专利名称：人类免疫缺陷病毒膜分子gp120功能域与人TGF-β1的重组分子的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种基因重组及表达的促Treg化蛋白及其制备方法和应用。
背景技术：
近年来免疫耐受研究中，⑶4+⑶25+调控T细胞(Treg)倍受关注。Treg细胞是一种免疫调节细胞，和其他调节细胞一起，在反馈性调节中居核心地位。不少学者研究发现 Treg在遏抑自身免疫病、过敏症和诱导移植耐受中发挥重要作用。但并非CD4+CD25+T细胞均为调节性T细胞，F0Xp3(f0rWiead box P3)转录因子阳性者有此功能。Treg细胞在T细胞中所占比例很低，胸腺中占5%左右，外周占5-10%。可喜的是，目前研究发现⑶4+⑶25-T 细胞可在一定条件下诱导转化成Treg细胞。利用转基因技术转入R)xp3基因证明，改变 CD4+CD25-naive T细胞R)xp3基因的转录水平，可转化为Treg细胞，并具有天然Treg细胞的功能。还有学者用细胞因子作用于⑶4+⑶25-naive T细胞，也发生了转化，转化细胞同样具有相应功能。天然Treg细胞具有免疫无能性和免疫抑制性两大功能，故在先天和后天免疫系统的协同调节中起特殊作用，可抑制性调节CD4+T细胞或CD8+T细胞活化与增殖； 抑制初始T细胞和记忆性T细胞的增殖。而现有免疫抑制剂的研制主要集中在如何抑制T 细胞的活化与增殖。T细胞在移植排斥中起主导作用，干预T细胞的活化与增殖，可有效控制移植排斥反应。虽然降低了 aGVHD的发生率，致移植物和患者的长期与近期存活率都有所提高，但仍存在不容忽视的缺点(1)长期甚至终生服药；( 药物作用的低或无特异性。 这些药物对静息和活化免疫细胞的作用没有选择性，长期使用势必导致受者机体免疫力降低，无法抵抗移植后感染，也容易导致恶性肿瘤的发生；C3)药物具有明显的毒副作用。长期使用，出现药物的毒性作用，加速移植物失功，影响受者生存质量，移植物长期存活率的显著提高比较困难。因此，利用Treg细胞预防和治疗移植排斥和GVHD是一种更有效、更安全的新型免疫治疗策略。实现这一策略的可能途径之一是构建特异性识别CD4+T细胞同时启动R)xp3的重组分子。人工构建由不同蛋白质结构域组成的蛋白质机器(Engineered Multi-domain ProteinMachine)是二十一世纪分子生物学领域最激动人心的前沿工作之一。根据抗原与抗体，细胞因子、生长因子和激素与受体等相互识别原理，将对细胞有杀伤作用的分子与抗体或相关因子连接，构建的蛋白质机器具有细胞的选择性清除功能。利用蛋白质机器原理， 人工构建的促⑶4+⑶25-naive T细胞转化为Treg细胞的重组分子由导向片段和功能片段两部分构成，其中间通过一段柔性linker连接。导向片段识别细胞表面分子，重组分子特异性的高低直接取决于被导向片段识别的分子在细胞表面的特异性程度。能够特异性的识别并结合⑶4的分子主要有⑶4单克隆抗体、⑶4单链抗体(Single Chain fragment variable, scFv)、CD4 双价单链抗体(disulfide stabilize Fvs, dsFv)、人类免疫缺陷病毒(HIV)的被膜蛋白gpl20。单克隆抗体能特异性识别肿瘤相关抗原及细胞表面特异性抗原，因而是应用最广的免疫毒素导向片段，但是完整的抗体(主要是非人源抗体)分子量大，穿透力弱，免疫原性强，又限制了临床应用。理论上单链抗体(Single Chain fragment variable, scFv)和双价单链抗体(disulfide stabilize Fvs，dsFv)，这类抗体分子量小， 穿透力强，避免了 Fc段引起的非特异性细胞毒性及免疫原性，是目前认为最理想的导向片段。但是由于膜分子⑶4存在很大变异，制备工艺复杂。而gpl20分子也能特异性的识别并结合CD4分子。有研究发现gpl20不仅可以特异性识别并结合CD4分子，而且可在体外及体内活化iTreg细胞。gpl20刺激Treg细胞后可使cAMP在胞浆内聚集。