使用分析物和过程控制信号的单次读取确定而鉴定含分析物的样品的方法和设备的制作方法

专利名称：使用分析物和过程控制信号的单次读取确定而鉴定含分析物的样品的方法和设备的制作方法
使用分析物和过程控制信号的单次读取确定而鉴定含分析物的样品的方法和设备
相关申请案
本申请要求于2010年6月30日提交的美国临时申请No. 61/360，296的权益。此在先申请的全部公开内容据此以引用方式并入。发明领域
本发明涉及关于诊断测定法的生物技术子领域。更具体地讲，本发明涉及在包括内控的测定法中进行分析物检测，其中使用不同的探针检测分析物和内控。在一个高度优选的实施方案中，使用具有相同可检测标记物的不同杂交探针检测单一混合物中的核酸分析物。_4] 发明背景
检测分析物(如核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物等)的存在的现代测定法依赖于使用阳性对照来确认过程可靠性。例如，测定法可能力图使用核酸扩增和随后通过探针杂交和检测来测定靶核酸。经过扩增的样品可包含与分析物核酸共扩增的内控(下文称为“1C”) 核酸。扩增产物可有利地具有可使用不同的杂交探针检测的非相同序列。检测IC扩增产物将确认测定程序的扩增和检测组成部分的完整性。该信息在未能检出分析物扩增产物时很有用。在这种情况下检出IC信号可验证分析物阴性结果。分析物扩增子及IC扩增子的特异性杂交探针通常通过它们所具有的标记物或通过空间分离而区分。
包括内部过程控制的基于探针的测定法(包括蛋白和核酸测定法)对于IC和分析物的检测通常有以下区别之一 (I)独立于分析物来检测IC ;以及⑵独立于分析物加IC 的组合来检测分析物。美国专利No. 6，586，234使用检测IC和分析物核酸的两次读取系统阐述了这两种可能性。当独立于IC加分析物的组合来检测分析物核酸时，可针对所产生的分析物杂交信号落在阳性评分所需的阈值截止值之下的样品而评估后者的杂交信号。例如，低于分析物检测的阈值截止值的信号作为另外一种选择可表明不存在分析物或测定法失效。如果在代表IC加分析物的组合的第二次读取中检出信号，则将该结果解释为验证分析物阴性结果。换句话讲，检出IC加分析物的足够信号表明必须已经检出1C，并因此可验证分析物阴性结果。应当显而易见的是，这样的系统要获得成功取决于从代表IC和分析物的杂交信号的组合中分离分析物杂交信号的能力。
在分析物检测领域中遇到的一个难题涉及当不同探针(例如，流体连通且在溶液中游离而非固定的不同探针)之间无空间分离而进行检测时，分析多重反应所需的不同标记物的数量。这可以在共扩增IC核酸和两种不同的靶核酸的测定法的背景下加以理解。通过具有一个标记物的IC探针，用于检测其余两个靶标的一套探针可用第二标记物进行标记。第二标记物的阳性检测信号表明存在两种分析物之一，但不能将一者与另一者进行区分。随着分析物数量的增加，解析反应性物质所需的再次测试的次数也相似地增加。换句话说，在阳性评分多重测定法中用于鉴定反应性物质的再次测试负担是不利的，尤其是当阳性样品所占的分数变得很大时。
本发明解决了对简化的分析物鉴定系统的需求。
发明概沭
在一个方面，本发明涉及通过过程控制确定包含内控的样品中第一分析物存在与否的设备。一般而言，本发明的设备包括(a)被构造成容纳样品的支架；(b)被布置成当样品容纳在支架中时接收来自样品的光学信号的光学检测机构；以及(C)与光学检测机构通信的处理器(如计算机)，该处理器被编程为执行确定多种情形中的哪一种情形适用的步骤。根据本发明，除了内控外，样品进一步包含在接触内控后生成内控信号的内控探针； 如果第一分析物存在于样品中，则在接触第一分析物后生成第一分析物信号的第一分析物探针；以及任选地如果第二分析物存在于样品中，则在接触第二分析物后生成第二分析物信号的第二分析物探针。进一步根据本发明，光学检测机构被构造成测量内控探针和分析物探针所产生的组合信号而不用区分内控信号与分析物信号。光学检测机构任选地被构造成测量第二分析物探针所产生的第二分析物信号。再进一步根据本发明，处理器被编程为确定以下哪一情形适用(i)样品不含第一分析物，条件是组合信号的幅度小于第一分析物截止值并且(I)组合信号的幅度大于或等于有效性截止值或者(2)第二分析物探针包含在样品中，光学检测机构被构造成测量第二分析物信号，且第二分析物信号的幅度大于或等于第二分析物截止值，从而确立样品包含第二分析物；(ii)样品包含第一分析物，条件是组合信号的幅度大于或等于第一分析物截止值；以及(iii)无法确定样品是否包含第一分析物，条件是组合信号的幅度小于第一分析物截止值且小于有效性截止值，并且如果第二分析物探针包含在反应混合物中，且光学检测机构被构造成测量第二分析物信号，第二分析物信号小于第二分析物截止值。一般来讲，第一分析物截止值的信号量大于有效性截止值的信号量，并且内控信号的可检测最大值不能超过第一分析物截止值。
根据通过过程控制确定包含内控的样品中第一分析物存在与否的一般描述的设备的第一高度优选实施方案，光学检测机构被构造成测量通过第二分析物探针生成的第二分析物信号。这样的话，优选地，支架基本上不改变光学检测机构测量组合信号的运行过程中的温度；第一分析物、第二分析物和内控各自都包含核酸；且光学检测机构不测量第一分析物信号，也不测量内控信号。作为另外一种选择，优选地，光学检测机构不测量第一分析物信号，也不测量内控信号；并且设备进一步包括输出装置，其产生由处理器执行的确定步骤的有形记录(如，打印的记录或存储在计算机可读介质上的电子记录)。更优选地，支架基本上不改变光学检测机构测量组合信号的运行过程中的温度；第一分析物、第二分析物和内控各自都包含核酸；且光学检测机构不测量第一分析物信号，也不测量内控信号。这样的话，优选地，样品在光学检测机构测量组合信号的运行过程中保持基本上恒定的温度。这可(例如)涉及使用温控培养箱。作为另外一种选择，优选地，光学检测机构包括选自光度计和荧光计的检测器。更优选地，检测器为光度计。
根据通过过程控制确定包含内控的样品中第一分析物存在与否的一般描述的设备的第二高度优选实施方案，光学检测机构不被构造成测量通过第二分析物探针生成的第二分析物信号。这样的话，优选地，支架基本上不改变光学检测机构测量组合信号的运行过程中的温度；第一分析物和内控各自都包含核酸；且光学检测机构不测量第一分析物信号，也不测量内控信号。作为另外一种选择，光学检测机构不测量第一分析物信号，也不测量内控信号；并且设备进一步包括输出装置，其产生由处理器执行的确定步骤的有形记录。更优选地，支架基本上不改变光学检测机构测量组合信号的运行过程中的温度；第一分析物和内控各自都包含核酸；且光学检测机构不测量第一分析物信号，也不测量内控信号。这样的话，优选地，样品在光学检测机构测量组合信号的运行过程中保持基本上恒定的温度。 作为另外一种选择，优选地，光学检测机构包括选自光度计和荧光计的检测器。更优选地， 检测器为光度计。
