专利名称：用于胞内代谢物检测的传感器的制作方法
用于胞内代谢物检测的传感器本发明涉及就其野生型而言进行了遗传修饰的细胞、用于鉴定具有提高的特定代谢物胞内浓度的细胞的方法、用于产生就其野生型而言进行了遗传修饰的具有特定代谢物的优化产生的细胞的方法、通过此方法获得的细胞、用于产生代谢物的方法和用于制备混合物的方法。微生物产生的代谢物具有巨大的经济利益。因此，将诸如L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-甲硫氨酸和L-色氨酸的氨基酸用作食物添加剂，L-谷氨酸用作香料添加剂，L-异亮氨酸和L-酪氨酸用于制药工业，L-精氨酸和L-异亮氨酸用作药物，或L-谷氨酸、L-天冬氨酸和L-苯丙氨酸用作用于合成精细化学药品的起始物质。从工业观点看，相关代谢物的另一实例是酮戍二酸(oxoglutarate),其用作食品补充剂,或用作精氨酸α -酮戍二酸(alpha-ketoglutarate)的前体，精氨酸α _酮戍二酸促进生长激素和胰岛素的释放。 用于产生这类代谢物的优选方法是利用微生物的生物技术产生。尤其是在氨基酸的产生中，可以直接以此方式获得特定代谢物的生物活性和旋光活性形式，此外，还可以利用简单且便宜的原料。所利用的微生物是例如谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)，它的亲缘物种 ssp. flavum 和 ssp.1actofermentum (Liebl 等，Int. J SystemBacteriol. 1991,41 :255_260),以及大肠杆菌(Escherichia coli)及相关细菌。在通过微生物学途径产生上述代谢物中，通常通过突变来修饰特定代谢物生物合成的调节，使得它们产生该特定代谢物超出其自身的需要，并将该特定代谢物分泌入培养基。因此，例如，W0-A-2005/059139公开了利用遗传修饰的谷氨酸棒杆菌菌株产生L-赖氨酸，其中通过改善经磷酸戊糖代谢途径的代谢来达到增加的L-赖氨酸产生。在W0-A-97/23597中，通过提高将这些氨基酸排出细胞的输出载体的活性来在微生物中达到诸如L-赖氨酸的氨基酸产生的增加。通常通过搜索以极大量产生代谢物的突变体来获得这类超量产生者。此搜索称为“筛选”。在筛选中，通常利用常规化学或物理诱变剂(例如MNNG或UV)来在起始菌株中诱导随机突变(非定向诱变)，并用常规微生物学方法选择突变体。提供代谢物超量产生者的另一可能性包括通过定向基因过量表达或缺失或避免竞争合成途径来增强特定合成途径。但是，此处的问题是，尤其是在非定向诱变的情况下，难以在大量细胞中检测哪一个细胞中发生了这样的突变，该突变导致所关注的代谢物的胞内合成增加。这需要的筛选方法非常耗时且昂贵。本发明基于克服源自现有技术的不足的目的，其与超量产生特定代谢物的遗传修饰细胞的检测相关。具体而言，本发明基于提供遗传修饰细胞的目的，其中可以在突变后以简单的方式鉴定导致超量产生特定代谢物的那些突变体，且可以可选地将它们从其余细胞分开。本发明所基于的另一目的由提供用于鉴定具有提高的特定代谢物的胞内浓度的细胞的方法组成，该方法使得可能以极其简单和便宜的方式在大量细胞中或从大量细胞(例如在细胞悬液中或从细胞悬液)鉴定并可选地定向分开这种细胞。本发明还基于提供具有特定代谢物的优化产生的细胞的目的，其中以定向方式引入或通过定向突变产生已通过上述筛选方法鉴定为对超量产生此代谢物有利的基因或突变。通过这样的细胞来对达到上述目的作出贡献，该细胞就其野生型而言进行了遗传修饰，且包含编码自发荧光蛋白的基因序列，其中该自发荧光蛋白的表达依赖于特定代谢物的胞内浓度。本文使用的术语“代谢物”将非常概括地理解为意指本发明的生化代谢途径的中间产物，其包括氨酸或氨基酸衍生物，例如L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-缬氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-瓜氨酸、L-组氨酸、L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸、L-色氨酸、L-甘氨酸或O-乙酰-L-丝氨酸；核苷酸或核苷酸衍生物，例如黄嘌呤、GTP或环二鸟苷一磷酸；脂肪酸或脂肪酸衍生物，例如乙酰辅酶A硫酯；糖或糖衍生物，例如葡萄糖、鼠李糖、核酮糖二磷酸、β -D-半乳糖苷或D-葡糖胺6-磷酸；酮酸，例如酮戊二酸；抗生素，例如噻烯霉素、卑霉 素、诺卡菌素或四环素；维生素或维生素衍生物，例如生物素或硫胺素焦磷酸；或嘌呤类生物碱，例如茶碱。上述代谢物的“衍生物”理解为尤其意指对应的化合物的胺、磷酸盐或酯。极其优选的代谢物是氨基酸，尤其是选自L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-缬氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-瓜氨酸、L-组氨酸、L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸、L-色氨酸、O-乙酰-L-丝氨酸的氨基酸，尤其优选选自L-赖氨酸、L-精氨酸、L-瓜氨酸和L-组氨酸的氨基酸。本发明最优选的代谢物是L-赖氨酸。细胞的“野生型”优选理解为意指其基因组以通过进化自然形成的状态存在的细胞。该术语用于整个细胞和单个基因二者。具体而言，因此，利用重组方法人为地至少部分修饰其基因序列的那些细胞或那些基因不归入术语“野生型”。本发明尤其优选的细胞是棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、芽抱杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、假丝酵母属(Candida)、毕赤氏酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluveromyces)、酵母属(Saccharomyces)、埃希氏菌属(Escherichia)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、子囊菌酵母属(Yarrowia)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)和梭菌属(Clostridium)的那些，其中尤其优选黄色短杆菌(Brevibacterium fIavum)、乳发酵短杆菌(Brevibacterium Iactofermentum)、大肠杆菌、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、乳酸克鲁维酵母(Kluveromyces Iactis)、布朗克假丝酵母(Candida blankii)、皱裙假丝酵母(Candida rugosa)、谷氛酸棒杆菌、YS-314棒杆菌(Corynebacterium efficiens)、运动发酵单抱菌(Zymonomas mobilis)、解脂亚罗酵母(Yarrowia Iipolytica)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、真氧产喊杆菌(Ralstonia eutropha)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。本发明最优选的细胞是棒状杆菌属和埃希氏菌属的那些，其中谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌是极其优选的细菌菌株。尤其是在代谢物是L-赖氨酸的情况下，遗传修饰的细胞尤其可以衍生自选自以下的细胞谷氨酸棒杆菌ATCC13032、醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)ATCC15806、嗜乙酸乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC13870、蜜栖棒杆菌(Corynebacterium melassecola)ATCC17965、热产氨棒杆菌(Corynebacteriumthermoaminogenes) FERM BP-1539、黄色短杆菌 ATCC14067、乳发酵短杆菌 ATCC13869 和叉开短杆菌(Brevibacteriumdivaricatum)ATCC14020,及从其产生的产生L-氨基酸的突变体和菌株，例如产生L-赖氨酸的菌株谷氨酸棒杆菌FERM-P 1709、黄色短杆菌FERM-P1708、乳发酵短杆菌FERM-P 1712、谷氨酸棒杆菌FERM-P 6463、谷氨酸棒杆菌FERM-P 6464和谷氨酸棒杆菌DSM 5715，或例如产生L-甲硫氨酸的菌株谷氨酸棒杆菌ATCC21608。可以提到的适宜的大肠杆菌菌株的实例是大肠杆菌AJl 1442 (见JP 56-18596和US4，346，170)、大肠杆菌菌株VL611和大肠杆菌菌株WC196 (见W0-A-96/17930)。因此，就其野生型而言进行了遗传修饰的本发明的细胞的特征在于，它们包含编码自发荧光蛋白的基因序列，其中此自发荧光蛋白的表达依赖于特定代谢物的胞内浓度。本领域技术人员已知的编码自发荧光蛋白的所有基因序列都可能作为编码自发·荧光蛋白的基因序列。尤其优选编码Aequora荧光蛋白质(如绿色荧光蛋白(GFP))及其变体的基因序列，该变体在不同波长范围内发荧光(例如，黄色荧光蛋白YFP ;蓝色荧光蛋白BFP ;青色荧光蛋白CFP)或其荧光得到增强(增强型GFP或EGFP或EYFP、EBFP或ECFP)。