专利名称：：山茱萸提取物及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种植物提取物，尤其是涉及一种山茱萸提取物、其活性成份以及它们在制备治疗疼痛、自身免疫病或炎症的药物中的用途。
背景技术：
：在日常生活中，疼痛是一种常见病症。据统计，在35-50岁的成人中，有55％左右会被各种病痛所困扰，如头痛、肩背痛、腰腿关节痛、软组织痛、坐骨神经痛等，而有些疾病如肿瘤在其病程发展过程中也会阶段性地伴有不同程度的疼痛，其顽固性和多发性严重影响了患者的工作与生活。研究证实，健康个体的正常免疫调节功能可将自身免疫耐受和自身免疫协调在一个相辅相成的合理水平上。当某种原因使自身免疫应答过分强烈时，便会导致相应的自身组织器官的损伤或功能障碍，这种病理状态就称为“自身免疫病”(autoimmunedisease，AID)。常见的由免疫功能亢进引发的“自身免疫病”包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、萎缩性胃炎、重症肌无力等。此外，机体在器官移植、骨髓移植等过程中也会发生类似的病理变化。通过免疫抑制剂调节患者机体的免疫应答以阻断疾病的进程，进而达到治疗的目的是免疫功能亢进疾病的一种主要治疗手段。常用的免疫抑制剂包括烷化剂(氮芥、环磷酰胺)，抗代谢药(硫唑嘌呤、氨甲蝶呤)，激素、真菌代谢产物(环孢素A)等。炎症是机体对各种致炎症因子引起的损伤所发生的以防御为主的反应，炎症的局部表现为红、肿、热、痛及功能障碍。这些表现在急性体表炎症时较为明显，而内脏的炎症和慢性炎症则多不明显。炎症不仅表现在局部，而且也常引起全身反应。常见的全身反应有发热、血液中的白细胞数目增多以及心、肝、肾等实质性器官的不同程度的变性、坏死等。按病理分类，炎症可分为变质性炎、渗出性炎(包括浆液性炎、纤维素性炎、化脓性炎、出血性炎和卡他性炎)、增生性炎(一般增生性炎及慢性肉芽肿性炎)等。马钱素为环烯醚萜苷类化合物，存在于山茱萸CornusofficinalicSieb.etZucc(Lietal.，Daozong.ShipinGongyeKeji(2002)，23(10)，45-47.)，八仙花Hydrangeahortensis(Khalifaetal.，JournalofPharmaceuticalSciences(2001)，28221-229.)，马钱子Strychnoscathayensis(Chengetal.，JournaloftheChineseChemicalSociety(Taipei，Taiwan)(2001)，48(2)，235-239)等植物中。据文献报道，马钱素具有很强的抗炎活性(MariadelCarmenRecioetalStructuralConsiderationsontheIridoidsasAnti-inflammatoryAgentsPlantaMed.60(1994)232-234)。其结构式如下分子式C17H26O10，分子量390.39Da，熔点221-222℃莫诺苷是一种环烯醚萜苷类化合物，存在于山茱萸(Endoetal.，YakugakuZasshi(1973)，93(1)，30-2.)，忍冬Loniceramorrowii(Ikeshiroetal.，PlantaMedica(1992)，58(1)，109.)等植物中。其结构式如下分子式C17H26O11，分子量406.39Da山茱萸苷是一种环烯醚萜苷类化合物，存在于山茱萸等植物中(Hatano，etal.，Phytochemistry(1990)，29(9)，2975-8.)。其结构式如下分子式C24H30O14，分子量542.49Da山茱萸(CornusOfficinalisSiebetZucc)是一种平补阴阳的中药，具有补益肝肾、收敛固涩的功效。近年来，国内外学者对山茱萸进行了多方面的研究，由于其分离出的有效成份不同，故对山茱萸有效成分的药理活性报道也有所不同。中国专利授权公告号CN1053371C公开了一种山茱萸提取物，该提取物能够显著抑制小鼠淋巴细胞转化、LAK细胞生成以及抑制小鼠单核巨噬细胞系统对刚果红的廓清、抑制角叉菜胶所致的大鼠、小鼠足肿胀等，具有显著的免疫抑制作用和抗炎作用。上述中国专利还公开了该提取物的提取方法。本发明人经实验证实，按上述方法制备的山茱萸提取物中多酚的含量低于50％。此外，该专利未公开山茱萸提取物的组成成份及配比。
