专利名称：作为抗病毒剂的乳凝集素源性肽的制作方法
作为抗病毒剂的乳凝集素源性肽描述本发明涉及单体和多聚肽化合物，所述肽化合物具有抗病毒活性，特别是针对利用整合素的病毒，更特别是针对轮状病毒。本发明进一步涉及包含用于医疗应用或用作食品添加剂的所述肽化合物的组合物。乳是乳清、酪蛋白的悬浮液和脂肪球的乳液在不同阶段相互保持平衡的不均匀混合物。脂肪球通常为由双层包围的数滴甘油三酯，所述双层是典型的脂质双分子层，其来自脂肪球由此起源的乳腺上皮细胞的顶端质膜。与乳脂肪球的膜(乳脂肪球膜MFGM)相关的蛋白质执行的功能对新生儿和婴幼儿是重要的。临床研究(Kurugol等,2003; Newburg 等，1998;Morrow 等,2004)表明不完全母乳喂养的婴幼儿有两次由于轮状病毒而发展胃肠炎的风险。按照新生儿或婴幼儿的营养需求，喂养这些孩子各种类型的制备品(preparation)。在大多数情况下,这些配制品来自用蔬菜起源的必需脂肪进行强化的脱脂牛乳。因此从这类制备品中排除了与乳脂肪球的膜(MFGM)相关的所有蛋白质。以前的研究，也是美国专利No. 5，667，797的课题，显示存在于人MFGM的生物化学化合物具有一些抗轮状病毒活性。具体地，基本上不含其脂质部分的乳脂肪球膜对抗轮状病毒感染具有活性，而从牛MFGM分离的那些相同的分子并未显示出这种功能。研究同样显示纯化的人乳凝集素对轮状病毒感染具有活性，而牛乳凝集素不具有这种活性(Kvistgaard 等,2004)。乳凝集素是存在于MFGM中的糖蛋白，可能通过与组成性磷脂相互作用而与膜相关。从不同的动物物种中分离的不同乳凝集素特征在于有若干结构域在N端区，这些类似于表皮生长因子，并且朝向C端，它们是凝血因子V和VIII的同系物。牛乳凝集素包含427个氨基酸残基，其包括18个氨基酸的N端信号序列，其在细胞内加工过程中被裂解。无信号序列的理论分子量是约45. 6KDa,并且等电点是6. 63。人乳凝集素是387个氨基酸的蛋白质，包括23个氨基酸的N端信号序列。无信号序列的理论分子量是约40. 8KDa，等电点是8. 22。通过二维电泳(2D E)分离时，这两种蛋白质显示大于理论值的表观分子量存在重量差异被解释为由于糖基化的存在。轮状病毒是一种裸RNA病毒，其对于通过口腔和排泄物途径传递的环境条件具有高耐受性。这种病毒的靶细胞是小肠绒毛的成熟顶端肠上皮细胞，由于感染，其随着绒毛的萎缩而死亡。这种由感染引起的组织损伤会导致肠黏膜严重的功能改变，如电解质的损失和水分吸收的减少，从而导致急性腹泻。轮状病毒属于利用整合素作为细胞受体的病毒类型，S卩，轮状病毒与整合素相互作用以进行细胞附着和进入。Graham等(Journal ofVirology, 2003年9月，第9969-9978页)公开了对参与整合素相互作用的病毒蛋白质和序列的研究，该整合素牵涉轮状细胞的附着和进入。特别是参考包含整合素配体序列DGE的病毒蛋白VP4，其参与利用整合素的轮状病毒的结合。对整合素配体肽DGEA和GPRP进行了研究。作者表明整合素配体肽可以剂量依赖性方式抑制猴轮状病毒SAll结合并感染MA104细胞。Zarate等(Journal ofVirology, 2004年10月，第10839-10847页)涉及对轮状病毒细胞的进入的研究，并且特别涉及对介导病毒感染性的整合素识别位点的确立。Zarate等将其研究集中于CNP肽，发现所述肽与整合素相互作用和轮状病毒的感染有关。