而抑制内源性 cAMP合成可阻止gpl20活化1Treg细胞。gpl20的耐受效应依赖于Treg细胞的存在及通过 gpl20介导的活化使cAMP的上调。在异种移植引起的GVHD模型中，单次剂量的gpl20即可抑制致死性GVHD，实验还发现通过刺激CD4受体使T细胞受体依赖的Treg活化通路激活从而诱导体内免疫耐受。但gpl20分子较大，存在免疫原性高等缺点。gpl20由恒定区和高变区组成V1 V5区段为高变区，位于gpl20表面，Cl C5区为稳定区，主要位于gpl20核心区域。gpl20的第4恒定区(C4)是gpl20与⑶4结合的主要区域，V3区对HIV侵入有重要的辅助作用，此外，gpl20的第2恒定区(C2)，第3恒定区(C3)，第4高变区(V4)也有一定的辅助作用。因此选择HIV gpl20分子的C2-C4区作为靶向片段，不仅保留了 gpl20与 CD4结合的功能以及在Treg细胞活化中的作用，而且小片段相对容易制备，免疫原性较低。TGF- β 1、IL-2 及 PGE2 等均能诱导 CD4+CD25-Treg 转化为 CD4+CD25+Treg 细胞， 其中TGF-β受到广泛关注。TGF-βΙ与Treg对于控制自身免疫反应和维持机体免疫耐受状态有着非常重要的作用。体内外的研究已经证实TGF-β 1的表达与Treg细胞的增殖分化密切相关。在胰岛给与短暂的TGF- β 1脉冲，能够刺激该处的CD4+CD25+T细胞增殖和阻止⑶8+Τ细胞介导的I型糖尿病的进展。在外周淋巴器官，过表达TGF-β 1能够增加外周 ⑶4+⑶25+Τ细胞和R)Xp3表达，阻断T细胞TGF- β 1信号通路则相反，说明TGF- β 1对调节外周CD4+CD25+T细胞池和R)xp3表达有重要作用。Chen等用TGF- β 1和TCR共刺激首次在体外成功将初始CD4+CD25-T细胞转化为R)xp3+CD4+CD25+Treg细胞。初始CD4+CD25-T 细胞感染表达1^即3基因逆转录病毒后转化为⑶4+⑶25+Treg，可进一步抑制未被感染的 CD4+CD25-Treg的增殖。研究发现TGF- β 1诱导初始CD4+CD25-T细胞转化iTreg可能是通过其信号通路启动细胞核你即3基因的表达，且TGF-β 1和IL-2在诱导iTreg产生中扮演关键的角色，为大量获得有功能的Treg提供新的途径。
发明内容
本发明的目的是提供一种促Treg化重组蛋白，该重组蛋白主要由靶向片段和功能片两部分构成。靶向片段可以是⑶4单克隆抗体、⑶4单链抗体(Single Chain fragment variable, scFv)、CD4 双价单链抗体(disulfide stabilize Fvs, dsFv)、人类免疫缺陷病毒(HIV)的被膜蛋白gpl20，本发明优选可以特异性识别并结合⑶4分子的gpl20的C2-C4 片段。功能片段可以是TGF-βl、IL-2及PGE2，本发明优选hTGF-βl。C2-C4片段可以直接以C末端与hTGF- β 1的N末端相连构成融合蛋白，也可以在两者之间增加一个连接肽(linker)，以构成融合蛋白C2-C4-linker-hTGF-β 1，连接肽长度可为2-100，常用的是 10-50个氨基酸，优选的是14-30个氨基酸。连接短肽可以使C2-C4片段和hTGF-β 1之间有更大的变化空间并有更好的柔韧性或刚性，或因更大的变化空间使C2-C4片段与受体的结合更容易些。连接肽的结构可为(G4S)3 4。连接肽的加入可能使融合蛋白在作为药物的使用时产生额外的免疫原性，最优选的是没有连接肽。其氨基酸序列如SEQ ID N0:1所 示。
