专利名称：肾移植耐受的确定方法
肾移植耐受的确定方法本发明涉及一种根据多个生物标志的水平确定个体移植耐受性的方法。本发明还涉及一个含有用于测定生物标志水平所需试剂的试剂盒。本发明还涉及了一种传感器，用于测定多个决定个体移植耐受性基因的表达水平。移植耐受性是指在持续无免疫抑制治疗的情况下稳定维持良好的异源移植功能。在临床领域，仅当患者尽管在长期停止接受所有的免疫抑制治疗时，仍具备稳定的同种异体移植功能时可见。这一状态被称之为可操作的耐受，在肾移植中很少有报道(1-5)，在肝脏移植中更为常见出、7)。肾移植患者的长期生存依赖于药物持续诱导的免疫抑制。然而，这通常伴随着发病率和死亡率的提高，主要是心血管疾病，偶然机会引起的感染和恶性肿瘤(8)。目前，我们不能提前确定哪些患者会对他们接受的移植体耐受，哪些患者可以从部分或完全中止免疫抑制获益。因此，日益需要研发检测和鉴定生物标志，从而能够使临床医生在患者自身特异的免疫特性的基础上，安全地使免疫抑制作用最小化。先前的研究已经在肝移植受体中鉴定出耐受相关的生物标志。特别研究了儿童受体的患者群中的细胞因子基因的多态性。与持续接受免疫抑制的对照组患者相比，所有未进行免疫抑制的患儿和绝大多数接受最小量免疫抑制的患儿显示出较低的肿瘤坏死因子(TNF)-Q和高度/中度白介素(IL)-1O (36)。此外，在两组患者之间，还存在树突细胞亚群比率的差异。与持续接受免疫抑制的患者相比，类浆细胞树突细胞(PDC2)，即报道的选择诱导的T-辅助细胞(Th) 2型应答的循环水平相对于单核树突细胞(pDCl)来说更为普遍，后者在未接受免疫抑制或最小量免疫抑制的患者体内诱导Thl型应答(37)。研究者进一步尝试使用外周血液基因表达特征和大量血细胞免疫表型来确定成人肝脏移植受体耐受的生物标志。研究证明，可操作的耐受患者可通过编码Y S T细胞的基因和自然杀伤(NK)细胞受体，以及涉及细胞增殖阻滞的基因得以确定(38)。他们还在耐受患者体内发现了大量的潜在的周期调节T-细胞亚群、⑶4+⑶25+T细胞和Y S T细胞，特别是在上皮组织的免疫调控过程涉及的S Vl+亚型。有趣的是，之前观察到的树突细胞亚群比率的差异在该患者群 体内没有发现。研究了相同群体内肝移植受体的外周血中的基因表达特征，与中断免疫抑制的患者及健康对照相比，前者成功尝试了中断过程，但导致需要重新采用免疫抑制的急性细胞排斥(39)。他们确定了三个不同的基因，涉及适量的基因(2至7个之间)，以区别耐受和非耐受同种异体肝移植受体与健康者对照。对附加的肝移植受体的独立人群中验证了可操作的耐受的基因组印记，其主要特征是由NK细胞、CD8+细胞和Y ST细胞表达的多种细胞表面受体编码基因的上调。外周血内假定的调节性T细胞(⑶4+CD25+Foxp3+，y S TCR+和S ITCR+T细胞)的扩增也在这一组新的耐受受体中观察到。总体而言，结合外周血中的转录特征和流式细胞仪研究可以确定那些能够在不接受药物免疫抑制的情况下接受移植体的肝移植受体。索里娄(Soulillou)等分析了五个可操作的耐受性肾移植受体中的TCR (T细胞抗原受体)，并在这些偏离的TCR 链使用的患者中进行论证，主要观察了⑶8+亚型。这些细胞具有细胞因子(IL10，IL2，IL13，IFN-Y )转录下降的特征，代表一种反应低下状态(40)。与慢性同种异体移植排斥的患者相比，耐受患者体内还有明显较少的循环⑶8+CD28_W巴球功能细胞，这意味着在这些患者体内存在对细胞毒性的抑制(Baeten等，2005(45))。随后，该研究组使用基因表达芯片来鉴定一套33个基因，能够区分高度特异的可操作的耐受性肾移植受体和急性/慢性同种异体移植排斥及相应年龄的健康志愿者(41)。与对照组相比，耐受患者体内共刺激基因和早期及后期T细胞活性标志的表达量有所减少，尽管耐受患者体内的抗炎症的细胞因子一转化生长因子P (TGFP)并未像很多TGFP调节基因那样上调。该研究组还分析了一组含有8个可操作的耐受肾移植受体的血细胞的表型和转录模式，研究表明与慢性排斥患者对照组相比，该组显示了较高的循环B细胞和调节性T细胞(⑶25hira4+)，而在慢性排斥受体体内则表现有F0XP3转录水平的显著下降(42)。有趣的是，在本研究中，临床耐受患者的血细胞表型与健康个体之间没有差别，这意味着可操作的耐受并非归因于调节性T细胞的增长，而是由于慢性排斥患者体内缺乏对自然状态的维持。相反，另一个研究组报道了与慢性排斥患者、透析患者和健康对照组相比，在长期稳定性肾移植受体内表现有更为多变的TCR-V ^组成和较高的CD4+CD25high百分比，该两个是没有接受免疫抑制的(43)。在波罗尔德(Brouard)等2007发表的文章中(41)，使用了 49个基因，在训练组内获得90%的最大灵敏性。绝大多数不同的33个基因被用来区分耐受和慢性排斥的个体。MS4A1是一种又被称为⑶20的分子，它在B淋巴细胞的表面表达。该分子出现在Brouard等2007的文章(41)中的两个基因组中，例如33个基因和49个基因组。此外，娄伊特(Louyet)等2005 (44)确定MS4A1为一种大鼠动物模型中的移植耐受相关标志。这提出需要一种改进的方法来有效地确定个体对器官移植的耐受。本发明提出了一种确定个体对肾移植免疫耐受的方法，包括确定从个体体内获得的样品中的 TLR5、PNOC, SH2D1B、CD79B、TCL1A、HS3ST1、MS4A1、FCRLl、SLC8A1 和 FCRL2 基因内选择至少两个基因的表达水平。通过上述确定的结果，可能会高度特异性和灵敏性地确定个体是否对器官移植具有免疫耐受。特异性是指本方法确定为非耐受的真阴性(非耐受个体)比例。灵敏性是指本方法确定为耐受的真阳性(耐受个体)比例。本方法提供了一个高度精确的测试，能够仅通过检测少量的生物标志(例如，基因表达水平)而相对容易地进行。从而提供了一种针对个体对器官移植耐受性的简单且有效的测试。“免疫耐受”一词对本领域的技术人员来说是非常熟悉的，该术语是指在持续无免疫抑制治疗的情况下，能够稳定的维持良好的异体移植功能。在临床领域，仅当患者在很长一段时间内即使停止了所有的免疫抑制治疗，例如一年，仍具有稳定的异体移植功能时才可视为免疫耐受。本发明的方法可用于确定个体对肾移植的耐受性。有研究表明，在能够耐受移植器官的个体中，SH2D1B、PN0C、CD79B、TCL1A、HS3ST1、MS4A1、FCRLl和FCRL2基因的表达水平升高，而TLR5和SLC8A1基因的表达水平则降低。这些基因的任意组合都可用于确定个体对器官移植的耐受性。尽管这10个基因都可用于耐受性的确定，也可优选为仅用2、3、4或5个基因来确定，进一步优选为仅用3个基因来确定。
更优选地，本发明公开的方法包含确定从个体获得的样本中的TLR5、PNOC和SH2D1B基因的表达水平。个体对器官移植耐受性的阳性预测是由SH2D1B和PNOC的高表达水平和TLR5的低表达水平决定的。如本领域的技术人员所熟知的那样，本发明公开的方法还包括确定CD79B、TCL1A、HS3ST1、MS4A1、FCRLl、SLC8A1和FCRL2基因中的一个或多个基因的表达水平。本发明公开的方法还可以进一步包含确定一个或多个适当的对照基因的表达水平。适当的对照包括HPRT (次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶)、￠-肌动蛋白和￠2微管蛋白。对照基因的水平在耐受和不耐受个体之间不存在明显的差异。在本发明的一个优选的具体实施例中，耐受个体的概率(P-Tol)可由下列公式计算得出:P-Tol=ez/(ez+l)，其中