轮状病毒是导致五岁以下儿童的严重肠胃炎的最重要的原因。这种疾病正常情况下是自限性的并且无后遗症，但致命的后果也是可能的，伴有脱水和电解质失衡，这种现象主要发生在营养不良的儿童和很少有机会获得支持疗法的儿童中。目前没有特定的抗轮状病毒的药物，因此通过支持疗法治疗严重的胃肠炎，目的是恢复失去的液体和修正电解质和酸碱失衡。由于轮状病毒导致的伴有严重脱水的胃肠炎风险的主要人群是未满两岁儿童、营养不良和/或免疫缺陷的儿童和住院和/或在社区治疗的那些儿童。在这种情况下，医疗和社会经济因素表明急切需要研发一种具有抗轮状病毒活性的基于人乳的组分的预防性和/或治疗性制备品。另一方面，由于实际和道德原因，不可能使用母乳。因此，本发明的目的是提供对人的轮状病毒感染表现有益效果的药学上有用的化合物和制备品。 尤其是由于牛乳便宜，且容易大量获得，已尝试使用牛乳或其组分。然而，来自牛乳的各组分不具有抗轮状病毒的活性，因此得出结论只有人乳具有抗轮状病毒活性(Kvistgaard,同上)。本发明人惊奇地发现来自马科动物乳的组分，包括与马科动物乳脂肪球相关的膜的组分，并且更优选特别不含脂质组分，表现出抗病毒活性，特别是针对人轮状病毒。具体地说，本发明人发现从马科动物乳的脂肪球提取的马科动物蛋白乳凝集素表现抗病毒活性，特别是抗轮状病毒活性。最后，本发明的作者能够通过氨基酸序列的测定来纯化和表征马科动物乳中乳凝集素蛋白。
图1示出已由本发明人测定的驴(Equus Asinus)乳乳凝集素的氨基酸序列的N端结构域。另外，本发明人惊奇的发现来自马科动物乳凝集素的特定肽基序具有抗病毒活性。具体地说，这些肽基序包括三肽序列DGE和/或RGD。本发明人不希望被任何理论束缚，已表征这些肽基序能够与细胞表面上的整合素蛋白质结合，从而特异性抑制利用整合素的病毒与宿主细胞表面结合，即抑制病毒附着和进入到宿主细胞。包含上述三肽序列中的一种或两种的肽化合物可被认为是整合素配体肽，其可以与病毒蛋白质竞争整合素附着并且从而通过阻断病毒结合和进入细胞来抑制病毒感染。因此，本发明提供了新型抗病毒肽化合物和在治疗中使用所述肽化合物的方法，例如以治疗和/或预防病毒疾病，特别是由利用整合素的病毒引起的病毒疾病，并且甚至更特别是轮状病毒疾病。因此，本发明的主题是长度为至多50个氨基酸残基的包含由通式(I)表示的氨基酸序列的肽化合物Zn-DGE-W111-RGD-ZJ r 式(I)或其盐，其中每个Z、Z’和W是氨基酸残基，特别是α-氨基羧酸残基；η为O至12的数字，特别是I至6，并且更特别是I至2 ;m 为 O 至 15 的数字，例如，O、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 或 15，特别是 O
至12，更特别是I至10，更特别是4至10，并且甚至更特别是5至8，并且r为O至20的数字，特别是I至12，并且更特别是I至4，并且其中
