专利名称：山茱萸提取物及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明提供了一种山茱萸提取物，还涉及该提取物的制备方法以及该提取物的用途，属于中药领域。
本发明还提供了山茱萸提取物的制药新用途。
本发明山茱萸提取物的制备如下山茱萸药材用水煎煮2-4遍，加水量3-10倍，煎煮时间1-4小时。合并煎煮液，过滤后减压浓缩，过滤后冷藏备用。
或者山茱萸药材用水煎煮2-4遍，加水量3-10倍，时间1-4小时。合并煎煮液，过滤后减压浓缩，加乙醇调至醇浓度为50％-90％，冷藏12-48小时，过滤，滤液减压回收乙醇后，用正丁醇萃取3-5次，回收正丁醇，萃取液冷藏备用。
将上述浓缩的山茱萸水提取液或者水提醇沉提取液，上大孔吸附树脂柱，使药液流过全柱，依次用去离子水、10％-95％乙醇进行梯度洗脱，减压浓缩成浸膏。
将大孔吸附树脂分离的总苷浸膏用乙酸乙酯或乙醇等有机溶媒进行精制，得有效部位。
本发明所说的山茱萸提取物，是指经过上述方法提取获得的有效部位。
本发明所说的山茱萸提取物是从山茱萸科植物山茱萸Cornus果肉中提取的总苷化合物(Cornus total glycosides，CTG)，其中包括山茱萸苷(Cornin即马鞭草苷Verbenalin)、莫诺苷(morroniside)、甲基莫诺苷(methylmorroniside)、马前素(loganin即番木鳖苷)、脱氢马前素(dehydrologanin)、环烯醚萜苷(iridoid glycosides)、獐牙菜苷(sweroside)、皂苷等。
有效部位的测定方法对上述提取物制品应用薄层层析进行定性分析。并且对上述提取物制品应用高效液相色谱仪进行定量分析，色谱条件Lichrospher-C18色谱柱，流动相甲醇-水(30∶70)，检测波长240nm，流速1.0ml/分钟。检测分析结果总苷含量占山茱萸提取物的50％以上。
本发明提取方法得到的山茱萸提取物，经实验证明，在治疗缺血性血管病方面具有确切的疗效，可用于制备治疗缺血性心脑血管病或周围血管病等的药物。
因此，本发明还包括山茱萸提取物在制备防治缺血性血管病药物中的应用。所说的缺血性血管病是指动、静脉系统病损引起的血管痉挛、血栓形成、或血管闭塞，或者所造成的器官局部循环或功能障碍。具体说，该缺血性血管病是指动脉硬化、短暂性缺血发作、或组织器官梗塞、或周围血管闭塞中的任何一种。所说的缺血性血管病的病理机制表现为各种原因所致血管痉挛或管腔狭窄，血管内皮损伤，血小板聚集性增高，血栓形成，或栓子阻塞，导致组织缺血以至坏死。本发明所述的山茱萸提取物其药理作用还包括抑制血小板聚集，减轻急性脑梗塞性血管损伤，减小梗塞缺血半暗区面积；降低细胞内钙离子浓度，改善急性全脑缺血缺氧后的能量和物质代谢，提高学习记忆能力，抑制乙酰胆碱酯酶和单胺氧化酶B活性。实验例1.山茱萸提取物(CTG)对大鼠血小板聚集性的影响实验目的在正常情况下，血小板以分散状态在血管内运行。但当血管损伤、血流改变或受到化学物质刺激时，血小板则发生形态改变、黏附、聚集和释放，在血栓形成中起着重要作用。血小板聚集性增高也可作为诊断高凝状态的参考指标和血栓形成的危险因子。本研究观察山茱萸提取物对大鼠血小板聚集性的影响。