Z=-4.4347+2.7191X[SH2DBl]-4.198733X[TLR5]+3.300620X[PNOC]
P-Tol值大于0.11时说明该个体是耐受性的。这个公式用于使用微芯片分析确定基因的表达水平。如果基因表达水平是通过其他方法来确定的，例如RT_PCR(实时聚合酶链式反应)，那么则需要对这个公式进行修订。更具体地说，在本发明的一个优选实施例中，当使用RT-PCR时，个体耐受概率(P-Tol)的计算公式为:P-Tol=ez/(ez+l)，其中
Z=-14.457+94156X[PNOC]+6.289X[SH2DBl]+5.054X[TLR5]-1.523X[PNOC]X[SH2DB1]-51.584X[PNOC]X[ TLR5]-2.339X[SH2DB1]X[TLR5]
每个基因的表达水平表示为2_dCT，其中dCT为每个基因与对照基因之间的CT值(每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数)差。另一个公式可用于提供一个对概率在大幅度上的确定测量。这个可选用的方程对于本领域的技术员来说是可以理解的且方便计算的。本发明的方法还包括确定B细胞和NK细胞的水平。通过确定B细胞和NK细胞的水平，可进一步提高本方法的特异性和灵敏性。更具体地说，在对移植器官耐受的个体体内，B细胞和NK细胞的水平都有所增加。本发明还包括确定⑶4+⑶25int T细胞的水平。通过确定⑶4+⑶25int T细胞的水平，可进一步提高本方法的特异性和灵敏性。更具体地说，在对移植器官耐受的个体体内，⑶4+⑶25int T细胞的水平相对于⑶4+T细胞的水平有所降低。本发明的方法还包括确定供体特异性CD4+T细胞的水平。供体特异性CD4+T细胞的水平可使用以下所述的IFN-Y ( Y干扰素)ELISPot (酶联免疫斑点法)分析确定。通过确定供体特异性CD4+T细胞的水平，可进一步提高本方法的特异性和灵敏性。通过确定供体特异的CD4+T细胞的水平，可确定个体对供体器官的应答。更具体地说，在对移植器官耐受的个体体内，这种应答(供体特异性CD4+T细胞的水平)有所降低。本发明所述方法还包括确定⑶4+T细胞FoxP3与a-1，2_甘露糖苷酶基因的表达t匕。通过确定⑶4+T细胞FoxP3与a-1,2-甘露糖苷酶基因的表达比，可进一步提高本方法的特异性和灵敏性。更具体地说，在对移植器官耐受的个体体内，该比值有所增加。本发明所述方法还包括确定⑶19+与⑶3+细胞的比率。通过确定⑶19+与⑶3+细胞的比率，可进一步提高本方法的特异性和灵敏性。更具体地说，在对移植器官耐受的个体体内，该比值有所增加。本方法用于取自个体的样本。该样本可以是任何一种能够检测上述标志的合适样本。这些样本可以是血液、血清和其他血液组分、尿液或移植的活组织样本。最优选的样本是外周血。SH2D1B (含有蛋白IB的SH2结构域)对该领域的技术人员来说是一个熟知的标准术语。更具体地说，人体SH2D1B的多形性形式的序列可从NCBI蛋白质数据库中获得，其登录号为 G1:42744572，版本号 AAH66595.1 ;登录号 Gl: 54792745，版本号 NP444512.2 ;登录号 G1: 18490409，版本号 AAH22407.1 和登录号 G1:55960297，版本号 CAI15780.1。TLR5 (Toll样受体5蛋白)对于本领域的技术人员来说是一个熟知的标准术语。更具体地说，人体TLR5的多形性形式的序列可从NCBI蛋白质数据库中获得，其登录号为GI =80478954,版本号 AA109119.1 ;登录号 GI =80475052,版本号 AA109120.1 ;登录号 GI:13810568，版本号 BAB43955.1 ;登录号 G1:222875780，版本号 ACM69034.1。PNOC (痛敏肽)对于本领域的技术人员来说是一个熟知的标准术语。更具体地说，人体PNOC的多形性形式的序列可从NCBI蛋白质数据库中获得，其登录号为GI =49456885,版本号 CAG46763.1 和登录号 G1:49456835，版本号 CAG46738.1。CD79B (B细胞抗原受体复合物相关蛋白P链)对于本领域的技术人员来说是一个熟知的标准术语。更具体地说，人体CD79B的多形性形式的序列可从NCBI蛋白质数据库中获得，其登录号为G1: 1087009，版本号AAC60654.1和登录号G1:20987620，版本号AAH30210.1。 TCLlA (T细胞白血病/淋巴瘤1A)对于本领域的技术人员来说是一个熟知的标准术语。更具体地说，人体TCLlA的多形性形式的序列可从NCBI蛋白质数据库中获得，其登录号为 G1:48145709，版本号 CAG33077.1 ;登录号 G1: 148922879，版本号 NP_001092195.1 ；登录号 G1: 11415028，版本号 NP_068801.1 ;登录号 G1: 13097750，版本号 AAH03574.1 ;登录号 G1:46255821，版本号 AAH14024.1 和登录号 G1: 13543334，版本号 AAH05831.1。HS3ST1 (硫酸乙酰肝素(葡糖胺)3-0-磺基转移酶I)对于本领域的技术人员来说是一个熟知的标准术语。更具体地说，人体HS3ST1的多形性形式的序列可从NCBI蛋白质数据库中获得，其登录号为G1:116283706，版本号AAH;25735.1和登录号G1:34785943，版本号 AAH57803.1。MS4A1 (跨膜4-结构域，A亚家族，成员I ;B_淋巴细胞抗原⑶20)对于本领域的技术人员来说是一个熟知的标准术语。更具体地说，人体MS4A1的多形性形式的序列可从NCBI蛋白质数据库中获得，其登录号为G1:23110989，版本号NP_690605.1 ;登录号GI:23110987，版本号 NP_068769.2 和登录号 G1: 12803921，版本号 AAH02807.1。FCRLl (这里又称作THC2438936) (Fe受体样蛋白I靠近3’段(FCRLl)基因)对于本领域的技术人员来说是一个熟知的标准术语。更具体地说，人体FCRLl的多形性形式的序列可从NCBI蛋白质数据库中获得，其登录号为G1:55662454，版本号CAH73053.1 ;登录号 G1:55661513，版本号 CAH70234.1 ;登录号 G1:55661511，版本号 CAH70232.1 ;登录号G1:21707303，版本号 AAH33690.1 和登录号 G1:117606520，版本号 ABK41917.1。SLC8A1 (溶解物载体家族8 (钠/钙交换蛋白)，成员I)对于本领域的技术人员来说是一个熟知的标准术语。更具体地说，人体SLC8A1的多形性形式的序列可从NCBI蛋白质数据库中获得，其登录号为G1:68087008，版本号AAH98285.1和登录号G1:67514242，版本号 AAH98308.1。
