专利名称：减少生物膜的方法
减少生物膜的方法本发明涉及利用融合蛋白消除、减少或防止细菌生物膜的方法，所述融合蛋白包括与具有破坏膜或LPS的活性的肽融合的内溶素(endolysin)、自溶素(autolysin)或细菌素(bacteriocin)。进一步，本发明涉及用作药物，特别是用于治疗或预防与细菌生物膜有关的革兰氏阴性细菌和/或革兰氏阳性细菌感染的药物、用作诊断手段、消毒剂或者用作化妆物质的融合蛋白。本发明还涉及去除或减少或防止食品、食品加工设备、食品加工厂、要与食品接触的表面、医疗器械(medical devices)、医院和诊所中的表面的与细菌生物膜有关的革兰氏阴性细菌和/或革兰氏阳性细菌污染。进一步，本发明涉及所述融合蛋白作为诊断手段在与细菌生物膜有关的医学、食品或饲料、或环境诊断中的应用。内溶素是由噬菌体(或细菌病毒)编码的肽聚糖水解酶。它们在噬菌体增殖裂解周期的晚期基因表达期间被合成，并通过降解细菌肽聚糖介导后代病毒粒子从被感染细胞中释放。它们是￠-(1,4)-糖基化酶(溶菌酶)、转糖基酶、酰胺酶或内肽酶。内溶素的抗微生物应用在1991年已经由Gasson所提出(GB2243611)。尽管内溶素的杀伤能力已经久为人知，但是由于抗生素的成功和统治地位，这些酶作为抗菌药物的应用遭到忽视。直到出现了多种抗生素耐药性的细菌之后，用内溶素来对抗人类致病原的这个简单构想才获得了关注。现在迫切需要开发全新类型抗菌剂，而使用内溶素作为“酶抗生素(enzybiotics)”- “酶”和“抗生素”的糅合术语-可以完美地满足这一需求。2001年，Fischetti及同事首次证明了噬菌体Cl内溶素对A群链球菌的治疗潜能(Nelson etal.，2001)。从此之后，许多出版文献确立了内溶素作为一种控制细菌感染，特别是革兰氏阳性细菌感染的有吸引力的并且互补的替代方法。随后，针对其它革兰氏阳性致病原，例如肺炎链球菌(Loeffler et al.，2001)、炭疽芽孢杆菌(Schuch et al.，2002)、无乳链球菌(Cheng et al.，2005)和金黄色葡萄球菌(Rashel et al，2007)，的不同内溶素也被证明具有酶抗生素的效力。现在，内溶素治疗最重要的挑战是革兰氏阴性细菌对内溶素的外源作用不敏感，因为外膜阻止内溶素接近肽聚糖。这一点目前妨碍了内溶素的有效范围扩展到重要的革兰氏阴性致病 原。革兰氏阴性细菌具有以其特征性的不对称双层膜作为标志的外膜。该双层外膜由含有磷脂(主要是磷脂酰乙醇胺)的内层、以及主要由一种糖脂:脂多糖(LPS)构成的外膜所组成。在细菌界中，LPS结构存在极大的多样性，并且LPS的结构可以响应主导性的环境条件而被修饰。LPS层的稳定性和不同LPS分子之间的相互作用主要通过二价离子(Mg2+, Ca2+)与LPS分子的阴离子组分(脂质A和内核中的磷酸基团和KDO的羧基基团)之间的静电作用实现。因此，阳离子结合位点对于外膜的完整性至关重要(Vaara，1992)。多阳离子试剂例如多聚-L-赖氨酸聚合物(至少20个残基)通过置换这些稳定性二价阳离子而提高外膜的透过性。此外，它们还发挥所谓的“自促摄取(self-promoted uptake) ”机制(Hancock and Wong, 1984)。由于它们的体积庞大,会破坏外膜的正常屏障功能并生成瞬时的裂隙，促进它们自身的摄取(Vaaraand Vaara, 1983)。而且,在不存在不饱和脂肪酸的情况下有利于脂质A的致密而有序的包装，该包装形成具有高粘性的刚性结构。这使得它对亲脂分子的透过性降低，并为外膜(OM)提供额外的稳定性。
与革兰氏阴性细菌相反，革兰氏阳性细菌不具有外膜。细胞质膜由厚达25nm的肽聚糖层包围(革兰氏阴性细菌株的厚度仅达5nm)，该肽聚糖层形成细胞壁。革兰氏阳性细菌细胞壁的主要目的是维持细菌形状和对抗细菌细胞的内部压力。肽聚糖，或胞壁质，是由糖和氨基酸构成的多聚物。糖部分由￠-(1,4)连接的交替出现的N-乙酰葡糖胺残基和N-乙酰胞壁糖酸残基构成。N-乙酰胞壁酸上附接着3-5个氨基酸的肽链。肽链可以和其他链上的肽链交联，形成3D网状层。肽链可以含有D-和L-氨基酸残基，并且其组成在不同细菌中可以不同。大多数革兰氏阴性细菌以及许多革兰氏阳性细菌可形成细菌生物膜。生物膜的定义为粘附在表面上的微生物体聚集体或联合体。粘附细菌经常被革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌所产生的细胞外聚合体物质包围或保护，它们。生物膜使得细菌对于抗微生物物质，例如抗生素、消毒剂和细胞壁降解酶非常耐受。此外，生物膜的处理目前并不可行，因为细胞外聚合体物质会保护其自身免于被抗微生物物质、消毒剂或生物膜降解物质降解。因此，需要有能够消除、减少或防止细菌生物膜的方法。这个目标可以通过本申请权利要求所限定的主题加以解决。下面的附图用于例证本发明
图1是显示用于重组产生(POLY)n_gpl44 ((P0LY)n_KZ144)的质粒构建的总体流程图。先前，pEXP5CT/P0LY-gpl44(pEXP5CT/P0LY-KZ144)通过 TAIL(热不对称交错)PCR(利用BamHI限制位点和5’ TAIL引物中的第一多聚阳离子盒子)加以构建。质粒用BamHI线性化、去磷酸化并与一个含有悬垂BamHI末端的盒子连接。这个盒子来自于两个互补寡核苷酸的杂交，并且编码9个带正电荷的残基。在第一和第二盒子之间的连接点处产生一个额外的带正电精氨酸残基和一个丝氨酸。通过重复进行循环类似地构建更长的PEXP5CT/(P0LY)n-gpl44 (PEXP5CT/ (P0LY)n-KZ144)变体。图2显示了通过巴斯德毕赤酵母表达和分泌P0LY_gpl44。将30 巴斯德毕赤酵母X33表达培养物[培养I天(方形)、3天(三角形)和4天(圆形)后]上清添加到270 u I经氯仿可透化的铜绿假单胞菌PAOlp细胞中。缓冲条件为P0LY-gpl44的最佳酶学条件(KH2PO4A2HPO4) I=I20mM pH6.2)。随后，用分光光度法记录光密度。光密度降低表示巴斯德毕赤酵母分泌了胞壁水解酶。作为阴性对照，还包括了不表达质粒的巴斯德毕赤酵母X33(菱形)。