本发明提供编码重组蛋白C2-C4-linker-hTGF-i3 1的核酸序列，优选如SEQ ID NO :2所示本发明还提供包含C2-C4-linker-hTGF-i3 1重组蛋白分子核酸序列的载体和宿主菌。本发明进一步提供制备C2-C4-linker-hTGF-i3 1重组蛋白分子的方法，包括制备hmTGF-β 1 和 C2-C4-Linker DNA片段，构建C2-C4-Linker_hmTGF-β 1 重组分子原核表达载体，表达重组蛋白 C2-C4-Linker-hmTGF-0 1，纯化重组蛋白 C2-C4-Linker_hmTGF-β 1。本发明获得的蛋白可用于1)与HIV竞争性结合⑶4，预防HIV感染；2)增加体内Treg细胞数量，增强Treg功能，用于治疗自身免疫性疾病、移植物抗宿主病等免疫介导的相关疾病；3)抑制肿瘤细胞增殖并可诱导凋亡，用于防治肿瘤。相对于现有技术，本发明的重组蛋白分子C2-C4-linker-hTGF-i3 1及其原核表达系统具有以下特点1、重细分子由两部分组成靶向片段和功能片段；2、gpl20 C2-C4区特异性结合⑶4分子，具有靶向特异性，提高重组分子的转化效率；3、人成熟16 -3 1(^^^_3 1)为功能片段，作用于初始CD4+CD25-T细胞促其Treg 化；4、gpl2 0C2-C4与CD4结合后，可活化体内静止的CD4+CD25-T细胞，增强其抑制功能，因此，C2-C4又可加强已获Treg化细胞功能，是一个双重作用分子；5、构建重组分子的原核表达系统，采用了原核表达系统，并融合6个HIS标签，蛋白以包涵体形式表达，具有蛋白表达量高、纯度高、易于纯化回收等优点。
图 1. C2-C4-Linker PCR 结果M IOObp markerLanel 近 55Obp 处见 C2_C4-Linker 条带图 2. RT-PCR 扩增 hmTGF- β 1Lane 1-2 :350bp 处见一较亮 hmTGF- β 1 条带图 3.质粒 pCR2. 1-hmTGF- β 1 构建鉴定M IOObp marker ；lane 1 质粒 pCR2. 1-hmTGF-β 1 ； lane2_3 =Apal 单酶切鉴定图 4.质粒 pCR2. l-C2-C4_Linker 构建鉴定M IOObp marker ；lane 1 质粒 pCR2. l-C2-C4_Linker ；Lane 2-3 =BamHI和Sail双酶切质粒，约550bp见一条带图5.重组分子原核表达质粒pET-C2-C4-L_hmTGF- β 1构建鉴定
M IOObp marker ；lanel =BamHI 酶切鉴定质粒，约 700bp 处见一条带；lane2 质粒 pET-C2-C4-L-hmTGF-β 1图6. western-blot检测特异性表达条带lane 1 诱导6h后；lane 2 诱导6h后离心上清；lane 3 包涵体溶解液图7.蛋白ρ C2-C4-L-hmTGF-β 1的诱导表达和纯化M 蛋白marker ；lanel 诱导前对照；lane 2 诱导6h后；lane 3 诱导6h后离心上清；lane 4 包涵体溶解液；lane 5 纯化后图8不同时间点、不同重组蛋白浓度400倍显微镜下细胞状态和细胞数量的变化图9不同蛋白浓度、不同时间点MTT法比较细胞增值率的变化
具体实施例方式现结合以下实施例更加详细的描述本发明的C2-C4-Linker-hmTGF-i3 1重组蛋白及其制备方法和应用。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook等人所著《分子克隆实验室手册》(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中的条件进行操作，或按照制造厂商所建议的条件进行。实施例一hmTGF-β 1 和 C2-C4_Linker DNA 片段的获取1. C2-C4-Linker DNA 片段分离中国流行株HIV-I感染患者外周血单个核细胞，Trizol (购自invitrogen) 法提取总RNA，用逆转录酶superscript 111(购自invitrogen)逆转录获得cDNA，以 cDNA模板，特异性引物指导下PCR扩增C2-C4区DNA片段。特异性引物(上海英骏合成)上游引物5，-CGCAGGATCCTCTGTCAATTTCACGG-3，引入内切酶BamHI位点；下游引物 5，-ACGCGTCGACATACATTGCTTTTCCT-3，引入内切酶 Mil 位点。