FCRL2 (Fe受体样蛋白2)对于本领域的技术人员来说是一个熟知的标准术语。更具体地说，人体FCRL2的多形性形式的序列可从NCBI蛋白质数据库中获得，其登录号为G1:55662464，版本号 CAH73063.1 ;登录号 G1:55662461，版本号 CAH73060.1 ;登录号 GI:46623042，版本号 AAH69185.1 和登录号 G1:117606518，版本号 ABK41916.1。FoxP3 (叉头框P3)对于本领域的技术人员来说是一个熟知的标准术语。更具体地说，人体FoxP3的多形性形式的序列可从NCBI蛋白质数据库中获得，其登录号为GI:146262391，版本号 ABQ15210.1 ;登录号 GI =219518921,版本号 AAI43787.1 ;登录号 GI:219517996，版本号 AAI43786.1 ;登录号 G1:109731678,版本号 AAI13404.1 ;登录号 GI:109730459，版本号 AAI13402.1 和登录号 G1:63028441，版本号 AAY27088.1。a -1, 2-甘露糖苷酶对于本领域的技术人员来说是一个熟知的标准术语。更具体地说，该术语是指a-1，2-甘露糖苷酶Al形式。人体a-1，2-甘露糖苷酶Al的序列可从NCBI蛋白质数据库中获得，其登录号为G1:24497519，版本号NP_005898.2。为了避免出现不确定性，上述标志的特异序列是根据本应用提出优先权日期时数据库中的版本号决定。标志的特异序列是可以仿效的。本领域的技术人员将会意识到人群中存在多形性变体。确定基因表达水平有很多种方法，包括Northern印迹(RNA印迹杂交)、mRNA微芯片分析、RT-PCR、差异显示、RNA干扰、报告基因分析和诸如基因表达序列分析(SAGE)之类的以碱基为基础技术。这些方法对于本领域的技术人员来说是熟知的(见Matthew Avison列举的基因表达测定，2007，由Taylor&Francis组出版；ISBN:978-0-415-37472-9 (简装本)978-0-203-88987-9 (电子版))。也可测定编码蛋白质的表达水平，从而确定基因表达水平。本领域的技术人员知道很多种确定蛋白表达的方法。
本发明所述方法中测定作为附加生物标志的不同细胞类型的水平可使用任何适当的方法检测。例如，使用适合抗体的流式细胞仪来测定。该方法对于本领域的技术人员来说是熟知的。可以使用任何适当的方法来测定CD4+T细胞供体特异的低反应性水平。适当的方法包括利用ELISA、流式荧光检测技术测定IFNy产量，或使用流式细胞术测定细胞内的细胞因子产量。在进行上述测定时，本优选地包含以下步骤:
a.取得一定数量的来自受体的CD4+T细胞；
b.用来自供体的细胞或作为供体具有相同HLA(人类白细胞抗原)_类型II个体的细胞刺激CD4+T细胞(于血清精度)，其中细胞受到辐照(细胞优选为耗尽T细胞和NK细胞的PBMC (外周血单核细胞)(使用⑶2和TCRgd抗体))；
c.用来自与供体和受体之间的情况类似的HLA-1I类错配的“第三方”的细胞刺激⑶4+T细胞(通常这些细胞是耗尽T细胞和NK细胞的PBMC (使用⑶2和TCRgd抗体))；
d.用来自与供体和受体之间的情况完全相同的HLA-1I类错配的“第四方”细胞刺激⑶4+T细胞(通常这些细胞是耗尽T细胞和NK细胞的PBMC (使用⑶2和TCRgd抗体))；
e.测定由⑶4+T细胞生产IFNy的相对水平。确定供体特异性的⑶4+T细胞水平的适宜方法如下所示。为了根据上述方法确定标志的水平是否大于(高于)或小于(低于)正常值，通常需要确定非耐受个体相关人群的正常水平。可在免疫抑制药物治疗水平和类型、种族背景或其他能够影响标志正常水平的其他特征的基础上进行确定相关人群，例如器官移植人群。一旦已知正常水平，则使用标准的统计方法来比较检测到的水平和差异的显著性。如果测定的水平和正常水平之间存在明显差异(例如，一个统计学上的显著差异)，那么该个体可被认为是免疫耐受的。所述的技术允许监测个体对移植体(例如，移植器官)的耐受性，从而确定能够停止免疫抑制药物治疗或减少免疫抑制药物治疗的个体。该技术也有助于移植器官受体的免疫抑制方案管理和移植后控制。本发明还提供了一个用于检测包括 TLR5、PNOC, SH2D1B、CD79B、TCL1A、HS3ST1、MS4A1、FCRLl、SLC8A1和FCRL2在内的一组基因中的至少两个基因表达水平的传感器。优选地，这个传感器用于监测TLR5、PNOC和SH2D1B基因的表达水平。适用于监测微芯片中基因表达水平的传感器是本领域中的技术人员所熟知的，包括mRNA芯片、蛋白表达传感器等。这些传感器通常包括一个或多个待测基因特异性的核酸探针粘附在传感器表面上。因此，核酸探针能够从目标基因检测基因转录。优选地，该传感器还进一步用于检测CD79B、TCL1A、HS3ST1、MS4A1、FCRLl、SLC8A1和FCRL2基因中的一个或多个甚至所有基因的表达。本发明还提供了一个包含有检测包括TLR5、PN0C、SH2D1B、CD79B、TCL1A、HS3ST1、MS4A1、FCRLU SLC8A1和FCRL2在内的一组基因中的至少两个基因表达水平所用试剂的试剂盒。该试剂盒包括用于检测TLR5、PN0C和SH2D1B基因的表达水平的试剂。优选地，该试剂盒还包含用于检测CD79B、TCL1A、HS3ST1、MS4A1、FCRLl、SLC8A1和FCRL2基因中的一个或多个基因表达所用试剂的试剂盒。检测这些基因表达水平的试剂优选为通过RT-PCR检测的试剂。该试剂盒还具有一个含一种算法的计算机程序，用于计算个体耐受的概率，以及上述方法操作所需的说明和其他事项。本技术特别的方面将参考以下附图通过举例的方式进行描述。
图1是对训练集( A-D)和测试集(E-H)外周血淋巴细胞子集的流式细胞仪分析。淋巴细胞子集被定义为=B细胞为⑶19+淋巴细胞(A，E)、NK细胞为⑶56+⑶3淋巴细胞(B，F) ;T细胞为CD3+淋巴细胞(C，G)。CD19+:CD3+的比值如图所示(D，H)。图中还显示了中值和四分位差，以及用于比较Tol-DF (免疫耐受-无药物治疗)患者和其他组之间的曼-惠特尼 U 检验(Mann-Whitney U 检验)的双侧检验 P 值(***p〈0.001, **p〈0.01 或 *p〈0.05)。表5为其他组间的P值。图2是对训练集(A&B)和测试集(C&D)外周血T细胞表达的流式细胞仪分析。图中显示了具有中级(⑶4+⑶25int)和高级(⑶4+⑶25hi)⑶25表达的⑶4+T细胞百分比的中值和四分位差，以及用于比较Tol-DF患者和其他组之间的Mann-Whitney U检验的双侧检验P值(**) p〈0.01或(*) p〈0.05)。表5为其他组间的P值。图3中(A)在训练集中供体特异的(DSA)和非特异的(NDSA)抗HLA类型I (Cl)和类型II (CU)抗体的血清阳性检测的每组中患者的百分率。(B)补体结合(IgGI，IgG3)或非补体结合(IgG2，IgG4)DSA存在(+ve)或缺失(_ve)患者的肾功能。图中显示了值和四分位差，以及各组之间的Mann-Whitney U检验的双侧检验P值(*p〈0.05)。值得注意的是，在耐受受体体内缺失DSA水平。图4显示了用于检测训练集(A)和测试集(B)患者体内直接的同种异体反应途径的IFNYELISpots (干扰素-Y酶联免疫斑点法)。当用供体细胞和第三方细胞(3rdP)刺激时，计算受体CD4+T细胞内产生IFNy的细胞数量(扣除背景)，以获得一定频度的应答细胞。