域的人员显而易见的是对所述的实施发明的方式的各种修饰都在下面的权利要求书的范围内。
本领域人员利用常规试验将认识到、或能确定出多种与在此所特异描述的特异的实施方式相等价的实施方案。这些等价方案包含在下面的权利要求书的范围内。
权利要求
1.一种用于诱导患者的耐受性的方法，所述方法包括耗竭患者的免疫细胞；阻断患者的性类固醇介导的信号途径；和给患者施用来自供者的细胞，其中所述细胞选自由干细胞、祖细胞、及其组合所组成的组，其中诱导患者对供者移植物的耐受性。
2.一种用于诱导患者的耐受性的方法，所述方法包括耗竭患者的免疫细胞；阻断患者的性类固醇介导的信号途径，其中患者骨髓的功能性或在没有患者胸腺再活化的情况下、或先于患者胸腺再活化、或在患者胸腺再活化的同时被增强；和给患者施用来自供者的细胞，其中所述细胞选自由干细胞、祖细胞、及其组合所组成的组，其中诱导患者的耐受性。
3.一种用于诱导患者的耐受性的方法，所述方法包括耗竭患者的免疫细胞；阻断患者的性类固醇介导的信号途径；给患者施用来自供者的细胞，其中所述细胞选自由干细胞、祖细胞、及其组合所组成的组；和容许供者细胞在患者骨髓的植入，其中供者细胞的植入或在没有胸腺再活化的情况下、或先于胸腺再活化、或在胸腺再活化的同时被增强，其中诱导患者的耐受性。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中患者的胸腺已经至少部分萎缩。
5.权利要求4的方法，其中患者患有至少部分导致患者胸腺萎缩的疾病。
6.权利要求4的方法，其中患者已经接受了对疾病的治疗，所述治疗至少部分导致患者胸腺萎缩。
7.权利要求5的方法，其中所述对疾病的治疗是免疫抑制、化疗或放射治疗。
8.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述干细胞选自由造血干细胞、上皮干细胞、及其组合所组成的组。
9.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述祖细胞选自由淋巴祖细胞、髓系祖细胞、及其组合所组成的组。
10.权利要求8的方法，其中所述细胞是造血干细胞。
11.权利要求10的方法，其中所述造血干细胞是CD34+的。
12.权利要求1或2的方法，其中在开始对性类固醇介导的信号途径进行阻断时施用所述细胞。
13.权利要求1-3中任一项的方法，还包括给患者施用至少一种细胞因子、或至少一种生长因子、或至少一种细胞因子和至少一种生长因子的组合。
14.权利要求13的方法，其中细胞因子选自由白介素2(IL-2)、白介素7(IL-7)、白介素15(IL-15)、干细胞因子(SCF)、及其组合所组成的组。
15.权利要求13的方法，其中生长因子选自由上皮生长因子家族的成员、成纤维细胞生长因子家族的成员、干细胞因子、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、角化细胞生长因子(KGF)、及其组合所组成的组。
16.权利要求1-3中任一项的方法，其中通过阉割阻断性类固醇介导的信号途径。
17.权利要求16的方法，其中通过手术阉割阻断生类固醇介导的信号途径。
18.权利要求16的方法，其中通过化学阉割阻断性类固醇介导的信号途径。
19.权利要求18的方法，其中通过施用一或多种药物阻断生类固醇介导的信号途径。
20.权利要求19的方法，其中一或多种药物选自由LHRH激动剂、LHRH拮抗剂、抗LHRH疫苗、抗雄激素、抗雌激素、SERM、SARM、SPRM、ERD、芳香酶抑制剂、肾上腺阻滞剂、醛固酮拮抗剂、抗孕激素、黄体酮、抗黄体酮、及其组合所组成的组。
21.权利要求20的方法，其中LHRH激动剂选自由氟他胺、戈舍瑞林、亮丙利德、Dioxalan衍生物、曲普瑞林、美替瑞林、布舍瑞林、组氨瑞林、那法瑞林、黄体瑞林、亮丙瑞林、地洛瑞林、Cystorelin、Decapeptyl、戈那瑞林、和上述各项的醋酸盐、柠檬酸盐和其他的盐、及其组合所组成的组。
22.权利要求20的方法，其中LHRH拮抗剂选自由阿巴瑞克、西曲瑞克、及其组合所组成的组。
23.权利要求20的方法，其中抗雄激素选自由比卡鲁胺、醋酸环丙孕酮、利阿唑、酮康唑、氟他胺、醋酸甲地孕酮、度他雄胺、非那雄胺、及其组合所组成的组。
24.权利要求20的方法，其中抗雌激素选自由阿那曲唑、氟维司群、他莫昔芬、氯米芬、氟维司群、己烯雌酚、己烯雌酚二磷酸盐、达那唑、屈洛昔芬、吲哚昔芬、托瑞米芬、Raloxofene、及其组合所组成的组。
25.权利要求20的方法，其中肾上腺阻滞剂选自由氨鲁米特、福美坦、Vorazole、依西美坦、阿那曲唑、来曲唑和依西美坦所组成的组。
26.权利要求1-3中任一项的方法，其中诱导对供者移植物的耐受性。
27.权利要求26的方法，其中所述供者移植物选自由供者的细胞、供者的组织或供者的器官、或其组合所组成的组。
全文摘要
本发明提供了通过阻断患者的性类固醇信号途径用于诱导受者对未匹配的器官、组织和/或细胞移植物的耐受性的方法，其中或在没有胸腺再活化的情况下、或先于胸腺再活化、或在胸腺再活化的同时，提高骨髓和其他免疫细胞的功能性。在一些实施方式中，通过施用LHRH激动剂、LHRH拮抗剂、抗LHRH受体抗体、抗LHRH疫苗、抗雄激素、抗雌激素、选择性雌激素受体调控物(SERM)、选择性雄激素受体调控物(SARM)、选择性孕酮应答调控物(SPRM)、ERD、芳香酶抑制剂或它们的各种组合中断或清除了患者的性类固醇信号途径。
文档编号C12N5/00GK1809277SQ200480017199
公开日2006年7月26日 申请日期2004年4月19日 优先权日2003年4月18日
发明者加布丽埃勒·莉安妮·戈德堡, 杰恩·苏珊尼·萨瑟兰, 安·帕特里夏·希德盖伊, 理查德·博伊德 申请人:诺伍德免疫学有限公司