反应条件98°C预变性 3min， 98°C 30s，50°C 30s，72°C 60s，共30个循环，最后72°C延伸lOmin。凝胶回收试剂盒(购自上海捷瑞)纯化回收目的基因C2-C4，BamHI和MlI双酶切后亚克隆至原核表达载体 pET28a(+)(购自 Merck 公司)，命名 pET28a_C2_C4。以 pET28a_C2_C4 原核质粒为 PCR 模版，设计特异性引物上游引物5’ AGGGATCCTCTGCCAATTTCAC 3，(划线部分为引入BamHI 限制性内切酶位点)；下游引物5，AGTCGACCGATCCGCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCT CCACCATACATTGCTTTTCCTAC 3，(划线部分为引入Mil限制性内切酶位点，框内为引入的 Linker片段)。PCR扩增C2-C4_Linker DNA片段，反应条件94°C预变性3min，以94°C 变性30s，53°C退火30s，72°C延伸Imin为一个循环，共；35个循环，72°C延伸IOmin0 1. 5% 琼脂糖凝胶鉴定和回收PCR产物。结果见图1，说明成功在C2-C4 3’端引入Linker，回收纯化 C2-C4-Linker。2. RT-PCR 扩增目的基因 hmTGF- β 1设计特异性引物上游引物5’AGTCGACGCCCTGGACACCAACTATT 3，(划线部分为引入Mil限制性内切酶位点)；下游引物5’ TCTCGAGGCTACACTTGCAGGAGCGC3，(划线部分为引入BioI限制性内切酶位点)。取人新鲜外周血10ml，人淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离单个核细胞，按 Trizol (英骏公司)说明书步骤提取总RNA，以提取的总RNA为模板，M-MLV试剂盒步骤逆转录获得hmTGF- β 1的cDNA。以获得的cDNA为模板，使用phusion高保真DNA聚合酶，特异性引物PCR扩增hmTGF-β 1基因，反应条件98°C预变性3min，以98°C变性30s，64 °C退火30s，72°C延伸Imin为一个循环，共35个循环，72°C延伸lOmin。2%琼脂糖凝胶电泳鉴定和回收PCR产物。结果见图2，说明成功扩增hmTGF-β 1，回收纯化hmTGF-β 1。实施例二 hmTGF- β 1和C2-C4_Linker克隆质粒的构建和鉴定phusion高保真DNA聚合酶和pfx Tag DNA聚合酶均为平末端克隆，使用普通 Tag DNA聚合酶在hmTGF-β 1和C2-C4_Linker PCR产物末端加A后，用T4 DNA连接酶连接至pCR2. I-T克隆载体，转化感受态细胞DH5 α，经蓝白筛选挑取阳性单克隆菌株于 LB培养基(含50mg/ml氨苄青)，37°C培养16_18h，小量提取质粒酶切鉴定。构建质粒分别命名为 pCR2. 1-hmTGF-β 1、pCR2. l-C2-C4_Linker。选 T 载体和 hmTGF-β 1 序列中均有的Apal限制性内切酶位点单酶切鉴定pCR2. 1-hmTGF-β 1，BamHI和Mil双酶切鉴定 PCR2. 1-C2-C4-Linker0结果分别见图3和图4，说明载体构建成功，为方便构建重组分子奠定基石出。实施例三C2-C4-Linker-hmTGF-i3 1重组分子原核表达载体的构建和鉴定BamHI 禾Π Sail 双酶切质粒 pCR2. l-C2-C4_Linker，回收目的 DNA 片段 C2-C4-Linker，SalI 和 XhoI 双酶切质粒 pCR2. 