图中显示有供体:3rdP刺激的应答频率比值的中值和四分位差。该比值大于1.5时表示对供体的低反应性。图中还有各组之间的Mann-Whitney U检验的双侧检验P值(**p〈0.01，*p〈0.05)。各个患者对供体和3rdP的IFNyELISpot应答频率如图10所示。供体与3rdP频率之间的魏克森(Wilcoxon)检测的p〈0.05。图5显示了 FoxP3和a -1, 2_甘露糖苷酶外周血表达的qRT_PCR基因表达分析。计算了训练集(A)和测试集(B)患者中FoxP和a-1，2-甘露糖苷酶的表达水平比值。图中显示了中值和四分位差，以及用于比较Tol-DF患者和其他组之间的Mann-Whitney U检验的双侧检验P值(#*p〈0.001，**p〈0.01)。其他研究组之间比较的统计值如表6所示。FoxP和a-1,2-甘露糖苷酶在个体内的表达水平分别如图1lA和IlB所示。图6显示了训练集(A)和测试集(B)患者中使用10多个最高等级基因绘制的ROC(受体运转特征)曲线(黑线)。使用外周血的微芯片分析检测明显差异的基因表达。对微芯片数据使用四类克-瓦氏(Kruskal-Wallis)分析确定的前10个重要基因构建回归模型，从而对ROC曲线进行分类(Tol-·DF vs非耐受组，不包括HC)。根据具有1%FDR (错误发现率)的P值的基础上排列训练集内的基因。相同的2-类模型被用于评估使用相同基因检测测试集内Tol-DF受体的诊断能力。图7显示了使用微芯片分析鉴定的跨平台生物标志和基因产生的训练集(A)和测试集(B)的ROC曲线。使用4个生物标志:B/T淋巴细胞比例，％CD4+⑶25int、抗供体:抗3rdP ELISpot频率的比率以及FoxP3/ a -1, 2_甘露糖苷酶的表达，并结合10个重要基因产生两类ROC曲线(Tol-DF vs非耐受组，不包括健康对照HC)。根据使用二进制回归步骤计算耐受的跨平台生物标志信号(4个生物标志+10个基因)的基础上被分类为耐受的训练集(C)和测试集(D)。图8显示了训练集和测试集患者体内外周血B细胞分析。(A)通过开启⑶19+淋巴细胞分析的B细胞亚组，定义如下:后记忆B细胞⑶19+⑶27+IgD-⑶24+⑶38-/int ;初始/ 成熟 B 细胞 CD19+CD27-CD24intCD38int ；T1/T2 过渡 B 细胞 CD19+CD27_CD24+CD38hi。初始B细胞(B)，T1/T2过渡B细胞(C)和记忆B细胞(D)占B细胞总数的百分比。T1/T2过渡B细胞:记忆B细胞的百分数比例(E)。图中显示了中值和四分位差。当差异显著时，显示了各组之间Mann-Whitney U检验的双侧检验p值(*p〈0.05, **p〈0.01)。图9显示了 B细胞细胞因子产生分析。当用佛波醇12-豆蘧酸盐13-醋酸盐和离子霉素在体外对PBMC刺激后，利用细胞内细胞因子染色方法估计B细胞TGFP (A)、IL-1O (B)和IFNy (C)的产生。结果由产生细胞因子的B细胞数量表示(通向⑶19+淋巴细胞)，对刺激(+ )和非刺激(_)的培养物进行流式细胞仪分析，每个样本分析IX 104个细胞，同时在图中表示了每组的中值和四分位差。图(D-F)以每个细胞因子反应的比率显示了每IX IO4个刺激的B细胞中细胞因子产生细胞的数量。图G显示了 TGFP和IFNy细胞因子应答，其中每个患者由一个实心圆表示，黑色填充的圆形代表Tol-DF患者，图中显示Tol-DF患者的B细胞产生TGFP的能力高于IFN Y。各组间Wilcoxon配对检验的P值(A-C)和Mann-Whitney U检验(D-F)的双侧检验值图中也有显示(*p〈0.05，#p〈0.01，_p〈0.001)。样本数:HC=8, Tol-DF=IO, s_LP=8，s_CNI=16，CR=4。
图10显示了细胞功能分析测定训练集(A)和测试集(B)中由IFNyELISpot引起的直接同种异体反应性途径。计算了受体CD4+T细胞内产IFNy细胞的数量。数据显示了扣除背景后的T细胞对供体抗原呈递细胞APCs Co抗供体应答)或等同于错配的第三方APCs (倒三角表示抗3rdP应答)的T细胞应答频率(I应答/n细胞)和中间组频率(黑条)。供体与3rdP频率之间的Mann-Whitney U检验的双侧检验P值(**p〈0.01)如图所示。图11显示了在训练集和测试集的外周血样本中(A) FoxP3和(B) a -1, 2_甘露糖苷酶表达的qRT_PCR(荧光实时定量PCR)分析。相对于HPRT的表达水平单位计算FoxP3和a -1, 2-甘露糖苷酶的表达水平。表达水平明显较高时,标示出各组之间的Mann-WhitneyU检验的双侧检验 p 值(*p〈0.05，**p〈0.01，***p〈0.001)。图12显示了利用微芯片和qRT-PCR分析训练集中所选择的展示显著差异表达的基因(A-E)表达的相互关系。计算每个患者在微芯片上的每个探针的信号强度数据，计算每个基因相对于HPRT的表达量，即log2 [感兴趣的基因]_log2[HPRT]。qRT-PCR的数据被描述为单位/HPRT。其中显示了皮尔森(Pearson)和斯皮尔曼(Spearman)等级相关系数和P-值。同组基因的RT-PCR基因表达数据显示在F-J。图中还显示出每组的中值和四分位差。利用Mann-Whitney U检验各组之间的统计比较,并标识出显著性p值(*p〈0.05,**p〈0.01, ***p〈0.001)。图13显示了利用微芯片和qRT-PCR检测测试集中所选择的展示显著差异表达的基因(A-E)表达的相互关系。计算每个患者在微芯片上的每个探针的信号强度数据，计算每个基因相对于HPRT的表达量，即log2 [感兴趣的基因]_log2[HPRT]。qRT-PCR的数据被描述为单位/HPRT。其中显示了 Pearson和Spearman等级相关系数和p-值。同组基因的RT-PCR基因表达数据显示在F-J。图中还显示出每组的中值和四分位差。利用Mann-Whitney U检验各组之间的统计比较,并标识出显著性p值(*p〈0.05, **p〈0.01,***p〈0.001)。图14显示了二元回归模型的结果，用于交叉验证选择的生物标志组合。MSE=均方误差，SD=标准差。图15是显示每组中3个基因(SH2DB1，PNOC和TLR5)表达水平的箱线图。图16是使用Logistic (逻辑)回归获得的ROC曲线，对TLR5、PNOC和SH2DB1三个基因之间的主要和相互作用进行分类。计算该样本中的AUC (曲线下面积)、灵敏性和特异性以得到最佳取点(例如0.0602)。图17显示了通过使用三个基因(SH2DB1，PNOC和TLR5)进行logistic回归分类估计耐受性概率的箱线图。图18显示了用三个基因(TLR5，SH2DB1和PN0C)估计的分类树。图中在每个终点指定了各个结果的每个节点(0-以上-非耐受，1-以下-耐受)和概率。图19显示了一系列说明分类树节点应用的箱线图。图20显示的是一个使用3个基因估计的分类树来预测耐受性的ROC曲线。图21显示的是通过患者群体构建的分类树指定的耐受概率频率的柱状图。
实施例
材料与方法研究患者:
对训练集的描述:
由耐受网络(IOT)表征的患者群体由71个肾移植受体和19个年龄与性别匹配的健康对照(HC)组成。5个患者组包括:11个功能稳定的肾移植受体(血清肌氨酸酐(CRT)<160umol/l,并且在过去12个月的增长〈10%)，尽管停止一年以上的免疫抑制治疗(Tol-DF)，11个具有稳定的肾脏功能的患者(相同的标准)，每天使用少于IOmg强的松作为唯一的免疫抑制剂(s-LP)，10个保持免疫抑制的患者(硝基咪唑硫嘌呤和强的松)，自移植以来都不用钙调磷酸酶抑制剂(s-nCNI)，30个维持标准钙调磷酸酶治疗(s-CNI)的患者，9个经活组织检查证明的患者(本研究均进行了重新估计)，并且免疫驱动了慢性排斥(CR)。患者的临床特征如表I所述。所有的样本均以盲测的方式进行处理和分析。对测试集的描述:
在美国招募了一组肾移植受体(ITN人群)。该ITN人群包括(I) “Tol-DF”(n=24)功能稳定的肾移植受体(血清肌氨酸酐(CRT)在基线的25%内)，尽管停止所有的免疫抑制治疗达一年以上；(2) “Mono”(n=ll)患者，具有稳定的肾功能，仅用类固醇单一治疗维持；
(3)“84[”对象(11=34)，使用与1'01-0 相同的标准具有临床稳定的肾功能，并且用三种药物免疫抑制方式(包括I丐调憐Ife酶或雷帕霉素革巴蛋白mTOR抑制剂、抗增殖剂和皮质留类)和“CAN”参与者(n=20)，被定义为慢性同种异体移植肾病和损伤的肾功能(相对于最初的移植后基线，其基线CRT有50%的增加)，这归因于假定的免疫介导的同种异体移植排斥。另一组由31名健康对照志愿者(HC)没 有肾病/肾功能障碍病史，或没有明确医学疾病患病证据。各组特征如表3所述。完整的血液mRNA和冰冻的PBMC由实验室进行上述选择的验证分析。血样:
在静脉放血24内，对所有训练集样本进行处理。使用淋巴细胞分选仪(PAA实验室，英国萨莫塞特郡)的密度梯度离心获取PBMCs。细胞清洗后重悬于10%的DMSO (Sigma公司，英国多塞特郡)和人血清(Biowest公司，法国)中，并立即冷冻于_80°C。24小时后转移至液氮存放备用。PBMC的流式细胞仪分析
融化后的PBMC清洗后重悬为lX106/mL。用滴定量的荧光结合的单克隆抗体来鉴定白血球，⑶45+⑶14-用于鉴定淋巴细胞，⑶3+用于鉴定T细胞，⑶19+用于鉴定B细胞，⑶56+⑶3-用于鉴定NK细胞，⑶4+⑶3+用于鉴定⑶4T细胞，⑶8+⑶3+用于鉴定⑶8T细胞。B细胞集群如上所述，⑶19+⑶27+IgD-⑶24+⑶38int用于后期记忆B细胞，CD19+CD27-CD24intCD38int 用于初始 / 成熟 B 细胞，CD19+CD27_CD24+CD38hi 用于 T1/T2过渡B细胞(以上均来自Caltag公司，美国伯林翰)。用多聚甲醛/PBS固定细胞，在48小时内从FAC Scalibur流式细胞仪获取数据。如参考文献(31)所述研究⑶4+T细胞的⑶25表达。利用500ng/mL佛波醇12-豆蘧酸盐13-醋酸盐和I y M离子霉素，在2 u M莫能菌素和10 u g/mL布雷菲尔得菌素-A存在下，于37°C处理5小时，体外刺激PBMC的细胞内细胞因子染色估计TGFP (来自R&D系统)、IL-10和IFNy (均来自eBioscience英国)的B细胞产生。抗供体抗体检测:将外周血收集在凝血激活因子采血器中(Becton Dickinson,美国圣何塞),使之在最少2小时，最多24小时内凝血。离心后收集血清并保存在_80°C备用。利用xMAP Luminex,液态悬浮芯片)技术筛选任何特异性的IgG抗HLA抗体
(32)。清洗后，被覆HLA的Luminex筛选小球和12.5 μl患者血清或对照血清被添加到平板上，在暗处温和混合30分钟。清洗平板3次，将结合PE (藻红蛋白)的目标抗人IgG (1:10)添加至每个测试孔中。孵育1小时，添加清洗缓冲液，然后参照操作手册使用LuminexlOO收集数据。IgG亚类和抗HLA广谱特异性的筛选:
检测阳性血清中的IgG亚类、类型I和类型II广谱特异性的差别。使用类型I和类型II的Luminex识别试剂盒(Quest生物医学公司)进行筛选。用于检测结合患者抗体的二级抗体为:与生物素结合的抗人IgGl (8c/6-39克隆，Sigma公司)，与生物素结合的抗人IgG2 (HP-6014克隆，Sigma公司)，与生物素结合的抗人IgG3 (HP-6050克隆，Sigma公司)，与生物素结合的抗人IgG4 (clone HP-6050，Sigma公司)和链霉素亲和素-藻红蛋白(Calbiochem 公司)。用于功能分析的细胞组分:
分析当天融化PBMCs。使用上述阴性免疫分离方法分离T细胞集CD4+和CD4+CD25-(扣除CD4+的CD25+细胞)(33)。利用流式细胞仪确定纯度。具体地说，本发明使用了两组特异的结合荧光染料的单克隆抗体来对分离的外周血单核细胞进行染色。对淋巴细胞(正向和CD45+CD14-表达选择)进行以下分析。第一组包括:TCRy / S -FITC，CD25-PE，CD4-APC。(FITC:异硫氰酸荧光素)。选择CD4+T细胞获得CD4+CD25int的水平，在这一组内研究CD25中间体的表达(限定为从CD25阴性到CD25，与CD4NEG细胞显示水平一样高的，高CD25细胞被排除在外)。第二组包括:CD3-FITC，CD56-PE和CD19-APC。选择CD19+细胞获得可变的“B.T”，通过CD3+淋巴细胞的百分比加以区分。供体、替代供体和第三方细胞:
来自31名肝肾供体的细胞被用于对训练集进行71供体特异性细胞分析，以及28个供体用于对测试集64个细胞样本的分析。在无法获得供体血的情况下，取具有与原始供体相同的HLA II类表达的替代供体细胞。这些细胞和类似地错配第三方细胞来自:安东尼 诺兰骨髓库登记处的健康志愿者、HLA类型的健康志愿者和来自伦敦汉默史密斯与盖伊医院的尸体捐赠者的脾细胞。当与相应供体和受体比较时，根据类型II (HLA-DR和HLA-DQMAHLC错配数选择类似错配的第三方细胞。用于ELISpot的MLR (混合淋巴细胞)培养物:
根据操作手册使用人IFN Y-ELISpotPRO试剂盒(Mabtech公司，瑞典)。使用ELISpot平板的自动成像分析仪(AID公司，德国)列举扣除背景的阳性点。使用从供体PBMCs或HLA-类型的第三方细胞分离到的无T细胞和NK细胞的PBMCs (APCs)的受体CD4+T细胞进行直接途径的供体抗体特异性应答T细胞频率的定量分析。异体移植物MLR培养24小时以上。通常从每孔2X 105个应答细胞开始进行三次两倍稀释设置重复。通过与在最高稀释中使用应答细胞数量相比一半的APCs来保持刺激物与应答细胞的比例一致，通常每孔2X105个应答细胞。利用对供体频率和对第三方频率的比表示供体的反应性。在数据库中记录频率倒数(例如，54000个细胞中的1个记录为54000)，从而当该比值大于1.5时表示对供体刺激的应答不足。用于基因表达分析的血样:
对于训练集来说，外周静脉血直接流入PAXgene全血RNA采血管(QIAgen公司，英国克劳里)中。使用包括DNAse I (脱氧核糖核酸酶I)处理的PAXgene全血RNA试剂盒(QIAgen公司)抽提全血RNA。对于测试集来说，外周静脉血直接流入Tempus 全血RA采血管(美国应用生物系统公司)中。根据操作手册抽提全血RNA。总RNA样本进行RT-PCR和微芯片分析确定基因表达。用于mRA研究的样本:
来自训练集的95个样本包括:13个来自IOTol-DF患者的样本，16个来自Ils-LP患者的样本，8个来自8s-nCNI患者的样本，40个来自28s_CNI患者的样本，10个来自9CR患者的样本和8个来自8HC的样本。来自测试集的142个样本包括:31个来自23Tol-DF患者的样本，14个来自IlMono患者的样本，52个来自34s_CNI患者的样本，25个来自18CAN患者的样本和20个来自20HC的样本。
RNA质量控制:
使用安捷伦(Agilent) RNA6000Nano试剂盒在Agilent2100生物分析仪(Agilent科技公司)上测定MXgene (训练集)和Tempus (测试集)纯化的RNA的质量和完整度。在ND-1000分光光度计(NanoDrop科技公司)上通过测定A260nm处的吸收值对RNA进行定量。RNA扩增和标记:
根据“基于单色微芯片的基因表达分析”方法(第5.5版，G4140-90040)对样本进行标记。简单地说，使用安捷伦低RNA输入线性扩增试剂盒(来自Agilent科技公司)，在青色素3-CTP存在的情况下，对0.5 ii g总RNA进行扩增和标记。使用ND-1000分光光度计测定cRNA的产量和染料结合率。RISET2.0Agilent 定制微芯片:
所有的全血样本在RISET2.0微芯片平台上进行杂交。这是一个定制的Agilent8X15K60mer寡核苷酸微芯片，包括5069个重复三次出现的探针。选择的探针对应于4607个具有有效的Entrez (因特兹)基因ID的基因，还有407个未指定有效Entrez基因ID的探针。在探针优化的杂交特性基础上，优化探针设计以检测一个基因的多种转录变体，并避免交叉杂交。在对RNA质量和完整性的控制后，使用Agilent基因表达杂交试剂盒(Agilent科技公司)中“基于单色微芯片的基因表达分析”方法进行杂交过程。简单地说，0.6ug溶于杂交缓冲液的用Cy3标记的cRNA碎片过夜杂交(17小时，65°C )至RISET2.0微芯片。杂交后，用Agilent基因表达漂洗缓冲液I在室温清洗一次，清洗时间为I分钟，之后用预热的(37°C )含有0.005%N-月桂酰肌氨酸的Agilent基因表达漂洗缓冲液2清洗第二次，清洗时间为I分钟。最后用乙腈清洗30秒。扫描和数据分析:
使用Agilent微芯片扫描系统(Agilent科技公司)检测Agilent微芯片上的突光信号。Agilent特征提取软件(FES v.9.5.1.1)用于读取和处理微芯片图像文件。为了确定差异的基因表达，使用罗塞特(Rosetta)解析基因表达分析系统(v.7.1.0.2，Rosetta制药公司)对FES来源的输出数据进行进一步的分析。首先，从IOT数据库中包含的所有样本中计算模拟共用基准。使用该基线，计算每个基因和样本的log2比率。同时，使用罗塞特分解(Rosetta Resolver)软件中的通用误差模型计算代表每个基因中样本与通用参照之间所观察到的差异可靠性的P-值(34)。注释富集分析:
不同样本组之间差异和两个研究组相同的基因列表对照完整的RISET2.0微芯片配置分析了生物途径注释的统计学重要富集。富集一词是指使用Fisher精密实验为预期的背景分布进行打分。注释源于不同的资源，例如基因本体(GO, www.geneontology.0rg)、信号通路、序列主题、染色体附近、文献关键词和细胞特异性标志基因。定量RT-PCR 分析:
使用qPCRlstStrand合成试剂盒(Stratagene公司)对200ng全血总RNA进行反转录，合成的cDNA用于RT-PCR分析。微芯片数据验证
利用定量RT-PCR对所选择的一套由微芯片基因表达分析鉴定的基因进行验证。使用来自美国应用生物系统公司的预制TaqMan (水解探针)平板对下列基因进行定量RT-PCR:Hs01017452_mlB 淋巴酪氨酸激酶(BLK)、Hs00236881_mlCD79b 分子(CD79b)、Hs01099196_ml硫酸乙酰肝素(葡糖胺)3-029磺基转移酶I (HS3ST1)、含有IB的Hs01592483_mlSH2结构域(SH2D1B)、Hs00172040_mlT 细胞白血病(TCL1A)。训练集中的其他分析筛查:
发明人还进行了间接途径IFN y ELISpot和直接与间接途径的trans-vivo DTH (体内转移性迟发型超敏反应)分析。对直接和间接途径培养的供体和受体细胞进行细胞因子基因的RT-PCR扩增，利用TC R-景观分析进行TCR-全侧面剖析(数据未显示)。统计学:
当n〈20，数据不遵循正态分布时，在很多组比较中非参数测试被用于评估统计学意义。魏克森(Wilcoxon)标志的等级检验被用于比较相同患者组内的应答。曼-惠特尼U检验(Mann-ffhitney U检验)被用于比较患者组之间的中值。为了比较临床变量之间的相互关系，通常作为绝对的数据和存在或不存在抗HLA抗体进行记录，使用费歇尔(Fisher)精度检验。当小于0.05时，双侧p值被用于表示差异显著。微芯片和生物标志的统计分析:
使用4类分析和克-瓦氏(Kruskal-Wallis)检验，结合本杰明-霍伯格检验(Benjamin1-Hochberg)调节1%的错误发现率(FDR) (12),统计地确定了微芯片检测到显著改变的表达。当数据似乎背离正常情况时，发明人选择一种非参数检验进行分析。使用类似的处理来排列生物标志(大规模检测，其遗漏值等于样本平均值)。为了评估变体数检测耐受患者的预测能力，发明人使用受体运转特征(ROC)曲线。为此，首先在训练集中进行四类分析，鉴定Tol-DF的差异表达探针，使用Kruskal-Wallis测试排序。然后在二元回归模型中添加显著差异表达的探针，并用于在样本中进行分类。二元回归处理用于计算每个主体是Tol-DF患者的概率p[l]，…，p[n]。通过在0至I之间改变概率阈值产生ROS曲线；对于每个阈值t来说，如果p [i] >t，那么主体i的实际等级与预期等级比的2 X 2分类表等同于“Tol-DF”。个体的自引重取样表示样本分类内的结果是坚定的。对于测试集来说，使用来自训练集分析的相同探针。耐受肾移植患者的人口统计学:训练集包括71个欧洲肾移植受体和19岁性别匹配健康对照(表I)。Tol-DF组具有高比例尸体供体(11个供体中有7个是尸体供体)、高度的HLA错配(中间错配4.0)，主要是男性(11个供体中有9个是男性)，该组有不同的原因导致晚期肾衰竭，以及一些敏感事件证据，例如输血和先前的移植(表2)。这些患者经历相对平安无事的移植后过程，其中仅有I名患者具有发生急性细胞排斥(ACR)的记录。无需免疫抑制的时间为期I年到21年。测试集的Tol-DF组(表3)包括24名患者，他们绝大多数接受了来自HLA高度匹配的活体供体的移植(中间错配0.0)，停止免疫抑制治疗长达I年至32年。Tol-DF受体出现B淋巴细胞和NK淋巴细胞数量的增长。如图1所示,训练集中的Tol-DF患者外周血B细胞和NK细胞的百分比有所增长，而T细胞的百分比则相应降低。当将B细胞与T细胞的百分比表示为一个比率时，Tol-DF患者于所有其他研究组相比具有较高的比率，包括HC。对于6位Tol-DF患者和10位s-CNI患者来说，也有可能计算每个淋巴细胞亚集中细胞的绝对数量。这表示可变的比例是由于B细胞和NK细胞数目的扩增，并不是T细胞数目的减少，因为Tol-DF组中没有一个是免疫缺陷的(表2)。与训练集中的结果一致，测试组中的Tol-DF患者体内外周血B细胞百分比有所增加，与其他所有组相比，除了 HC外，具有更高比率的B:T细胞百分比。假设Tol-DF患者体内检测到外周血B细胞有明显的增加，进一步评估来自两个研究集中所选患者的B细胞亚集分析(图8)和细胞因子产量(图9) Tol-DF组中的B细胞亚集展现重新分布的趋势，后期记忆库降低，并伴随过渡性和天然B细胞亚集的增加。当检测B细胞亚集百分率时，Tol-DF患者与CR患者相比具有明显较低的记忆B细胞比率和较高的过渡态B细胞。源自Tol-DF患者B细胞的绝大部分可在体外刺激下产生TGF β，而不是IL-1O或IFN Y。但是，任何研究组中都没有观察到IL-1O产量的显著差异。通过计算产每种细胞因子的B细胞数量比值分析来自每个患者分组的B细胞在刺激下产细胞因子的能力。这表明Tol-DF患者的B细胞具有偏离的细胞因子应答，其产TGF β的能力比来自其他研究组的B细胞高。