实验方法雄性SD大鼠连续灌胃给山茱萸提取物14天后，进行实验。取血前1小时给药一次，戊巴比妥钠麻醉。腹主动脉取血，3.8％枸橼酸钠抗凝(1∶9)，离心制备富血小板血浆(PRP)及贫血小板血浆(PPP)，用上海斯隆公司MPG3E型血小板聚集仪测定ADP(1.25mmol/L)及凝血酶诱导的血小板聚集。
实验结果山茱萸提取物具有显著降低ADP及凝血酶致血小板聚集的作用(表1)。表明该化合物有利于防治多种组织器官血管内血栓形成。
表1.山茱萸提取物(CTG)对大鼠血小板聚集的的影响组别 动物数 最大聚集率(％)ADP诱导 凝血酶诱导对照组1060.0±5.8 58.9±6.2海得琴(阳性对照药)9 44.1±6.6*39.1±5.8*CTG0.33g/kg 9 50.7±9.5 44.6±6.7*CTG1g/kg 1046.9±5.1*37.9±9.2*CTG3g/kg 1037.7±5.7*35.8±6.5*M±SD；*p＜0.05，与对照组相比实验例2山茱萸提取物对小鼠断颅致急性全脑缺血模型的影响实验目的断颅致急性全脑缺血小鼠模型是常用的快速筛选抗脑缺血缺氧药物的模型，此模型可模拟脑内能量代谢的降低，引起神经元死亡。断颅后脑内存有的一些供能物质仍够维持一定时间的小鼠张口呼吸，所以可用张口呼吸时间来表示供能物质耗竭的时间。本研究旨在观察山茱萸提取物对小鼠急性全脑缺血模型的保护作用。
实验方法昆明种小鼠，雌雄各半，体重18-22克。给小鼠灌胃给药每天2次，连续给药5天。于第六天上午给药1小时后断颅，用秒表记录小鼠张口连续呼吸持续时间，以两次呼吸间隔大于5秒为死亡。
实验结果山茱萸提取物灌胃口服可延长小鼠断颅后张口呼吸的时间(表2)，表明山茱萸提取物具有拮抗脑缺血缺氧引起的能量代谢降低造成的神经细胞损伤的作用。
表2.山茱萸提取物对小鼠断颅致急性全脑缺血后张口呼吸时间的影响组别 动物数 张口呼吸时间(秒)对照组10 25.34±2.58尼莫地平(阳性对照药) 14 28.66±1.22**CTG 0.75g/kg12 27.02±2.27*CTG 1.5g/kg 13 27.62±2.00*CTG 3.0g/kg 11 31.44±6.42**M±SD；*p＜0.05，**p＜0.01，与对照组相比实验例3山茱萸提取物对光化学诱导急性脑梗塞小鼠模型的影响实验目的由氧自由基增高引起血管内皮细胞损伤，血小板聚集，形成血栓，导致局部组织缺血坏死是缺血性心脑血管病和周围血管病的共同病理变化。光化学诱导急性脑梗塞的造模原理是将光敏物质(玫瑰红)注入小鼠尾静脉，以560nm波长的冷光源照射小鼠颅部，发生光化学反应，生成大量氧自由基，引起血管内皮细胞损伤，血小板聚集，在照射区内形成血栓，局部皮层缺血坏死。本研究旨在观察山茱萸提取物对急性脑梗塞小鼠模型脑血管损伤及缺血半暗区的影响。
实验方法给小鼠灌服不同剂量山茱萸提取物，15天后造模。将光敏物质(玫瑰红)注入小鼠尾静脉，以560nm波长的冷光源照射小鼠颅部。在造模后3小时经舌静脉注入伊文斯兰染料，1小时后处死动物。处死后取脑组织制成匀浆，并以比色法测定平均脑组织的光密度。梗塞严重者，染色深，光密度大，缺血半暗区面积大。
实验结果灌服山茱萸提取物可降低光化学诱导急性脑梗塞模型小鼠脑组织伊文斯兰的光密度，并减少模型小鼠缺血半暗区的面积(表3)。表明山茱萸提取物可减轻由于氧自由基增高而引起血管损伤和血栓形成，有利于防治缺血性血管病的血管损伤和组织坏死。