其中D是具有天冬氨酸侧链的氨基酸残基，优选L-天冬氨酸，G是具有甘氨酸侧链的氨基酸残基，E是具有谷氨酸侧链的氨基酸残基，特别是L-谷氨酸，并且R是具有精氨酸侧链的氨基酸残基，特别是L-精氨酸；并且其中式(I)的肽化合物可以包括L和/或D-氨基酸残基，优选L-氨基酸残基。进一步，本发明的主题是长度至多为50个氨基酸残基的包含由通式(Ia)表示的氨基酸序列的肽化合物([Y1]nl_ [Y2]n2-DGE-[Y3]n3_ [Y4]n4-[Y5]n5)-W，-([Xjml-X2-RGD-X3-X4-X5)式(Ia)或其盐，其中Y1, Y2和Y3独立地为具有中性极性侧链的氨基酸残基，优选地具有丝氨酸⑶、天冬酰胺(N)、半胱氨酸(C)、谷氨酰胺(Q)、酪氨酸(Y)或苏氨酸(T)侧链，Y4是具有带正电荷侧链的氨基酸残基，优选地具有组氨酸(H)、精氨酸(R)或赖氨酸⑷侧链，Y5是具有中性非极性侧链的氨基酸残基，优选地具有苯丙氨酸(F)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、脯氨酸(P)或色氨酸(W)侧链，D是具有天冬氨酸侧链的氨基酸残基，优选L-天冬氨酸，
G是具有甘氨酸侧链的氨基酸残基，E是具有谷氨酸侧链的氨基酸残基，优选L-谷氨酸，ηι、n4和n5独立地为O或I，n2和n3为O或1，条件是n2和n3中至少一个是1，XJPX5独立地为具有中性极性侧链的氨基酸残基，优选地具有丝氨酸(S)、天冬酰胺(N)、半胱氨酸(C)、谷氨酰胺(Q)、酪氨酸(Y)或苏氨酸(T)侧链，X2为具有带正电荷侧链的氨基酸残基，优选地具有组氨酸(H)、精氨酸(R)或赖氨酸⑷侧链，X3和X4独立地为具有中性非极性侧链的氨基酸残基，优选地具有苯丙氨酸(F)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、脯氨酸(P)或色氨酸(W)侧链，R是具有精氨酸侧链的氨基酸残基，特别是L-精氨酸，G是具有甘氨酸侧链的氨基酸残基，D是具有天冬氨酸侧链的氨基酸残基，优选L-天冬氨酸，并且!!^是。或 1，并且W’是共价化学键或连接体基团，优选肽连接体基团，包含I至10个氨基酸残基，优选I至5个，更优选I至3个氨基酸残基，并且其中所述式Ia的肽化合物可以包含L-和/或D-氨基酸残基，优选L-氨基酸残基。当Ψ是共价化学键时，该键优选为当一个氨基酸残基(例如E、Y3、Y4或Y5)的羧基与另一个氨基酸残基(例如&或&)的氨基反应时形成的肽键。共价化学键进一步的例子是例如甲酰胺、氨基甲酸酯、酯、硫酯、醚、硫醚、四唑、噻唑、逆酰胺(retooamide)和硫代酰胺(thiamide)键。在本发明的上下文中，连接体基团W’定义为双官能团，在两端都具有反应性官能末端基团。该连接体的其中一个反应性末端基团与式(Ia)的一个氨基酸残基(如E、Y3、Y4或1)的C端反应。该连接体的另一端上的另一个官能团与式(Ia)的另一个氨基酸残基(如X1或X2)的N端结合。根据本发明的优选的实施方案，该连接体基团是包含I至10个，优选I至5个，更优选I至3个(如1、2或3个)氨基酸残基，特别是α -氨基羧酸残基的肽连接体基团。在本发明的非常优选的实施方案中，该肽连接体基团包含3个氨基酸残基，特别是α -氨基羧酸残基。具体地说，所述三肽连接体基团优选地为由式(Ib)表示的基团，W1-W2-W3 式(Ib)其中W1是具有中性非极性侧链的氨基酸残基，优选地具有苯丙氨酸(F)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、脯氨酸(P)或色氨酸(W)侧链，并且W2和W3独立地为具有带负电荷侧链的氨基酸残基，优选地具有天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)侧链。在非常优选的实施方案中，式W1-W2-W3由1-D-D表示，其中I是具有异亮氨酸侧链的氨基酸残基，优选L-异亮氨酸，并且D是具有天冬氨酸 侧链的氨基酸残基，优选为L-天冬氨酸。