除了一般描述的设备的前述高度优选实施方案外，还存在许多可用来改变本发明的设备的一般优选的修改。在一个一般优选的实施方案中，样品容纳在反应容器中，而支架被构造成容纳多个反应容器。更优选地，反应容器选自试管和多孔板的孔。在另一个一般优选的实施方案中，光学检测机构包括选自光度计和荧光计的检测器。更优选地，检测器为光度计。在又一个一般优选的实施方案中，处理器为包含软件查表的计算机(如独立计算机)。 在再一个一般优选的实施方案中，支架基本上不改变光学检测机构测量组合信号的运行过程中的温度；第一分析物、第二分析物和内控各自都包含核酸；且光学检测机构不测量第一分析物信号，也不测量内控信号。在另一个一般优选的实施方案中，样品在光学检测机构测量组合信号的运行过程中保持基本上恒定的温度。更优选地，其中支架容纳在温控培养箱内。在另一个一般优选的实施方案中，光学检测机构不测量第一分析物信号，也不测量内控信号；并且设备进一步包括输出装置，其产生由处理器执行的确定步骤的有形记录。
在另一个方面，本发明涉及采用过程控制确定包含内控的样品中第一分析物存在与否的方法。一般而言，该方法包括第一步骤(a):其用于制备待测试第一分析物的存在的反应混合物。反应混合物包含样品；在接触内控后生成内控信号的内控探针；如果第一分析物存在于样品中，则在接触第一分析物后生成第一分析物信号的第一分析物探针；以及任选地如果第二分析物存在于样品中，则在接触第二分析物后生成第二分析物信号的第二分析物探针。接下来为步骤(b)，其用于测量(i)内控探针和分析物探针生成的组合信号， 而不用区分内控信号与分析物信号；和(ii)任选地如果第二分析物探针包含在反应混合物中，则第二分析物探针生成的第二分析物信号。再下来为步骤(C)，其用于确定以下哪一情形适用(i)样品不含第一分析物，条件是组合信号的幅度小于第一分析物截止值，并且(I)组合信号的幅度大于或等于有效性截止值，或者(2)第二分析物探针包含在反应混合物中，在步骤(b)中测量第二分析物信号，且在步骤(b)中测量的第二分析物信号的幅度大于或等于第二分析物截止值，从而确立样品包含第二分析物；(ii)样品包含第一分析物， 条件是组合信号的幅度大于或等于第一分析物截止值；以及(iii)无法确定样品是否包含第一分析物，条件是组合信号的幅度小于有效性截止值，并且如果第二分析物探针包含在反应混合物中，则在步骤(b)中测量第二分析物信号，且在步骤(b)中测量的第二分析物信号的幅度小于第二分析物截止值。一般来讲，第一分析物截止值的信号量大于有效性截止值的信号量，并且内控信号的可检测最大值不能超过第一分析物截止值。
根据一般描述的方法的第一高度优选实施方案，在步骤(a)中制备的反应混合物包含第二分析物探针；步骤(b)包括在恒定温度下测量；以及通过计算机自动进行步骤 (C)。更优选地，步骤(b)包括光学测量。在一种情况下，步骤(b)优选地包括用选自光度计和荧光计的装置进行光学测量。更优选地，该装置为光度计。在另一种情况下，内控探针、 第一分析物探针和第二分析物探针各自进行可检测地标记。更优选地，内控探针和第一分析物探针各自用相同的可检测标记物进行可检测地标记。例如，内控探针和第一分析物探针各自用相同的化学发光标记物进行可检测地标记。作为另外一种选择，内控探针和第一分析物探针各自用相同的吖啶酯进行可检测地标记。
根据该一般描述的方法的第二高度优选实施方案，在步骤(a)中制备的反应混合物不含第二分析物探针；步骤(b)包括在恒定温度下测量；以及通过计算机自动进行步骤 (c)。更优选地，步骤(b)包括光学测量。在一种情况下，步骤(b)优选地包括用选自光度计和荧光计的装置进行光学测量。更优选地，该装置为光度计。在另一种情况下，内控探针、 第一分析物探针和第二分析物探针各自进行可检测地标记。更优选地，内控探针和第一分析物探针各自用相同的可检测标记物进行可检测地标记。例如，内控探针和第一分析物探针各自用相同的化学发光标记物进行可检测地标记。作为另外一种选择，内控探针和第一分析物探针各自用相同的吖啶酯进行可检测地标记。
除了该一般描述的方法的前述高度优选实施方案外，还存在许多可用来改变本发明的方法的一般优选的修改。在一个一般优选的实施方案中，步骤(b)包括在恒定温度下测量，且通过计算机自动进行步骤(C)。在另一个一般优选的实施方案中，在步骤(a)中制备的反应混合物包含第二分析物探针。更优选地，在步骤(b)中测量第二分析物信号；在步骤(b)中测量的第二分析物信号的幅度小于第二分析物截止值；以及在步骤(b)中测量的组合信号的幅度大于或等于有效性截止值，从而确定样品不含第二分析物。在又一个一般优选的实施方案中，在步骤(a)中制备的反应混合物不含第二分析物探针。更优选地，在步骤(b)中测量的组合信号的幅度小于第一分析物截止值但大于或等于有效性截止值，并在步骤(C)中确定样品不含第一分析物。在再一个一般优选的实施方案中，第一分析物、内控和第二分析物各自都包含核酸。在另一个一般优选的实施方案中，内控探针、第一分析物探针和第二分析物探针各自进行可检测地标记。更优选地，内控探针和第一分析物探针各自用相同的可检测标记物进行可检测地标记。这样的话，优选地，内控探针和第一分析物探针各自用相同的化学发光标记物进行可检测地标记。作为另外一种选择，优选地，内控探针和第一分析物探针各自用相同的吖啶酯进行可检测地标记。在另一个一般优选的实施方案中，内控探针、第一分析物探针和第二分析物探针各自包含化学发光标记物。在另一个一般优选的实施方案中，步骤(b)包括光学测量。更优选地，步骤(b)包括用选自光度计和荧光计的装置进行光学测量。还更优选地，该装置为光度计。在另一个一般优选的实施方案中， 步骤(C)涉及使用包含软件查表的计算机进行确定。在另一个一般优选的实施方案中，每个探针都包含核酸。
发明详述
简介和概述
本发明提供鉴定含分析物样品的工具和方法，方式是使用单通道检测仅以单次读取而无需区分IC和分析物探针结合所贡献的信号来检测相同反应混合物中的IC信号和分析物信号。在高度优选的实施方案中，使用单个可检测标记物质来同时标记分析物探针(可用于检测分析物扩增子)和IC探针(可用于检测IC扩增子)。在另一个实施方案中，标记物可以不同，只要它们可在检测装置的单通道中被检出并且只要IC检测探针生成的最大信号落在分析物检测的阈值截止值之下即可。根据所述的方法，将代表分析物和IC检测的信号的幅度用作变量，因而需要多个阈值来解释结果。以此方式，可能的是，无需空间分离或单独的标记物来检测IC扩增子和分析物扩增子，并能够验证分析物检测的阴性结果。当在恒定的温度下评估探针杂交(如下所示)时尤其如此，从而将本发明所公开的技术与热熔融分析区别开来。实际上，所述技术不需要监测在多种温度条件下的探针杂交程度。