图3图示了未经修饰的phiKZgpl44和ELgpl88内溶素、经过修饰包含含有9个带正电氨基酸残基的肽的内溶素变体P0LY-gpl44和P0LY-gpl88、和经过修饰的包含含有18个带正电氨基酸残基的肽的变体(POLY) 2-gpl44和(POLY) 2-gpl88对铜绿假单胞菌PAOlp细胞的抗菌活性。误差棒指示平均值的标准偏差。图4显示了考马斯染色的SDS-PAGE图片，其显示了未经修饰的内溶素PSP3gplO和其经过修饰的内溶素变体PKPSP3gplO的表达和纯化结果。泳道LMW是大小标记物(LMW ladder)。随后的三个泳道是经过Ni2+亲和色谱后在洗脱缓冲液(20mM NaH2PO4-NaOHpH7.4;0.5M NaCl; 500mM咪唑)中纯化蛋白的蛋白级分。泳道FT是穿透部分(flowthrough),泳道W是废弃级分(waste fraction)。在纯化蛋白级分中只能见到很少的次级条带，表明重组蛋白的纯度很高(>90%)。图5A-D图示了未经修饰的PSP3gplO和经过修饰的PKPSP3gplO在不同组合物中在室温并且无振荡下温育之后对数种指数生长过程中的革兰氏阴性细菌的抗菌活性。每种革兰氏阴性细菌用如下的组合物温育30分钟:含有0.5mM EDTA但无内溶素的组合物、含有1.315 ii M未经修饰的PSP3gplO但无EDTA的组合物、含有1.315 u M经过修饰的PKPSP3gplO但无EDTA的组合物、含有1.315 u M未经修饰的PSP3gplO和0.5mM EDTA的组合物、含有1.315 u M经过修饰的PKPSP3gplO和0.5mM EDTA的组合物。在图5A中，显示了对铜绿假单胞菌PAOlp细胞的抗菌活性，图5B中，显示了对铜绿假单胞菌Br667细胞的抗菌活性，图5C中，显示了对大肠杆菌WK6细胞的抗菌活性，图中显示了对鼠伤寒沙门氏菌细胞的抗菌活性。“ A ”给出了 PSP3gplO和PKPSP3gplO样品的各自活性之间的差异。误差棒指示平均值的标准偏差。图6显示了考马斯染色的SDS-PAGE图片，其显示了未经修饰的内溶素P2gp09和其经过修饰的内溶素变体PKP2gp09的表达和纯化结果。泳道LMW是大小标记物(LMWladder)。随后的三个泳道是经过Ni2+亲和色谱后在洗脱缓冲液(20mM NaH2PO4-NaOHpH7.4;0.5M NaCl; 500mM咪唑)中纯化蛋白的蛋白级分。泳道FT是穿透部分(flowthrough),泳道W是废弃级分(waste fraction)。在纯化蛋白级分中只能见到很少的次级条带，表明重组蛋白的纯度很高(>95%)。图7A-F图示了未经修饰的P2gp09和经过修饰的PKP2gp09在不同组合物中在室温并且无振荡下温育之后对数种指数生长过程中的革兰氏阴性细菌的抗菌活性。每种革兰氏阴性细菌用如下的组合物温育30分钟:含有0.5mM EDTA但无内溶素的组合物、含有1.315u M未经修饰的P2gp09但无EDTA的组合物、含有1.315 y M经过修饰的PKP2gp09但无EDTA的组合物、含有1.315 ii M未经修饰的P2gp09和0.5mM EDTA的组合物、含有1.315 y M经过修饰的PKP2gp09和0.5mM EDTA的组合物。在图7A中，显示了对铜绿假单胞菌PAOlp细胞的抗菌活性，图7B中，显示了对铜绿假单胞菌Br667细胞的抗菌活性，图7C中，显示了对大肠杆菌WK6细胞的抗菌活性，图7D中显示了对类鼻疽伯克霍尔德氏菌细胞的抗菌活性，图7E中，显示了对恶臭假单胞菌Gl细胞的抗菌活性，图7F中，显示了对鼠伤寒沙门氏菌LT2 (SGSC N。2317)细胞的抗菌活性。“ A ”给出了 P2gp09和PKP2gp09样品的各自活性之间的差异。误差棒指示平均值的标准偏差。
图8显示了考马斯染色的SDS-PAGE图片，其显示了未经修饰的内溶素OBPgpLYS和其经过修饰的内溶素变体PKOBPgpLYS的表达和纯化结果。泳道LMW是大小标记物(LMW ladder)。随后的三个泳道是经过Ni2+亲和色谱后在洗脱缓冲液(20mM NaH2PO4-NaOHpH7.4;0.5M NaCl; 500mM咪唑)中纯化蛋白的蛋白级分。泳道FT是穿透部分(flowthrough),泳道W是废弃级分(wastefraction)。在纯化蛋白级分中只能见到很少的次级条带，表明重组蛋白的纯度很高(>90%)。图9A-F图示了未经修饰的OBPgpLYS和经过修饰的PKOBPgpLYS在不同组合物中在室温并且无振荡下温育之后对数种指数生长过程中的革兰氏阴性细菌的抗菌活性。每种革兰氏阴性细菌用如下的组合物温育30分钟:含有0.5mM EDTA但无内溶素的组合物、含有1.315u M未经修饰的OBPgpLYS但无EDTA的组合物、含有1.315 y M经过修饰的PKOBPgpLYS但无EDTA的组合物、含有1.315 u M未经修饰的OBPgpLYS和0.5mM EDTA的组合物、含有1.315 ii M经过修饰的PKOBPgpLYS和0.5mM EDTA的组合物。