1-hmTGF- β 1，回收目的 DNA 片段 hmTGF-β 1， BamHl和BioI双酶切线性化原核表达载体pET48a，T4 DNA连接酶连接C2-C4_Linker和 hmTGF- β 1至pETj8a，转化BL21 (DE3)感受态细胞，涂布LB同体培养基(含25mg/ml卡那霉素)平板于37°C培养16h，挑取单克隆菌落于LB培养基(含25mg/ml卡那霉素)，37°C摇床剧烈摇菌培养16-18h，小量提取质粒，命名为pET-C2-C4-L-hmTGF-i3 1，BamHI酶切鉴定重组质粒pET-C2-C4-L-hmTGF-i3 1，1. 5%琼脂糖凝胶电泳示在约700bp处见一条带(见图 5)，与预期结果相符。鉴定正确者进行测序。实施例四重组分子蛋白的诱导表达和鉴定接种保存的测序正确菌种pET-C2-C4-L-hmTGF- β 1 (BL21 (DE3))于 IOml LB 培养基(含25mg/ml卡那霉素)，37°C摇床150rpm过夜震荡培养，次日按1 100接种于 500ml LB培养基(含25mg/ml卡那霉素)，37°C摇床剧烈摇菌监测0D600至0. 5-0. 6时，收集Iml菌液为两导前对照，加诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度0. lmmol/L，诱导表达后收集菌体，按20ml/g菌体加入裂解缓冲液(300mmol NaCl,50mmol Tris-HCL, pH8. 0)，超声波破碎菌体(6mm变幅杆，400W，工作5S，停5S，8min为一个循环，共4个循环)，12000gX20min、4°C离心，收集上清和沉淀，十二烷基硫酸钠_聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)和用小鼠抗6XHis单克隆抗体western-blot鉴定蛋白是否表达及表达形式， 将表达蛋白命名为pC2-C4-L-hmTGF- β 1。结果见图6。实施例五蛋白ρ C2-C4-L-hmTGF-β 1的纯化pET28a原核表达载体在表达蛋白后融合6XHis标签，可通过亲和层析纯化目标蛋白。按上述方法获得包涵体，按20ml/g菌体加入包涵体洗涤液((2M尿素，2% Triton， 300mmol NaCl, IOOnmolPMSF, 50mmol Tris-HCL, pH8. 0)重悬沉淀洗涤包涵体 3-4 次，彻底去除菌体残渣和内毒素，1200(^乂201^11、41离心去上清，按151111/^包涵体加入包涵体溶解液(8M 尿素，300mmol NaCl，IOOnmolPMSF, 50mmol Tris-HCL, pH8. 0)，室温震荡溶解 4h, 12000gX20min、4°C离心去除不溶沉淀。以Ni-NTAOliagen)凝胶亲和层析方法纯化蛋白ρ C2-C4-L-hmTGF-β 1
平衡液1 (8M 尿素，300mmol NaCl, 50mM Tris-HCL,pH8. 0) 10 个柱床体积平衡镍柱包涵体溶解液等柱床体积过柱，夹闭流出口，室温静置30min，分次纯化全部包涵体溶解液。洗涤液2 (IOmmol 咪唑，8M尿素，300mmol NaCl, 50mM Tris_Hcl，pH8· 0) 2 个柱体积
洗涤非特异结合蛋白。洗脱液3(500mmol 咪唑，8M 尿素，300mmol NaCl, 50mM Tris-Hcl, pH8. 0) 5 个柱体
积洗脱目标蛋白。10个柱床三蒸水洗柱后灌注20%乙醇保存于4度。SDS-PAGE凝胶电泳分析蛋白纯化效果。结果见图7 lane 5。实施例七蛋白ρ C2-C4-L-hmTGF-β 1的复性纯化后蛋白溶解液用洗脱液3 (500mmol咪唑，8M尿素，300mmol NaCl，50mM Tris-Hcl，pH8. 0) 3倍稀后装入透析袋(pierce公司)，配制复性液(2M尿素，Immol还原型谷胱甘肽，0. Immol氧化型谷胱甘肽，IOOmmol苯甲基磺酰氟，10 %丙三醇，300mmol NaCl, 50mM Tris-Hcl, pH8. 