附图
简沭
图I是柱状图，示出了如何根据本发明所公开的技术将组合IC信号加分析物信号的幅度用于在IC验证测定法中确定分析物的存在与否。坐标图的纵轴代表组合信号幅度。 纵轴上标出了用于解释实验结果的有效性(“A”)和分析物(“B”)截止值。落在有效性截止值之下的组合信号不能表明测定结果有效(即，可能表明反应失败或无效)。达到或超过有效性截止值但未达到或超过分析物截止值的组合信号表明不含分析物的有效反应。达到或超过分析物截止值的组合信号表明包含分析物并被自动视为有效的反应。
图2是柱状图，显示了多重测定的结果，其中单独地或组合地检测两种分析物。空心柱表示使用IC和分析物-I的特异性探针检测的组合信号的幅度。这些探针具有相同类型的AE标记物(B卩，闪光体)，并且信号代表均相测定形式下的累积探针杂交信号。所有四个试验(即，阴性对照、仅分析物-I、仅分析物-2以及分析物-I与分析物-2)都给出了可检测的闪光体信号。填充柱表示使用分析物_2的特异性探针检测的信号的幅度，其中该探针具有与用于标记IC和分析物-I的特异性探针的类型不同的类型的AE(S卩，发光体)。只有包含分析物_2核酸模板的试验才产生可检测的分析物_2信号。
定义
以下术语在本说明书中具有指定的含义，除非明确地表明具有不同的含义。
所谓“样品”或“测试样品”是指疑似含有目标生物体或生物分子(诸如衍生自目标生物体的核酸)的任何物质。该物质可以为(例如)未处理的临床标本、含有标本的缓冲介质、含有标本和裂解剂(用于释放属于目标生物体的核酸)的介质，或含有衍生自目标生物体的核酸(已在反应容器中或反应材料或装置上分离和/或纯化)的介质。在某些情况下， 样品或测试样品可包含生物标本的产物，诸如待检测的扩增核酸。
所谓“分析物”是指在分析程序中检测或测量的物质，诸如核酸或蛋白质。分析物可包含在进行测试的样品中。
如本文所用，“标准样品”是包含已知量的分析物的样品。
如本文所用，“多核苷酸”是指RNA、DNA或同时包含RNA和DNA的嵌合分子。
所谓“分析物多核苷酸”或“分析物核酸”是指待检测或定量的所关注的多核苷酸。
所谓“分析物多核苷酸标准品”是指已知量的分析物多核苷酸或其片段。例如，病毒分析物多核苷酸标准品可包含已知数量的以下拷贝病毒基因组、病毒转录体或体外合成的代表病毒基因组一部分的转录体。
“核酸”是指包含核苷或核苷类似物的多聚化合物，这些核苷或核苷类似物具有含氮杂环碱基或碱基类似物，它们通过磷酸二酯键或其它键合连接形成多核苷酸。核酸包括 RNA、DNA或嵌合DNA-RNA聚合物以及它们的类似物。核酸“主链”可由多种键合构成，包括糖-磷酸二酯键合、肽-核酸(PNA)键(PCT NO.W095/32305)、硫代磷酸酯键合、甲基膦酸酯键合中的一种或多种，或它们的组合。核酸的糖部分可以是核糖或脱氧核糖，或具有已知取代的类似物化合物，诸如2'甲氧基取代和2’卤取代(如2’-F)。含氮碱基可以是常规碱基(A、G、C、T、U);其类似物(如肌苷)；嘌呤或嘧啶碱基的衍生物，诸如N4-甲基脱氧鸟苷，去氮或氮杂嘌呤，去氮或氮杂嘧啶，在5或6位具有取代基团的嘧啶碱基，在2、6和/或8位具有改变的或置换取代基的嘌呤碱基，诸如2-氨基-6-甲氨基嘌呤、O6-甲基鸟嘌呤、4-硫代嘧啶、4-氨基嘧啶、4- 二甲基肼嘧啶和O4-烷基嘧啶；以及吡唑并化合物，诸如未取代或3-取代的吡唑并[3，4-d]嘧啶(美国专利No. 5，378，825,6, 949，367和PCTNo. W093/13121)。核酸可包含“脱碱基”位置，其中主链的一个或多个残基不含含氮碱基(参见美国专利No. 5，585，481)。核酸也包括“锁核酸” (LNA)，它是一种含一个或多个LNA核苷酸单体与一个以RNA模拟糖构象锁定的双环呋喃糖单元的类似物(Vester等，2004, Biochemi stry43 (42) : 13233-41)。核酸可只含在RNA和DNA中发现的常规糖、碱基和键合，或者可包含常规组分和取代(例如，通过2'甲氧基主链连接的常规碱基，或包含常规碱基与一种或多种碱基类似物的混合物的核酸)。体外合成核酸的方法在本领域中是熟知的。
所谓“寡核苷酸”或“寡聚物”是指由连在一起的两个或更多个核苷亚单元或核碱基亚单元构成的聚合物。寡核苷酸的长度范围优选地为10-100个核苷酸，更优选地为10-80个核苷酸，还更优选地为15-60个核苷酸。寡核苷酸可以是DNA和/或RNA以及它们的类似物。核苷亚单元的糖基可以是核糖、脱氧核糖以及它们的类似物，包括(例如)具有对呋喃核糖部分的2’-O-甲基取代的核糖核苷。包含具有2’取代的核苷亚单元并可用作检测探针的寡核苷酸、捕获寡核苷酸和/或扩增寡核苷酸由Becker等在美国专利No. 6，130，038中公开。核苷亚单元可通过以下方式接合键合，诸如磷酸二酯键合、修饰键合；或不会防止寡核苷酸与其互补靶核酸序列杂交的非核苷酸部分。修饰键合包括其中标准磷酸二酯键合被不同键合取代的那些键合，诸如硫代磷酸酯键合或甲基膦酸酯键合。核碱基亚单元可(例如)通过将DNA的天然磷酸脱氧核糖主链用伪肽主链(诸如通过羧甲基连接基将核碱基亚单元连接到中央仲胺的2-氨乙基甘氨酸主链)替换而接合。(具有伪肽主链的DNA类似物通常称为“肽核酸”或“PNA”，并由Nielsen等在美国专利No. 5，539，082 “Peptide Nucleic Acids”中公开。)本发明设想的寡核苷酸或寡聚物的其它非限制性实例包括含双环和三环核苷的核酸类似物以及称为“锁核酸”、“锁核苷类似物”或“LNA”的核苷酸类似物。(锁核酸在以下专利中被公开=Wang的美国专利 No. 6，083，482 “ConformationalIy Locked Nucleosides and Oligonucleotides”； Imanishi 等的美国专利 No. 6，268，490 “Bicyclonucleoside and Oligonucleotide Analogues” ；以及 Wengel 等的美国专利 No. 6, 670, 461 “Oligonucleotide Analogues”。) 本发明设想了任何核酸类似物，前提是修饰的寡核苷酸可在严格杂交条件下或扩增反应条件下杂交到靶核酸。
如本文所用，“扩增”是指获得靶核酸序列、其互补序列或其片段的多个拷贝的体外程序。例如，体外扩增反应是一种酶催化反应，其导致合成靶核酸序列、其互补序列或其片段的多个拷贝。可用于准备体外扩增反应的扩增方法的实例在下文中给出。优选的体外扩增反应以指数方式合成扩增子，这意味着一个扩增子将作为产生新扩增子的模板。