发明内容本发明涉及一种山茱萸提取物。该提取物包含5-20％重量比的马钱素、5-25％莫诺苷和0.5-5％山茱萸苷。特别是，该提取物可包含10％重量比的马钱素、17.5％莫诺苷和2％山茱萸苷。该提取物包含至少50％重量比的多酚。本发明还提供了一种包含选自马钱素、莫诺苷和山茱萸苷的至少两种成份的药物组合物，其中至少一种成份是分离的。本发明还提供了一种含有分离的莫诺苷和可药用载体的药物组合物。本发明还提供了一种含有分离的山茱萸苷和可药用载体的药物组合物。本发明还涉及上述山茱萸提取物、药物组合物在制备治疗疼痛、自身免疫病或炎症的药物中的用途。本发明还涉及上述山茱萸提取物、药物组合物的制备方法。本发明各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求的描述，本发明的其他特点、目的和优势将会更为明显。本发明的问世部分是基于这样一个意外的发现马钱素、莫诺苷、山茱萸苷以特定的配比存在于具有止痛、免疫抑制和抗炎活性的山茱萸提取物中。因此，山茱萸提取物及其活性成份(单独或以组合形式)可用于治疗疼痛、自身免疫病或炎症。本发明的山茱萸提取物含有5-20％(如10％)重量比的马钱素、5-25％(如17.5％)的莫诺苷、0.5-5％(如2％)的山茱萸苷。该提取物可按实施例1的方法制备，亦可按其他类似方法制备。简而言之，将山茱萸加水煎煮，滤过后将水煎液通过纯化柱，再用水、10％的乙醇和80-95％的乙醇依次洗脱树脂柱，收集洗脱液，真空干燥后，得到山茱萸提取物。该提取物中多酚的含量经皮粉法测定，至少为50％(重量比，即50％-100％之间的任意整数百分比，包括50％和100％)。皮粉法是《中华人民共和国药典2000年版》认可的分析多酚含量的标准方法，包括先将含多酚的物质溶于水，用皮粉吸收溶液后再通过重量分析法测定溶液中的多酚含量。另外，本发明人先用山茱萸苷预处理人外周血单核细胞(PBMC)，并用来自Salmonellaryphimurium的LPS(Calbiochem，SanDiego，CA)刺激这些细胞；随后用TNF-alpha.ELISA试剂盒(BenderMedsytems，Vienna，Austria)和IL-1betaELISA试剂盒(JingmeiBiotech，Shanghai，China).分别测定细胞里TNF-alpha和IL-1beta的含量；最后用RT-PCR分析TNF-alpha和IL-1beta的mRNA或蛋白表达量。结果出人意料地发现，山茱萸苷能显著抑制TNF-alpha和IL-1beta两种炎症因子的表达。由于马钱素、莫诺苷、山茱萸苷三者的生物活性不同，故可根据需要对山茱萸提取物中三者的比例进行调整，如进一步提纯或者在提取物中加入分离的(包括化学合成的)成份。此外，还可以按比例将两种或三种分离的成份混合，配制成特定配比的药物组合物。该提取物或组合物的配比具有增效作用，从而使其较之其组成成份具有更佳的抗炎、免疫抑制或镇痛活性。术语“分离的”是指一种状态，处于该状态的化合物较之其自然状态(存在于自然界时的状态)具有更高的纯度。具体地说，分离的马钱素其干重纯度至少为21％(即21％-100％之间的任意整数百分比，包括21％和100％)，分离的莫诺苷其干重纯度至少为26％(即26％-100％之间的任意整数百分比，包括26％和100％)，分离的山茱萸苷其干重纯度至少为6％(即6％-100％之间的任意整数百分比，包括6％和100％)。化合物的纯度可通过一些标准方法检测，如柱层析或HPLC分析。特别是，在山茱萸提取物或其活性成份里可加入可药用载体以促进其给药。较佳的，本发明的药物组合物含有0.1-99.9％重量比的提取物或其活性成份。“可药用载体”不会破坏山茱萸提取物或其活性成份的药学活性，同时其有效用量，即能够起到药物载体作用时的用量对人体无毒。“可药用载体”包括但不限于离子交换材料、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、自乳化药物传递系统(SEDDS)如d-alpha-维生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯、吐温(Tweens)或其他类似聚合介质等药物制剂用的表面活化剂、血清蛋白如人血清白蛋白、缓冲物质如磷酸盐、氨基乙酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸部分甘油酯混合物、水、盐、电解质如硫酸盐精蛋白、磷酸氢二纳、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅胶、硅酸镁等。