0)置4°C冰柜中预冷，将按稀释后蛋白溶解液复性液=1 20配制复性液，透析袋水平放置且全部没入复性液中，置于4°C摇床缓慢摇动，复性过程中，前 12h，每4h换一次预冷的复性液，在12-24h过程中，每Mi换一次复性液，在Mh-72h中，每 1 换一次复性液，共复性72h，结束后，按与稀释后蛋白溶解液体积比=1 1，用预冷磷酸盐缓冲液逐步透析去除尿素，每池换缓冲液一次，至少换6次，及时离心去除析出蛋白。从复性液取出透析袋，水平置于干净玻璃器皿，用聚乙二醇20000(购自国药集团)于4°C透析浓缩，定时观察，防止析干，透析袋内存留液浓缩至原蛋白溶液体积1/10左右停止浓缩， Iowary法测蛋白浓度。0. 22 μ m —次性滤器过滤除菌，4°C保存备用。实施例八复性后蛋白ρ C2-C4-L-hmTGF_i3 1的功能鉴定已知TGF- β 1能够抑制人舌鳞癌细胞Tca-8113增殖和诱导凋亡，故选择该细胞鉴定复性后蛋白活性。含10% FBS RPMI-1640培养基(Gibco公司)于5% C02、37°C培养箱，常规培养人舌鳞癌细胞1^3-8113。接种4X103个细胞于96孔板，10% FBS RPMI-1640培养基培养 24h至细胞贴壁，更换含FBS RPMI-1640培养基，按以下分组进行实验实验分组PBS空白对照组，蛋白溶解液阴性对照组，蛋白组。蛋白组按蛋白终浓度分为0.51111101/1，1.(^11101/1两组。每组设三个复孔，于每611、1211、2411、4811、6011、7211相差显微镜观察细胞形态变化和测0D490 MTT值，以阴性对照组细胞活性100%，计算比较细胞增值率的变化。结果见图8，通过相差显微镜观察细胞形态变化，作用他后，对照组和阴性对照组细胞形态良好， 贴壁生长良好，成不规则梭型，细胞透明度大，折光性强，轮廓清晰，培养孔内清澈无碎片， 细胞数量随时间增多；0. 5 μ mol/L与1. 0 μ mol/L蛋白处理组大部分细胞形态不好，胞间空隙加大，细胞折光性变弱，变得不透明，培养孔内可见大量细胞残片，1. 0 μ mol/L蛋白处理组尤为严重，7 几乎见不到良好状态细胞。图9，MTT法测定不同时间细胞增值率变化，以阴性对照组活性为100%计算，前3 细胞增殖受到抑制，36h可能0. 5 μ mol/L蛋白浓度组蛋白耗尽，细胞活性增加，但高浓度蛋白组仍持续降低。结果说明复性后蛋白能够抑制肿瘤细胞I~ca-8113的增殖，成功复性出有功能的重组蛋白pC2-C4-L-hmTGF-i3 1。
权利要求
1.一种重组的促Treg(⑶4+⑶25+调控T细胞)化药物，其特征为该重组药物主要由靶向片段和功能片段两部分组成，并且可由连接片段连接。
2.如权利要求1所述的促Treg化药物，其靶向片段可以是CD4单克隆抗体、CD4单链抗体、CD4双价单链抗体、人类免疫缺陷病毒的被膜蛋白gpl20。
3.如权利要求1所述的促Treg化药物，其靶向片段优选gpl20。
4.如权利要求1所述的促Treg化药物，其靶向片段更优选gpl20的C2-C4区。
5.如权利要求1所述的促Treg化药物，其功能片段可以是TGF-β1、IL-2及PGE2。
6.如权利要求1所述的促Treg化药物，其功能片段优选TGF-β1。
7.如权利要求1所述的促Treg化药物，其中靶向片段直接以N末端或C末端和功能片段C末端或N末端相连构成融合蛋白。
8.如权利要求1所述的促Treg化药物，其中靶向片段和功能片段通过柔性连接片段 (linker)连接。
9.如权利要求1所述的促Treg化药物，其连接片段可以是氨基酸片段或高分子聚合物。
10.如权利要求1所述的的促Treg化药物，其连接片段优选氨基酸片段。
11.如权利要求1所述的的促Treg化药物，其连接片段优选为(G4S)3_4。
12.如权利要求1所述的促Treg化药物，高分子聚合物包括聚烯醇类化合物、聚醚类化合物、二乙烯基醚与马来酸酐共聚物、聚烃基乙二醇及其衍生物、聚烃基乙二醇及其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙醚、氧化乙烯和甲醛共聚物、聚环氧化物、乙二酸和丙二酸共聚物以及上述这些物质的衍生物中的一种。