表3.山茱萸提取物对光化学诱导脑梗塞小鼠模型的影响组别 动物数 伊文斯兰(OD值) 缺血半暗带面积模型组6 0.1333±0.0759 ++++海得琴(阳性对照药)7 0.1121±0.0441 +CTG 0.167g/kg 6 0.1097±0.0259 ++CTG 0.5g/kg 8 0.1072±0.0303 +CTG 1.5g/kg 8 0.0547±0.0260* +M±SD；*p＜0.05，与模型组相比缺血半暗带+，++，+++，++++代表面积依次由小到大。实施例4山茱萸提取物对大脑中动脉闭塞致局灶性脑缺血大鼠模型的影响实验目的由缺血引起的胞浆钙离子浓度异常增高是缺血性心脑血管病和周围血管病的共同病理变化，钙离子增高也可引起血管收缩或痉挛。大脑中动脉闭塞(MCAO)是常用的模拟临床疾病的局灶性脑缺血模型。细胞内钙离子稳态失调在细胞缺血损害中起重要作用。由缺血引起的胞浆钙离子浓度异常增高，可使得受钙离子调节的磷脂酶、蛋白酶、核酸内切酶等被激活导致膜磷脂分解和细胞骨架破坏，细胞产生不可逆性损伤。本研究旨在观察山茱萸提取物对缺血后胞浆内钙离子浓度的影响。
实验方法(1)模型制作实验大鼠于第14天给药30分钟后行腹腔麻醉，于右外耳道与右外眦连线中点作一上下的斜行切口，分离至充分暴露大脑中动脉，以浸有50％三氯化铁的滤纸条贴于大脑中动脉与大脑前静脉交叉处，30分钟后用显微镜观察大脑中动脉血流确已阻断，去滤纸，生理盐水冲洗、缝合。
(2)海马细胞内钙离子荧光强度的测定大鼠造模后24小时，断头取脑后置于人工脑脊液中，于视交叉水平切300微米厚的脑片。加入含5uMFluo-3/AM的人工脑脊液400微升，孵育1小时后激光共聚焦显微镜测定海马区细胞内钙离子荧光强度。
实验结果每组右侧为缺血侧，钙离子浓度比健侧(左侧)增高。左右脑钙离子浓度差值比较，模型组海马细胞内钙离子荧光强度增高较对照组明显，模型是成立的。山茱萸提取物用药组较模型组海马细胞内钙离子浓度降低(表4)。该化合物降低胞浆内钙离子浓度的作用有利于保护缺血组织，提高细胞存活率，并有利于扩张血管，对缺血性血管病的防治具有重要意义。
表4山茱萸提取物对MCAO模型大鼠海马细胞内钙离子浓度的影响组别 动物数 钙离子荧光强度差值缺血侧健侧(缺血侧-健侧)差值对照组6 47.99±26.28 36.72±6.93 11.27±22.38*模型组6 105.2741.30 60.31±32.3444.96±12.44海得琴4 86.0235.10 56.1527.30 29.88±29.13CTG 0.33g/kg 4 99.2013.52 58.33±19.1040.86±18.23CTG 1g/kg6 89.57±15.67 54.57±17.7534.60±3.92CTG 3g/kg6 95.22±29.42 64.40±23.4430.82±17.39M±SD；*p＜0.05，与对照组相比实验例5山茱萸提取物对双侧颈总动脉结扎大鼠模型学习记忆功能的影响实验目的组织器官缺血及其病理变化的结果是导致功能减退甚至丧失。长期脑缺血可造成学习记忆功能下降或血管性痴呆。本研究观察山茱萸提取物对双侧颈总动脉结扎8周后大鼠学习记忆功能的影响。
实验方法双侧颈总动脉结扎大鼠模型的制备及分组给药SD大鼠，腹腔注射麻醉，分离双侧颈总动脉，用1号丝线永久结扎，缝合肌肉皮肤。术前预防灌胃给山茱萸提取物2周，术后灌胃给药8周。
避暗法检测被动回避记忆功能。采用大鼠避暗箱，于术后第8周进行实验，第一天进行训练，将大鼠放入明室中，使其进入暗室受电击2次，24小时后进行测试，记录大鼠进入暗室的次数和潜伏期，并分级。两前肢进入暗室记为1分；三前肢进入暗室记为2分；四肢同时进入暗室记为3分。结果组间比较，进行t检验。