聚乙烯吡咯酮、纤维素物质、聚乙烯醇、羧甲基纤维素钠、聚丙稀酸酯、乙烯-聚氧乙烯-嵌段聚合物和羊毛酯、环糊精如alpha-、beta-及gama-环糊精或其经化学修饰的衍生物如2-和3-羟丙基-beta-环糊精等羟烷基环糊精或其他可溶性衍生物等均可用于促进本发明的山茱萸提取物或其活性成份的药物传递。其他可药用辅料如填充剂(如无水乳糖、淀粉、乳糖珠粒和葡萄糖)、粘合剂(如微晶纤维素)、崩解剂(如交联羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素和交联PVP)、润滑剂(如硬酯酸镁)、吸收促进剂、香味剂、甜味剂、稀释剂、赋形剂、润湿剂、溶剂、增溶剂和着色剂等也可加入本发明的药物组合物中。上述山茱萸提取物、其活性成份以及药物组合物可通过肠道或者非肠道途径给药。肠道给药制剂包括丸剂、颗粒剂、胶囊剂、悬浮液或溶液。非肠道给药制剂包括注射剂、霜剂、膏剂、贴剂或喷雾剂。非肠道给药途径包括皮下、皮内、动脉、静脉、肌肉、关节、滑液、胸骨、鞘内、病灶内、颅内注射或滴注。其它给药途径可包括局部、直肠、经鼻、经颊、阴道、舌下、粘膜、气管或尿道。山茱萸提取物、其活性成份以及药物组合物还可以通过气雾吸入或植入蓄积或针刺等方式给药。山茱萸提取物、其活性成份以及药物组合物的口服制剂包括但不限于胶囊、片剂、乳剂、水悬浮剂、胶体液、溶液、微胶囊、丸剂、锭剂、颗粒剂、粉剂。常用于片剂的可药用载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还会加入硬脂酸镁等润滑剂。常用于胶囊剂的可药用载体包括乳糖和干玉米淀粉。当制成口服水悬浮剂和/或乳剂时，山茱萸提取物或其活性成份可悬浮或溶解于油相里并与乳化剂或悬浮剂相结合。如果需要，也可以加入一些甜味剂和/或香味剂和/或增色剂。研究发现，山茱萸提取物的酸性pH(pH2-3)会导致胃肠不适(如疼痛、恶心、呕吐等)。若将碱性物质和山茱萸提取物或其活性成份一起给药则可减轻上述不适。术语“一起给药”是指碱性物质可以在山茱萸提取物或其活性成份给药之前、之后或者与山茱萸提取物或其活性成份同时给药；山茱萸提取物或其活性成份和碱性物质可以分别以单一制剂给药或者以合剂形式给药。需要选择适宜的碱性物质以避免因加入碱性物质而削弱山茱萸提取物或其活性成份的原有药学活性。适宜的碱性物质包括碳酸氢盐(如碳酸氢钠或碳酸氢钾，优选碳酸氢钠)、碳酸盐(如碳酸钠或碳酸钙，优选碳酸钠)、氢氧化物或者碱性氨基酸(如精氨酸、赖氨酸或组氨酸，优选赖氨酸)。碱性物质的用量应足以缓解山茱萸提取物或其活性成份引发的胃肠不适，例如可根据用药后治疗对象胃部不适、疼痛、恶心、呕吐等症状的变化来调整其用量。当碱性物质和山茱萸提取物或其活性成份分别以单一制剂给药时，两者的用量比例可根据给药对象的年龄、体重以及其胃肠刺激症状的严重程度做相应的调整。当碱性物质和山茱萸提取物或其活性成份以合剂形式给药时，可将合剂的pH值调至4～10，优选6～8，最优选为7。制备合剂的方法是将山茱萸提取物或其活性成份以及可药用载体溶于水，加入碱性物质，将pH值调至4～10。如果需要，亦可将溶液干燥。此外，也可将山茱萸提取物或其活性成份、可药用载体和碱性物质按特定用量配比直接混合制得pH值适宜的药物组合物。另外，山茱萸提取物或其活性成份(含有或不含有碱性物质)可被包裹于肠溶层中以使其不溶于酸性的胃液而溶于小肠，以减少胃肠刺激。所述肠溶层包括但不限于肠溶硬胶囊、肠溶衣、肠溶微型胶囊或肠溶复合胶囊。可以以羟烷基纤维素酞酸酯为主要原料，加入增塑剂，表面活性剂和颜料；或由羟丙基纤维素、聚乙烯酯酸酯、醋酸纤维素、邻苯二甲酸酯加入增塑剂和抗氧化剂；或由邻苯二甲醋酸纤维素和丙酮物质等制得肠溶层。本发明的山茱萸提取物、其活性成份和药物组合物可被制成无菌注射剂，如无菌水相或油相悬浮液。该悬浮液可按本领域的常规方法即使用适宜的分散剂或湿润剂(如Tween80)及悬浮剂等制得。其还可以是在可肠道外给药的无毒稀释剂或溶剂中的水溶液或悬浮液，如在1，3-丁二醇中的溶液。相关的可用载体或溶剂包括甘露醇、水、林格氏液、等渗氯化钠等。另外，无菌的固定油常被作为溶剂或悬浮剂的媒介，因而包括合成甘油单酯或甘油二酯在内的多种柔和的固定油(blandfixedoil)均适用。