此外，还可以按照本发明使用编码其他自发突光蛋白(例如，从BDBiosciences, FranklinLakes, USA 已知的 DsRecU HcRecU AsRecU AmCyan、ZsGreen、AcGFP、ZsYellow)的基因序列。因此，可以以多种方式和途径来按照本发明实现这样的特征，根据该特征，自发荧光蛋白的表达依赖于特定代谢物的胞内浓度，从而可以作为此代谢物浓度的函数由细胞控制。根据本发明的细胞的第一具体实施方案，作为特定代谢物的胞内浓度的函数在转录水平实现编码自发荧光蛋白的基因序列的表达控制。取决于特定代谢物的胞内浓度，因此形成较多或较少的可以在核糖体中翻译形成自发荧光蛋白的mRNA。与本发明的细胞的此第一具体实施方案相关，可以通过使编码自发荧光蛋白的基因序列处于异源启动子的控制下来实现在翻译水平控制表达，该异源启动子在细胞的野生型中控制这样的基因的表达，该基因在野生型细胞中的表达依赖于特定代谢物的胞内浓度。编码自发荧光蛋白的基因序列还可以处于衍生自这种启动子的启动子的控制下。措词“处于异源启动子的控制下”表明，在自然方式中，尤其是在从其分离该启动子序列并可选地进行遗传修饰来进一步提高启动子效率的野生型细胞中，该启动子不调节编码自发荧光蛋白的基因序列的表达。在这一点上，措词“衍生自这种启动子的”意指包含在该遗传修饰细胞中并调节编码自发荧光蛋白的基因序列的表达的启动子并非必须是必须以相同的核酸序列包含在野生型细胞中的启动子。相反，为了提高启动子效率的目的，可以例如通过单个核酸序列的回文化(palindromization),例如通过单个碱基的插入、缺失或交换来修饰此启动子序列。调节编码自发荧光蛋白的基因序列表达的启动子也并非必须是包含在遗传修饰细胞自身的基因组中的启动子，或衍生自包含在遗传修饰细胞自身的基因组中的启动子的启动子。然而，如果启动子是包含在遗传修饰细胞自身的基因组中的启动子，或衍生自包含在遗传修饰细胞自身的基因组中的启动子的启动子，但在其中控制其表达依赖于特定代谢物的胞内浓度的基因的表达，则也可以证明是完全有利的。在本发明的细胞的此实施方案中，编码自发荧光蛋白的基因序列处于启动子控制下。在此背景中，术语“处于启动子控制下”优选理解为意指编码自发荧光蛋白的基因序列与该启动子功能性连接。如果这两个序列和可选的其他调节元件(例如终止子)顺次排列，使得各调节元件可以在核酸序列的转基因表达中执行其功能，则启动子和编码自发荧光蛋白的基因序列功能性连接。为此，并非绝对必需化学意义上的直接连接。遗传控制序列(例如增强子序列)也可以从更远的位置或甚至从其他DNA分子发挥其对靶序列的功能。优选将编码自发荧光蛋白的基因序列放置在启动子序列之后(即，3’端)，使得两个序列相互共价连接的排列。优选地，在此背景中，编码自发荧光蛋白的基因序列和启动子序列之间的距离小于200碱基对,尤其优选小于100碱基对,极其优选小于50碱基对。编码自发突光蛋白的基因序列和启动子还可能这样相互功能性连接，使得这两个基因序列之间仍存在异源基因(即，其在野生型细胞中的表达受该启动子调节的基因)的部分序列。在这种DNA构建体的表达中，获得来自自发荧光蛋白和由对应的同源基因的部分序列编码的氨基酸序列的融合蛋白。这类同源基因的部分序列的长度并不重要，只要不使自发荧光蛋白的功能能力(即，其在用特定波长的光激发时发荧光的特性)显著受损。除启动子和编码自发荧光蛋白的基因序列外，根据此具体实施方案，本发明的细胞还可以包含编码调节物的基因序列，其中该调节物优选是这样的蛋白质，该蛋白质以任意方式与代谢物和启动子相互作用，并以此方式影响启动子序列与RNA聚合酶的结合亲和力。在此背景中，调节物和启动子序列之间的相互作用依赖于代谢物的存在。通常，代谢物与调节物的特定功能区结合，并以此方式具有改变调节物构象的作用，该构象改变对调节物和启动子序列之间的相互作用具有影响。在此背景中，该调节物基本上可以是激活物或阻抑物。根据本发明，可能的启动子基本上是所有启动子，该启动子通常通过功能性连接来控制其表达依赖于特定代谢物的胞内浓度的基因的表达。极其优选地，该启动子是通常控制这样的基因的表达的启动子，该基因的表达依赖于特定代谢物的胞内浓度，且编码使得可能通过代谢物的化学反应或通过将代谢物从细胞排出来降低代谢物的胞内浓度的蛋白质。因此，此蛋白质或者是催化该代谢物转化为不同于该代谢物的代谢产物的反应的酶，或者是催化该代谢物从细胞流出的主动或被动转运蛋白。此外，启动子可以是在代谢物的存在下与特定激活物相互作用，并以此方式导致编码自发荧光蛋白的基因序列表达的那些启动子，或者受阻抑物抑制的启动子，该阻抑物通过与特定代谢物相互作用来扩散脱离(diffusing away from)启动子,结果消除了抑制，实现编码自发荧光蛋白的基因序列的表达。
现将在下文中更详细地描述本发明的此第一具体实施方案的细胞的适宜的实例。但是，将在这一点上强调，本发明不限于归入本发明的细胞的第一具体实施方案的以下实例。因此，第一实施方案的遗传修饰细胞可以是这样的遗传修饰细胞，优选遗传修饰的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)细胞,其包含编码自发突光蛋白的基因序列，该基因序列处于bkd启动子的控制下(恶臭假单胞菌中的BkdR调节物见例如J. Bact.，181 (1999)，2，889-2，894 页；J. Bact.，187 (2005)，664 页)。提高的 L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-缬氨酸或D-亮氨酸的胞内浓度在此导致自发荧光蛋白的表达。除bkd启动子和处于此启动子控制下的自发荧光蛋白的基因序列外，这种细胞还优选包含编码BkdR调节物(支链酮酸脱氢酶调节蛋白)的基因序列。在SEQ ID No. 01中再现受BkdR调节物调节的bkd启动子的DNA序列，在SEQ ID No. 02中再现BkdR调节物自身的序列。此外，第一实施方案的遗传修饰细胞可以是这样的遗传修饰细胞，优选遗传修饰的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)细胞，其包含编码自发荧光蛋白的基因序列，该基因序列处于ackA启动子的控制下(CodY阻抑物见Mol. Mic. 62 (2006)，811页)。同样，提高的L-异亮氨酸、L-亮氨酸和L-缬氨酸的胞内浓度在此导致自发荧光蛋白的表达。除ackA启动子和处于此启动子控制下的自发荧光蛋白的基因序列外，这种细胞还优选包含编码CodY阻抑物的基因序列。在SEQ ID No. 03中再现受CodY激活物调节的ackA启动子的DNA序列，在SEQ ID No. 04中再现CodY激活物自身的序列。第一实施方案的遗传修饰细胞还可以是这样的遗传修饰细胞，优选遗传修饰的恶臭假单胞菌细胞，其包含编码自发荧光蛋白的基因序列，该基因序列处于mdeA启动子的控制下(MdeR调节物见J. Bacteriol.，179 (1997)，3，956页)。提高的L-甲硫氨酸的胞内浓度在此导致自发荧光蛋白的表达。除mdeA启动子和处于此启动子控制下的自发荧光蛋白的基因序列外，这种细胞还优选包含编码MdeR调节物的基因序列。在SEQ ID No. 05中再现受MdeR调节物调节的mdeA启动子的DNA序列，在SEQ ID No. 06中再现MdeR调节物自身的序列。此外，第一实施方案的遗传修饰细胞可以是这样的遗传修饰细胞，优选遗传修饰·的谷氨酸棒杆菌细胞，其包含编码自发荧光蛋白的基因序列，该基因序列处于brnF启动子的控制下(谷氨酸棒杆菌中的Lrp调节物见J. Bact.，184(14) (2002)，3，947-3，956页)。提高的L-异亮氨酸、L-亮氨酸和L-缬氨酸的胞内浓度在此导致自发荧光蛋白的表达。除brnF启动子和处于此启动子控制下的自发荧光蛋白的基因序列外，这种细胞还优选包含编码Lrp调节物的基因序列。在SEQ ID No. 07中再现受Lrp调节物调节的brnF启动子的DNA序列,在SEQ ID No. 08中再现Lrp调节物自身的序列。此外，第一实施方案的遗传修饰细胞可以是这样的遗传修饰细胞，优选遗传修饰的大肠杆菌细胞，其包含编码自发荧光蛋白的基因序列，该基因序列处于cysP启动子的控制下(大肠杆菌中的CysB调节物见Mol. Mic.，53 (2004)，791页)。提高的O-乙酰-L-丝氨酸的胞内浓度在此导致自发荧光蛋白的表达。除cysP启动子和处于此启动子控制下的自发荧光蛋白的基因序列外，这种细胞还优选包含编码CysB调节物的基因序列。在SEQIDNo. 09中再现受CysB调节物调节的cysP启动子的DNA序列，在SEQ IDNo. 10中再现Lrp调节物自身的序列。第一实施方案的遗传修饰细胞还可以是这样的遗传修饰细胞，优选遗传修饰的大肠杆菌细胞，其包含编码自发荧光蛋白的基因序列，该基因序列处于cadB启动子的控制下(大肠杆菌中的CadC调节物见Mol. Mic. 51 (2004)，I, 401-1，412页)。提高的诸如尸胺或腐胺的二胺的胞内浓度在此导致自发荧光蛋白的表达。除cadB启动子和处于此启动子控制下的自发荧光蛋白的基因序列外，这种细胞还优选包含编码CadC调节物的基因序列。在SEQ ID No. 11中再现受CadC调节物调节的cadB启动子的DNA序列，在SEQ ID No. 12中再现CadC调节物自身的序列。此外，第一实施方案的遗传修饰细胞可以是这样的遗传修饰细胞，优选遗传修饰的谷氨酸棒杆菌细胞，其包含编码自发荧光蛋白的基因序列，该基因序列处于metY、metK、hom、cysK、cysI或suuD启动子的控制下(谷氨酸棒杆菌中的McbR调节物及受此调节物调节的启动子序列见Mol. Mic. 56 (2005)，871-887页)。