专利名称：人工胸腺、人工中枢免疫耐受缺损模型及制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明特别涉及一种人工胸腺、人工中枢免疫耐受缺损模型及其制备方法与应 用，属于细胞和器官工程技术领域。
背景技术：
中枢免疫耐受的维持对于机体内环境的稳定、正常淋巴细胞的产生、抵御外来异 物的侵袭等具有极其重要的意义。目前，对于中枢免疫耐受恒常性维持的分子机制的研究 才刚刚起步(Science. 2008,321 :843-847 ；Immunity. 2008,29 :423-437)；而对于中枢免疫 耐受维持机体内环境稳定如维持母-胎免疫耐受、避免自身免疫疾病发生的机理、中枢免 疫耐受是否影响移植物的存活、中枢免疫耐受在癌症、糖尿病等疾病的发生、发展过程中的 确切作用等仍然知之甚少。因此，建立一个合适的中枢免疫耐受缺损模型来揭示中枢免疫 耐受对这些生命活动的影响已势在必行。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种人工胸腺的制备方法。本发明的另一目的在于提供通过所述制备方法得到的人工胸腺和利用该人工胸 腺得到的人工中枢免疫耐受缺损模型。本发明的再一目的在于提供所述人工中枢免疫耐受缺损模型的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现一种人工胸腺的制备方法，包括以下步 骤(1)将除去淋巴细胞的小鼠胎儿胸腺置于含有胰蛋白酶和DNase I的PBS溶液 中，37°C下培养至整个胸腺分散为单个的细胞；接着加入相当于前述溶液3倍体积的不含 2'-脱氧鸟苷的RlO培养基以终止反应，过滤，离心，取沉淀，得到胸腺细胞；(2)将含有抑制小鼠TRAF6基因表达的shRNA的慢病毒质粒、pCMV-VSV-G-RSV-Rev 以及pCAG-HIVgp质粒按照质量比5 2 2的比例导入到人胚肾细胞中，培养，去除 细胞，过滤，浓缩，得到含有抑制小鼠TRAF6基因表达的shRNA的病毒液；(3)将步骤(1)制备的胸腺细胞悬浮于步骤( 制备的病毒液中，病毒的用量为 300iu/个细胞，再添加polybrene、青霉素和链霉素；然后将胸腺细胞/病毒混悬液移至培 养板中，25°C以800 IOOOrpm的速度离心2小时，再加入与胸腺细胞/病毒混悬液等体积 的不含2 ’ -脱氧鸟苷的RlO培养基，培养30min ；收集胸腺细胞/病毒混悬液，接着离心， 除去上清液，利用残留的液体将胸腺细胞均勻地悬浮，将混悬的胸腺细胞重新置于核孔滤 膜上，然后将载有这些胸腺细胞的核孔滤膜置于不含2'-脱氧鸟苷的RlO培养基中培养， 24小时后，这些胸腺细胞重新聚集形成含有抑制小鼠TRAF6基因表达的慢病毒shRNA质粒 的人工胸腺；所述除去淋巴细胞的小鼠胎儿胸腺优选通过以下步骤得到将小鼠胎儿的胸腺置于核孔滤膜上，然后将载有胸腺的核孔滤膜放于RlO培养基上培养5天，除去胸腺中的淋巴 细胞；所述的小鼠优选为BALB/C小鼠；所述的RlO培养基的成分如下在RPMI1640培养基中添加胎牛血清、L-谷氨酰 胺、青霉素、链霉素、巯基乙醇和2'-脱氧鸟苷，其中胎牛血清的使用浓度为体积百分 比10%，L-谷氨酰胺的使用浓度为2mM，青霉素的使用浓度为100U/ml，链霉素的使用浓度 为100mg/ml，β -巯基乙醇的使用浓度为50mM，2'-脱氧鸟苷的使用浓度为1. 35mM ；所述的PBS 溶液的组成为=KCl 0. 2g，KH2PO4 0. 2g，NaCl 8g, Na2HPO4 · 12H20 2. 9g， pH 值 7. 