在图9A中，显示了对大肠杆菌WK6细胞的抗菌活性，图9B中，显示了对鼠伤寒沙门氏菌LT2(SGSC N0 2317)细胞的抗菌活性，图9C中，显示了对铜绿假单胞菌PAOlp细胞的抗菌活性，图9D中显示了对铜绿假单胞菌Br667细胞的抗菌活性，图9E中，显示了对恶臭假单胞菌Gl细胞的抗菌活性，图9F中，显示了对类鼻疽伯克霍尔德氏菌细胞的抗菌活性。“ A ”给出了 P2gp09和PKP2gp09样品的各自活性之间的差异。误差棒指示平均值的标准偏差。图1OA和B图示了 PoIyKZ144(Art-014)对铜绿假单胞菌2573粘液样生长性临床分离株(Source Uniklinikum Regensburg, nicht naher definiert)的生物膜降低活性。使铜绿假单胞菌2573在37° C聚苯乙烯微滴定板上生长至少24小时以形成生物膜。为了将生物膜含量可视化，进行了结晶紫染色。图1OA中，用海藻酸裂解酶(lOu/ml)或PolyKZ144(50ug/ml)温育生物膜。两种酶的效果与作为对照的未处理的生物膜或经过清洗并用LB-培养基重新温育的生物膜进行比较。图1OB中，PolyKZ144的效果与作为对照的未处理的生物膜或经过清洗并用LB-培养基重新温育的生物膜进行比较，并且用非粘液样生长性的大肠杆菌实验室菌株来指示非特异性背景染色。图1lA-G图示了数种融合蛋白对不同革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌菌株的生物膜降低活性。使金黄色葡萄球菌KS13 (A和B)、单核细胞增生利斯特氏菌Scott A(C)、鲍氏不动杆菌DSMZ30007 (D)、铜绿假单胞菌2572 (E，F)和铜绿假单胞菌2573 (G)在37° C聚苯乙烯微滴定板上生长至少24小时以形成生物膜。为了将生物膜含量可视化，进行了结晶紫染色。图1lA中，用PK-肽(1.25iig/孔)或内溶素Ply2638(25iig/孔)或融合蛋白Ply2638-PK(25 y g/孔)温育生物膜。将肽、内溶素和融合蛋白的效果与用LB指示的未处理的生物膜(一份蛋白缓冲液对一份无NaCl的2x LB)进行比较。图1lB中，用细菌素溶葡萄球菌酶(18 U g/孔)或细菌素变体PK-溶葡萄球菌酶(18 y g/孔)温育生物膜。细菌素和细菌素变体的效果与用LB指示的未处理的生物膜(一份蛋白缓冲液对一份无NaCl的2x LB)进行比较。图1lC中，用经过修饰的内溶素变体五肽-Ply511(25i!g/孔)温育生物膜。经过修饰的内溶素变体的效果与用LB指示的未处理的生物膜(一份蛋白缓冲液对一份无NaCl的2x LB)进行比较。图1lD和E中，再用PK-肽(1.25 y g/孔)或内溶素OBP (25 y g/孔)或经过修饰的内溶素变体PK-OBP (25 y g/孔)温育生物膜。肽、内溶素和经过修饰的内溶素变体的效果与用LB指示的未处理的生物膜(一份蛋白缓冲液对一份无NaCl的2x LB)进行比较。图1lF和G中，再用内溶素KZ144 (50 y g/孔)或经过修饰的内溶素变体SMAP29-KZ144 (50 y g/孔)温育生物膜。将肽、内溶素和经过修饰的内溶素变体的效果与用LB指示的未处理的生物膜(一份蛋白缓冲液对一份无NaCl的2x LB)进行比较。如这里所使用的，术语“蛋白质”与术语“多肽”同义使用。如这里所使用的，术语“蛋白质”是指按照特定序列通过肽键连接的氨基酸残基的直链聚合物。蛋白质的氨基酸残基可以通过例如共价附接各种基团(如碳水化合物和磷酸)加以修饰。其它物质(例如亚铁血红素或脂质)可以更松散地与多肽链缔合，形成缀合蛋白，它们也被这里所用的术语“蛋白质”所涵盖。已经阐明了多肽链折叠的多种方式，特别是就a螺旋和￠-折叠片的存在而言。如这里所用的术语“蛋白质”是指所有四种类型的蛋白质:全a、全P、a/^和a+3。而且，术语“蛋白质”还指复合物，其中该复合物指同聚体(homomer)。如这里所使用的，术语“融合蛋白”是指由两个核酸序列融合产生的表达产物。这种蛋白可以在例如重组DNA表达系统中产生，或者通过化学交联产生。而且，这里所用的术语“融合蛋白”表示第一氨基酸序列，特别是内溶素、自溶素或细菌素和/或其它肽聚糖水解酶，与第二或进一步的氨基酸序列的融合物。第二或进一步的氨基酸序列优选地是肽，特别是阳离子性、多聚阳离子性、疏水性、两亲性和/或抗微生物肽。优选地，所述第二和/或进一步的氨基酸序列对第一氨基酸序列的任何结构域而言均为外来的，并且与第一氨基酸序列的任何结构域均没有实质的同源性。这里使用的术语“经过修饰的内溶素变体”与术语“内溶素变体”同义使用。这两个术语均指包含内溶素和肽(特别是阳离子性、多聚阳离子性、疏水性、两亲性和/或抗微生物肽)的融合蛋白。这里使用的术语“经过修饰的细菌素变体”与术语“细菌素变体”同义使用。这两个术语均指包含细菌素和肽(特别是阳离子性、多聚阳离子性、疏水性、两亲性和/或抗微生物肽)的融合蛋白。这里使用的术语“经过修饰的自溶素变体”与术语“自溶素素变体”同义使用。这两个术语均指包含内溶素和肽(特别是阳离子性、多聚阳离子性、疏水性、两亲性和/或抗微生物肽)的融合蛋白。这里使用的术语“肽段”是指任何种类的与蛋白质连接的肽，例如内溶素、细菌素或自溶素。特别地，这里使用的术语“肽段”是指阳离子性肽、多聚阳离子性肽、两亲性肽、疏水性肽、和/或抗微生物肽。然而，本发明意义中的肽段并不是指His-标签，优选地His5-标签、His6-标签、His7-标签、His8-标签、His9-标签、His10-标签、His11-标签、His12-标签、His16-标签和His2tl-标签、Strep-标签、Av1-标签、Myc-标签、Gst-标签、JS-标签、半胱;氣酸-标签、FLAG-标签或其它本领域已知的标签、硫氧还原蛋白或麦芽糖结合蛋白质(MBP)。