提高的S-腺苷高半胱氨酸的胞内浓度在此导致自发突光蛋白的表达。除metY、metK、hom、cysK、cysI或suuD启动子和处于此启动子控制下的自发荧光蛋白的基因序列外，这种细胞还优选包含编码McbR调节物的基因序列。在SEQ ID No. 13中再现受McB调节物调节的metY启动子的DNA序列，在SEQ IDNo. 14中再现MecR调节物自身的序列。第一实施方案的遗传修饰细胞还可以是这样的遗传修饰细胞，优选遗传修饰的大肠杆菌细胞，其包含编码自发荧光蛋白的基因序列，该基因序列处于argO启动子的控制下。提高的L-赖氨酸的胞内浓度在此导致自发荧光蛋白的表达。除argO启动子和处于此启动子控制下的自发荧光蛋白的基因序列外，这种细胞还优选包含编码ArgP调节物的基因序列。在SEQID No. 15中再现受ArgO调节物调节的argO启动子的DNA序列，在SEQIDNo. 16中再现ArgP调节物自身的序列。此外，第一实施方案的尤其优选的配置的遗传修饰细胞可以是这样的遗传修饰细胞，优选遗传修饰的谷氨酸棒杆菌细胞，其包含编码自发荧光蛋白的基因序列，该基因序列处于IysE启动子的控制下(IysE启动子及其调节物LysG见Microbiology, 147 (2001),1，765页)。提高的L-赖氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸和L-瓜氨酸的胞内浓度在此导致自发荧光蛋白的表达。除IysE启动子和处于此启动子控制下的自发荧光蛋白的基因序列外，这种细胞还优选包含编码LysG调节物的基因序列。在SEQ ID No. 17中再现受LysG调节物调节的IysE启动子的DNA序列，在SEQ ID No. 18中再现LysG调节物自身的序列。在谷氨酸棒杆菌中，IysE基因编码次级载体(secondary carrier),该载体与涉及有机分子和阳离子流出的12个已知转运蛋白超家族之一在分子水平和结构水平上都不具有相似性。基于新的功能和罕见的结构，已将LysE鉴定为新的易位蛋白家族的第一个成员。在基因组测序的背景中，虽然其功能迄今仍基本上未知，但可能将许多蛋白质归入此家族。LysE所属的LysE家族与RhtB家族和CadD家族一起形成LysE超家族，迄今已将总计22个成员归入LysE超家族。在LysE家族中，来自谷氨酸棒杆菌的赖氨酸输出蛋白(exporter)是迄今唯一具有功能特征的成员。在遗传水平，IysE受调节物LysG (控制L-赖氨酸输出)调节。LysG与LTTR家族的细菌调节蛋白(LysR型转录调节物)具有高度相似性。在此背景中，L-赖氨酸作为LysG介导的IysE转录的诱导物。除L-赖氨酸外，两种碱性氨基酸L-精氨酸和L-组氨酸以及L-瓜氨酸也是LysG介导的IysE表达的诱导物。此外，第一具体实施方案的遗传修饰细胞可以是这样的遗传修饰细胞，优选遗传修饰的大肠杆菌细胞，其包含编码自发荧光蛋白的基因序列，该基因序列处于fadE或fadBA启动子的控制下(大肠杆菌中的FadR调节物见例如Mol. Biol.，29 (4) (2002)，937-943页)。提高的乙酰辅酶A的胞内浓度在此导致自发荧光蛋白的表达。除fadE或fadBA启动子和处于此启动子控制下的自发荧光蛋白的基因序列外，这种细胞还优选包含编码FadR调节物的基因序列。在SEQ ID No. 19中再现受FadR调节物调节的fadE启动子的DNA序列，在SEQ ID No. 20中再现LysG调节物自身的序列。第一具体实施方案的遗传修饰细胞还可以是这样的遗传修饰细胞，优选遗传修饰的枯草芽孢杆菌细胞，其包含编码自发荧光蛋白的基因序列，该基因序列处于fadM启动子的控制下(枯草芽孢杆菌中的FabR调节物见例如J. Bacteriol.，191 (2009)，6，320-6，328页)。同样，提高的乙酰辅酶A的胞内浓度在此导致自发荧光蛋白的表达。除fadM启动子和处于此启动子控制下的自发荧光蛋白的基因序列外，这种细胞还优选包含编码FabR调节物的基因序列。在SEQ ID No. 21中再现 受FabR调节物调节的fadM启动子的DNA序列，在SEQ ID No. 22中再现FabR调节物自身的序列。
此外，第一具体实施方案的遗传修饰细胞可以是这样的遗传修饰细胞，优选遗传修饰的大肠杆菌细胞，其包含编码自发荧光蛋白的基因序列，该基因序列处于rhaSR、rhaBAD或rhaT启动子的控制下(大肠杆菌中的RhaR和RhaS调节物见例如J. Bacteriol.,189(1) (2007)，269-271)。提高的鼠李糖的胞内浓度在此导致自发荧光蛋白的表达。除rhaSR、rhaBAD或rhaT启动子和处于此启动子控制下的自发荧光蛋白的基因序列外，这种细胞还优选包含编码RhaR和RhaS调节物的基因序列。在SEQ ID No. 23中再现受RhaR调节物调节的rhaSR启动子的DNA序列，在SEQ ID No. 24中再现rhaBAD启动子的序列，在SEQ ID No. 25中再现RhaR调节物的序列，在SEQ ID No. 26中再现RhaS调节物的序列。第三配置的遗传修饰细胞还可以是这样的遗传修饰细胞，优选遗传修饰的鱼腥藻属物种(Anabaena sp.)细胞，其包含编码自发荧光蛋白的基因序列，该基因序列处于hetC、nrrA或devB启动子的控制下(鱼腥藻属物种中的NtcA调节物见例如J. Bacteriol.,190(18) (2008)，6，126-6，133页)。提高的酮戊二酸的胞内浓度在此导致自发荧光蛋白的表达。除hetC、nrrA或devB启动子和处于此启动子控制下的自发荧光蛋白的基因序列外，这种细胞还优选包含编码NtcA调节物的基因序列。在SEQ ID No. 27中再现受NtcA调节 物调节的hetC启动子的DNA序列，在SEQ ID No. 28中再现nrrA启动子的序列，在SEQ IDNo. 29中再现devB启动子的序列，在SEQ ID No. 30中再现NtcA调节物的序列。此外，第一具体实施方案的遗传修饰细胞可以是这样的遗传修饰细胞，优选遗传修饰的分枝杆菌属物种(Mycobacterium sp.)细胞,其包含编码自发突光蛋白的基因序列，该基因序列处于cbbLS-2或cbbLS-Ι启动子的控制下(分枝杆菌属物种中的CbbR调节物见例如Mol. Micr. 47 (2009)，297页)。提高的核酮糖二磷酸的胞内浓度在此导致自发荧光蛋白的表达。除cbbLS-2或cbbLS-Ι启动子和处于此启动子控制下的自发荧光蛋白的基因序列外，这种细胞还优选包含编码CbbR调节物的基因序列。在SEQ IDNo. 31中再现CbbR调节物的DNA序列。此外，第一具体实施方案的遗传修饰细胞可以是这样的遗传修饰细胞，优选遗传修饰的卡特利链霉菌(Streptomyces cattleya)细胞,其包含编码自发突光蛋白的基因序列，该基因序列处于PcbAB启动子的控制下(卡特利链霉菌中的ThnU调节物见例如Mol.Micr.，69 (2008)，633页)。提高的噻烯霉素的胞内浓度在此导致自发荧光蛋白的表达。除pcbAB启动子和处于此启动子控制下的自发荧光蛋白的基因序列外，这种细胞还优选包含编码ThnU调节物的基因序列。在SEQ ID No. 32中再现受ThnU调节物调节的pcbAB启动子的DNA序列，在SEQ ID No. 33中再现ThnU调节物自身的序列。第一具体实施方案的遗传修饰细胞还可以是这样的遗传修饰细胞，优选遗传修饰的绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)细胞,其包含编码自发突光蛋白的基因序列，该基因序列处于aviRa启动子的控制下(绿色产色链霉菌中的AviCl或AviC2调节物见例如J. Antibiotics，62 (2009)，461页)。提高的卑霉素的胞内浓度在此导致自发荧光蛋白的表达。除aviRa启动子和处于此启动子控制下的自发荧光蛋白的基因序列外，这种细胞还优选包含编码AviCl和/或AviC2调节物的基因序列。在SEQ IDNo. 34中再现受AviCl或AviC2调节物调节的aviRa启动子的DNA序列，在SEQ ID No. 35中再现AviCl或AviC2调节物自身的序列。此外，第一具体实施方案的遗传修饰细胞可以是这样的遗传修饰细胞，优选遗传修饰的均勻诺卡氏菌(Nocardia uniformis)细胞,其包含编码自发突光蛋白的基因序列，该基因序列处于nocF启动子的控制下(均匀诺卡氏菌中的NocR调节物见例如 J. Bacteriol.，191 (2009)，1，066页)。提高的诺卡菌素的胞内浓度在此导致自发荧光蛋白的表达。除nocF启动子和处于此启动子控制下的自发荧光蛋白的基因序列外，这种细胞还优选包含编码NocR调节物的基因序列。在SEQ ID No. 36中再现受NocR调节物调节的 nocF启动子的DNA序列，在SEQ ID No. 37中再现NocR调节物自身的序列。
因此，大体而言，存在产生本发明的第一具体实施方案的细胞的多种可能性，该细胞包含上述启动子及编码自发荧光蛋白且处于此启动子控制下的核酸。
第一种可能性由例如以下组成从其基因组已包含上述启动子之一，且优选包含编码对应的调节物的基因序列的细胞起始，然后将编码自发荧光蛋白的基因序列引入该细胞的基因组中，使得此基因序列处于该启动子的控制下。如果适当，为了提高启动子效率的目的，可以在编码自发荧光蛋白的基因序列整合入基因组之前或之后，通过一个或多个核苷酸交换、核苷酸缺失或核苷酸插入 来修饰启动子自身的核酸序列。