2，定容至 IOOOml ；步骤(1)中所述胰蛋白酶的使用浓度优选为质量体积比0. 25% ；步骤(1)中所述的PBS溶液还含有EDTA，EDTA的使用浓度为质量体积比0. 02% ；步骤(1)中所述DNase I的使用浓度优选为质量体积比；步骤(1)中所述的过滤优选通过孔径为30 μ m的尼龙膜进行；步骤(1)中所述的离心优选为室温下1500rpm离心5min ；步骤O)中所述含有抑制小鼠TRAF6基因表达的shRNA的慢病毒质粒优选为 CS-RfA-EG-TRAF6-shRNA 重组质粒；步骤O)中所述的过滤优选为通过孔径为0. 45 μ m的PVDF滤器过滤；步骤⑵中所述的离心的条件优选为20°C，35000rpm离心35min ；步骤(3)中所述的polybrene的使用浓度优选为5 μ g/ml ；步骤(3)中所述的青霉素的使用浓度优选为100U/ml ；步骤(3)中所述的链霉素的使用浓度优选为100mg/ml ；上述细胞的培养优选于37°C、5% CO2细胞培养箱中进行；一种人工胸腺，通过上述方法得到；所述人工胸腺应用于制备中枢免疫耐受缺损模型，包括以下步骤将所述人工胸 腺移植到6周龄的无胸腺的雌性小鼠肾脏荚膜下，饲养6 8周，该小鼠即为人工中枢免疫 耐受缺损模型；一种人工中枢免疫耐受缺损模型，通过上述制备方法得到；所述的人工中枢免疫耐受缺损模型可用于中枢免疫耐受维持的分子机制研究，也 可用于探讨中枢免疫耐受维持机体内环境稳定的机理研究，还可用于探索中枢免疫耐受在 癌症、糖尿病等疾病发生、发展过程中的作用等。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果当前，关于中枢免疫耐受的研究 主要利用调控中枢免疫耐受的基因缺损小鼠来进行，这些基因缺损小鼠全球仅少数实验室 拥有，尚不能广泛用于中枢免疫耐受的研究中。同时，也缺乏其他的模型可供利用。本发 明利用慢病毒将控制中枢免疫耐受的基因特异性shRNA质粒导入胸腺细胞，利用表达的 shRNA抑制目的基因的功能，从而诱导中枢免疫耐受缺损。这种模型具有与控制中枢免疫 耐受的基因缺损小鼠相似的特点，可以用于各种中枢免疫耐受相关研究中。同时，本发明也 展示了一种崭新的制备中枢免疫耐受缺损的方法，它避免了传统的基因缺损小鼠制备过程 中的各种复杂环节，非常简便、实用。这种方法不仅可用于人工中枢免疫耐受缺损模型的制 备，而且能用于中枢免疫耐受维持的分子机制研究中，为中枢免疫耐受分子机制的研究提供了一种新途径、新方法。
图1是FACS分析培养48小时的人工胸腺中GFP的表达情况图，其中A为对照组； B为实验组。图2是免疫染色检测培养48小时的人工胸腺髓质上皮细胞照片图，其中A为对 照组；B为实验组。图3是人工胸腺培养M小时后，手术移植到6周龄的无胸腺的雌性小鼠肾脏荚膜 下，饲养8周后的胸腺图(箭头所示)，其中A为对照组；B为实验组。图4是人工胸腺移植到无胸腺的雌性小鼠肾脏荚膜下生长8周后，冷冻切片，荧光 显微镜检测荧光表达图，其中A为对照组；B为实验组。图5是人工胸腺移植到无胸腺的雌性小鼠肾脏荚膜下生长8周后，冷冻切片， UEA-I (箭头所示)检测成熟的胸腺髓质上皮细胞图，其中A为对照组；B为实验组。图6是移植人工胸腺后饲养8周的小鼠脾脏图，其中A为对照组；B为实验组。图7是移植人工胸腺后饲养8周的小鼠脾脏中的⑶4、⑶8T淋巴细胞的比率图，其 中A为对照组；B为实验组。图8是移植人工胸腺后饲养8周的小鼠脾脏中CD4T细胞中活化的淋巴细胞的比 率图，其中A为对照组；B为实验组。