所谓“扩增子”或“扩增产物”是指在核酸扩增反应中生成的核酸分子。扩增子或扩增产物含有可以与靶核酸同义或反义的靶核酸序列。
所谓“分析物扩增子”或“分析物扩增产物”是指在核酸扩增反应中使用分析物核酸作为模板而合成的扩增子。
如本文所用，“探针”是指可用于检测靶标诸如靶生物分子的靶的分析物特异性试剂。探针的实例包括核酸杂交探针、抗体探针、细胞表面受体和受体特异性配体。
所谓“杂交”是指两条完全或部分互补的核酸链在规定的杂交测定条件下合在一起形成具有双链区域的稳定结构的能力。该双链结构(有时称为“杂交体”)的两条组成链通过氢键合在一起。虽然这些氢键最常见的是在单条核酸链上在含腺嘌呤与胸腺嘧啶或尿嘧啶(A与T或U)或者胞嘧啶与鸟嘌呤(C与G)碱基的核苷酸之间形成，但是碱基配对也可在不属于这些“常规”配对成员的碱基之间形成。非常规的碱基配对在本领域中是熟知的。
如本文所用，“杂交探针”是在促进杂交的条件下特异性杂交到核酸(优选扩增的核酸)中的靶序列以形成可检测杂交体的寡核苷酸。探针任选地可包含可检测的部分，其可连接到探针的末端或可处于内部。探针中与靶多核苷酸结合的那些核苷酸不必严格邻接， 当可检测的部分处于探针序列内部时即可能如此。检测可以是直接的(即，由探针直接杂交到靶序列或扩增的核酸而产生)或间接的(即，由探针杂交到中间分子结构而产生，该中间分子结构将探针连到靶序列或扩增的核酸)。探针的“靶” 一般是指扩增核酸序列内所含的序列，其可使用标准氢键结合(即，碱基配对)特异性杂交到探针寡核苷酸的至少一部分。探针可包含靶特异性序列和任选地不与待检测的靶序列互补的其它序列。
如本文所用，“可检测标记物”或简称为“标记物”是指可被检测或可导致可检测响应的化学部分。根据本发明的可检测标记物可直接或间接地连接到探针，诸如杂交探针。优选的可检测标记物的实例包括放射性同位素、酶、半抗原、诸如染料或赋予可检测颜色的粒子(如乳胶小珠或金属粒子)的发色团、发光化合物(如生物发光、磷光或化学发光部分)和荧光化合物。
如本文所用，“均相可检测标记物”是指可以通过确定标记物是否位于结合到靶序列的探针上而以均相方式检测的标记物。也就是说，均相可检测标记物可无需从标记物或标记探针的非结合(如，未杂交)形式物理地除去结合(如，杂交)而进行检测。当使用标记探针进行检测核酸时，均相可检测标记物是优选的。均相标记物的实例在以下专利中有详细描述ArnoId等的美国专利No. 5，283，174、Woodhead等的美国专利No. 5，656，207和 Nelson等的美国专利No. 5，658，737。用于均相测定法的优选标记物包括化学发光化合物 (例如参见Woodhead等的美国专利No. 5，656，207、Nelson等的美国专利No. 5，658，737和 Arnold, Jr.等的美国专利No. 5，639，604)。优选的化学发光标记物为吖啶酯(“AE”)化合物，诸如标准AE或其衍生物(如萘基-AEjMi -AE、I-或3-甲基_AE、2，7- 二甲基-AE、 4，5- 二甲基-AE、邻二溴-AE、邻二甲基-AE、间二甲基-AE、邻甲氧基-AE、邻甲氧基(桂皮酸)-AE^P甲基-AE、邻氣_AE、1_或3-甲基邻氣-AE、1_或3-甲基间二氣-AE和2-甲基 _AE)。
“均相测定”是指在确定特异性探针结合程度前不需要将结合的探针与未结合的探针物理分离的检测程序。示例性均相测定(诸如本文所述的那些)可采用分子炬、分子信标或具有茎环结构并在杂交到合适靶标时发出荧光信号的其它自我报告探针，除非存在于杂化双链中否则可通过化学方法选择性破坏的化学发光吖啶酯标记物，以及本领域的普通技术人员将会熟悉的其它均相可检测标记物。
在本发明的背景下，将某些方法用于作出或输出诊断确定结果。例如，基于一组数据，将得出特定分析物存在于测试样品中的可能性极高的结论。方法的输出结果可表示为 “确定”或“指定”或“建立”或“称作”特定分析物存在或可能不存在的步骤。
如本文所用，“内控”是包含在反应混合物中用来检测分析物存在与否的试剂，其中内控的直接或间接检测用于验证测定过程步骤。在使用扩增反应检测核酸分析物的测定法的背景下，内控可以是能与核酸分析物一起共扩增并在杂交反应中检测的核酸模板。检测适当水平的内控扩增产物可确认扩增和杂交过程步骤的成功。在一个实施方案中，内控核酸使用与扩增分析物核酸相同的引物进行扩增，但内控扩增子和分析物扩增子使用不同的杂交探针进行检测。优选的内控包括加到用于检测分析物存在与否的反应混合物中的外源性试剂。
所谓“内控扩增子”或“ IC扩增子”或“ IC扩增产物”或其变化形式是指使用内控核酸作为模板在核酸扩增反应中合成的扩增子。
如本文所用，“设备”是指执行某一目的或实现特定用途必需的事物。
如本文所用，“支架”是将某物保持在适当位置的结构元件。例如，支架可容纳试管、多孔板、毛细管或其它反应容器。支架可包括用于保持所夹持的事物的机械夹具。优选地，可用于执行本发明的测定法的设备的支架将允许在所夹持的样品(诸如液相反应混合物)与光学检测机构之间具有光学通路。
如本文所用，“光学检测机构”是指从进行测试的样品中采集光学信号所必需的组件的集合。可用的光学检测机构的优选实例包括荧光计和光度计。
如本文所用，能量传感器装置(诸如配有光能传感器的装置)的“通道”是指可排除其它波段而检测或定量的限定波段。例如，光度计的一个检测通道能够将一定波长范围内的一种或多种化学发光标记物发出的光能作为单一事件而检测。在化学发光反应过程中发出的光可通过光度计用相对光单位(RLU)定量，计量单位表示在给定波长或波段下样品发出的光子的相对数量。因荧光而发出的光可作为给定波长下或某一波段内的相对荧光单位 (RFU)而定量。
如本文所用，“单通道检测”是指这样一种过程，借以可在能量传感器装置的一个通道所代表的限定波段内检出一个或多个信号。如果例如有两种可检测标记物，每种设置在不同的探针上，两者均发出彼此不同的特征性波长光，并且如果那些波长在对应于能量传感器装置的一个检测通道的限定波段内检出，则该检测将被称为“单通道检测”。通过单通道检测，当光子由不同的标记物产生，并具有落在单检测通道的检测范围内的波长时，产生被检测光子的标记物之间没有区别。
如本文所用，“单次读取确定”是指在探针与分析物之间的结合反应后通过检测步骤获得结果的过程。通过单次读取确定，没有必要更改反应条件(诸如探针杂交条件)，或者进行二次杂交反应。
如本文所用，“内控信号”(有时称为“1C信号”)是可测量的信号，它表明反应混合物中存在内控或其产物(例如扩增产物)。例如，如果内控带有标记，则IC信号可由内控直接产生。作为另外一种选择，内控信号可由与内控或其产物发生特异性相互作用的探针(如内控探针)产生。优选的内控包括蛋白质和核酸。