第二种可能性由例如以下组成将一个或多个核酸构建体引入细胞中，该构建体包含启动子序列及编码自发荧光蛋白且处于该启动子控制下的基因序列，为了提高启动子效率的目的，此处还可能通过一个或多个核苷酸交换、核苷酸缺失或核苷酸插入来修饰启动子自身的核酸序列。核酸构建体的插入可以发生在染色体上或染色体外，例如发生在染色体外复制载体上。适宜的载体是在特定细菌菌株中复制的那些。许多已知白勺质粒载体，如 pZl (Menkel 等，Applied and Environmental Microbiology (1989) 64 549-554)、pEKExl(Eikmanns 等，Gene 102 :93-98(1991))或 pHS2_l (Sonnen 等，Gene 107 69-74(1991))基于隐蔽性质粒pHM1519、pBLl或pGAl。可以以相同的方式使用其他质粒载体，例如基于 pCG4 (US 4, 489, 160)或 pNG2 (Serwold-Davis 等，FEMS Microbiology Letters66，119-124(1990))或pAGl(US 5, 158,891)的那些。但是，此列表不是对本发明的限制。
本领域技术人员例如从Martin 等(Bio/Technology 5,137-146 (1987))、从 Guerrero 等(Gene 138,35-41 (1994))> 从 Tsuchiya 和 Morinaga(Bio/Technology 6, 428-430(1988))、从 Eikmanns 等(Gene 102，93-98 (1991))、从 EP-A-O 472 869、从 US 4,601,893、从 Schwarzer 和 Piihler(Bio/Technology 9,84-87(1991))、从 Remscheid 等(Applied andEnvironmental Microbiology 60,126-132(1994))> 从 LaBarre 等 (Journalof Bacteriology 175,1001-1007(1993))、从 W0-A-96/15246、从 Malumbres 等 (Gene 134,15-24 (1993))、从 JP-A-10-229891、从 Jensen 和 Hammer(Biotechnology and Bioengineering 58,191-195(1998))及从已知的遗传学和分子生物学教科书充分了解了产生包含启动子和此启动子控制下的基因序列的基因构建体及将这种构建体导入细胞的染色体中或将包含此基因构建体的染色体外复制载体导入细胞中的指导。
根据本发明的细胞的第二具体实施方案，利用所谓的“核糖开关(riboswitch) ”， 作为特定代谢物的胞内浓度的函数实现对编码自发荧光蛋白的基因序列的表达控制，可能利用这种“核糖开关”来在转录水平和翻译水平两个水平上调节表达。“核糖开关”理解为意指完全由mRNA组成的调节元件。它们同时作为传感器和调节元件。核糖开关的综述见于例如 Vitrechak 等，Trends in Genetics, 20 (I) (2004), 44-50 页中。关于用核糖开关调节基因表达的其他详情还可以见于提交至Faculty of Biochemistry, Chemistry and Pharmacy of the Johann Wolfgang Goethe University inFrankfurt am Main 的 Jonas Noeske (2007)的标题为 “StrukturelIeUntersuchungen an Metabolit-bindenden Riboswitch-RNAs mittelsNMR” 的论文中。
可以将核糖开关用于本发明的此第二具体实施方案的细胞，因为编码自发荧光蛋白的基因序列与能够在mRNA水平结合代谢物的DNA序列功能性连接，沿DNA的进一步转录或核糖体上的翻译作为代谢物与mRNA结合的函数受影响。核糖开关以这种方式在转录水平或翻译水平调节编码自发荧光蛋白的基因序列的表达。在本发明的具有核糖开关元件的细胞中，代谢物直接与mRNA 5’ -UTR中的构成区域结合而不涉及任何蛋白质因子，并诱导 RNA 二级结构的改变。5’-UTR中的此构象改变导致后面编码自发荧光蛋白的基因的表达的调变。在此背景中，可以通过影响转录或翻译，或者(如果适当)还通过影响RNA加工来达到基因调节作用。核糖开关的代谢物结合区(适配体结构域)是模块式独立RNA结构域。 核糖开关的其余部分(表达平台)通常位于适配体结构域的下游。取决于代谢物是否与适配体结构域结合，表达平台可以与适配体结构域的区域形成碱基配对。在大多数情况下，表达平台和适配体结构域之间的这些碱基配对发生在非结合代谢物状态中，并导致基因表达的激活。相反，配体结合状态中阻碍了这些碱基配对，其通常导致基因表达的抑制。该调节机制是否对转录或翻译具有影响取决于表达平台在代谢物结合或非代谢物结合状态中采取的二级结构。表达平台常包含可以形成转录终止子和转录抗终止子的序列，但是，这两种二级结构相互排斥。常存在的另一基序是通过其来将SD序列(Shine-Dalgarno序列)转化为单链形式或将SD序列掩蔽(取决于代谢物结合状态)的二级结构。如果二级结构的形成掩蔽了 SD序列，则核糖体不能识别SD序列。核糖 开关可以以这种方式调节转录的提前中断或翻译的起始。
可以提到的使得能够在转录水平或翻译水平控制自发荧光蛋白的表达的适宜核糖开关元件的实例是，例如，来自枯草芽孢杆菌的赖氨酸开关(Grundy等，2009所述)、来自枯草芽孢杆菌的甘氨酸核糖开关(Mandal等，Science 306 (2004)，275-279页所述)、来自枯草芽抱杆菌的腺嘌呤核糖开关(Mandal和Breaker, Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (2004)， 29-35页所述)或来自炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)的TPP串联核糖开关(Welz 和Breaker，RNA 13 (2007)，573-582页所述)。除这些天然存在的核糖开关元件外，还可以使用合成的核糖开关元件，例如茶碱核糖开关(Jenison等，Science 263(1994), I, 425-1，429 页或 Desai 和 Gellivan, J. Am. Chem. Soc. 126 (2004)，1. 3247-54 页所述)、生物素核糖开关(Wilson 等，Biochemistry 37 (1998)，14, 410-14，419 页所述)或 Tet 核糖开关(Berens 等，Bioorg. Med. Chem. 9 (2001)，2, 549-2，556 页所述)。
此外，通过用于在细胞悬液中鉴定具有提高的特定代谢物的胞内浓度的细胞的方法来对达到上述目的作出贡献，该方法包括步骤
i)提供包含上述本发明的细胞的细胞悬液，该细胞就其野生型而言进行了遗传修饰，且包含编码自发荧光蛋白的基因序列，其中该自发荧光蛋白的表达依赖于特定代谢物的胞内浓度；
ii)遗传修饰细胞来获得细胞悬液，其中细胞就特定代谢物的胞内浓度而言不
iii)通过检测胞内荧光活性来鉴定该细胞悬液中具有提高的此特定代谢物的胞内浓度的单个细胞。
在本发明的方法的步骤i)中，首先提供包含营养培养基和大量上述遗传修饰细胞的细胞悬液。
然后在本发明的方法的步骤ii)中，对细胞悬液中的一个或多个细胞进行遗传修饰，以获得细胞悬液，其中细胞就特定代谢物的胞内浓度而言不同。
可以通过定向或非定向诱变来实现细胞悬液的遗传修饰，尤其优选非定向诱变。
在定向诱变中，以受控的方式在细胞的特定基因中产生突变。可能的突变是转换、颠换、插入和缺失。取决于该氨基酸交换对酶活性的影响，涉及“错义突变”或 “无义突变”。在基因中插入或缺失至少一个碱基对导致“移码突变”，其结果是掺入错误氨基酸或翻译提前中断。缺失几个密码子通常导致酶活性的彻底丧失。产生这类突变的指导属于现有技术，且可以见于已知的遗传学和分子生物学教科书中，例如， Knippers ( " MolekulareGenetik ",第 6 版，Georg Thieme-Verlag, Stuttgart,德国， 1995、Winnacker (" Gene und Klone " , VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，德国，1990) 5 Hagemann (" Allgemeine Genetik" , Gustav Fischer-Verlag, Stuttgart, 1986)的教科书。
涉及这些定向诱变方法的详情，尤其是有用的参考文献可以见于例如DE-A-102 24 088 中。
但是，本发明尤其优选通过非定向诱变来实现方法步骤ii)中的遗传修饰。这种非定向诱变的实例是用诸如N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍的化学品处理细胞或用紫外线照射细胞。这类用于诱导突变的方法众所周知，且尤其可以在MilleH" A Short Course in Bacterial Genetics, A LaboratoryManual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria " (ColdSpring Harbor Laboratory Press,1992))中或在 American Society forBacteriology 的手册 〃 Manual of Methods for General Bacteriology " (Washington D. C. , USA, 1981)中查找。