耐受受体的外周血内具有较少的活性⑶4+Τ细胞。按照上述方法分析⑶4+Τ细胞中CD25的表达。与HC、s-LP, s-nCNI和CR组相比，训练集中Tol-DF患者具有明显较低的循环⑶4+⑶25int T细胞百分比，大体上被认为是活性T细胞(9，10)(图2A)。有趣的是，仅在用s-CNI完全免疫抑制的患者和其他组患者之间仅检测到⑶4+⑶25hi调节T细胞百分比的明显差异(图2B)。相似的结果也见于测试集，其中Tol-DF患者的⑶4+⑶25int T细胞的百分比较s-CNI和CAN组明显更低，但To1-DF和其他研究组之间没有检测到⑶4+⑶hiTregs百分比的差异(图2C和2D)。其他组之间的统计比较如表5所示。当我们检测富集的CD4+CD25hi T细胞抑制因多克隆刺激诱导的自身T细胞增殖的能力是，我们发现任何患者组或健康对照之间没有明显差异(数据未显示)。此外，Tol-DF患者没有更高比率的其他调节T细胞亚集，例如⑶3+⑶8+⑶28-或⑶3+⑶4-⑶8-T细胞(数据未显示)。绝大多数耐受受体没有检测到抗供体HLA特异性抗体。利用Luminex xMAP分析，在来自所有训练集研究组的一些患者中检测到了血清非供体特异性抗体(NDSA)(图3A)。在这群人中，没有Tol-DF患者具有可检测的供体特异性抗体(DSA)，其中所有其他组中的一些患者具有可检测的DSA，几乎有一半的CR患者具有可检测的供体和非供体特异性抗HLA类型I和类型II抗体。与训练集类似，测试集中的22名Tol-DF患者中只有一名患者具有可检测的DSA (数据未显示)。有趣的是，通常DSA-阳性患者较DSA-阴性患者具有更差的移植功能，与DSA-阴性患者中估计的肾小球渗透率为60(幅度13-94)相比，DSA-阳性患者仅为31 (幅度17-87)。在训练集中检测到可能的检测抗供体抗体的致病性(图3B)。在20名具有抗类型I抗体的患者中的7位和13名具有抗类型II抗体的患者中的4位体内，发明人发现补体固定的同型抗原(IgGl和IgG3);其余阳性病例仅是非补体固定的同型抗原。NDSA抗类型I和抗类型II抗体的检测与之前接受移植有关，在移植前具有可检测的专门活性抗体(Fisher精确检验p〈0.05),但与之前的怀孕、输血、移植功能障碍或ACR发作无关。相反，DSA抗类型II抗体与之前的ACR发作和供体与受体之间HLA错配数量有关(Fisher精确检验P〈0.05)。耐受患者具有较低频率的直接途径抗供体IFNy⑶4+T细胞应答。与由IFNyELISport评估的直接途径的⑶4+T细胞抗供体和抗第三方(等同于与供体错配)应答相比，Tol-DF患者较训练集内其他所有稳定患者组具有明显更高应答抗供体:抗第三方频率比值，代表供体特异性的低反应性(图4A ;供体和第三方的个体应答频率如图10所示)。供体特异性的低反应性并不是由调·节性T细胞介导的，因为CD25+细胞从应答T细胞的耗尽并没有导致应答频率的增加(数据未显示)。由于测试集Tol-DF组通常与其供体完全HLA匹配，抗供体和抗第三方IFNy应答通常非常低(应答频率>1/200000)。尽管如此，Tol-DF组中抗供体应答的趋势通常会再生，尽管没有检测到与其他组有明显的不同(图4B)。耐受受体的外周血中有较高的FoxP3和α -1, 2_甘露糖苷酶基因的表达比率，由qRT-PCR分析得到的全血FoxP3和α· -1, 2_甘露糖苷酶基因的表达水平都与移植后抗供体免疫活性相关(图11)。当计算FoxP3和α-1，2_甘露糖苷酶基因表达比率时，训练集Tol-DF和CR与HC组之间检测到明显的差异(图5Α)。显示最高比率的患者组是HC，s_LP和Tol-DF，其中CR中的比率非常低(用于各组间比较的Mann-Whitney U检验P值如表6所不)。该比率明显与eGFR (表皮生长因子受体)相关,与血清肌氨酸酐相反(Pearson皮尔森系数:0.372p=0.002和-0.299p=0.014，数据未显示)。当对测试集进行同样的分析时，Tol-DF患者比率明显高于其他患者组，除了 HC (图5B)。结合训练集和测试集的观察结果显示耐受与外周血中FoxP3和α -1, 2-甘露糖苷酶基因的高表达比有关。耐受患者具有不同的基因表达特征。以移植研究为目的设计的RISET2.0定制微芯片包含5069个探针，用于分析外周血样本中4607个基因的表达(有效的Entrez基因ID)。对训练集进行微芯片数据的四类分析(图6)。使用Kruska-Wallis非参数测试，结合将错误发生率(FDR)调整为1%，统计确定Tol-DF患者于其他比较组、稳定受体(s-CN1、s-nCNI和s-LP )、CR和HR之间检测到显著改变的基因表达。HC组被弓I入这一分析中，从而解决与其他研究组相比Tol-DF患者中免疫抑制的缺乏。对应于255个基因的260个探针在研究组之间有明显的差异表达。当对测试集进行同样的分析时，对应于1352个基因的1378个探针有明显改变的表达，而训练集与测试集之间有174个探针(170个基因)是共同的(表7)。对列表中高度排列的若干探针进行qRT-PCR分析验证微芯片表达，包括下调或上调探针。使用两种分析所有基因的表达都是高度共相关的(图12A-E)，根据基因研究，所选择基因的qRT-PCR定量表达与至少一个其他患者组有明显差异(图12F-J)。有趣的是，训练集和测试集之间，Tol-DF患者样本中所有选择基因的中间表达水平非常相似，尽管测试集中具有更高的样本数，其相关系数通常更高(图13A-E)。此外，Tol-DF患者中检测的5个基因中的4个基因的基因表达与其他组中的绝大多数差异显著(图12&13F-J)。表8中显示了顶端排布探针的中间探针表达值。一种更为精确的基因表达分析的定量方法进行基因表达诊断能够确定非耐受个体的耐受性，这种能力是由微芯片分析鉴定的顶端排布基因进行研究，不包括用于任何单个基因(例如，排名第2和4的TCL1A，不包括排名第4的探针)的任何重叠探针，在附加的二元回归模式中绘制ROC曲线。这些探针被用于构建基因表达标记，通过首次产生预测类型(样本内)来特异性鉴定Tol-DF患者，从而对每个个体进行分类。为了进行这种分析，通过从非耐受比较组中包含和排除HC组建立两类ROC曲线(耐受与非耐受)。因为尽管健康对照与耐受个体相比是鉴定耐受特异性基因表达，在肾移植患者中研发进行临床耐受诊断测试时，这种比较是无用的。在排前10位的基因表达的基础上(表4)，排除HC建立相应的ROC曲线具有一个特异性和灵敏性为I的峰，其阈值是0.01，训练集(R0C包括HC ;阈值0.2、特异性0.853、灵敏性0.923)内100%相应阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)。尽管3个基因和6个基因足以在训练集内很好地分辨耐受患者，选择使用排前10位的基因，它们提高测试集ROC分析的特异性和灵敏性，其特异性为0.890，灵敏性为0.806，阈值为0.35，PPV和NPV分别为71%和93% (R0C包括HC ；阈值0.23，特异性0.801，灵敏性0.806)。发明人对训练集和测试集之确定的174个重叠探针进行注释富集分析。绝大多数与注释途径有关的基因在相关途径的B细胞内富集(表9)。与这些数据一致，排名前11的探针与10个基因、6个基因相关，由B细胞或相应于B细胞功能表达(表4)。除了本探针列表内富集的B细胞相关途径，其他途径也是非常重要的，包括蛋白质-酪氨酸激酶、次级信号分子的产生和其他T细胞激活相关途径(表9)。跨平台生物标志诊断能力