脂肪酸，如十八烯酸及其甘油酯衍生物(如橄榄油或蓖麻油，特别是其聚氧乙烯基衍生物)等可用于制备所述注射剂。所述油溶液或悬浮液还可包含一种长链的乙醇稀释剂或分散剂或羧甲基纤维素或类似的其他分散剂，此类物质常用于制备可药用乳剂和/或悬浮剂。其它一些制剂常用的表面活性剂如Tweens或Spans和/或其他类似的乳化剂或生物利用度促进剂等也同样可用于制备本制剂。本发明的山茱萸提取物、其活性成份以及药物组合物可制成栓剂通过直肠给药，方法是将山茱萸提取物或其活性成份与适宜的非刺激性赋形剂混合，后者在室温下为固体而在直肠温度下为液体，因而该栓剂可融解于直肠中并释放出活性成份。此类赋形剂包括但不限于可可油、蜂蜡和聚乙烯。本发明的山茱萸提取物、其活性成份以及药物组合物的局部给药制剂(如油膏)可直接用于患处。此类局部制剂含有活性成份及可药用载体，后者包括但不限于矿物油、液体石油、白石油、丙二醇、聚氧乙烯或聚氧丙稀化合物、乳化腊或水。另外，本发明的药物组合物还可制成洗剂或油剂。适用的载体包括但不限于矿物油、三梨醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、鲸腊酯、十六烷醇、2-十八烷醇、苯甲基乙醇或水。本发明的山茱萸提取物或其活性成份还可制成灌肠剂等用于直肠局部给药。局部透皮贴剂亦在本发明的保护范围之内。本发明的山茱萸提取物、其活性成份以及药物组合物亦可经鼻喷雾或者吸入给药，即按本领域的常规方法，使用苯甲基乙醇或其他防腐剂、吸收促进剂、碳氟化合物和/或其他增溶剂或分散剂制得盐溶液。本发明的山茱萸提取物、其活性成份以及药物组合物还可通过植入给药。采用植入给药方式可达到在给药对象体内持续，定时释放本发明的山茱萸提取物、其活性成份以及药物组合物的效果。另外，植入给药还能在局部组织和器官定位给药(Negrinetal.，Biomaterials22(6)563，2001)定时释放技术亦可用于本发明山茱萸提取物、其活性成份以及药物组合物的给药中，如基于聚合体技术的定时释药胶囊、缓释技术和制剂包裹技术(如聚合体和脂质体)等。贴剂同样包括在本发明的范围之内。其包括基层(如聚合体、布、纱和绷带)和本发明的药物组合物。基层的一边可设有一保护层以防止活性成份的流出。所述贴剂还可含有一用于固定的粘合剂，后者可以是一种自然的或者合成的物质，当其与给药对象的皮肤接触时可暂时粘附于皮肤上。粘合剂可以是防水的。当本发明的山茱萸提取物、其活性成份、药物组合物和制剂可与一种或多种附加的治疗药物或预防药物混合。附加药剂可作为独立的剂型与本发明的山茱萸提取物、其活性成份以及药物组合物分别给药。附加药剂也可和本发明的山茱萸提取物、其活性成份以及药物组合物一起以单一剂型给药。本发明还提供了一种治疗疼痛、自身免疫病和炎症的方法，包括给予治疗对象治疗有效量的本发明的山茱萸提取物、其活性成份和药物组合物。其他的山茱萸提取物亦可用于治疗疼痛。所述治疗对象可以是那些需要给予疼痛、自身免疫病、炎症治疗的对象。是否需要这种治疗可以是基于该对象自己的判断，也可以是基于保健专业人士的判断，所述判断可以是主观的(如个人观点)，也可以是客观的(如进行检查或检验)。术语“治疗”是指出于治愈、减轻、缓解、补救、预防、改善某种功能紊乱、功能紊乱表现出的症状、继发于功能紊乱的病态或发生功能紊乱的倾向之目的，给予某一对象某一物质的行为。“治疗有效量”是指所述治疗物质的用量足以在受治对象体内产生上述预期的医疗效果。对这种医疗效果的判断可以是客观的(如进行检验)，也可以是主观的(如根据给药对象的主诉)。所述疼痛包括但不限于原发性痛觉过敏、继发性痛觉过敏、面肌疼痛(myofascialpain)、顽固性面肌疼痛(intractablemyofascialpain)、头痛、背痛、颈痛、创伤性疼痛、炎症性疼痛、溃疡性疼痛、内脏痉挛痛、神经性疼痛、感受性疼痛(nociceptivepain)、肌肉疼痛、骨关节疼痛或肿瘤性疼痛。所述自身免疫病包括但不限于慢性淋巴性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、慢性溃疡性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征、天庖疮、类天庖疮、原发性胆汁性肝硬变、多发性脑脊髓硬化症、急性特发性多神经炎、系统性红斑狼疮、口眼干燥综合症、硬皮病、结节性多动脉炎、Wegener肉芽肿病、类风湿性关节炎、肾炎、肾病综合症、器官移植、骨髓移植、药物性皮炎、荨麻疹、蔬菜日光性皮炎、过敏性休克或哮喘等。