通过方法步骤ii)中细胞的遗传修饰，取决于细胞中已发生的突变的性质，在特定细胞中，例如由于提高或降低的酶活性·、特定酶的提高或降低的表达、特定转运蛋白的提高或降低的活性、特定转运蛋白的提高或降低的表达、调节蛋白中的突变、结构蛋白中的突变或RNA控制元件中的突变，代谢物的胞内浓度可以提高，该代谢物通过经启动子与对应的调节蛋白相互作用或通过与核糖开关元件相互作用而对自发荧光蛋白的表达具有影响。 从而区分其中特定代谢物的浓度因该突变而提高的细胞，因为此细胞中形成了自发荧光蛋白。自发荧光蛋白的基因从而作为提高的胞内代谢物浓度的报道基因。
在本发明的方法的方法步骤iii)中，从而通过检测胞内荧光活性来鉴定细胞悬液中具有提高的此特定代谢物的胞内浓度的单个细胞。为此，将细胞悬液暴露于激发自发荧光蛋白发光的频率的电磁辐射。
根据本发明的方法的具体配置，在方法步骤iii)中鉴定细胞后，优选在方法步骤iii)中鉴定细胞后立即进行另一方法步骤iv)，其中将鉴定出的细胞从细胞悬液分开，优选利用流式细胞术(FACS =荧光激活细胞分选术)、极其优选利用高效流式细胞术 (HAT-FACS=高通量荧光激活细胞分选术)来进行此分开。关于利用流式细胞术分析细胞悬液的详情可以见于例如Sack U, Tarnok A, Rothe G (编辑)ZeIllllSre Diagnostik. Grundlagen, Methoden und klinische Anwendungen der Durchflusszytometrie,Basel, Karger, 2007，27-70 页中。
因此，利用本发明的方法，可能以定向方式在细胞悬液(其中已在细胞中产生定向或非定向突变)中分离其中的突变已导致特定代谢物的胞内浓度提高的那些细胞而不影响细胞的活力。
还通过用于产生就其野生型而言进行了遗传修饰的具有特定代谢物的优化产生的细胞的方法来对达到上述目的作出贡献，该方法包括步骤
I)提供包含上述本发明的细胞的细胞悬液，该细胞就其野生型而言进行了遗传修饰，且包含编码自发荧光蛋白的基因序列，其中该自发荧光蛋白的表达依赖于特定代谢物的胞内浓度；
II)遗传修饰细胞来获得细胞悬液，其中细胞就其特定代谢物的胞内浓度而言不同；
III)通过检测胞内荧光活性来鉴定该细胞悬液中具有提高的特定代谢物的胞内浓度的单个细胞；
IV)将鉴定出的细胞从细胞悬液分开；
V)在鉴定出并分开的细胞中鉴定负责提高的特定代谢物的胞内浓度的那些遗传修饰基因G1至Gn或那些突变M1至Mm ;
VI)产生就其野生型而言进行了遗传修饰的具有特定代谢物的优化产生的细胞， 其基因组包含基因G1至Gn中的至少一个和/或突变M1至Mm中的至少一个。
根据方法步骤I)至IV)，首先通过诱变产生具有提高的特定代谢物的胞内浓度的细胞并从细胞悬液分开，此处可能参考上述方法步骤i)至iv)。
然后在方法步骤V)中，利用本领域技术人员已知的遗传学方法在鉴定出并分开的细胞中鉴定负责提高的特定代谢 物的胞内浓度的那些遗传修饰基因G1至Gn或那些突变 M1至Mm，η和m的数值分别取决于在鉴定出并分开的细胞中观察到的修饰基因的数目和观察到的突变的数目。优选地，在此背景中，该方法是这样，首先分析已知其在细胞中刺激特定代谢物的形成的那些基因序列或启动子序列。在L-赖氨酸作为该代谢物的情况下，这些是例如基因lysC、hom、zwf、mqo、leuC、gnd或pyk。如果未在这些基因的任一个中识别出突变，则适当时对鉴定出并分开的细胞的整个基因组进行分析来鉴定其他修饰基因Gi或其他突变Mi。可以以这种方式鉴定在细胞中导致特定代谢物的胞内浓度提高的有利的修饰基因61或有利的突变吣。
然后可以在进一步的方法步骤VI)中产生这样的细胞，该细胞就其野生型而言进行了遗传修饰，具有特定代谢物的优化产生，其基因组包含基因G1至6 中的至少一个和/ 或突变M1至Mni中的至少一个。为此，以定向方式将在方法步骤V)中观察到的一个或多个有利的修饰基因G和/或修饰突变M引入细胞中。可以例如利用“基因置换”来实现特定突变的此定向引入。在此方法中，在体外在目的基因中产生诸如缺失、插入或碱基交换的突变。将产生的等位基因克隆入对靶细胞而言是非复制型载体的载体中，然后通过转化或接合来将此载体转入靶细胞中。利用产生整合的第一“交换”事件和产生切除的适宜的第二 “交换”事件在靶基因中或在靶序列中实现同源重组后，达到突变或等位基因的掺入。
还通过具有特定代谢物的优化产生的细胞(通过上述方法获得)来对达到上述目的作出贡献。
还通过用于产生代谢物的方法来对达到上述目的作出贡献，该方法包括步骤
(a)通过上述方法产生就其野生型而言进行了遗传修饰的具有特定代谢物的优化产生的细胞；
(b)在细胞从营养物产生该特定代谢物的条件下在包含该营养物的培养基中培养该细胞。
为了产生代谢物的目的，可以在方法步骤(b)中以分批方法(分批培养)或以补料分批方法(流加法)或反复补料分批方法(反复流加法)在培养基中连续或不连续地培养方法步骤(a)中产生的具有特定代谢物的优化产生的本发明的遗传修饰细胞。还可以想到如GB-A-1009370中所述的半连续方法。已知的培养方法的总结描述于Chmiel的教科书(〃 Bioprozesstechnik1. Einfiihrung in die Bioverfahrenstechnik〃 (GustavFisc her Verlag, Stuttgart, 1991))中或 Storhas 的教科书("Bioreaktoren undperiphere Einrichtungen" , Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)中。
待使用的营养培养基必须以适宜的方式满足特定菌株的需要。 American Society for Bacteriology 的手册 "Manual of Methods for GeneralBacteriology " (Washington D. C. , USA, 1981)中包含多种微生物的培养基的描述。
营养培养基可以包含糖类(例如葡萄糖、鹿糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素)、油和脂肪(例如大豆油、向日葵油、花生油和椰子脂肪)、脂肪酸(例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)、醇(例如甘油和甲醇)、烃(如甲烷)、氨基酸(如L-谷氨酸或L-缬氨酸) 或有机酸(例如乙酸)作为碳源。这些物质可以单独使用或作为混合物使用。
营养培养基可以包含有机含氮化合物(如蛋白胨、酵母提取物、肉膏、麦芽汁、玉米浆、大豆粉和尿素)或无机化合物(如 硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)作为氮源。氮源可以单独使用或作为混合物使用。
营养培养基可以包含磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或对应的含钠盐作为磷源。 此外，营养培养基必须包含生长必需的金属盐，例如硫酸镁或硫酸铁。最后，除上述物质外， 可以利用必需生长物质，如氨基酸和维生素。此外，可以向营养培养基中加入适宜的前体。 可以以一次性分批的形式向培养基中加入所提到的起始物质，或者可以以适宜的方式在培养过程中流加。
以适宜的方式利用碱性化合物(如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水)或酸性化合物 (如磷酸或硫酸)来控制培养物的pH。可以利用消泡剂(例如脂肪酸聚乙二醇酯)来控制泡沫的出现。可以向培养基中加入适宜的具有选择作用的物质(例如抗生素)来维持质粒的稳定性。向培养物中引入氧或含氧气体混合物(例如空气)来维持好气条件。培养物的温度通常是20V至45°C，优选25°C至40°C。
还通过用于制备混合物的方法来对达到上述目的作出贡献，该方法包括步骤
(A)通过上述方法产生代谢物；
(B)将该代谢物与不同于该代谢物的混合物成分混合。
如果该代谢物是氨基酸，尤其是L-赖氨酸，则该混合物优选是食物，极其优选动物饲料，或药物组合物。
现在借助附图和非限制性实施例来更详细地解释本发明。
图1显示可能的构建体，其中本发明的细胞的第一实施方案的自发荧光蛋白 (afp)的基因序列处于启动子(IysE启动子)的控制下。
图2 显示实施例1 中产生的载体 pJCllysGE' eYFP(lysE/ eYFP, LysEi eYFP 融合蛋白的编码序列；lysG，调节蛋白LysG的编码序列；kanR，卡那霉素介导的抗性的编码序列；repA，复制起点；BamHI，限制酶BamHI的识别序列和切割位点)。
图3显示实施例1中获得的菌株ATCC 13032 pJCllysGE' eYFP (上)和DM1800 P JCllysGE' eYFP (下)的共焦显微镜图像。下部图像中的白色条对应于10 μ m的长度。 在每种情况下，将3μ I细胞悬液放置在载玻片上，并通过I %琼脂糖薄层固定。用514nm波长的光激发固定的悬液，曝光时间为700毫秒。使用505nm至550nm范围内的宽谱带滤光片，用Zeiss AxioImager Ml进行eYFP的荧光发射测量。
图4显示实施例2中基于核糖开关元件产生的基因序列的序列，其包含核糖开关元件和与此核糖开关元件功能性连接并编码自发荧光蛋白的基因序列(粗体适配体；斜体终止序列；下划线EYFP)。