与这里所用的术语“肽段”相对的术语“标签”是指可用于帮助多肽表达和/或亲和纯化、将多肽固定于表面上、或者充当多肽检测的标记物或标签部分(例如通过在不同ELISA测定形式中的抗体结合)的肽，只要使得该标签可用于上述用途之一的功能不是由所述肽的正电荷导致的。然而，His6 -标签，根据具体的pH，也可能是带正电荷的，但由于它可以结合固定的二价阳离子而被用作亲和纯化工具，而并不用作根据本发明的肽段。这里使用的术语“肽”是指由大约2个-大约100个氨基酸残基，更优选地由大约4个-大约50个氨基酸残基，更优选地大约5个-大约30个氨基酸残基组成的短肽，其中一个氨基酸残基的氨基通过肽键与另一个氨基酸残基的羧基连接。肽可以具有特定的功能。肽可以是天然存在的肽或者合成设计和产生的肽。肽可以是例如通过酶学或化学切割从天然蛋白质衍生或者取出的，或者可以使用常规的肽合成技术(例如固相合成)或分子生物学技术(见 Sambrook, J.等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold SpringHarborPress, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989))加以制备。优选的合成产生的肽是例如阳离子性、多聚阳离子性、两亲性或疏水性肽。优选的天然发生的肽是例如抗微生物肽。如这里所使用的，术语“阳离子性肽”是指具有带正电的氨基酸残基的肽。优选地，阳离子性肽的PKa值为9.0或者更高。典型地，阳离子性肽的至少4个氨基酸残基可以是带正电的，例如赖氨酸或精氨酸。“带正电”是指氨基酸残基的侧链在大约生理条件下具有净正电荷。这里使用的术语“阳离子性肽”也指多聚阳离子性肽。这里所使用的术语“多聚阳离子性肽”是指合成设计和产生的肽，其主要由带正电荷的氨基酸残基，特别是赖氨酸、精氨酸和/或组氨酸残基，更优选赖氨酸和/或精氨酸残基组成。如果至少有大约20，30，40，50，60，70，75，80，85，90，95或大约100%的氨基酸残基
是带正电荷的氨基酸残基，特别是赖氨酸和/或精氨酸残基，则称肽是主要由带正电荷氨基酸残基组成的。非带正电荷的氨基酸残基可以是电荷中性氨基酸残基和/或带负电荷氨基酸和/或疏水性氨基酸残基。优选地，非带正电荷氨基酸残基是电荷中性氨基酸残基，特别是丝氨酸和/或甘氨酸。如这里所使用的，术语“抗微生物肽”(AMP)是指任何天然存在的对例如细菌、病毒、真菌、酵母、支原体和原生动物具有杀微生物和/或抑微生物活性的肽。因此，这里所使用的术语“抗微生物肽”特别指任何具有抗细菌、抗真菌、抗霉菌、抗寄生物、抗原生动物、抗病毒、抗感染、抗传染和/或杀菌、杀操、杀阿米巴、杀微生物、杀细菌、杀真菌、杀寄生物、杀原生动物、杀原生生物(protozoicidal)性质的肽,特别是sushi肽和防卫素。抗微生物肽可以是RNA酶A超家族的成员、防卫素、cathelicidin、颗粒溶素(granulysin)、组胺素(histatin)、牛皮癖素(psoriasin)、dermicidine或铁调激素(hepcidin)。抗微生物肽可以天然出现在昆虫、鱼、植物、蛛形纲动物、脊椎动物或哺乳动物中。优选地，抗微生物肽是在昆虫、鱼、植物、蛛形纲动物、脊椎动物或哺乳动物中天然出现的。优选地，抗微生物肽是在如下生物体内天然存在的:萝卜、蚕蛾、狼蛛、蛙类，优选地非洲爪蟾；娃属动物(Rana frogs),更优选地牛娃(Rana catesbeiana);蟾蜍,优选地亚洲蟾蜍中华大蟾蜍(Bufo fubogargarizans)，蝇类，优选果蝇，更优选黑腹果蝇，埃及伊蚊、蜜蜂、熊蜂，优选牧熊蜂(Bombus pascuorum)，食肉蚬，优选麻蚬(Sarcophaga peregrine)、蝎子、马蹄蟹、St鱼，优选淡水鲇(Parasilurus asotus)、牛、猪、绵羊、猪类、牛类(bovine)、猴类和人。 这里所用的术语“sushi肽”是指具有短的共有重复的补体调节蛋白(CCP)。Sushi肽的sushi模块在许多不同蛋白质中发挥蛋白-蛋白互作结构域的功能。含有Sushi结构域的肽已经显示具有抗微生物活性。优选地，SUShi肽是天然存在的抗微生物肽。这里所使用的术语“两亲性肽”是指同时具有亲水和疏水性功能基团的合成肽。优选地，这里所使用的术语“两亲性肽”是指具有确定的排列的亲水和疏水性基团的肽，例如两亲性肽可以是例如a螺旋，沿着螺旋的一侧主要是非极性侧链，沿着其表面的其余部分则是极性残基。这里所使用的术语“疏水性基团”是指如下的化学基团，例如在水中基本上不溶但在油相中可溶或者在油相中的溶解度高于在水中或水相中的溶解度的氨基酸侧链。在水中，具有疏水性侧链的氨基酸残基彼此相互作用产生一个非水性环境。具有疏水性侧链的氨基酸残基的实例是缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和甘氨酸残基。这里所使用的术语“内溶素”是指适合于水解细菌细胞壁的酶。“内溶素”包括至少一个具有至少一种如下的活性的“酶活性结构域”(EAD):内肽酶、N-乙酰-胞壁酰-L丙氨酸-酰胺酶(酰胺酶)、N-乙酰-胞壁质酶、N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶(溶菌酶)或转糖基酶。此外，内溶素还可以含有没有酶活性但与宿主细菌的细胞壁结合的区域，即所谓的CBD(细胞壁结合结构域)。