如本文所用，“分析物信号”是可测量的信号，它表明反应混合物中存在分析物或其产物(例如扩增产物)。例如，如果分析物带有标记，则分析物信号可由分析物直接产生。 作为另外一种选择，分析物信号可由与分析物发生特异性相互作用的探针(如分析物探针) 产生。优选的分析物包括蛋白质和核酸。
如本文所用，“组合信号值”是单个值，它表示对单个反应混合物中的分析物和IC所测得的可检测信号的组合。组合信号不区分内控信号与分析物信号。例如，组合信号值对于化学发光标记物可记录为RLU (相对光单位)或对于荧光标记物可记录为RFU (相对荧光信号)。
在某些检测不止一种分析物的多重测定法中，不同的分析物可分别通过检测或测量“第一分析物信号”和“第二分析物信号”而检测。不同分析物的存在与否可通过将相应信号的幅度与相应截止值(如，“第一”和“第二”分析物截止值)进行比较而判定。
如本文所用，“阈值”或“阈值截止值”或简称为“截止值”是指用于解释实验结果的定量限，其中高于和低于截止值的结果将导致相反的结论。例如，落在截止值之下的测得信号可表示不存在特定靶标，但是超过同一截止值的测得信号则可表示存在该靶标。按照惯例，对于达到截止值(即，刚好等于截止值)的结果，其解释与超过截止值的解释相同。
如本文所用，“有效性截止值”是用于确定过程步骤是否有效(如，有效或无效)的截止值。例如，达到或超过有效性截止值的内控信号可表示过程按预期进行，而包括该过程的测定法的结果是有效的。反之，落在有效性截止值之下的内控信号可表示过程未按预期进行，而相应测定法的结果是无效的。
如本文所用，“分析物截止值”是用于表示分析物在反应混合物或测试样品中存在与否的截止值。例如，达到或超过分析物截止值的分析物信号可表示分析物存在于反应混合物或测试样品中。反之，落在分析物截止值之下的分析物信号如果经过程控制验证，则将表示不存在分析物。
如本文所用，“查表”是指相对于(如，<或彡)阈值截止值而表示的阳性和阴性结果的可能组合的集合。集合中的组合可与为进行测试的样品中的分析物存在性指定阳性或阴性状态的解释相关联。也可指定测定有效性状态。查表可存储在计算机可读介质上，并通常用于解码实验结果。
所谓“套装”是指通常旨在彼此相互结合使用的材料的包装组合。根据本发明的套装可包含“有形”形式的说明或其它信息(如，印刷信息、以电子方式记录在计算机可读介质上或以其它方式记录在机器可读介质诸如用于存储数值的条形码上的信息)。
本发明的优诜实施方案
本文所述的分析技术在某些方面与许多其它人所用的先前方法相反。例如，不同于上面提到的美国专利No. 6，586，234，其描述了使用将(a)分析物信号从(b)分析物信号与IC信号的组合中区分开来的两次读取方法进行IC验证，而本发明的方法完全不用分离这些信号。更具体地讲，本发明的方法采用单次读取法，其不需要归属由IC和分析物探针产生的信号的来源或幅度，即便使用检测装置的单检测通道进行多个信号检测时也是如此，这种情况可以通过在两个探针上使用相同的标记物而产生。实际上，本发明的技术使用单通道检测法，来同时检测单一反应混合物中由IC探针和分析物探针两者产生的信号。本发明的技术不在单独的检测反应中分离IC和分析物探针，而是将两种探针相结合，并同时检测由它们产生的信号。再次提到，IC和分析物探针可有利地具有相同的可检测标记物或使用检测装置的单通道检测的不同标记物。他人可能使用单个截止值检测来自使用相同标记物检测的多个靶标的信号，但本发明的技术需要使用单独的截止值(如，所谓的有效性截止值和分析物截止值)。使用多个单独的截止值能避免单独读取以区分不同探针产生的信号。根据本发明的技术，存在多个阈值截止值，并要求由IC探针的检测所产生的信号的幅度不能超过用于指示分析物的存在的截止值。换句话说，最大可检测IC信号不能超过用于指示分析物的存在的截止值。总而言之，这些差别将本发明的技术与先前方法区分开来。
一般而言，本文所公开的技术可应用于检测多种分析物，包括核酸(如DNA和 RNA)、蛋白质(如抗体、激素或其它配体的受体等)以及具有生物学意义的其它分子。通过本发明所公开的方法鉴定的特别优选的分析物为使用互补杂交探针检测的核酸。IC优选地为外源性合成核酸，其在与分析物核酸共扩增前包含在测试分析物核酸的存在的反应混合物中。将具有不同碱基序列的单独的杂交探针用于检测分析物和IC扩增子。检测步骤在恒定温度下进行。在一个高度优选的实施方案中，将具有不同靶核酸(即，IC和分析物)特异性的不同探针用相同的化学可检测标记物质进行标记。然而，如果将不同的可检测标记物用于标记不同的探针，则由不同标记物产生的信号必须可使用检测装置的单通道检测。优选地，两种可检测标记物产生使用检测装置的单通道检测的光学信号，其中该通道由预定的波长范围限定。
阈倌
本发明的一个方面涉及定义和使用可检测信号的多个阈值截止值，所述可检测信号用在通过IC验证的测定法中鉴定分析物的存在与否。优选地，当使用具有相同化学可检测标记物质的不同探针来检测IC和分析物时，对于在检测分析物信号和IC信号的检测仪器的单通道中检出的信号存在两个阈值截止值。这两个阈值截止值中的低值(即，“有效性截止值”)用于验证IC过程控制。这两个阈值截止值中的高值用于表示分析物在进行测试的样品中存在与否。未能达到或超过有效性截止值的信号表示因测定过程失败而导致反应无效。这样的情形可因测定法的扩增步骤和/或检测步骤受到抑制而引起。超过有效性截止值但未达到或超过分析物检测的阈值截止值的信号表示测定法的扩增和检测步骤成功， 并进一步表示分析物不存在于样品中。该后一结果可通过本文所公开的方法评定为“有效， 分析物阴性”。最后，检出既超过有效性截止值也超过分析物阈值截止值的信号则表示分析物存在于样品中(即，“分析物阳性”样品)。这样的话，无需报告或质疑测定结果的有效性。 本发明的这些特征在图I中示出。
本文所公开的技术的成功取决于以下两者间的某些一般关系代表IC和分析物检出的信号的容许幅度，以及多个阈值截止值。重要的是，当使用具有可检测标记物(它们产生的信号可在检测装置的单通道内检出)的不同探针来检测分析物和IC时，有效性截止值必须不同于且低于分析物检测的阈值截止值。在高度优选的实施方案中，所述可检测标记物是相同的可检测标记物(如，相同的化学突光标记物质或化学发光标记物，诸如AE标记物)。实际上，通过IC扩增和检测而产生的超过有效性截止值的信号不应含糊不清地表明使用具有相同化学可检测标记物质的探针检测的分析物的存在性。这可通过例如以下方式得以保证要求仅由检测IC扩增子(B卩，无分析物存在于反应中)而产生的信号的幅度具有无法超过的上限阈值。在特别优选的方法中，这通过以下方式实现确保对本发明所公开的测定法的IC扩增和检测组成部分进行校准，使得IC信号无法超过不含分析物的扩增反应中的上限阈值截止值。这可防止因仅扩增和检测IC而表明存在分析物的假阳性结果。用于检测分析物的阈值截止值始终大于有效性截止值。检出达到或超过分析物检测的阈值截止值的信号将自动验证分析物阳性测定结果。