图9是无胸腺的雌性小鼠移植人工胸腺后饲养8周，HE染色的小鼠肺切片图，其 中箭头所示部位为出现炎性细胞浸润的部位，A为对照组，B为实验组。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。实施例1(1)乙醚麻醉后颈椎脱臼处死妊娠14天的BALB/C小鼠(购自日本SLC公 司)，取出胎儿，从胎儿中分离胸腺，将胸腺置于核孔滤膜(Nucleopore filter，购自 Whatmann公司)上，然后将载有胸腺的核孔滤膜放于RlO培养基培养基的组成成分如 下:RPMI1640(购自 Invitrogen 公司)，体积百分比 10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS,购自Equitech-Bio公司)，2mM L-glutamine (购自日本和光公司)，100U/ml青霉素和 100mg/ml链霉素(购自Sigma公司)，50mM的β -巯基乙醇(购自日本和光公司)，1. 35mM 2'-deoxyguanosine (2-DG, 2‘-脱氧鸟苷，购自 Sigma-Aldrich 公司)，于含 5% CO2 的潮 湿培养箱中，37°C下培养培养5天，除去胸腺中的淋巴细胞。(2)将除去淋巴细胞的胸腺置于最终浓度为质量体积比0.25% Trypsin(购自 Sigma公司)、质量体积比0. 02% EDTA(购自Sigma公司)，质量体积比DNaseI(购自 TAKARA 公司)的 PBS 溶液(KCl 0. 2g, KH2PO4O. 2g,NaCl 8g, Na2HPO4 · 12H20 2. 9g，pH 值 7. 2， 定容至1000ml，下同)中，37°C培养30分钟，其间每间隔10分钟使用移液器分散胸腺细胞 1次，将整个胸腺分散为单个的细胞；加入前述溶液3倍体积量的不含2-DG的RlO培养基终 止反应，通过孔径为30 μ m的尼龙膜(购自日本Exigen公司)过滤后，离心沉淀(1500rpm，室温，5分钟)，除去上清液，PBS溶液洗涤1次，离心沉淀(1500rpm，室温，5分钟)除去上 清液，备用。一个完全除去淋巴细胞的胸腺可以获得2 IOxlO4个胸腺细胞。(3)采用钙-磷质粒导入法(步骤见 http://www. brc. riken. jp/lab/cfm)，将 CS-RfA-EG-TRAF6-shRNA重组质粒(已在申请号为201010019508.8的国家发明专利公 开)、pCMV-VSV-G-RSV-Rev以及pCAG-HIVgp质粒(均购自日本理化学研究所，http:// www. brc. riken. jp/lab/cfm)按照质量比5 2 2的比例导入到70 80 %融合的 人胚肾细胞(购自ATCC)中，为实验组；以CS-RfA-EG(购自日本理化学研究所)、 pCMV-VSV-G-RSV-Rev以及pCAG-HIVgp按照质量比5 2 2的比例导入到人胚肾细 胞，为对照组；搜集细胞培养的上清液，1500rpm,室温下离心5分钟后，上清液通过孔径为 0. 45 μ m 的 PVDF 滤器(购自 Millipore 公司)过滤，即得到 CS-RfA-EG-TRAF6_shRNA 重组 质粒(用于实验组)或者含有CS-RfA-EG质粒(用于对照组)的病毒液。利用超高速离心机(购自Beckman公司)对上述病毒液分别离心(TLA100. 3转子， 35000rpm, 20°C，35分钟)，除去上清液，将病毒沉淀重悬于体积百分比0. 1 %原培养液体积 的PBS溶液或者RPMI1640培养基中中，得到浓缩的病毒液。