13.如权利要求1所述的促Treg化药物，其氨基酸序列与SEQID NO :1所示的氨基酸序列具有至少90%的序列同源性。
14.如权利要求1所述的促Treg化药物，其氨基酸序列与SEQID NO :1所示的氨基酸序列具有至少95%的序列同源性。
15.如权利要求1所述的促Treg化药物，其氨基酸序列为SEQID NO=I所示。
16.一种编码如权利要求书1所述的蛋白质的核酸序列，其核苷酸序列SEQ ID N0:2具有至少90%的序列同源性。
17.—种编码如权利要求书1所述的蛋白质的核酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示；
18.—种载体质粒，携带有编码如权利要求1所述的促treg化药物的核苷酸序列。
19.一种重组宿主系统，经权利要求18所述的重组载体质粒转化、转染或转导得到，并用于表达如权利要求1所述的促Treg化药物。
20.如权利要求19所述的重组宿主系统可以是脊椎动物、昆虫、植物的细胞、酵母菌、 细菌或病毒。
21.如权利要求20所述的重组宿主细胞，其中酵母菌可以是酿酒酵母、毕赤酵母、念珠菌酵母、汉逊酵母、克鲁维亚酵母或裂殖酵母。
22.如权利要求20所述的宿主细胞，其中细菌可以是大肠杆菌。
23.生产如权利要求1所述的促Treg化蛋白的方法该方法包括下列步骤a.制备hmTGF-β 1 和 C2-C4-Linker DNA 片段b.构建C2-C4-Linker-hmTGF-01重组分子表达载体c.表达重组蛋白C2-C4-Linker-hmTGF-3 1d.纯化重组蛋白C2-C4-Linker-hmTGF-β 1
24.生产如权利要求1所述的促Treg化药物，当连接片段是高分子聚合物时需要先将功能片段和靶向片段表达纯化后获得目标蛋白，然后通过化学反应将功能片段和靶向片段连接组装成具有促Treg化活性的分子。
25.一种药物组合物，其含有如权利要求1所述的促Treg化药物。
26.如权利要求1所述的促Treg化药物，可以加工成冻干粉针或注射液以及其它可以接受的水溶液剂型的制剂，可用于全身给药，如肌注、静脉点滴、静脉推注，或者局部给药， 如皮下或病变部位注射。
27.如权利要求1-19所述的促Treg化药物，用于制备预防HIV感染、治疗自身免疫性疾病、移植物抗宿主病等免疫介导的相关疾病、防治肿瘤的药物。
28.如权利要求27所述的自身免疫性疾病包括慢性淋巴性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、炎性肠病、寻常天皰疮、类天皰疮、原发性胆汁性肝硬变、多发性硬化、急性特发性多神经炎等，系统性红斑狼疮、肾小球肾炎、银屑病、干燥综合征、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、硬皮病、结节性多动脉炎、Wegener肉芽肿病等。
29.如权利要求27所述的肿瘤包括CD4+的良性和恶性肿瘤，包括淋巴瘤、成人T细胞白血病、NK母细胞白血病等。
全文摘要
本发明提供一种人类免疫缺陷病毒膜分子gp120功能域与人TGF-β1的重组分子及其制备方法和应用，属于生物技术领域，该分子由gp120 C2-C4区通过一段柔性连接片段(linker)与人成熟转化生长因子β1(hTGF-β1)片段连接而成。本发明的C2-C4-linker-hTGF-β1能激活和增强外周血静止CD4+CD25+调节性T细胞的功能，并能够选择性作用于CD4+D25-初始T细胞，促使CD4+D25-初始T细胞转化为CD4+CD25+调节性T细胞，增加外周血中CD4+CD25+调节性T细胞的数量，为临床治疗自身免疫性疾病和移植相关疾病提供新的策略。
文档编号C12N15/63GK102552904SQ20101060194
公开日2012年7月11日 申请日期2010年12月23日 优先权日2010年12月23日
发明者张倩, 张建军, 徐开林, 曹江, 曾令宇, 李振宇, 桑威, 王东洋, 陈翀, 齐共建 申请人:徐州医学院附属医院