所述炎症包括但不限于变质性炎、浆液性炎、纤维素性炎、化脓性炎、出血性炎、卡他性炎、增生性炎或慢性肉芽肿性炎。治疗有效量的山茱萸提取物或其活性成份介于1～300mg/kg/d之间。任何介于上述范围之内的用量皆为本发明的有效量，其中较低剂量介于1mg/kg/d和299.999mg/kg/d之间，较高剂量介于2mg/kg/d和300mg/kg/d之间。所述“治疗有效量”可用于疼痛、自身免疫病或炎症的单一用药或联合用药治疗。本领域的专业人员可以理解，在实际给药时的用量可高于或低于上述剂量范围。针对某一对象(如哺乳动物-人)的“治疗有效量”和具体治疗方案可受诸多因素影响，包括所用山茱萸提取物或其活性成份的药效活性、给药对象的年龄、体重、一般情况、性别、饮食、给药时间、疾病易感性、疾病进程以及收治医师的判断等。为了便于理解本发明，特列举以下实施例。其作用应被理解为是对本发明的诠释而非对本发明的任何方式的限制。上文所列的各参考文献均以全文引入本发明作为参考。图1本发明的山茱萸提取物HPLC色谱图；图2本发明的具有特定成份配比的山茱萸提取物和山茱萸苷对细胞分泌TNFa的抑制活性比较；图3本发明的具有特定成份配比的山茱萸提取物和山茱萸苷对细胞分泌IL1-beta的抑制活性比较；具体实施方式实施例1制备山茱萸提取物并用皮粉法测定其中的多酚含量山茱萸500g，加水5000mL，煎煮3次，煎煮以微沸为度，每次煎煮时间为2小时，煎煮液过滤，合并，静置备用；取D101大孔吸附树脂，按与生药重量比1∶2的比例装柱，然后将上述水煎液以20毫升/分钟的流速通过此大孔吸附树脂柱，完全通过后，再用水、10％的乙醇和95％的乙醇洗脱树脂柱。收集洗脱液，真空干燥后，得到山茱萸提取物48g。取上述山茱萸提取物2.0076g(W)，溶于500mL水中，取25mL溶液，将其浓缩至干，然后于105℃干燥3小时，得固体产物，其重量为T1＝0.0966g。另取上述溶液100mL，加入6g皮粉(购于上海化学试剂公司)，振荡15分钟。滤去皮粉，取25mL滤液，将其浓缩至干，然后于105℃干燥3小时，得固体产物，其重量为T2＝0.0561g。将6g皮粉加入100mL蒸馏水中，振荡15分钟。滤去皮粉，取25mL滤液，将其浓缩至干，然后于105℃干燥3小时，得固体产物，其重量为T0＝0.0155g。按公式(T1-T2+T0)×20/W×100％计算得出待测山茱萸提取物中的多酚含量为55.3％。实施例2山茱萸三种活性成份的分离和鉴定马钱素的分离和鉴定可将100g山茱萸用500mL95％乙醇浸泡三次，合并提取液，得10g浓缩物。浓缩物经减压柱层析，依次用石油醚、氯仿、甲醇洗脱。甲醇洗脱液浓缩后，再经硅胶柱层析(洗脱剂CH2CL2/CH3OH＝6∶4)，得马钱素875mg，其Rf值＝0.57(展开剂0.1MKH2PO4∶0.1MH3PO4∶CH3CN＝7∶7∶4)。其光谱数据为[α]D25＝-81°(c0.1，H2O)，UV(λmax，nm)238(4.0)；IR(cm-1，KBr)3350，3300，1715，1650，1440，1300，1080；1HNMR(D2O，300MHz)δppm7.42(s，H-3)，5.39(d，J＝3.6Hz，H-1)，4.14(m，H-7)，3.73(s，OCH3)，3.05(m，H-5)，2.16(m，H-6a)，2.10(m，H-9)，1.88(m，H-8)，1.73(m，H-6b)，1.06(d，J＝6.9Hz，H-10)，4.78(d，J＝7.8Hz，H-1’)，3.90(d，J＝10.8，H-6a’)，3.50(m，H-6b’)，3.36-3.47(m，H-3-H5’)，3.28(t，J＝8Hz，H-2’).13CNMR(D2O，75MHz)δppm170.3(C-11)，151.2(C-3)，113.3(C-4)，96.9(C-1)，74.6(C-7)，52.0(C-12)，45.2(C-9)，40.6(C-6)，40.4(C-8)，30.1(C-5)，12.3(C-10)，98.9(C-1’)，76.6(C-5’)，76.0(C-3’)，73.0(C-2’)，69.9(C-4’)，61.0(C-6’).莫诺苷的分离和鉴定可将100g山茱萸用500mL95％乙醇浸泡三次，合并提取液，得10g浓缩物。浓缩物经减压柱层析，依次用石油醚、氯仿、甲醇洗脱。