通道式水迷宫法于术后第8周开始训练。实验分4天进行，第1天训练2盲端2次，第2天训练3盲端2次；第3天训练4盲端2次，第4天测4盲端。每次训练时间限定在2min，超时者采用人工引导，按2min计时。每只大鼠每次训练和测试均记录到达终点的时间(到达时间)和进入盲端的次数(错误数)。以4盲端训练期到达时间和错误数的均值作为学习成绩，4盲端测试期到达时间和错误数作为记忆成绩，结果组间比较，进行t检验。
Morris水迷宫法于术后第8周开始训练。实验分5天进行，每天训练2次。第1天训练2次，入池位置为站台所对象限及所邻象限。于象限边1/2弧度处将大鼠头朝池壁入水。训练时间限定在2min，超时者采用人工引导，按2min计时。每只大鼠每次训练均记录游出时间、距离、搜索站台的轨迹。结果组间比较，进行t检验。
实验结果双侧颈总动脉长期结扎的方法可使大鼠产生学习记忆障碍，山茱萸提取物经长时间用药可改善大鼠的学习记忆，表现在可缩短水迷宫试验中的游出时间和距离、减少错误次数(表5-7)；在避暗试验中可延长潜伏期，减少错误次数(表8)。表明山茱萸提取物可改善长期组织器官缺血导致的功能障碍。表5.山茱萸提取物对双侧颈总动脉结扎模型大鼠Morris水迷宫游出时间(秒)的影响组别例数 第二天 第三天 第四天正常对照1425.78±23.3612.82±15.22*9.50±5.73*模型1246.38±34.5635.36±24.17 25.75±20.20CTG 3g/kg 9 32.85±22.5610.52±7.04**16.55±10.98M±SD，与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01表6.山茱萸提取物对双侧颈总动脉结扎大鼠模型Morris水迷宫游出距离(厘米)的影响组别 例数 第二天第三天 第四天正常对照 14532.51±485.17307.46±382.49* 190.06±108.84*模型 12934.25±759.87746.41±540.72 612.66±505.56CTG 3g/kg9 10.44±457.20 227.11±134.18* 366.78±251.87M±SD，与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01
表7.山茱萸提取物对双侧颈总动脉结扎模型大鼠通道式水迷宫学习记忆的影响组别 学习成绩(4盲端) 记忆成绩(4盲端)游泳时间(s) 错误次数游泳时间(s) 错误次数正常 59.4316.19 1.19±0.61**28.64±20.55** 0.39±0.77*模型 74.41±31.02 2.92±1.83 66.33±28.851.83±2.02CTG(3g/kg)63.22±36.83 2.78±2.38 35.33±24.47* 0.61±0.82*M±SD，与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01表8.