利用人胚肾细胞测定这 些浓缩后的病毒液的感染滴度(具体方法详见http://www. brc. riken. jp/lab/cfm ；这种 浓缩后的病毒液的感染滴度约为1 hl09iu/ml)。浓缩后的病毒液可保存于_70°C下。(4)将步骤⑵获得的5 IOxIO5个胸腺细胞混悬于步骤(3)制得的浓缩后的病 毒液中，病毒的用量为300iu/个细胞，再添加5μ g/ml的polybrene (购自Sigma公司)， 100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素，然后将胸腺细胞/病毒混悬液移至NUNC培养 板中，将培养板于25°C、IOOOrpm离心2小时后，加入与胸腺细胞/病毒混悬液等量的不含 2-DG的RlO培养基，于5% (X)2的潮湿培养箱中，37°C培养培养30分钟。收集胸腺细胞/ 病毒混悬液，1500rpm，室温下离心5分钟，除去上清液，利用残留的液体将胸腺细胞均勻地 悬浮，最终体积大约为0. 5 μ 1 (注体积最大不能超过1 μ 1)，将混悬的胸腺细胞重新置于 核孔滤膜(购自Whatmarm公司)上，然后将载有这些胸腺细胞的核孔滤膜置于不含2-DG 的RlO培养基上于5% CO2的潮湿培养箱中，37°C培养M小时后，这些胸腺细胞重新聚集形 成含有CS-RfA-EG-TRAF6-shRNA重组质粒的人工胸腺，为实验组；利用同样方法获得含有 CS-RfA-EG质粒的人工胸腺，为对照组。(5)人工胸腺细胞中慢病毒shRNA质粒导入率的检测将上述实验组和对照组的人工胸腺于5% CO2的潮湿培养箱中，37°C培养培养48 小时后，将人工胸腺置于 0. 25 % Trypsin/EDTA/PBS (含 0. 25 % Trypsin, 0. 02 % EDTA 的 PBS 溶液(PH7. 2))中，37°C下培养30分钟，将人工胸腺分散为单个细胞。流式细胞仪(FACS)检 测质粒的导入率(质粒导入后，细胞表达GFP)，结果表明实验组和对照组的质粒的导入率 均为75%以上(如图1所示)。免疫细胞化学染色(方法见The tumor necrosis factor family receptors RANK and CD40cooperatively establish the thymic medullary microenvironment and self-tolerance。 Immunity, 2008, 29 :423-437)也检 则至Ij 表达 keratin 5 (胸腺髓质上皮细胞marker之一，抗体购自Covance公司)的细胞也同时表达 GFP(如图2所示)，keratin 5阳性为红色，表达GFP为绿色。(6)人工胸腺的移植和人工中枢免疫耐受缺损模型的制备将步骤中培养M小时后的导入CS-RfA-EG-TRAF6-shRNA重组质粒的人工胸腺，手术移植到6周龄的无胸腺的雌性BALB/C小鼠肾脏荚膜下，饲养6 8周，这些小鼠即 为人工中枢免疫耐受缺损模型，为实验组。同样，将步骤(4)中的导入CS-RfA-EG质粒的人 工胸腺培养M小时后，手术移植到6周龄的无胸腺的雌性BALB/C小鼠肾脏荚膜下，饲养 6 8周，这些小鼠作为对照组。(7)人工中枢免疫耐受缺损模型的鉴定人工胸腺移植后6 8周，乙醚麻醉后颈椎脱臼处死BALB/C小鼠。检测以下项 目①人工胸腺在无胸腺的雌性小鼠肾脏荚膜下的生长发育情况。实验组和对照 组的人工胸腺都能在无胸腺的雌性小鼠肾脏荚膜下生长发育长大(如图3所示)。