内溶素可以含有一个、两个或更多个CBD。然而，这里所用的术语“内溶素”还指具有至少一个EAD但没有CBD的酶。一般地，细胞壁结合结构域能够与细菌表面上的不同组分结合。优选地，细胞壁结合结构域是肽聚糖结合结构域，并且与细菌的肽聚糖结合。这里使用的术语“细胞壁”是指形成革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌外层细胞包被、从而保证它们的完整性的所有组分。特别地，这里所用的术语“细胞壁”是指肽聚糖、具有脂多糖的革兰氏阴性细菌的外膜、细菌细胞膜，还指沉积在肽聚糖上的额外层，作为例如荚膜(capsule)、外蛋白层或粘液(slime)。这里使用的术语“自溶素”是指与内溶素有亲缘关系，但是由细菌编码并且参与例如细胞分裂和细胞壁代谢的酶。自溶素的概述可以参见^Bacterialpeptidoglycan(murein)hydrolases.Vollmerff, Joris B，Charlier P, FosterS.FEMS Microbiol Rev.2008Mar; 32 (2): 259-86，，。这里使用的术语“细菌素”是指与能够抑制其它细菌的生长的类蛋白质、类多肽或类肽物质。一些细菌素能够降解细菌细胞壁，例如溶葡萄球菌酶(Lysostaphin)(降解葡萄球菌属细胞壁)、变溶菌素(Mutanolysin)(降解链球菌细胞壁)和肠球菌素(Enterolysin)(降解肠球菌属细胞壁)。优选地，所述抑制特别地是通过将所述其它细菌吸附到细菌素的特异受体上。一般地，细菌素由微生物产生。然而，这里使用的术语“细菌素”同时表示由微生物产生的分离物形式和合成产生的形式，还表示基本上保持其亲本细菌素的活性但是其序列已通过插入或删除一个或多个氨基酸残基而被改变的变体。这里所使用的术语“EAD”是指内溶素的酶活性结构域。EAD负责水解细菌的肽聚糖。其显示内溶素的至少一种酶活性。EAD还可以由超过I个酶活性模块构成。这里使用的术语“EAD”与术语“催化结构域”同义使用。这里所使用的 术语“删除”是指从各自的起始序列除去1、2、3、4、5或更多个氨基
酸残基。这里所使用的术语“插入”或“添加”是指向各自的起始序列插入或添加1、2、3、4、
5或更多个氨基酸残基。这里所使用的术语“替换”是指特定位置的氨基酸残基交换成不同的氨基酸残基。这里所使用的术语“生物膜”是指细菌微生物的聚集物，其中细菌细胞彼此粘附和/或粘附到表面上。这些粘附细胞经常被胞外高分子物质(EPS)基质所覆盖，其是由细胞产生的。生物膜EPS由细胞外DNA、蛋白质和多糖构成。这些生物膜可以在任何有生命或无生命的表面上形成，特别是在固体表面上作为菌落形成和在液体表面上作为菌膜(pellicle)形成。在生物膜中生长的微生物细胞与相同生物体的浮游细胞是生理上是截然不同的。本发明涉及消除、减少或防止细菌生物膜的方法，包括如下步骤:a)提供融合蛋白，其包含与具有破坏膜或LPS的活性的肽融合的酶，所述酶具有降解革兰氏阴性细菌和/或革兰氏阳性细菌细胞壁的活性；和b)使材料、液体、表面或生物材料与所述融合蛋白相接触。优选地，本发明涉及消除、减少或防止细菌生物膜的方法，包括如下步骤:a)提供融合蛋白，其包含与具有破坏膜或LPS的活性的肽融合的内溶素、自溶素或细菌素；和b)使材料、液体、表面或生物材料与所述融合蛋白相接触。根据本发明，术语“提供”融合蛋白是指仅仅取得(taking)或使用(using)根据本发明的融合蛋白，或者指在根据本发明使用之前产生并纯化这种融合蛋白。
优选地，材料是石、岩、土壤、沉积物、食品、饲料或化妆品。优选地，液体是水，例如饮用水，地下水或废水，温泉，海，湖，河，任何类型的水系统，接触镜、假牙、植入物、假体或支具(braces)的清洗和保存溶液。优选地，生物材料是衍生自或获得自活体，特别是植物和哺乳动物，优选人类，的任何物质，例如细胞、组织、器官、血液、血液组分和体液。优选地，细胞是例如有核细胞或无核细胞。细胞可以衍生自任何器官，特别是肝细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、角质形成细胞、胰岛细胞、干细胞(成年和新生儿的，各种组织或物种来源)、干细胞祖细胞、脐带血细胞、配子(雄性和雌性)、配子祖细胞、成红细胞、成白细胞和成软骨细胞。组织是例如黏膜、神经、肌肉、上皮、结缔和支持组织、口腔软组织和牙齿。器官是例如心脏、心脏瓣膜、眼睛、耳朵、尿道、肺、肝、肾、胆道、前列腺、鼻子、消化道、呼吸道、胃肠道、脑和骨髓。优选的体液是尿液、脑脊液和淋巴液。优选地，表面是固体生物或非生物表面。优选地表面实例是医疗器械的表面，特别是植入体、假体、导管，例如牙移植物、尿管假体、腹膜和腹膜透析导管、用于血液透析和长期化疗剂给药的留置导管(Hickman导管)、心脏植入体例如起搏器、心脏瓣膜假体、血管辅助装置、合成血管移植物和支架、内部固定装置、经皮缝合和气管和呼吸机管道，以及工业或饮用水系统管道和自然水系统的表面。生物膜由细菌微生物形成，其中细菌细胞彼此粘附和/或粘附于表面上。由生物膜的细菌微生物分泌的胞外高分子物质(EPS)形成水凝胶，从而形成类似粘液的基质。这种基质还包括气泡和无机颗粒。生物膜EPS由细胞外DNA、蛋白质和多糖构成。除了细菌微生物之外，其它单细胞生物也可以被集合在生物膜中。生物膜可以通过将细菌微生物置于界面上而发生。大多数情况下，生物膜在水表面或者与固相的界面上形成。这些生物膜可以在任何有生命或无生命的表面上形成。一般地，所有的界面均可以产生生物膜。生物膜几乎存在于任何地方，在土壤和沉积物中、在地下水中、在岩上、在沙漠中、在温泉中、在植物和动物表面或体内，特别是在黏膜上。