图5 显不载体 pJCllrp-brnF' eYFP。·
图6显示实施例3中获得的ATCCUOSZpJCllrp-brnF' -eYFP培养物的内部L-甲硫氨酸浓度与荧光输出信号的相关性。
图7显示实施例4c)中的起始菌株ATCC13032pSenLysTK-C的突变体的赖氨酸形成。
图1显示可能的构建体，其中本发明的细胞的第一实施方案的自发荧光蛋白 (afp)的基因序列处于启动子(IysE启动子)的控制下。变体A显示起始情况，其中依赖代谢物的调节物直接邻近其根据代谢物浓度调节的靶基因(IysE)。根据变体B，在最简单的情况下，用自发荧光蛋白(afp)取代该靶基因。根据变体C，发生了靶基因的第一氨基酸与荧光蛋白的翻译融合。在变体D中，发生了转录融合，使得形成长转录物，其起始于包含靶基因的第一氨基酸的启动子区，结束于终止密码子，后面是核糖体结合位点(RBS)及荧光蛋白的可读框。在变体E中，发生了转录融合，使得形成长转录物，其起始于包含靶基因的第一氨基酸的启动子区，结束于终止密码子，后面是核糖体结合位点及已知且良好表达的蛋白质(例如来自大肠杆菌的β_半乳糖苷酶LacZ)的起始，该蛋白质转而与荧光蛋白融口 ο实施例
实施例1
以其中编码自发荧光蛋白的基因序列处于IysE启动子的控制下，且其中该自发荧光蛋白的表达依赖于胞内L-赖氨酸浓度的细胞为例，产生本发明的第一实施方案的细胞。
a)载体 pJCllysGE' eYFP 的构建
通过重叠延伸PCR来达到IysE^与报道基因eyfp (SEQ ID No. 49 ；eYFP的蛋白质序列SEQ ID No. 72)的融合的构建。用携带IysE的编码序列连同异向转录的调节物LysG的基因的 PUC18-2. 3-kb-lysGE-BamHI (Bellmann 等，2001 !Microbiology 1471765-74)和使得可能扩增 eyfp 的 pEKEx2-yfp-tetR(Frunzke 等,2008 ；J Bacteriol. 190 :5111-9)作为模板。为了建立lysGE' eyfp片段，首先用寡核苷酸组合plySGE_for(SEQ ID No. 38)和 plysGE_rev(SEQ ID No. 39)扩增编码序列 IysGE'和 lysGE' ns(l, OlObp)。对于 eyfp 的编码序列的扩增，使用两个寡核苷酸组合peYFP_rev(SEQID No. 40)和peYFP_fw2 (SEQ ID No. 41)。
plysGE_for 5' -CGCGGATCCCTAAGCCGCAATCCCTGATTG-3'
plysGE_rev 5' -TCCGATGGACAGTAAAAGACTGGCCCCCAAAGCAG-3'
peYFP_rev 5 ‘-TGAGGATCCTTATTACTTGTCAGCTCGTCCATGCCGA-GAGTGATCC-3 ‘
peYFP_fw2 5 ‘-CTTTTACTGTCCATCGGAACTAGCTATGGTGAGCAAG-GGCGAGGAGCTGTTCAC C-3 ^
从I %强度琼脂糖凝胶纯化扩增的片段后，在使用外侧引物plysGE-for和peYFP_ rev的第二 PCR反应中将这些片段用作基质。通过模板片段在产生自内侧寡核苷酸引物 plysGE_rev和peYFP_fw2的17bp的互补区内的杂交，可能建立重叠延伸片段。用限制酶BamHI消化以这种方式形成的产物lysGE' eyfp,并在纯化反应批次(batch)后用于与同样经BamHI打开并去磷酸化的载体pJCl的连接反应。直接用连接批次转化大肠杆菌 DH5 a MCR,并在含50 μ g/ml卡那霉素的LB平板上进行转化体的选择。用在这些平板上生长并因此具有卡那霉素抗性的20个菌落进行菌落PCR。在每种情况下，用上述寡核苷酸组合进行菌落PCR来检验片段lysGE' eyfp是否插入载体pJCl中。在琼脂糖凝胶中分析菌落PCR显示所分析的样品中大小为l，010bp的预期PCR产物，然后以更大规模培养菌落进行质粒制备。可能通过用限制酶Bglll、XhoI和PvuI进行测试切割来显示插入片段 pJClIysGE/ eYFP的存在。插入片段的测序显示与预期序列100%—致。
b)用pJCllysGE' eYFP转化谷氨酸棒杆菌
按Tauch 等，2002 (Curr Microbiol. 45(5) (2002)，362-7 页)所述制备谷氨酸棒杆菌菌株ATCC 13032和DM1800的感受态细胞。菌株ATCC 13032是分泌赖氨酸的野生型，而通过基因定向突变使菌株DM1800成为赖氨酸分泌者(Georgi等Metab Eng. 7 (2005)，291-301 页)。按 Tauch 等(CurrMicrobiol. 45 (5) (2002)，362-7 页)所述， 用pJCllysGE' eYFP电穿孔来转化这些细胞。在含25 μ g/ml卡那霉素的BHIS平板上进行转化体的选择。通过质粒制备及BglI1、XhoI和PvuI酶的测试切割来针对载体的存在检验在这些平板上生长并因此具有卡那霉素抗性的菌落。在每种情况下，将一个正确的克隆命名为 ATCC 13032 PJClIysGE; eYFP 和 DMISOOpJCllysGE' eYFP。
c)赖氨酸特异性荧光的检测
用Zeiss AxioImager Ml通过共焦显微术来测试体内突光发射。为了此目的,将菌株 ATCC 13032 P JCl IysGE; eYFP 和 DM1800p JCl lysGE' eYFP 的 3μ I 细胞悬液放置在预先应用了 1%强度琼脂糖薄层的载玻片上进行固定。用514nm波长的光激发固定的悬液，曝光时间为700毫秒。用505nm至550nm范围内的宽谱带滤光片进行eYFP的荧光发射测量。 借助AxioVision 4. 6软件数字化记录突光细胞。在图像中可以看到,只有在形成赖氨酸的菌株DM1800 pJClIysGE; eYFP的情况下存在荧光发射，而不形成赖氨酸的菌株ATCC13032 PJCllysGE' eYFP 无荧光。
实施例2
以其中自发荧光蛋白的表达受腺嘌呤核糖开关(ARS)下调，且其中该自发荧光蛋白的表达依赖于胞内腺嘌呤浓度的细胞为例，产生本发明的第二实施方案的细胞。
首先从来自枯草芽孢杆菌的基因组DNA开始，用引物ARS_for(SEQID No. 42)和 ARS_rev(SEQ ID No. 43)扩增来自枯草芽孢杆菌的腺嘌呤核糖开关(ARS)(见Mandai和 Breaker,Nat Struct Mol Biol, 11 (2004), 29-35页)。在第二PCR中，从用 Qiagen MinElute Gel Extraction Kit 纯化的 ARS扩增产物开始，使用引物ARS_for_BamHI 和 ARS_rev_NdeI， 扩增具有5’端BamHI和3’端NdeI切割位点的ARS扩增产物，并用这些限制酶切割。
用引物EYFP_for_NdeI (SEQ ID No. 44)和 EYFP_rev_EcoRI (SEQID No. 45)(用酶 NdeI和EcoRI限制)以pEKEx2_EYFP为基础扩增报道基因eyfp，并同样用Qiagen MinElute Gel Extraction Kit 纯化。
ARS_for 5 ‘-TCAACTGCTATCCCCCCTGTTA-3 ‘
ARS_rev 5 ‘-AAACTCCTTTACTTAAATGTTTTGATAAATAAA-3 ‘
EYFP_for_NdeI 5 ‘-TACATATGGTGAGCAAGGGCGA-3 ‘
EYFP_rev_EcoRI 5 ‘-TAGAATTCTTATCTAGACTTGTACAGCTCG-3 ‘
将两个限制PCR产物一起连接入预先用BamHI和EcoRI连接的载体pEKEx2中，从而放置在IPTG诱导型启动子ptac的控制下。然后用连接批次转化大肠杆菌XLl blue。
利用菌落PCR针对构建体pEKEx2-ARS_EYFP的存在测试卡那霉素抗性转化体(引物 pEKEx2_f or (SEQ I D No. 46)和 EYFP_rev (SEQ IDNo. 47))，并纯化质粒进行进一步分析。
为了验证制备的构建体pEKEx2-ARS_EYFP，用限制酶NdeI切割此构建体，并借助带型来测试。
图4中所示的腺嘌呤传感器的测序(SEQ ID No. 48)确认了依赖腺嘌呤的核糖开关(ydhL)与自发荧光蛋白EYFP的完好融合。
pEKEx2_for 5 ‘-CGGCGTTTCACTTCTGAGTTCGGC-3 ‘
EYFP_rev 5 ‘-TAGAATTCTTATCTAGACTTGTACAGCTCG-3 ‘
实施例3
以其中编码自发荧光蛋白的基因序列处于brnFE启动子的控制下，且其中该自发荧光蛋白的表达依赖于胞内L-甲硫氨酸浓度的细胞为例，产生本发明的第一实施方案的细胞。
a)载体 pJCllrp-brnF' eYF 的构建