当使用单一化学可检测标记物质或可使用检测装置的单通道进行检测的不同可检测标记物来检测IC和分析物时，许多不同的方法可用于确保由IC检测(如，IC扩增子检测)产生的最大信号低于用于检测分析物的阈值截止值。例如，可使IC扩增子的比活性(如， 可通过每单位质量探针的可检测标记单位数来度量)相对于用于检测分析物扩增子的探针的比活性降低。用于杂交反应的IC特异性探针的量或浓度可相对于分析物特异性探针的量或浓度降低。设置在IC特异性探针上的标记物可选择为其检测有效性相对设置在分析物特异性探针上的标记物的有效性低。在高度优选的实施方案中，将用于检测IC扩增子和分析物扩增子的不同探针用相同的化学可检测标记物质(如，化学发光标记物，诸如特定结构的吖啶酯标记物；或者作为另外一种选择，特定结构的荧光标记物)标记，并且用于检测 IC扩增子的IC特异性探针的量小于用于检测分析物扩增子的分析物特异性探针的量。当然，用于共扩增反应的IC模板核酸的输入量也可进行调整，使得通过检测IC扩增子产生的杂交信号的幅度低于分析物截止值。例如，可将IC核酸的输入量选择为不大于分析物检测下限的十倍，更优选地不大于分析物检测下限的三倍，更优选地不大于分析物检测下限的两倍，还更优选地不大于分析物检测下限。例如，用于扩增反应的IC模板核酸的量优选地落在以下范围内从测定法中分析物检测下限的二分之一到十倍，更优选地从测定法中分析物检测下限的十分之一到一倍。任何这些低输入水平的IC模板与任何上述控制量的探针的组合也已得到了成功应用，并落在本发明的范围内。
当IC和分析物靶标使用单一化学物质作为可检测标记物(如，同一化学发光标记物、同一荧光标记物等)或可使用检测装置的单通道检测的不同化学可检测标记物质进行检测时，阈值截止值的前述讨论与IC和分析物的分析相关。通过此方法获得的结果分析在表I中示出。使用与用于检测IC和第一分析物不同的可检测标记物来检测第二分析物能够实现，并可涉及使用不同的阈值截止值。实际上，用于评估第二分析物存在与否的阈值截止值可独立于用于评估第一分析物和IC的结果的阈值截止值。通过该后一方法获得的结果的分析在表2中示出。
信号幅度和阈值截止值之间的某些关系
如本文其它地方所述，在代表内控和一种或多种分析物检出的信号幅度与各种相应的阈值截止值之间存在许多有意义的关系。例如，在包括内控和第一分析物的任选地包括第二分析物的测定法以及执行该测定法的设备的背景下，可将测得的组合信号(如，通过内控探针和第一分析物探针产生)的幅度与有效性截止值以及与第一分析物截止值进行比较。如果该测定法包括测量第二分析物信号(如，通过第二分析物探针产生，并区别于组合信号)，则可将该第二分析物信号与第二分析物截止值进行比较。如果组合信号的幅度大于或等于有效性截止值，则通过过程控制确立测定结果有效。如果组合信号的幅度大于或等于第一分析物截止值，则确立检出第一分析物。如果组合信号的幅度小于有效性截止值，则通过过程控制不能确立测定结果有效。如果反应混合物包含第二分析物探针，并且如果第二分析物信号的幅度大于或等于第二分析物截止值，则通过过程控制确立测定结果有效， 并确立检出第二分析物。如果反应混合物包含第二分析物探针，并且如果第二分析物信号的幅度小于第二分析物截止值，则不能确立检出第二分析物，并且通过过程控制不能确立测定结果有效。因此，当检出第二分析物信号时，该信号也可用于验证测定结果，包括检测第一分析物的阴性结果。这些确定过程的每一个都可以通过根据本发明的设备的处理器或计算机元件而确立。确立的实例
阈值截止值(S卩，有效性截止值和分析物截止值)与代表IC加分析物检测的组合信号的测得测试信号之间的比较可通过可供选择的方法执行。在一个优选的实施方案中，将预定的阈值截止值用于评估测试结果并确定分析物是否存在。在不同的优选实施方案中， 使用在待用于测试的各种不同机器上运行的校准品确立阈值截止值。
确立具体机器和/或试剂组特定的阈值截止值可以按不同的方式进行，但通常将采用一个或多个校准标准品(即，一个或多个含有已知量的待扩增和检测的相关核酸的标准品)。各校准反应均包括内控。对于将视为有效的测定法，“阴性”校准品可用于确立必须由代表IC和分析物检出的信号超过的有效性截止值。阴性校准品反应优选地包括可以扩增并检测的IC模板核酸，但不包括任何分析物核酸。确立有效性截止值的一种方法是计算在阴性校准品运行(即，扩增和检测程序)中测得的信号的值的二分之一(即50%)，或更优选地在多个阴性校准品扩增和检测反应中测得的信号的平均值的二分之一。产生的组合信号值低于该有效性截止值的任何测试反应在不存在第二分析物测得的验证结果的情况下将被视为无效(即，表示过程失败)。阴性校准品结果除了二分之一以外的分数(如60%、70% 等)作为另外一种选择可被选为具有良好结果的有效性截止值。产生的信号值高于有效性截止值的任何测试反应将被视为有效。
对于要视为分析物阳性的结果(B卩，“分析物阳性”)而言必须超过的最简单形式的上限阈值(即，“分析物截止值”)也可通过使用阴性校准品反应获得的结果加以确定。分析物截止值优选地将为阴性校准品试验测得的信号值(或阴性校准品运行的平均值)的至少一点五倍。更优选地，分析物截止值将为阴性校准品试验测得的信号值的至少两倍。还更优选地，分析物截止值使用得自阴性校准品试验以及得自阳性校准品试验的结果加以确定。 例如，分析物截止值可通过以下方式确定将多个阴性校准品的值加上产生代表IC和分析物检出的信号的阳性校准品的测得值的一定百分比(如，10%、20%、30%，或在10%-30%的范围内)，其中两个靶标都使用单通道检测进行检测。这将在下文的实施例中示出。
核酸检测
在优选的实施方案中，当检测杂交信号时，核酸扩增子在溶液中用不固定到固体载体上的液相杂交探针进行检测。这明显不同于阵列检测形式，诸如核酸微阵列，其中探针杂交结果的解释依赖于一个探针与另一个的空间分离。同样，本发明的方法可使用以下IC 探针和分析物探针(例如，它们的每一个都为核酸杂交探针)加以实践，这些探针具有相同的化学可检测标记物质，或者足够相似以允许使用检测装置中的单检测通道进行检测的标记物。要注意的是，优选的程序不涉及检测只代表分析物存在的信号，也不检测代表IC存在的信号。同样地，优选的程序不涉及检测只代表IC存在的信号，而在分析物也可检测时将分析物排除在外不进行检测。例如，在某些实施方案中，检测表示IC和分析物均存在的累积信号，这意味着不单独检测IC信号和分析物信号。以此方式，本发明的方法不同于其中要单独检测分析物信号和IC信号的某些其它测定形式。