而且，生物膜可以出现在医疗器械上，例如植入体、导管、内窥镜、假体、仪器和装置，也可以出现在化妆物质、食物和饲料中。生物膜还可以和感染有关，因为大多数情况下，细菌微生物形成生物膜可以免于免疫系统破坏。生物膜的形成使得细菌微生物能够长期存活。急性呼吸道感染的一个实例是军团病，其是由于吞入或者吸入从加热或冷却系统的空气或水管道脱落的导致的军团菌-生物膜结块(clump)导致的。另外，许多食物细菌，例如大肠杆菌0157:H7、单核细胞增生利斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、沙门氏菌和空肠弯曲菌可以在食物和装置上形成生物膜，然后它们对杀生物剂、干旱、加热、抗生素和清洁剂高度耐受。会导致植入体、导管和其它医疗装置感染的微生物可以是凝固酶阴性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、链球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、不动杆菌、奇异变形菌属、铜绿假单胞菌和假丝酵母，它们也与医院的广谱感染有关。人类典型的与生物膜有关的细菌感染是:伤口感染，特别是与糖尿病有关的伤口，扁桃体炎、骨髓炎、细菌性心内膜炎、鼻窦炎、角膜感染、尿道感染、胆道感染、感染性肾结石、尿道炎、前列腺炎、导管感染、中耳感染、牙菌斑形成、牙龈炎、齿根骨膜炎、囊性纤维化病和永久留置装置感染，例如关节假体和心脏瓣膜。生物膜的存在可以通过各 种测试加以确定，例如通过Christensen等，JClinMicrobiol22:996-1006 (1985)中描述的组织培养板法(TCP)或者通过如前所述的Christensen 等，Infect Tmmun37:318-26 (1982)的试管法(TM),或者通过 Freeman 等，JClin Pathol42:872-4(1989)所述的刚果红琼脂法(CRA)。生物膜可以通过使用结晶紫测定加以定量(Peeters 等，J Microbiol Methods 72:157-165(2008))。根据本发明的融合蛋白可以影响形成生物膜的细菌的相互作用，从而使细胞以单个游离细胞转移，然后被所述融合蛋白裂解，结果生物膜被部分或者完全降解。根据本发明的融合蛋白对细菌的影响也可以直接裂解与生物膜有关的细菌，从而使生物膜被部分或者完全降解。而且，根据本发明的融合蛋白可以通过裂解能够与其它细菌形成生物膜的细菌防止细菌生物膜的形成。根据本发明的融合蛋白优选地涉及内溶素变体、细菌素变体和自溶素变体。根据本发明的优选融合蛋白包括与具有脂多糖(LPS)或一般而言破坏膜的活性的肽融合的内溶素、自溶素或细菌素。LPS是革兰氏阴性细菌外膜的主要组分。它增加细胞膜的负电荷，并保护膜免于某些类型的化学攻击。在一定程度上，所述LPS也保护革兰氏阴性细菌的膜免于从细菌外部添加的内溶素的破坏。然而，LPS可以被具有破坏LPS的活性的肽，例如带正电荷的肽，所破坏。而且，所述肽可以参与外膜蛋白运输机制，一种结构性外膜蛋白的失稳机制，和/或参与脂质依赖的失稳。本发明的发明人出人意料地发现，具有破坏LPS的活性或者一般而言破坏膜的活性的肽可以促进与所述肽融合的内溶素、自溶素或细菌素穿过革兰氏阴性细菌的外膜。在促进内溶素、自溶素或细菌素穿过细菌外膜之后，细菌的细胞壁会更容易被内溶素破坏或分解，这是因为肽聚糖层被降解后，当细菌的细胞内压力无法再得到对抗时，发生渗透性裂解。革兰氏阳性细菌具有比革兰氏阴性细菌厚得多的肽聚糖层。这里，融合蛋白的膜破坏活性通过作用于细胞质膜而促进细菌的裂解。因此，本发明涉及通过利用融合蛋白消除、减少或防止细菌生物膜的方法，该融合蛋白包括具有降解革兰氏阴性细菌和/或革兰氏阳性细菌细胞壁活性的酶(优选内溶素、自溶素或细菌素)和具有膜破坏活性的肽，其中所述肽融合于酶的N端和/或C端。根据本发明的所述融合蛋白还称作经过修饰的内溶素变体或者简单地称作内溶素变体或者经过修饰的内溶素，经过修饰的自溶素变体或自溶素变体，经过修饰的细菌素或细菌素变体。
融合蛋白的内溶素部分优选地由特异针对革兰氏阴性细菌的噬菌体编码，例如包括对人或动物的致病原株的细菌群、科、属或种的革兰氏阴性细菌，例如肠杆菌科(埃希菌属，特别是大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、柠檬酸杆菌属、爱德华氏菌属、肠杆菌、哈夫尼菌属、克雷伯氏菌属特别是肺炎克雷伯氏菌、摩根氏菌属、变形菌属、普罗威登斯菌属、沙雷氏菌属、耶尔森氏菌属)，假单胞菌科(假单胞菌属，特别是铜绿假单胞菌、类鼻疽伯克霍尔德氏菌、寡氧单胞菌属、希瓦氏菌属、鞘氨醇单胞菌属、丛毛单胞属)，奈瑟氏菌属、莫拉氏菌属、弧菌属、气单胞菌属、布鲁氏菌属、弗朗西丝氏菌属、博德特氏菌属、军团菌属、巴尔通氏体属、考克斯氏体属、嗜血菌属、巴斯德氏菌属、曼氏杆菌属、放线杆菌属、加德纳氏菌属、螺旋体科(密螺旋体属和疏螺旋体属)、钩端螺旋体科、弯曲杆菌属、螺杆菌属、螺菌属、链杆菌属、拟杆菌科(拟杆菌属、梭杆菌属、普雷沃氏菌属、叶啉单胞菌属)，不动杆菌属，特别是鲍氏不动杆菌。