甲醇洗脱液经LH-20层析(洗脱剂CH3OH/CH3COCH3/H2O＝7∶2∶1)，最后再经硅胶柱层析(洗脱剂CH2CL2/CH3OH＝6∶4)，得莫诺苷875mg，其Rf值＝0.68(展开剂同上)。浓缩物经反复硅胶柱层析，得莫诺苷643mg。其光谱数据为D25＝-70°(c1，EtOH)，UV(λmax，nm)238(4.0)；IR(cm-1，KBr)3350，3300，1710，1650，1080；1HNMR(D2O，300MHz)δppm7.57(s，H-3)，5.90(D，J＝9.3Hz)，H-1)，4.99(d，J＝1.0Hz，H-7)，4.91(d，J＝7.8Hz，H-1’)，4.36(m，H-8)，3.93(dd，J＝2.0，12.4Hz，H-6’a)，3.3-3.8(m，H-2’，3’，4’，5’，6’b)，3.0(dt，J＝12.8，4.6Hz，H-5)，2.05(m，H-6b)，1.90(m，H-6b)，1.85*m，H-9)，1.38(d，J＝3.8Hz，CH3)，3.74(s，OCH3).山茱萸苷的分离和鉴定可将100g山茱萸用500mL95％乙醇浸泡三次，合并提取液，得10g浓缩物。浓缩物经经减压柱层析，依次用石油醚、氯仿、甲醇洗脱。甲醇洗脱液经反相硅胶层析，得山茱萸苷23mg，其Rf值＝0.3(展开剂同上)。其光谱数据为[α]D＝-90°(c1.0，CH3OH)；UV(λmax，nm)275(4.0)；IR(cm-1，KBr)3350，2980，1720，1640，1600，1400，10201HNMR(acetone-d6+D2O，300MHz)δppm7.43(s，H-3)，7.04(d，J＝2.1Hz，H-2’，H-6’)，5.73(ddd，J＝9.0，11.5，17.7Hz，H-8)，5.40(d，J＝6.6Hz，H-1)，5.25(dd，J＝11.4，17.4Hz，H-10)，4.72(d，J＝7.8Hz，H-1”)，4.12(m，H-7)，3.82(dd，J＝1.8，12.3Hz，H-6”a)，3.61(dd，J＝5.4，12.0，H-6”b)，3.50(s，OCH3)，3.20-3.42(m，H-2”，3”，4”，5”)，2.86(m，H-5)，2.634(m，H-9)，1.90(m，H-6).13CNMR(acetone-d6+D2O，75MHz)δppm168.6(C-11)，167.5(C-7’)，153.1(C-8)，145.7(C-3)，134.8(C-2’，6’)，121.0(C-3’，4’，5’)，119.7(C-1’)，110.7(C-4)，109.7(C-10)，99.5(C-1”)，97.2(C-1)，77.3(C-5”)，76.8(C-3”)，73.6(C-2”)，70.5(C-4”)，63.7(C-7)，61.8(C-6”)，51.7(OCH3)，44.3(C-9)，30.7(C-6)，30.4(C-5).实施例3山茱萸提取物HPLC色谱图及定量分析用HPLC系统对山茱萸提取物(实施例1)进行定量分析。仪器Agilent1100，设定波长为240nm，分析柱为ZorbaxSC184.6*150mm，流速为1ml/分钟。流动相为CH3CN和0.1％的H3PO4溶液。梯度状况为CH3CN在50分钟内从0％递增到25％。在随后的5分钟内，CH3CN递增到100％。得附图1所示HPLC图谱。马钱素，莫诺苷，山茱萸苷的对照品均在本实验室内分离纯化。经HPLC分析，纯度均在96％以上。测得本发明的山茱萸提取物(实施例1)含马钱素9.7％(保留时间20.4分钟)，莫诺苷17.5％(保留时间26.5分钟)，山茱萸苷2.6％(保留时间41.9分钟)。实施例4镇痛药效学实验醋酸扭体实验实验材料1.动物NIH小鼠，雌性，体重18～22g，由卫生部北京生物制品研究所提供2.受试药物山茱萸提取物(按实施例1方法制备)，用蒸馏水溶解后，用碳酸氢钠调pH7.23.阳性对照药布洛芬，片剂，规格0.1g/片，人日用量为1.2g，由沈阳东陵药业股份有限公司生产，批号98080204.试剂0.6％醋酸(HOAc)生理盐水溶液(100％冰醋酸0.3ml溶于pH7-7.2的生理盐水溶液50ml中)、生理盐水。