实 验组和对照组的人工胸腺在无胸腺的雌性小鼠肾脏荚膜下生长6 8周后，这些胸腺的 冷冻切片在荧光显微镜下检测能观察到荧光(GFP)表达(如图4所示)，表明实验组含 CS-RfA-EG-TRAF6-shRNA重组质粒以及对照组含慢病毒CS-RfA-EG质粒的人工胸腺在无胸 腺雌性小鼠体内生长时仍然能发挥其功能。②利用UEA-I抗体(购自VECTOR Laboratories公司)染色检测小鼠体内的人 工胸腺冷冻切片(染色方法见 Jhe tumor necrosis factor family receptors RANK and CD40cooperatively establish the thymic medullary microenvironment and self-tolerance。Immunity, 2008, 29 :423-437)，发现体内移植后实验组人工胸腺与对照组 人工胸腺相比，UEA-I阳性细胞明显减少(注UEA-1为胸腺髓质成熟上皮细胞marker)(如 图5所示)，表明导入CS-RfA-EG-TRAF6-shRNA重组质粒的人工胸腺在无胸腺的雌性小鼠肾 脏荚膜下生长后，人工胸腺髓质成熟上皮细胞明显减少。③检测移植人工胸腺7周后的小鼠发现，移植实验组人工胸腺的小鼠脾脏比移植 对照组人工胸腺的小鼠脾脏明显增大(如图6所示)。④移植实验组人工胸腺7周后的小鼠脾脏中的⑶4、⑶8T淋巴细胞的比率与移植 对照组人工胸腺的小鼠脾脏中的⑶4、⑶8T淋巴细胞的比率没有明显差异(如图7所示)。 然而移植实验组人工胸腺的小鼠脾脏中活化的T淋巴细胞(CD44阳性)的比率比移植对照 组人工胸腺的小鼠脾脏中活化的T淋巴细胞的比率明显增加(如图8所示)。⑤移植人工胸腺8周后的小鼠肺的HE染色(染色方法见The tumor necrosis factor family receptors RANK and CD40cooperatively establish the thymic medullary microenvironment and self-tolerance。Immunity, 2008,29 :423-437)显不 移植实验组人工胸腺的小鼠肺出现炎性细胞浸润(如图9所示)，与TRAF6缺损小鼠的症状 相似(见 Dependence of Self-tolerance on TRAF6_directed Development of Thymic Stroma. Science. 2005,308 :248-251)，而相同处理的移植对照组人工胸腺的小鼠却没有。这一系列现象表明，移植实验组人工胸腺(即TRAF6表达被抑制的人工胸腺)的 小鼠发生了中枢免疫耐受的缺损，同时表明建立的人工中枢免疫耐受缺损模型是成功的。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种人工胸腺的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)将除去淋巴细胞的小鼠胎儿胸腺置于含有胰蛋白酶和DNaseI的PBS溶液中，37°C 下培养至整个胸腺分散为单个的细胞；接着加入相当于前述溶液3倍体积的不含2'-脱 氧鸟苷的RlO培养基以终止反应，过滤，离心，取沉淀，得到胸腺细胞；(2)将含有抑制小鼠TRAF6基因表达的shRNA的慢病毒质粒、pCMV-VSV-G-RSV-Rev以 及pCAG-HIVgp质粒按照质量比5 2 2的比例导入到人胚肾细胞中，培养，去除细 胞，过滤，浓缩，得到含有抑制小鼠TRAF6基因表达的shRNA的病毒液；(3)将步骤⑴制备的胸腺细胞悬浮于步骤(2)制备的病毒液中，病毒的用量为 