在另一个优选的实施方案中，融合蛋白的内溶素由特异针对革兰氏阳性细菌的噬菌体编码，例如包括对人或动物的致病株的细菌群、科、属或种的革兰氏阴性细菌，特别是放线菌门，特别是放线菌纲，特别是放线菌科:放线菌科(放线菌属、动弯杆菌属)，棒杆菌亚目:分枝杆菌科(分枝杆菌属)、诺卡氏菌科、棒杆菌科，弗兰克氏菌亚目:弗兰克氏菌科，微球菌亚目:棒状杆菌科和丙酸杆菌科(丙酸杆菌属)和双歧杆菌目，特别是双歧杆菌科(双歧杆菌属、镰刀弧菌属、加德纳氏菌属)和其它亚纲:酸微菌亚纲、Coriobacteridae,红色杆菌亚纲、球形杆菌亚纲；和厚壁菌门，特别是杆菌纲，特别是杆菌目，特别是如下的科:杆菌科(杆菌属)、利斯特氏菌科(利斯特氏菌属)、球菌科(葡萄球菌属、孪生球菌属、Jeotgalicoccus)和乳杆菌目，特别是如下的科:肠球菌科(肠球菌)、乳杆菌科(乳杆菌属、片球菌属)、明串珠菌科(明串珠菌属)、链球菌属(乳酸球菌、链球菌)和梭菌纲，特备是如下的目:梭菌目(梭菌属、消化链球菌属、新月形单胞菌属)，盐厌氧菌目和Thermoanaerobacterales,和柔膜菌纲/软皮体纲,特别是如下的目:支原体目(支原体、解脲支原体)、虫原体目(螺原体)、厌氧浆菌目(丹毒丝菌属)、无胆留浆菌目(无胆留浆菌属)、无胆甾原体目(无胆甾原体属)。在另一个优选的实施方案中，融合蛋白的自溶素或细菌素由革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌编码，例如包括对人或动物的致病菌株的细菌群、科、属或种的革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌，如上面列出的。优选地，内溶素部分源自于如下面表I中列出的噬菌体或野生型内溶素:
权利要求
1.一种消除、减少或防止细菌生物膜的方法，包括: a)提供融合蛋白，所述融合蛋白包含与具有破坏膜或LPS的活性的肽融合的内溶素、自溶素或细菌素；和 b)使材料、液体、表面或生物材料与所述融合蛋白相接触。
2.根据权利要求1的方法，其中所述与内溶素、自溶素或细菌素融合的肽是合成的或天然存在的肽，长度为6-39个氨基酸残基。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述与内溶素、自溶素或细菌素融合的肽是合成阳离子性肽、合成多聚阳离子性肽、合成疏水性肽、合成两亲性肽或天然存在的抗微生物肽。
4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述肽与内溶素、自溶素或细菌素的N-和/或C-端融合，特别是与内溶素、自溶素或细菌素的N端融合。
5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述内溶素、自溶素或细菌素具有降解革兰氏阴性细菌和/或革兰氏阳性细菌，特别是选自下组的革兰氏阴性细菌的细胞壁的活性:肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(埃希氏菌属(Escherichia)，特别是大肠杆菌(E.coli)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、梓檬酸杆菌属(Citrobacter)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、哈夫尼菌属(Hafnia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)特别是肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)、摩根氏菌属(Morganella)、变形菌属(Proteus)、普罗威登斯菌属(Providencia)、沙雷氏菌属(Serratia)、耶尔森氏菌属(Yersinia))，假单胞菌科(Pseudomonadaceae)(假单胞菌属(Pseudomonas)，特别是铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、寡氧单胞菌属(Stenotrophomonas)、希瓦氏菌属(Shewanella)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、丛毛单胞属(Comamonas))，奈瑟氏菌属(Neisseria)、莫拉氏菌属(Moraxella)、弧菌属(Vibrio)、气单胞菌属(Aeromonas)、布鲁氏菌属(Brucella)、弗朗西丝氏菌属(Francisella)、博德特氏菌属(Bordetella)、军团菌属(Legionella)、巴尔通氏体属(Bartonella)、考克斯氏体属(Coxiella)、嗜血菌属`(Haemophilus)、巴斯德氏菌属(Pasteurella)、曼氏杆菌属(Mannheimia)、放线杆菌属(Actinobacillus)、加德纳氏菌属(Gardnerella)、螺旋体科(Spirochaetaceae)(密螺旋体属(Treponema)和疏螺旋体属(Borrelia))、钩端螺旋体科(Leptospiraceae)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、螺菌属(Spirillum)、链杆菌属(Streptobacillus)、拟杆菌科(Bacteroidaceae (拟杆菌属Bacteroides)、梭杆菌属(Fusobacterium)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、卩卜啉单胞菌属(Porphyromonas)，不动杆菌属(Acinetobacter)，特别是鲍氏不动杆菌(A.baumannii)；其中革兰氏阳性细菌选自下组:单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、类肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、酿胺链球菌(Streptococcus