山茱萸提取物对双侧颈总动脉结扎模型大鼠避暗实验的影响组别 例数 潜伏期(秒) 错误次数 分级正常对照 14 234.64±20.04* 0.07±0.27*0.07±0.27*模型 12 169.75±99.34 0.92±1.31 1.17±1.59CTG 3g/kg 9 211.25±58.42 0.25±0.46 0.38±0.74M±SD，与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01实验例6山茱萸提取物对双侧颈总动脉结扎大鼠模型大脑皮层乙酰胆碱酯酶活性的影响实验目的脑内乙酰胆碱酯酶(AchE)是水解神经递质乙酰胆碱的酶类。AchE抑制剂可减缓乙酰胆碱的分解代谢，提高学习记忆能力。本研究观察山茱萸提取物对大鼠脑组织AchE活性的影响。
实验方法大鼠大脑皮层匀浆离心后，取上清液用生化方法测定AchE活性。
实验结果山茱萸提取物可明显抑制双侧颈总动脉结扎模型大鼠大脑皮层AchE活性(表9)。
表9.山茱萸提取物对双侧颈总动脉结扎模型大鼠大脑皮层AchE活性的影响组别 例数 AchE(umol/mg蛋白)正常对照 12 0.430±0.073*模型 8 0.623±0.189CTG 3g/kg 6 0.329±0.077**M±SD，与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01实验例7山茱萸提取物对双侧颈总动脉结扎模型大鼠大脑皮层单胺氧化酶B活性的影响实验目的单胺氧化酶广泛分布在动物组织，主要位于细胞线粒体部分，它可催化各种单胺类使其脱氨生成相应的醛，进一步氧化成酸或使醛转化成醇再进行下一步代谢。单胺氧化酶B(MAO-B)与衰老关系密切，随增龄多种组织的MAO-B活性增高。近年来MAO-B抑制剂可用于治疗帕金森病、老年痴呆症和延缓衰老。本研究观察山茱萸提取物对双侧颈总动脉结扎模型大鼠大脑皮层MAO-B活性的影响。
实验方法大鼠脑组织匀浆离心后，取上清液用生化方法测定MAO-B活性。
实验结果山茱萸提取物可明显抑制双侧颈总动脉结扎模型大鼠大脑皮层MAO-B活性(表10)。
表10.山茱萸提取物对双侧颈总动脉结扎模型大鼠大脑皮层MAOB活性的影响组别 例数MAO-B(U/mg/h)正常对照 12 899.2±190.4*模型 8 1214.0±230.1CTG 3g/kg6 851.3263.5*M±SD，与模型组比较*P＜0.05综上所述，从山茱萸中提取获得的总苷化合物，可明显降低由ADP和凝血酶诱导的血小板聚集，减轻急性脑梗塞动物模型血管损伤、减小缺血半暗区面积，降低细胞内钙离子浓度，改善急性全脑缺血缺氧后的能量和物质代谢，提高长期脑缺血动物模型的学习记忆能力，抑制乙酰胆碱酯酶和单胺氧化酶B活性。表明该化合物具有防治缺血性血管病的作用。可用于治疗动、静脉系统病损引起的血管痉挛、血栓形成或血管闭塞，或者造成器官局部循环和功能障碍。临床上主要用于治疗动脉硬化、缺血性心脑血管病和周围血管病等。
最佳实施方式实施例1山茱萸提取物的制备山茱萸药材用水煎煮3遍，加水量6倍，时间2小时。合并3次煎煮液，过滤后减压浓缩，冷藏备用；取浓缩的山茱萸水提取，上HP20大孔吸附树脂柱，使药液流过全柱，依次用去离子水、30％、50％乙醇进行梯度洗脱，收集50％乙醇的洗脱液，减压浓缩成浸膏；将大孔吸附树脂分离的总苷浸膏用乙醇萃取，脱除有机溶剂，浓缩，干燥，获得固体产物。得率9.1％。实施例2山茱萸提取物的制备山茱萸药材用水煎煮3遍，加水量6倍，时间2小时。合并3次煎煮液，过滤后减压浓缩，加乙醇调至醇浓度为70％，冷藏24小时，过滤，滤液减压回收乙醇后，冷藏备用。