方法与结果小鼠55只，分为生理盐水组、布洛芬组(0.2g/kg)、山茱萸提取物大(0.32g/kg)、中(0.16g/kg)、小(0.08g/kg)剂量组，每组11只，连续给药5天，最后1天，给药1小时后，随即腹腔注射0.6％醋酸(HOAc)生理盐水溶液0.2ml/只后，观察20分钟内小鼠扭体次数和只数并记录结果，计算山茱萸提取物的镇痛百分比。结果见表1。镇痛百分比＝{(对照组扭体反应数-给药组扭体反应数)/对照组扭体反应数}×100％表1山茱萸提取物对小鼠腹腔注射醋酸致痛的影响(X±s)剂量扭体次数扭体小鼠镇痛百分率分组动物数(g/kg)(X±s)(只)(％)生理盐水11-24±16.78110布洛芬110.21.818±3.46**464山茱萸提110.080.364±0.771**373取物山茱萸提110.160.818±1.403**373取物山茱萸提110.321.091±2.58**282取物注与生理盐水组比较，**为P＜0.01热板法实验实验材料1.动物昆明种小鼠，雌性，体重18～20g，购于中国预防医学科学院流行病与微生物研究所2.受试药物山茱萸提取物(按实施例1方法制备)，用蒸馏水溶解，用碳酸氢钠调pH8。3.阳性对照药布洛芬，片剂，规格0.1g/片，人日用量为1.2g，由沈阳东陵药业股份有限公司生产，批号98080204.调节恒温水浴箱北京市长风仪器仪表公司生产。方法与结果1.调节恒温水浴将水浴槽加满水，使水面接触热板，调节恒温水浴箱，使水温控制在55±0.5℃，热板预热10分钟。2.分组与实验小鼠80只，每次一只放在热板上，小鼠自放在热板上至出现舔后足所需时间(秒)作为该鼠的痛阈值。凡舔后足时间(秒)小于5秒或大于30秒或跳跃者弃之不用。将合格的70只小鼠随机分为生理盐水组、布洛芬组、山茱萸提取物大(0.32g/kg)、中(0.16g/kg)、小(0.08g/kg)剂量组，每组14只，重复测定其正常痛阈值，取两次正常痛阈平均值，作为该鼠的给药前痛阈值。3.观察山茱萸提取物的镇痛作用对各组分别给予生理盐水、布洛芬和不同剂量的山茱萸提取物，连续给药3天于第4天给药后30、60、90分钟分别测定小鼠的痛阈值，并进行统计t检验。结果见表2。表2山茱萸提取物对小鼠的镇痛作用(热板法)(X±s)动物剂量给药前痛阈分组给药后不同时间痛阈值(S)数(g/kg)值(S)时间30min60min生理盐水11-18.04±2.79718.61±2.3418.36±3.39布洛芬110.218.39±2.79532.43±7.197**28.25±7.51**山茱萸提取物110.0818.86±2.2229.14±7.199**26.43±6.33**山茱萸提取物110.1618.72±2.3931.07±7.82**27.5±6.297**山茱萸提取物110.3218.14±2.5733.68±6.41**28.04±6.81**注与生理盐水组比较，**为P＜0.01给药后不同时间痛阈值(S)90min18.14±3.1826.07±8.56**24.29±6.696**25.29±6.91**25.36±7.53**以上实验结果显示山茱萸提取物具有显著的镇痛作用。实施例5山茱萸提取物和山茱萸苷的抗炎活性比较实验实验材料1.细胞外周血单核细胞2.受试药物山茱萸提取物(按实施例1制备)，山茱萸苷(按实施例2制备)。3.阳性对照地塞米松4.试剂Ficoll-PaquePlus(AmershamBioscience)；内毒素(LPS)和地塞米松(CalBiochem.)；TNFaELISAKit及IL1-betaELISAKit(晶美生物工程公司)；DMSO(Sigma)。方法与结果新鲜血液以EDTA为抗凝剂，分离外周血单核细胞，悬浮在含10％FBS的RIMP1640培养基中。在96孔板中加入100μl密度为1×105细胞/ml新分离的细胞，每孔细胞总数为104个，每个样品作3个孔。a)在细胞中加入指定浓度的山茱萸提取物或山茱萸苷(终浓度分别为3，10，30，100，300ug/ml，加样量为10ul)和阳性对照(地塞米松，10uM)。置于37℃含5％CO2的培养箱中保温15分钟；b)加入10ul浓度为100ug/ml的LPS，置于37℃含5％CO2的培养箱中保温16小时；c)与1000rpm离心15分钟，将上清转移入新的板中，测定TNFa及IL1-beta浓度，或冻藏于-20℃，避免反复冻融。实验结果以上实验表明，含有本发明的特定配比的山茱萸提取物的抗炎活性要明显优于其所含单体化合物山茱萸苷的抗炎活性，说明本发明的特定配比具有协同增效作用(参见附图2，3)。