pyogenes)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、马链球菌(Streptococcus equi)、又艮难梭菌(Clostridiumdifficile) ^ 肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、炭疽芽抱杆菌(Bacillus anthracis)、錯状芽抱杆菌(Bacillus cereus)、疮疱丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphteriae)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、放线菌属(Actinomyces)。
6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述内溶素选自下组:根据SEQID NO:1的phiKZgpl44，根据SEQ ID NO: 2的ELgp 188，根据SEQID NO: 3的沙门氏菌内溶素，根据SEQID NO: 4的肠杆菌噬菌体T4内溶素，根据SEQ ID NO: 5的鲍氏不动杆菌内溶素，根据SEQ IDNO:6的大肠杆菌噬菌体KlF内溶素，根据SEQ ID NO: 7的OBPgpLyS，根据SEQ ID NO:8的PSP3沙门氏菌内溶素，根据SEQ ID NO:9的大肠杆菌噬菌体P2内溶素，根据SEQ ID NO:85的Ply511，根据SEQ ID NO:92的Ply2638，或者其中所述细菌素是根据SEQ ID N0:87。
7.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述阳离子性/多聚阳离子性肽显示根据SEQ ID NO: 10-30和32-34的氨基酸序列，或者其中所述抗微生物肽显示根据SEQ IDN0:93-133的氨基酸序列，或者其中所述疏水性肽显示根据SEQ ID NO: 134和135的氨基酸序列；或者其中所述两亲性肽显示根据SEQ ID NO: 136-138的氨基酸序列。
8.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述内溶素变体或细菌素变体包含选自下组的氨基酸序列:SEQ I D NO:35-49, 53，57，62-64，66-78 和 139-142。
9.根据前述权利要求中任一项的方法，其中与所述融合蛋白接触的材料是石、岩、土壤、沉积物、食品、饲料或化妆品。
10.根据前述权利要求中任一项的方法，其中与所述融合蛋白接触的液体是水，特别是饮用水，地下水或废水，温泉，海，湖，河流，任何种类的水系统，接触镜、假牙、移植物、假体或支具的清洗和保存溶液。
11.根据前述权利要求中任一项的方法，其中与所述融合蛋白接触的液体是衍生自或获自活生物体的任何物质，所述活生物体特别是植物和哺乳动物，优选人。
12.根据前述权利要求中任一项的方法，其中与所述融合蛋白接触的液体是医疗器械的表面、工业或饮用水系统管道的表面、以及自然水系统的表面。
13.根据前述权利要求中任一项的方法，其中可以与所述融合蛋白组合添加或在融合蛋白之外进一步添加抗生素。
14.内溶素变体、自溶素变体或细菌素变体，包含与具有破坏膜或LPS的活性的肽融合的内溶素、自溶素或细菌素，用作治疗与细菌生物膜有关的革兰氏阴性和/或革兰氏阳性细菌感染的药物。
15.内溶素变体、自溶素变体或细菌素变体，用于根据权利要求14的用途，其中该内溶素变体、自溶素变体或细菌素变体与抗生素组合使用或者在抗生素之外进一步使用。
16.内溶素变体、自溶素变体或细菌素变体用于去除、减少和/或防止食品、食品加工设备、食品加工厂、与食品接触的表面、医疗器械、医院和诊所中的表面的与细菌生物膜有关的革兰氏阴性细菌和/或革兰氏阳性细菌的污染的用途，其中所述变体包含与具有破坏膜或LPS的活性的肽融合的内溶素、自溶素或细菌素。
17.内溶素变体、自溶素变体或细菌素变体作为与细菌生物膜有关的医学、食品或饲料、或环境诊断中的诊断手段，作为消毒剂或者作为化妆物质的用途，其中所述变体包含与具有破坏膜或LPS的活性的肽融合的内溶素、自溶素或细菌素。
18.根据权利要求16和17的用途，其中所述内溶素变体、自溶素变体或细菌素变体与抗生素组合使用或者在抗生素之外进一步使用。
全文摘要
本发明涉及利用融合蛋白消除、减少或防止细菌生物膜的方法，所述融合蛋白包括与具有破坏膜或LPS的活性的肽融合的内溶素(endolysin)、自溶素(autolysin)或细菌素(bacteriocin)。进一步，本发明涉及用作药物，特别是用于治疗或预防与细菌生物膜有关的革兰氏阴性细菌和/或革兰氏阳性细菌感染的药物、用作诊断手段、消毒剂或者用作化妆物质的融合蛋白。本发明还涉及去除或减少或防止食品、食品加工设备、食品加工厂、要与食品接触的表面、医疗器械(medical devices)、医院和诊所中的表面的与细菌生物膜有关的革兰氏阴性细菌和/或革兰氏阳性细菌污染。进一步，本发明涉及所述融合蛋白作为诊断手段在与细菌生物膜有关的医学、食品或饲料、或环境诊断中的应用。
文档编号C12N9/52GK103119158SQ201180032048
公开日2013年5月22日 申请日期2011年4月27日 优先权日2010年4月27日
发明者S.米勒 申请人:莱桑多公司