材料与方法部分描述的所有测试与其从所有其他研究组中区分Tol-DF患者的诊断能力并行测定对测试集的分析是对训练集内耐受的高度预测，这已在上文进行讨论。通过结合表示耐受的多种生物标志，发明人预期它可以明显提高任何个体测试的诊断能力。这确实在测试集中观察到了。事实上，当结合分析生物标志和微芯片数据，使用B/T淋巴细胞亚集比，2)CD4+CD25int T细胞百分比，3)抗供体比抗第三方ELISpot频率比，4)FoxP3/α-1，2-甘露糖苷酶表达比，5)排名前10基因特征，训练集的特异性和灵敏性为1，阈值为
0.01，这表示100%的PPV和NPV(图7Α)。当分析测试集时，获得一个特异性为0.923、灵敏性为0.903的峰，其阈值为0.27，PPV为80%，NPV为96% (图7Β)，这比仅获得基因表达的方法提高了诊断能力。因此，跨平台生物标志的应用提高了鉴定真实耐受性的能力，除了基因表达和表型分析，还考虑了个体的免疫功能状态，后者可能与描述耐受机制的基础的关系更为密切。在这一方面，研究患者T细胞和B细胞应答是有用的方法，也可能用作本发明的生物标志。跨平台生物标志的利用在于它能够确定未察觉的可操作耐受的肾移植患者。如图7C和D所示，测试集中5个稳定的受体具有耐受特征，可从免疫抑制的中断管理中受益。有趣的是，测试集中2个CAN患者也被鉴定为具有高概率的耐受性。该结果可用慢性排斥的临床评估中的不同来解释，与训练集中的CR组不同，CAN患者的活组织检查结果并不被证明具有免疫介导的排斥，但可在低移植功能的基础上确定。用于检测这些患者的跨平台生物标志具有足够的灵敏性来检测 这两组患者之间的微小差异，其性能可由对患者连续的免疫监测揭示。统计数据
权利要求
1.种确定个体对肾移植免疫耐受的方法，其特征在于，该方法包含确定从个体所获取样本的一组基因中选择的至少2个基因的表达水平，这组基因由TLR5、PNOC, SH2D1B、CD79B、TCL1A、HS3ST1、MS4A1、FCRLl、SLC8A1 和 FCRL2 组成。
2.权利要求1所述方法,其特征在于，SH2D1B、PN0C、CD79B、TCL1A、HS3ST1、MS4A1、FCRLl和FCRL2的表达水平比具有免疫耐受性个体的正常水平更高，而TLR5和SLC8A1的表达水平则比具有免疫耐受性个体的正常水平低。
3.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法确定了来自个体样本中的TLR5、PNOC和SH2D1B基因的表达水平。
4.权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法通过SH2D1B和PNOC的高表达水平，以及TLR5的低表达水平能够确定个体对器官移植耐受的阳性预测结果。
5.权利要求3所述方法，其特征在于，所述方法还确定了⑶79B、TCL1A、HS3ST1、MS4A1、FCRLl、SLC8A1和FCRL2基因中的一个或多个的表达水平。
6.上述权利要求中任意之一所述的方法，其特征在于，所述方法包含确定B细胞和NK细胞的水平，该两种细胞的水平升高代表免疫耐受。
7.上述权利要求中任意之一所述的方法，其特征在于，所述方法包含确定⑶4+⑶25int T细胞的水平，该细胞水平相对于⑶4+ T细胞总数而降低代表免疫耐受。
8.上述权利要求中任意之一所述的方法，其特征在于，所述方法包含确定供体特异性CD4+ T细胞的水平，该细胞水平的降低代表免疫耐受。
9.上述权利要求中任意之一所述的方法，其特征在于，所述方法包含确定CD4+T细胞的FoxP3与a -1, 2-甘露糖苷酶基因表达水平的比率，该比率高则代表免疫耐受。
10.上述权利要求中任意之一所述的方法，其特征在于，所述方法包含确定CD19+与CD3+细胞的比率，该比率高则代表免疫耐受。
11.上述权利要求任意之一所述的方法，其特征在于，所述方法将P-actin和/或HRPT的表达水平作为对照。
12.个传感器，其特征在于，所述传感器用于检测从包括TLR5、PN0C、SH2D1B、CD79B、TCL1A、HS3ST1、MS4A1、FCRL1、SLC8A1和FCRL2在内的基因中选择的至少2个基因的表达水平。
13.个传感器，其特征在于，所述传感器用于检测TLR5、PNOC和SH2D1B基因的表达水平。
14.权利要求13所述的传感器，其特征在于，所述传感器用于检测⑶79B、TCL1A、HS3ST1、MS4A1、FCRLl、SLC8A1和FCRL2中的一个或多个基因表达水平。
15.个试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测从包括TLR5、PNOC、SH2D1B、CD79B、TCL1A、HS3ST1、MS4A1、FCRLl、SLC8A1和FCRL2在内的基因中选择的至少2个基因的表达水平的试剂。
16.个试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测TLR5、PNOC和SH2D1B基因的表达水平的试剂。
17.权利要求16所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还进一步包含用于检测CD79B、TCL1A、HS3ST1、MS4A1、FCRLl、SLC8A1和FCRL2中的一个或多个基因表达水平的试剂。
18.权利要求15至17所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含利用RT-PCR检测基因表达水 平的试剂。
全文摘要
本发明涉及一种根据多个生物标志的水平确定个体移植耐受性的方法。本发明还包括一个含有用于测定生物标志水平所需试剂的试剂盒。此外，本发明还公开了一种传感器，用于测定多个决定个体移植耐受性基因的表达水平。
文档编号C12Q1/68GK103097549SQ201180032809
公开日2013年5月8日 申请日期2011年5月4日 优先权日2010年5月4日
发明者玛利亚·赫尔南德兹-富恩特斯, 艾琳·梅萨, 乌维·杨森, 斯蒂凡·汤米尤, 波吉特·萨维斯基, 汉斯-迪特·沃尔克, 罗伯特·莱克勒 申请人:伦敦国王学院, 柏林夏洛蒂医科大学, 美天旎生物技术有限公司