300iu/个细胞，再添加polybrene、青霉素和链霉素；然后将胸腺细胞/病毒混悬液移至培 养板中，25°C以800 IOOOrpm的速度离心2小时，再加入与胸腺细胞/病毒混悬液等体积 的不含2’ -脱氧鸟苷的RlO培养基，培养30min ；收集胸腺细胞/病毒混悬液，接着离心， 除去上清液，利用残留的液体将胸腺细胞均勻地悬浮，将混悬的胸腺细胞重新置于核孔滤 膜上，然后将载有这些胸腺细胞的核孔滤膜置于不含2'-脱氧鸟苷的RlO培养基中培养， 24小时后，这些胸腺细胞重新聚集形成含有抑制小鼠TRAF6基因表达的慢病毒shRNA质粒 的人工胸腺。
2.根据权利要求1所述人工胸腺的制备方法，其特征在于所述除去淋巴细胞的小鼠 胎儿胸腺通过以下步骤得到将小鼠胎儿的胸腺置于核孔滤膜上，然后将载有胸腺的核孔 滤膜放于RlO培养基上培养5天，除去胸腺中的淋巴细胞。
3.根据权利要求1所述人工胸腺的制备方法，其特征在于所述的小鼠为BALB/C小鼠。
4.根据权利要求1所述人工胸腺的制备方法，其特征在于 步骤(1)中所述胰蛋白酶的使用浓度为质量体积比0.25% ； 步骤(1)中所述DNase I的使用浓度为质量体积比；步骤(1)中所述的PBS溶液还含有EDTA，EDTA的使用浓度为质量体积比0. 02% ； 步骤(1)中所述的过滤通过孔径为30 μ m的尼龙膜进行； 步骤(1)中所述的离心为室温下1500rpm离心5min。
5.根据权利要求1所述人工胸腺的制备方法，其特征在于步骤O)中所述含有抑制小鼠TRAF6基因表达的shRNA的慢病毒质粒为 CS-RfA-EG-TRAF6-shRNA 重组质粒；步骤O)中所述的过滤为通过孔径为0. 45 μ m的PVDF滤器过滤； 步骤O)中所述的离心的条件为20°C，35000rpm离心35min。
6.根据权利要求1所述人工胸腺的制备方法，其特征在于 步骤⑶中所述的polybrene的使用浓度为5μ g/ml ； 步骤(3)中所述的青霉素的使用浓度为100U/ml ；步骤(3)中所述的链霉素的使用浓度为100mg/ml。
7.一种人工胸腺，通过权利要求1 6任一项所述制备方法得到。
8.—种人工中枢免疫耐受缺损模型的制备方法，其特征在于将权利要求7所述的人 工胸腺移植到6周龄的无胸腺的雌性小鼠肾脏荚膜下，饲养6 8周，得到人工中枢免疫耐 受缺损模型。
9.一种人工中枢免疫耐受缺损模型，通过权利要求8所述的制备方法得到。
10.权利要求9所述的人工中枢免疫耐受缺损模型应用于中枢免疫耐受维持的分子机 制研究、用于探讨中枢免疫耐受维持机体内环境稳定的机理研究以及探索中枢免疫耐受在 疾病发生、发展过程中的作用。
全文摘要
本发明公开一种人工胸腺、人工中枢免疫耐受缺损模型及其制备方法与应用。本发明将除去淋巴细胞的胎鼠胸腺细胞分散成单个细胞，利用慢病毒将控制中枢免疫耐受的基因特异性shRNA质粒导入胸腺细胞，再将这些胸腺细胞重新构建成人工胸腺，植入6周龄的无胸腺的雌性小鼠肾脏荚膜下，饲养6～8周，这些小鼠为人工中枢免疫耐受缺损模型。该人工中枢免疫耐受缺损模型具有与控制中枢免疫耐受的基因缺损小鼠模型相似的特点，表现为脾脏肿大，器官炎性细胞浸润，T淋巴细胞活性增加等。该人工中枢免疫耐受缺损模型用于中枢免疫耐受维持的分子机制研究、探讨中枢免疫耐受维持机体内环境稳定的机理研究及探索中枢免疫耐受在疾病发生、发展过程中的作用等。
文档编号C12N15/86GK102061286SQ20101055398
公开日2011年5月18日 申请日期2010年11月23日 优先权日2010年11月23日
发明者井上纯一郎, 秋山泰身, 秦俊文, 谢琪璇, 马清河, 黄军 申请人:暨南大学