用于构建brnF与报道基因eyfp的融合的方法如下。在两个分开的反应中，首先用寡核苷酸对 lrp-fw-A-BamHI(SEQ ID No. 50)/lrp-brnF-rv-1-Ndel (SEQ ID No. 51)扩增编码Irp及brnF序列的前30个核苷酸(brnF')连同基因间区(560bp),用寡核苷酸对 eyfp-fw-H-NdeI (SEQ ID No. 52)/eyfp-rv-D-Sall (SEQ ID No. 53)扩增 eyfp (751bp)。用来自谷氨酸棒杆菌的基因组DNA和使得可能扩增eyfp的载体pEKEx2_yfp_tetR (Frunzke 等，2008，J. Bacteriol. 190 :5111-5119)作为模板。寡核苷酸 fw-A-BamHI 和 lrp-brnF-rv-1-NdeI 添加了 5'端 BamHI 和 NdeI 限制切割位点，寡核苷酸 eyfp-fw-H-Ndel 和eyfp-rv-D-Sall添加了 5'端NdeI和SalI限制切割位点。用BamHI和NdeI限制切割lrp-brnF'扩增产物并用NdeI和SalI限制切割eyfp扩增产物后，在连接批次中使lrp-brnF'扩增产物经NdeI切割位点的自由末端与eyfp扩增产物融合，同时克隆入同样通过BamHI和SalI打开的载体pJCl (图5)。直接用连接批次转化大肠杆菌DH5 α。在含 50 μ g/ml卡那霉素的LB平板上进行转化体的选择。用在这些平板上生长并因此具有卡那霉素抗性的菌落进行菌落PCR。为了检验片段lrp-brnF' eyfp是否插入载体pJCl,用载体 PJCl中的“多克隆位点”区域侧翼的寡核苷酸进行菌落PCR。在琼脂糖凝胶中分析菌落PCR 显示所分析的样品中大小为l，530bp的预期PCR产物，然后以更大规模培养菌落进行质粒制备。通过用限制酶BamH1、NdeI和SalI进行测试切割来证明插入片段的存在。插入片段的测序显不与预期序列 100%一致。通过 Tauch 和 Kirchner (Curr. Microbiol. (2002)45: 362-367)的方法来进行载体pJCllrp-brnF' eYFP对感受态谷氨酸棒杆菌的转化，获得谷氨酸棒杆菌 ATCC13032 pJCllrp-brnF' eYFP 菌株。
lrp-fw-A-BamHI 5 ‘-GCGCGGATCCTCACACCTGGGGGCGAGCTG-3 ‘
lrp-brnF-rv-1-Ndel 5 ‘-GCGCCATATGATATCTCCTTCTTAAAGTTCAGC-TTGAATGAATCT CTTGCG-3 ^
eyfp-fw-H-NdeI 5 ‘-GCGCCATATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3 ‘
eyfp-rv-D-Sall 5 ‘-GCGCGTCGACTTATCTAGACTTGTACAGCTCG-TC-3 ‘
Seq_pJCl_forl(SEQ. -1D. -Nr. 54) 5 ‘-CGATCCTGACGCAGATTTTT-3 ‘
Seq_pJCl_revl(SEQ. -1D. -Nr. 55) 5 ‘-CTCACCGGCTCCAGATTTAT-3 ‘
b)胞内甲硫氨酸浓度与荧光输出的相关性
对于更详细的表征，测定了 L-甲硫氨酸传感器的敏感性和动态区。为此，用肽在ATCC13032 pJCllrp-brnF/ eYFP中建立甲硫氨酸的多种内部浓度。此方法由例如 TrttSeM 等，(J. Bacteriol. 2005，187 =3786-3794)描述。利用以下二肽L_ 丙氨酸~L_甲硫氨酸(Ala-Met)、L_甲硫氨酸-L-甲硫氨酸(Met-Met)和L-丙氨酸-L-丙氨酸 (Ala-Ala)。为了达到不同的L-甲硫氨酸浓度,使用以下混合比0. 3mM Ala-Met加2. 7mM Ala_Ala、0. 6mMAla_Met 加 2. 4mM Ala_Ala、0. 9mM Ala-Met 加 2.1mM Ala-Ala、1. 5mMAla-Met 加1. 5mM Ala-Ala、2.1mM Ala-Met 加 0. 9mM Ala_Ala、2. 7mMAla_Met 加 0. 3mM Ala_Ala、3mM Ala-Met,3mM Met-Met,将其加至 CGXII 培养基(Keilhauer 等，1993，J Bacteriol. 175 5595-603) ο 在 BioLector 系统(m2p_labs GmbH, Forckenbeckstrasse 6, 52074 Aachen, 德国)中以微量滴定规模(Flowerplate MTP-48-B)用0.6ml培养基进行培养。加入肽 7分钟后，通过硅酮油离心将来自200 μ I细胞悬液的细胞从培养基分开，并按Klingenberg 和 Pfaff(Methods in Enzymology 1967 ；10 :680-684)所述灭活。按 Ebbinghausen 等(Arch. Microbiol. (1989), 151 :238-244)所述制备样品的胞质级分，按 Lindroth 和 Mopper (Anal. Chem. (1979) 51,1167-1174)所述用反相 HPLC 定量氨基酸浓度。用 BioLector 系统(m2p_labs GmbH,Forckenbeckstrasse 6,52074 Aachen,德国)在线检测具有多种妝浓度的ATCC13032 pJCllrp-brnF/ eYFP培养物的荧光。图6中显示内部L-甲硫氨酸浓度与荧光输出信号的相关性。可以看到，传感器质粒pJCllrp-brnF' eYFP使得可能在约 0.2-25mM的线性范围内胞内检测甲硫氨酸。在低于mM的区域(< ImM)已经可以检测到甲硫氨酸的累积。
实施例4
代谢物传感器在分离具有提高的赖氨酸形成的细胞和鉴定导致赖氨酸形成的突变中的用途。
a)具有赖氨酸传感器PSenLysTK-C的重组野生型谷氨酸棒杆菌的构建
载体pJCl 由 Cremer 等(Molecular and General Genetics, 1990, 220 :478-480) 描述。用 BamHI 和 Sail 切割此载体，并与由 GATC(GATCBiotech AG, Jakob-Stadler-Platz 7，78467 Konstanz)合成的 1，765kb 片段 BamH1-〈-EYFP_lysE ' -lysG->-SalI (SEQ ID No. 56)连接。
用限制酶BamHI消化得到的载体pSenLysTK，并与由GATC (GATCBiotech AG， Jakob-Stadler-Platz 7,78467 Konstanz)合成的 2，506 片段 BamH1-T7terminator-〈-c;ri mson——lacIQ->-BamHI (SEQ ID No. 57)连接。
得到的载体称为pSenLysTK-C。它包含EYFP作为转录融合,蛋白质crimson作为活标记。按 Tauch 等(Curr. Microbiol. 45 (2002), 362-7 页)所述将传感质粒 pSenLysTK-C 引入野生型的感受态细胞，获得谷氨酸棒杆菌ATCC13032 pSenLysTK-C菌株。
b)谷氨酸棒杆菌 ATCC13032 pSenLysTK-C 的诱变
在3CTC下在 “Difco Brain Heart Infusion，，培养基(Difco, BectonDickinson BD, I Becton Drive, Franklin Lakes, NJ USA)中过夜培养产生的菌株 ATCC13032 pSenLysTK-C，在每5ml此 培养物中加入O.1ml将O. 5mg N-甲基-N-硝基-N'-硝基胍溶解在Iml 二甲基亚砜中的溶液。在30°C摇动此培养物15分钟。然后在4°C和2，500g离心收集细胞，并重悬在5ml0. 9% NaCl中。重复离心步骤和重悬。向以这种方式获得的细胞悬液中加入7. 5ml 80%强度甘油，并将此突变细胞悬液的整分试样保存在-20°C。
c)高通量细胞计量术(HT-FACS = “高通量荧光激活细胞分选术”)和细胞分选术
在20ml CGXII_Kan25 液体培养基(Keilhauer 等，J. Bacteriol. 1993 ; 175 (17) 5595-603)中加入b)下获得的200 μ I细胞悬液，在30 V和180转/分钟孵育此培养物。45分钟后，按O.1mM的终浓度加入异丙基β -D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thioglactopyranoside)。进一步孵育2小时后，进行光学特性分析和来自Becton Dickinson(Becton Dickinson BD,IBecton Drive,Franklin Lakes,NJ USA)的FACS Aria II细胞分选仪上的细胞颗粒分选。在“前向散射”(ND过滤1.0)为50mV，“侧向散射”为 550mV的电子放大下，“前向散射”和“侧向散射”阈限的FACS设置是500。在488nm波长实现EYFP的激发，并在625mV用530至30的“参数增益”(PMT)检测。在633nm波长实现 crimson的激发，并在700mV用660至20的PMT检测。将二百万个crimson阳性细胞分选在20ml CGXI1-Kan25中，并在180转/分钟和30°C下培养该培养物22小时。然后再次按 O.1mM的终浓度加入异丙基β-D-硫代半乳糖苷。2小时后，借助FACS Aria II细胞分选仪按每秒10，000个颗粒的分析速度针对EYFP和crimson荧光分析18，000, 000个细胞，分选出580个细胞，并自动存放在BHIS-Kan25平板上。在30°C孵育平板16小时。在所存放的580个细胞中，270个生长。将这些细胞全都转入微量滴定板中的0. 8mlCGXI1-Kan25中， 并在400转/分钟和30°C下培养48小时。在微量滴定板转子中4°C、4，OOOxg离心平板30 分钟，用水1: 100稀释上清并用HPLC分析。将185个克隆鉴定为赖氨酸形成剂。对于更详细的表征，在摇瓶中在50ml CGXI1-Kan25中再次进行这些克隆中的40个克隆的产物形成的分析。虽然起始菌株ATCC13032 pSenLysTK-C不分泌赖氨酸，但这40个突变体形成 2-35mM范围内的不同量的赖氨酸(图7)。