取上述山茱萸水提醇沉提取液，上HP20大孔吸附树脂柱，使药液流过全柱，依次用去离子水、30％、50％乙醇进行梯度洗脱，收集50％乙醇的洗脱液，减压浓缩成浸膏。
将大孔吸附树脂分离的总苷浸膏用乙醇萃取，脱除有机溶剂，浓缩，干燥，获得固体产物。得率8.1％。
经高效液相色谱仪分析，所述产物中山茱萸苷、莫诺苷、甲基莫诺苷、马前素(即番木鳖苷)、脱氢马前素、环烯醚萜苷、獐牙菜苷、皂苷等含量占山茱萸提取物的72％。
权利要求
1.一种山茱萸提取物，其特征在于它是以下述方法提取获得山茱萸药材用水煎煮2-4遍，加水量3-10倍，煎煮时间1-4小时，合并煎煮液，过滤后减压浓缩，冷藏备用；将上述浓缩的山茱萸水提取液上大孔吸附树脂柱，使药液流过全柱，依次用去离子水、10％-95％乙醇进行梯度洗脱，减压浓缩成浸膏；将大孔吸附树脂分离的总苷浸膏用乙酸乙酯或乙醇等有机溶媒进行精制，得有效部位提取物。
2.根据权利要求1所述的山茱萸提取物，其特征在于它是以下述方法提取获得山茱萸药材用水煎煮2-4遍，加水量3-10倍，时间1-4小时，合并煎煮液，过滤后减压浓缩，加乙醇调至醇浓度为50％-90％，冷藏12-48小时，过滤，滤液减压回收乙醇后，冷藏备用；将上述的山茱萸水提醇沉提取液上大孔吸附树脂柱，使药液流过全柱，依次用去离子水、10％-95％乙醇进行梯度洗脱，减压浓缩成浸膏；或将上述水提醇沉提取液用正丁醇萃取3-5次，回收正丁醇，萃取液减压浓缩成浸膏；将大孔吸附树脂分离的总苷浸膏用乙酸乙酯或乙醇等有机溶媒进行精制，得有效部位提取物。
3.根据权利要求1所述山茱萸提取物，其特征在于它是以山茱萸总苷为主要活性成分的提取物。
4.根据权利要求3的提取物，其中所述山茱萸总苷包括山茱萸苷、莫诺苷、甲基莫诺苷、马前素、脱氢马前素、环烯醚萜苷、獐牙菜苷、皂苷。
5.山茱萸提取物在制备防治缺血性血管病药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于所说的缺血性血管病是指动、静脉系统病损引起的血管痉挛、血栓形成、或血管闭塞，或者所造成的器官局部循环或功能障碍。
7.根据权利要求5所述的用途，其特征在于所说的缺血性血管病是指动脉硬化、短暂性缺血发作、或组织器官梗塞、或周围血管闭塞中的任何一种。
8.根据权利要求5所述的用途，其特征在于所说的缺血性血管病的病理机制表现为各种原因所致血管痉挛或管腔狭窄，血管内皮损伤，血小板聚集性增高，血栓形成，或栓子阻塞，导致组织缺血以至坏死。
9.山茱萸提取物在制备具有下述任一药理作用的药物中的应用，其中所述的药理作用包括抑制血小板聚集，减轻急性脑梗塞性血管损伤，减小梗塞缺血半暗区面积；降低细胞内钙离子浓度，改善急性全脑缺血缺氧后的能量和物质代谢，提高学习记忆能力，抑制乙酰胆碱酯酶和单胺氧化酶B活性。
全文摘要
本发明公开了山茱萸提取物及其制备方法，还公开了山茱萸提取物的制药新用途，即在制备治疗缺血性血管病的药物的应用，所说的缺血性血管病包括动、静脉系统病损引起的血管痉挛、血栓形成或血管闭塞，或者所造成的器官局部循环或功能障碍。临床上主要指动脉硬化、短暂性缺血发作、组织器官梗塞、或周围血管闭塞等。
文档编号C07H1/00GK1424319SQ0215950
公开日2003年6月18日 申请日期2002年12月30日 优先权日2002年12月30日
发明者李林, 赵玲, 张兰, 叶翠飞 申请人:首都医科大学宣武医院