实施例6山茱萸提取物(实施例1)片剂可按如下方法制备山茱萸提取物30g淀粉3g淀粉浆(10％)适量枸橼酸0.15g滑石粉1.5g将山茱萸提取物加淀粉拌和均匀，加8％淀粉浆制成软件，用14目尼龙筛制粒，70～80℃干燥，经10～12目铁丝筛整粒，与滑石粉混匀后用12mm冲模压片。实施例7山茱萸提取物(实施例1)粉针剂可按如下方法制备山茱萸提取物20gNaOH适量将山茱萸提取物加蒸馏水溶解，用NaOH调PH至7.4，用0.22um的微孔滤膜过滤，无菌条件下，分别装于10ml西林瓶中，转盘，预冷冻(低于熔点10～20℃)，放入低于-45℃的冷冻箱中，出结晶后升华干燥，出箱，轧盖，即可。实施例8山茱萸提取物(实施例1)喷雾剂可按如下方法制备山茱萸提取物21.5gVc1g乙醇296.5gF12适量将山茱萸提取物溶解于乙醇中，加入喷射剂F12(先加入总体积的50％，然后根据喷射情况自行调节)，最后加入抗氧化剂Vc。权利要求1.一种山茱萸植物提取物，包括如下重量比成份马钱素5-20％、莫诺苷5-25％和山茱萸苷0.5-5％。2.权利要求1的提取物，包括至少50％重量比的多酚。3.权利要求1或2的提取物，其特征在于，它可由如下方法制得将山茱萸植物与水接触得一混合物；将所述混合物加热处理得到一溶液；将所述溶液通过大孔吸附树脂柱；和用水和乙醇水溶液进行梯度洗脱得到山茱萸植物提取物。4.权利要求3的提取物，其特征在于所述加热处理是将溶液加热至微沸。5.权利要求3或4的提取物，其特征在于所述的梯度洗脱分别用水、10％的乙醇和80-95％的乙醇依次进行。6.权利要求1或2的提取物，包括如下重量比成份马钱素10％、莫诺苷17.5％和山茱萸苷2％。7.一种药物组合物，包括治疗有效量的选自马钱素、莫诺苷和山茱萸苷的至少一种成份与可药用载体，其中马钱素不单独使用。8.权利要求7的药物组合物，其中马钱素、莫诺苷或山茱萸苷中至少一种成份是分离的。9.权利要求8的药物组合物，其中包括马钱素、莫诺苷和山茱萸苷。10.权利要求9的药物组合物，其中包括至少50％重量比的多酚。11.权利要求9或10的药物组合物，包括如下重量比成份马钱素5-20％、莫诺苷5-25％和山茱萸苷0.5-5％。12.权利要求11的药物组合物，包括如下重量比成份马钱素10％、莫诺苷17.5％和山茱萸苷2％。13.权利要求1的山茱萸植物提取物在制备治疗疼痛、自身免疫病或炎症的药物中的用途。14.马钱素、莫诺苷、山茱萸苷或其组合在制备治疗疼痛或自身免疫病的药物中的用途。15.莫诺苷、山茱萸苷或其组合在制备治疗炎症的药物中的用途。16.权利要求13或14的用途，其中所述疼痛选自原发性痛觉过敏、继发性痛觉过敏、面肌疼痛、顽固性面肌疼痛、骨关节疼痛、头痛、背痛、颈痛、创伤性疼痛、炎症性疼痛、溃疡性疼痛、神经性疼痛、感受性疼痛、肿瘤性疼痛、内脏痉挛痛或肌肉疼痛。17.权利要求13或14的用途，其中所述自身免疫病选自慢性淋巴性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、慢性溃疡性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征、天庖疮、类天庖疮、原发性胆汁性肝硬化、多发性脑脊髓硬化症、急性特发性多神经炎、系统性红斑狼疮、口眼干燥综合症、硬皮病、结节性多动脉炎、Wegener肉芽肿病、类风湿性关节炎、肾炎、肾病综合症、器官移植、骨髓移植、药物性皮炎、荨麻疹、蔬菜日光性皮炎、过敏性休克或哮喘。18.权利要求13或15的用途，其中所述炎症选自变质性炎、浆液性炎、纤维素性炎、化脓性炎、出血性炎、卡他性炎、增生性炎或慢性肉芽肿性炎。19.一种制备权利要求1的山茱萸植物提取物的方法，包括将山茱萸植物与水接触得一混合物；将所述混合物加热处理得到一溶液；将所述溶液通过大孔吸附树脂柱；和用水和乙醇水溶液进行梯度洗脱得到山茱萸植物提取物。20.权利要求19的方法，其特征在于所述加热处理是将溶液加热至微沸。21.权利要求19或20的方法，其特征在于所述梯度洗脱分别用水、10％的乙醇和80-95％的乙醇依次进行。全文摘要本发明涉及一种山茱萸提取物，其活性成分(马钱素、莫诺苷和山茱萸苷)，以及它们在制备治疗疼痛、自身免疫病或炎症的药物中的用途。文档编号A61P37/00GK1566124SQ0314577公开日2005年1月19日申请日期2003年7月3日优先权日2003年7月3日发明者杜莹,潘柯,严孝强,张维汉申请人:和记黄埔医药企业有限公司