d)鉴定 lysC、hom、thrB 和 thrC 中的突变
为了进一步表征这40个突变体,用来自Qiagen (Qiagen, Hilden,德国)的DNeasy 试剂盒分离它们的染色体DNA。用引物lysC-32F(SEQ IDNo. 58)和lysC_1938R(SEQ ID No. 59)扩增基因 IysC,并由 Eurof ins MWGOperon (Anzingerstr. 7a, 85560 Ebersberg,德国)测序扩增产物(amplificate)。
lysC-32F 5 ‘-GAACATCAGCGACAGGACAA-3 ‘
lysC-1938R 5 ‘-GGGAAGCAAAGAAACGAACA—3 ‘
获得了已知的突变T3111、T3081、A279T、A279V和A279T。此外，获得了新突变 H357Y (cac- > tac)、T313I (acc- > ate)、G277D (ggc- > gac)和 G277S (ggc- > age)。在每种情况下，在圆括号中给出野生型的编码三联体，随后是突变体的对应的突变三联体。
用引物hom-289F(SEQID No. 60)和 thrB_2069R(SEQ ID No. 61)扩增基因 hom，并由 Eurofins MWG Operon(Anzingerstr. 7a,85560Ebersberg,德国)测序扩增产物。
hom-289F 5 ‘-CCTCCCCGGGTTGATATTAG-3 ‘
thrB-2069R 5 ‘-GGCCAGCACGAATAGCTTTA-3 ‘
获得了新突变 A346V(get- > gtt)、V211F(gtc- > ttc)、G241S(ggt- > agt)、 A328V(get- > gtt) >T233I (acc- > ate)和双突变Rl58C(cgc- > tgc) T35II (acc- > ate)。
用引物对hom-1684F(SEQ ID No. 62)和 thrB_2951R(SEQ ID No. 63)进一步测序突变体中的thrB,给出了新突变S102F (tcc- > ttc)。
hom-1684F 5 ‘-AGGAATCTCCCTGCGTACAA-3 ‘
thrB-2951R 5 ‘-CCGGATTCATCCAAGAAAGC-3 ‘
用引物对thrC-22F(SEQ ID No. 64)和 thrC_2046R(SEQ ID No. 65)进一步测序突变体中的thrC,给出了新突变A372V(gcc- > gtc)。
thrC-22F 5 ‘-GCCTTAAAACGCCACTCAAT-3 ‘
thrC-2046R 5 ‘-GGCCGTTGATCATTGTTCTT-3 ‘
e)鉴定murE中的突变
为了进一步在IysC中和hom、thrB或thrC中都不包含突变的突变体中鉴定突变， 还测序了 murE。用引物 murE-34F(SEQ ID No. 66)和 murE_1944R(SEQ ID No. 67)扩增基因 murE,并由 GATC(GATC BiotechAG, Jakob-Stadler-Platz 7, 78467Konstanz)测序扩增产物。
murE-34F 5 ‘-AACTCCACGCTGGAGCTCAC-3 ‘
murE-1944R 5 ‘-AGAACGCGGAGTCCACG-3 ‘
测定了在核苷酸361中包含C至T的转换(ctc- > ttc)的murE基因序列(SEQ ID No. 69)，该转换在MurE蛋白质(SEQ ID No. 68)中导致121位的氨基酸交换L121F。
f)murE突变对野生型中赖氨酸形成的影响
利用引物7-39-L-F(SEQ ID No. 70)和 7_39_R-R(SEQ ID No. 71)，用来自实施例 e)的谷氨酸棒杆菌突变体M39的染色体DNA扩增Ikb的基因murE，从而获得携带新鉴定的突变的murE片段。获得的扩增产物经BamHI和SalI克隆入在谷氨酸棒杆菌中是非复制型载体的pK19mobsacB载体(Schafer等，Gene 1994 ；145 :69-73),并利用同源重组引入野生型基因组(Tauch 等，Curr. Microbiol. 45 (2002)，362-7 页；ScIlUfl1 丨 等，Gene 1994 ；145 69-73)。然后在30°C和130转/分钟下在50mlBHIS_Kan25中培养得到的谷氨酸棒杆菌Lys39菌株12小时。将500 μ I此培养物转入50ml CGXII_Kan25,再次在30。。和130转 /分钟培养24小时。从这里开始，接种50ml初始OD为O. 5的CGXII主培养物，并在130转 /分钟和30°C下培养此培养物48小时。用水1: 100稀释培养物上清，并用HPLC测定表 I中获得的L-赖氨酸浓度。
7-39-L-F 5 ^-TAGGATCCCGACAACATCCCACTGTCTG-S ‘
7-39-R-R 5 ‘-AAGTCGACGTCTGCTTCTTGCCCAAGG-3 ‘
表I
权利要求
1.细胞，就其野生型而言进行了遗传修饰且包含编码自发荧光蛋白的基因序列，其中所述自发荧光蛋白的表达依赖于特定代谢物的胞内浓度。
2.权利要求1的细胞，其中作为所述特定代谢物的胞内浓度的函数在转录水平实现所述编码自发荧光蛋白的基因序列的表达控制。
3.权利要求1或2的细胞，其中所述编码自发荧光蛋白的基因序列处于异源启动子的控制下，所述异源启动子在所述细胞的野生型中控制下述基因的表达，所述基因的表达在野生型细胞中的表达依赖于特定代谢物的胞内浓度。
4.权利要求3的细胞，其中作为所述特定代谢物的胞内浓度的函数在翻译水平实现所述编码自发荧光蛋白的基因序列的表达控制。
5.权利要求2或4的细胞，其中所述编码自发荧光蛋白的基因序列与DNA序列功能性 连接，所述DNA序列在mRNA水平承担在转录水平或翻译水平调节所述编码自发荧光蛋白的基因序列的表达的核糖开关的功能。
6.前述权利要求中任一项的细胞，其中所述细胞是棒状杆菌属或埃希氏菌属细胞。
7.前述权利要求中任一项的细胞，其中所述代谢物选自氨基酸、核苷酸、脂肪酸和糖类。
8.权利要求7的细胞，其中所述代谢物是氨基酸。
9.权利要求8的细胞，其中所述氨基酸是L-赖氨酸。
10.权利要求2和6至9中任一项的细胞，其中所述启动子是IysE启动子，所述基因是IysE基因。
11.前述权利要求中任一项的细胞，其中所述自发荧光蛋白是绿色荧光蛋白(GFP)或此蛋白质的变体。
12.用于在细胞悬液中鉴定具有提高的特定代谢物的胞内浓度的细胞的方法，其包括方法步骤 i)提供包含权利要求1至11中任一项的细胞的细胞悬液； ii)遗传修饰所述细胞来获得细胞悬液，其中细胞就特定代谢物的胞内浓度而言不同； iii)通过检测胞内荧光活性来鉴定所述细胞悬液中具有提高的此特定代谢物的胞内浓度的单个细胞。
13.权利要求12的方法，其中通过非定向诱变来进行方法步骤ii)中的遗传修饰。
14.权利要求12或13的方法，其进一步包括方法步骤 iv)将鉴定出的细胞从所述细胞悬液分开。
15.权利要求14的方法，其中利用流式细胞术来进行所述分开。
16.用于产生就其野生型而言进行了遗传修饰的具有特定代谢物的优化产生的细胞的方法，其包括方法步骤 I)提供包含权利要求1至11中任一项的细胞的细胞悬液； II)遗传修饰所述细胞来获得细胞悬液，其中细胞就其特定代谢物的胞内浓度而言不同； III)通过检测胞内荧光活性来鉴定所述细胞悬液中具有提高的特定代谢物的胞内浓度的单个细胞；IV)将鉴定出的细胞从所述细胞悬液分开； V)在鉴定出并分开的细胞中鉴定负责提高的特定代谢物的胞内浓度的那些遗传修饰基因G1至Gn或突变M1至Mm ; VI)产生就其野生型而言进行了遗传修饰的具有特定代谢物的优化产生的细胞，其基因组包含基因G1至Gn中的至少一个和/或突变M1至Mm中的至少一个。
17.权利要求16的方法，其中通过非定向诱变来进行方法步骤II)中的遗传修饰。
18.细胞，其通过权利要求16或17的方法获得。
19.用于产生代谢物的方法，其包括方法步骤 (a)通过权利要求16或17的方法来产生就其野生型而言进行了遗传修饰的具有特定代谢物的优化产生的细胞； (b)在细胞从营养物产生所述特定代谢物的条件下在包含所述营养物的培养基中培养所述细胞。
20.权利要求19的方法，其中所述代谢物选自氨基酸、核苷酸、脂肪酸和糖类。
21.权利要求20的方法，其中所述代谢物是氨基酸。
22.权利要求21的方法，其中所述氨基酸是L-赖氨酸。
23.用于制备混合物的方法，其包括方法步骤 (A)通过权利要求19至22中任一项的方法产生代谢物； (B)将所述代谢物与不同于所述代谢物的混合物成分混合。
24.权利要求23的方法，其中所述代谢物是L-赖氨酸，所述混合物是食品或药物组合物。
全文摘要
本发明涉及就其野生型而言进行了遗传修饰且包含编码自发荧光蛋白的基因序列的细胞，该自发荧光蛋白的表达依赖于特定代谢物的胞内浓度。本发明还涉及鉴定具有提高的特定代谢物的胞内浓度的细胞的方法、产生就其野生型而言进行了遗传修饰且具有特定代谢物的优化产生的细胞的方法、通过此方法获得的细胞、用于产生代谢物的方法和用于制备混合物的方法。
文档编号C12P13/08GK103003426SQ201180032302
公开日2013年3月27日 申请日期2011年5月3日 优先权日2010年5月3日
发明者L·埃格林, M·博特, S·宾德, J·弗兰兹克, N·穆斯塔菲 申请人:于利奇研究中心有限公司