本文所述的方法可便利地采用查表来解释结果并确定样品中分析物存在与否，以及验证测定完整性。表I表示可用于根据本发明所公开的使用分析物和IC信号的单通道检测来检测分析物和IC的方法进行结果解释的基本查表，这些信号可通过用单一类型的可检测标记物(即，每种探针上的标记物相同)标记的不同探针(即，IC和分析物的单独探针) 提供。参照阈值截止值的排列，检出的信号低于分析物的阈值截止值也低于有效性截止值时表明测试无效。反之，检出的信号低于分析物的截止值但高于有效性截止值则表明测试有效且分析物阴性。最后，信号高于分析物截止值则表明测试为分析物阳性。因此，使用少至两种的具有相同化学可检测标记物质的探针可了解分析过程的有效性以及了解分析物的存在与否。
表I
对使用单标记物质检测IC和分析物获得的结果进行的分析
权利要求
1.一种通过过程控制确定包含内控的样品中第一分析物存在与否的设备，所述设备包括 (a)被构造成容纳所述样品的支架， 所述样品进一步包含 在接触所述内控后生成内控信号的内控探针， 如果第一分析物存在于所述样品中，则在接触所述第一分析物后生成第一分析物信号的第一分析物探针，以及 任选地如果第二分析物存在于所述样品中，则在接触所述第二分析物后生成第二分析物信号的第二分析物探针； (b)被布置成当所述样品容纳在所述支架中时接收来自所述样品的光学信号的光学检测机构， 其中所述光学检测机构被构造成测量所述内控探针和所述分析物探针所产生的组合信号而不用区分所述内控信号与所述分析物信号，并且 其中所述光学检测机构任选地被构造成测量所述第二分析物探针产生的所述第二分析物信号； (C)与所述光学检测机构通信的处理器，所述处理器被编程为执行下列步骤 确定以下哪一,清形适用， (i)所述样品不含所述第一分析物，条件是所述组合信号的幅度小于第一分析物截止值并且 所述组合信号的幅度大于有效性截止值，或 所述第二分析物探针包含在所述样品中，所述光学检测机构被构造成测量所述第二分析物信号，且所述第二分析物信号的幅度大于第二分析物截止值，从而确立所述样品包含所述第二分析物； ( )所述样品包含所述第一分析物，条件是所述组合信号的幅度大于所述第一分析物截止值，以及 (iii)无法确定所述样品是否包含所述第一分析物，条件是所述组合信号的幅度小于所述第一分析物截止值且小于所述有效性截止值，并且所述第二分析物探针包含在所述反应混合物中，且所述光学检测机构被构造成测量所述第二分析物信号，所述第二分析物信号小于所述第二分析物截止值， 其中所述第一分析物截止值的信号量大于所述有效性截止值的信号量，并且 其中所述内控信号的可检测最大值不能超过所述第一分析物截止值。
2.根据权利要求I所述的设备，其中所述光学检测机构被构造成测量所述第二分析物探针产生的所述第二分析物信号。
3.根据权利要求2所述的设备，其中所述支架基本上不改变所述光学检测机构测量所述组合信号的运行过程中的温度，其中所述第一分析物、所述第二分析物和所述内控各自都包含核酸，并且其中所述光学检测机构不测量所述第一分析物信号也不测量所述内控信号。
4.根据权利要求2所述的设备，其中所述光学检测机构不测量所述第一分析物信号，也不测量所述内控信号，并且其中所述设备进一步包括输出装置，其产生由所述处理器执行的所述确定步骤的有形记录。
5.根据权利要求4所述的设备，其中所述支架基本上不改变所述光学检测机构测量所述组合信号的运行过程中的温度，其中所述第一分析物、所述第二分析物和所述内控各自都包含核酸，并且其中所述光学检测机构不测量所述第一分析物信号也不测量所述内控信号。
6.根据权利要求5所述的设备，其中所述光学检测机构包括选自光度计和荧光计的检测器。
7.根据权利要求6所述的设备，其中所述检测器为光度计。
8.根据权利要求5所述的设备，其中所述样品在所述光学检测机构测量所述组合信号的运行过程中保持基本上恒定的温度。
9.根据权利要求I所述的设备，其中所述光学检测机构不被构造成测量所述第二分析物探针产生的所述第二分析物信号。
10.根据权利要求9所述的设备，其中所述支架基本上不改变所述光学检测机构测量所述组合信号的运行过程中的温度，其中所述第一分析物和所述内控各自都包含核酸，并且其中所述光学检测机构不测量所述第一分析物信号也不测量所述内控信号。
11.根据权利要求9所述的设备，其中所述光学检测机构不测量所述第一分析物信号，也不测量所述内控信号，并且其中所述设备进一步包括输出装置，其产生由所述处理器执行的所述确定步骤的有形记录。
12.根据权利要求11所述的设备，其中所述支架基本上不改变所述光学检测机构测量所述组合信号的运行过程中的温度，其中所述第一分析物和所述内控各自都包含核酸，并且其中所述光学检测机构不测量所述第一分析物信号也不测量所述内控信号。
13.根据权利要求12所述的设备，其中所述光学检测机构包括选自光度计和荧光计的检测器。
14.根据权利要求13所述的设备，其中所述检测器为光度计。
15.根据权利要求12所述的设备，其中所述样品在所述光学检测机构测量所述组合信号的运行过程中保持基本上恒定的温度。
16.根据权利要求I所述的设备，其中所述样品容纳在反应容器中，并且其中所述支架被构造成容纳多个反应容器。
17.根据权利要求16所述的设备，其中所述反应容器选自试管和多孔板的孔。
18.根据权利要求I所述的设备，其中所述光学检测机构包括选自光度计和荧光计的检测器。
19.根据权利要求18所述的设备，其中所述检测器为光度计。
20.根据权利要求I所述的设备，其中所述处理器为包含软件查表的独立计算机。
21.根据权利要求I所述的设备，其中所述支架基本上不改变所述光学检测机构测量所述组合信号的运行过程中的温度，其中所述第一分析物、所述第二分析物和所述内控各自都包含核酸，并且其中所述光学检测机构不测量所述第一分析物信号也不测量所述内控信号。
22.根据权利要求I所述的设备，其中所述样品在所述光学检测机构测量所述组合信号的运行过程中保持基本上恒定的温度。
23.根据权利要求22所述的设备，其中所述支架容纳在温控培养箱内。
24.根据权利要求I所述的设备，其中所述光学检测机构不测量所述第一分析物信号，也不测量所述内控信号，并且其中所述设备进一步包括输出装置，其产生由所述处理器执行的所述确定步骤的有形记录。
25.一种采用过程控制确定包含内控的样品中第一分析物存在与否的方法，所述方法包括以下步骤 (a)制备待测试所述第一反应物的存在的反应混合物，所述反应混合物包含 所述样品 接触所述内控后生成内控信号的内控探针， 如果第一分析物存在于所述样品中，则在接触所述第一分析物后生成第一分析物信号的第一分析物探针，以及 任选地如果第二分析物存在于所述样品中，则在接触第二分析物后生成第二分析物信号的第二分析物探针； (b)测量 (i)所述内控探针和所述分析物探针所产生的组合信号而不用区分所述内控信号与所述分析物信号，并且 ( )任选地如果所述第二分析物存在于所述反应混合物中则测量所述第二分析物信号；以及 (C)确定以下哪一,清形适用， (i)所述样品不含所述第一分析物，条件是所述组合信号的幅度小于第一分析物截止值并且 所述组合信号的幅度大于有效性截止值，或 所述第二分析物探针包含在所述反应混合物中，在步骤(b)中测量所述第二分析物信号，而在步骤(b)中测量的所述第二分析物信号的幅度大于第二分析物截止值，从而确立所述样品包含所述第二分析物； ( )所述样品包含所述第一分析物，条件是所述组合信号的幅度大于所述第一分析物截止值，以及 (iii)无法确定所述样品是否包含所述第一分析物，条件是所述组合信号的幅度小于所述有效性截止值，并且所述第二分析物探针包含在所述反应混合物中，在步骤(b)中测量所述第二分析物信号，而在步骤(b)中测量的所述第二分析物信号的幅度小于所述第二分析物截止值， 其中所述第一分析物截止值的信号量大于所述有效性截止值的信号量，并且 其中所述内控信号的可检测最大值不能超过所述第一分析物截止值。
26.根据权利要求25所述的方法，其中步骤(b)包括在恒定温度下测量，并且其中通过计算机自动进行步骤(C)。
27.根据权利要求25所述的方法，其中在步骤(a)中制备的所述反应混合物包含所述第二分析物探针，其中步骤(b)包括在恒定温度下测量，并且其中通过计算机自动进行步骤(c)。
28.根据权利要求27所述的方法，其中步骤(b)包括光学测量。
29.根据权利要求28所述的方法，其中步骤(b)包括通过选自光度计和荧光计的装置进行光学测量。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述装置为光度计。
31.根据权利要求28所述的方法，其中所述内控探针、所述第一分析物探针和所述第二分析物探针各自进行可检测地标记。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述内控探针和所述第一分析物探针各自用相同的可检测标记物进行可检测地标记。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述内控探针和所述第一分析物探针各自用相同的化学发光标记物进行可检测地标记。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述内控探针和所述第一分析物探针各自用相同的吖啶酯进行可检测地标记。
35.根据权利要求25所述的方法，其中在步骤(a)中制备的所述反应混合物不含所述第二分析物探针，其中步骤(b)包括在恒定温度下测量，并且其中通过计算机自动进行步骤(c)。
36.根据权利要求35所述的方法，其中步骤(b)包括光学测量。
37.根据权利要求36所述的方法，其中步骤(b)包括通过选自光度计和荧光计的装置进行光学测量。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述装置为光度计。
39.根据权利要求36所述的方法，其中所述内控探针、所述第一分析物探针和所述第二分析物探针各自进行可检测地标记。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述内控探针和所述第一分析物探针各自用相同的可检测标记物进行可检测地标记。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述内控探针和所述第一分析物探针各自用相同的化学发光标记物进行可检测地标记。
42.根据权利要求40所述的方法，其中所述内控探针和所述第一分析物探针各自用相同的吖啶酯进行可检测地标记。
43.根据权利要求25所述的方法，其中在步骤(a)中制备的所述反应混合物包含所述第二分析物探针。
44.根据权利要求43所述的方法，其中在步骤(b)中测量所述第二分析物信号，其中在步骤(b)中测量的所述第二分析物信号的幅度小于第二分析物截止值，其中在步骤(b)中测量的所述组合信号的幅度大于有效性截止值，从而确定所述样品不含所述第二分析物。
45.根据权利要求25所述的方法，其中在步骤(a)中制备的所述反应混合物不含所述第二分析物探针。
46.根据权利要求45所述的方法，其中在步骤(b)中测量的所述组合信号的幅度小于所述第一分析物截止值但大于所述有效性截止值，并且其中在步骤(c)中确定所述样品不含所述第一分析物。
47.根据权利要求25所述的方法，其中所述第一分析物、所述内控和所述第二分析物各自都包含核酸。
48.根据权利要求25所述的方法，其中所述内控探针、所述第一分析物探针和所述第二分析物探针各自进行可检测地标记。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述内控探针和所述第一分析物探针各自用相同的可检测标记物进行可检测地标记。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述内控探针和所述第一分析物探针各自用相同的化学发光标记物进行可检测地标记。
51.根据权利要求49所述的方法，其中所述内控探针和所述第一分析物探针各自用相同的吖啶酯进行可检测地标记。
52.根据权利要求25所述的方法，其中所述内控探针、所述第一分析物探针和所述第二分析物探针各自包含化学发光标记物。
53.根据权利要求25所述的方法，其中步骤(b)包括光学测量。
54.根据权利要求53所述的方法，其中步骤(b)包括通过选自光度计和荧光计的装置进行光学测量。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述装置为光度计。
56.根据权利要求25所述的方法，其中步骤(c)包括通过含有软件查表的计算机进行确定。
57.根据权利要求25所述的方法，其中每个所述探针都包含核酸。
全文摘要
本发明公开了用于检测含内控的反应混合物中的分析物的设备和方法。使用核酸的扩增和检测阐述了本发明，其中扩增反应包含外源性内控。检测信号的幅度用作鉴定无效试验、鉴定分析物阴性的有效试验以及鉴定分析物阳性的试验的变量。对表明探针杂交的信号进行检测可用于在只使用单个可检测标记物的验证反应中指定分析物核酸的存在与否，并且不用区分由内控探针结合和分析物探针结合所贡献的信号的比例。
文档编号C12Q1/68GK102985566SQ201180032676
公开日2013年3月20日 申请日期2011年6月30日 优先权日2010年6月30日
发明者S.A.朱, J.M.多克特 申请人:简.探针公司