该肽连接体基团的氨基酸残基可以包括L-和/或D-氨基酸残基，优选L-氨基酸残基。本领域技术人员已知进一步适合的连接体基团。连接体基团的例子可以包括，但不限于聚合物的异_、双官能小分子。因此，根据本发明的另一个实施方案，该连接体基团可以由包含选自N、S和O的I至3个杂原子的双官能C6-C12烷基基团或异双官能C6-C12烷基基团表示。可替代地，该连接体基团可以由双官能聚合物部分表示，优选地双官能寡聚物部分，其是生物相容的、天然的、半合成或合成起源的，并且可具有直链或支链结构。聚合物的例子可以包括，但不限于聚亚烷基二醇和聚亚烷基氧化物。非常优选的双官能聚合物部分是聚乙二醇(PEG)，特别是中间短的双官能PEG链，如双官能寡聚乙二醇部分，如包含2-10个，优选2-8或2-6个，甚至更优选2、3或4个乙二醇单体单元。在进一步优选的实施方案中，本发明涉及长度至多为50个氨基酸的包含由通式
(II)表示的氨基酸序列的肽化合物；[Yjnl-[Y2]n2-DGE-[Y3]n3_[Y4]n4-[Y5]n5 式(II)或其盐，其中Y1, Y2和Y3独立地为具有中性极性侧链的氨基酸残基，优选地具有丝氨酸(S)、天冬酰胺(N)、半胱氨酸(C)、谷氨酰胺(Q)、酪氨酸(Y)或苏氨酸(T)侧链，Y4是具有带正电荷侧链的氨基酸残基，优选地具有组氨酸(H)、精氨酸(R)或赖氨酸⑷侧链，Y5是具有中性非极性侧链的氨基酸残基，优选地具有苯丙氨酸(F)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、脯氨酸(P)或色氨酸(W)侧链，D是具有天冬氨酸侧链的氨基酸残基，优选L-天冬氨酸，G是具有甘氨酸侧链的氨基酸残基，E是具有谷氨酸侧链的氨基酸残基，优选L-谷氨酸，H1, n4和n5独立地为O或I ;n2和n3为O或1，条件是n2和n3中至少有一个是I ;并且其中所述式(II)的肽化合物可以包含L-和/或D-氨基酸残基，优选L-氨基酸残基。在进一步优选的实施方案中，本发明进一步涉及长度至多为50个氨基酸的包含由通式(III)表示的氨基酸序列的肽化合物[X1Jml-X2-RGD-X3-X4-X5 式(III)或其盐，其中XJPX5独立地为具有中性极性侧链的氨基酸残基，优选地具有丝氨酸⑶、天冬酰胺(N)、半胱氨酸(C)、谷氨酰胺(Q)、酪氨酸(Y)或苏氨酸(T)侧链，X2是具有带正电荷侧链的氨基酸残基，优选地具有组氨酸(H)、精氨酸(R)或赖氨酸⑷侧链，X3和X4独立地为具有中性非极性侧链的氨基酸残基，优选地具有苯丙氨酸(F)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、脯氨酸(P)或色氨酸(W)侧链，
R是具有精氨酸侧链的氨基酸残基，优选L-精氨酸，G是具有甘氨酸侧链的氨基酸残基，D是具有天冬氨酸侧链的氨基酸残基，优选L-天冬氨酸，并且IH1为O或I ;并且其中所述式(III)的肽化合物可以包含L-和/或D-氨基酸残基，优选L-氨基酸残基。通式(I)、(la)、(II)和/或(III)的肽化合物可以包含L-和/或D-氨基酸残基结构单元。本发明中所述肽化合物的序列从左边N端到右边C端书写。本发明涉及肽化合物。本文使用的术语“肽化合物”和“肽连接体”涵盖这样的化合物，其至少部分包括通过化学(优选甲酰胺键)连接的氨基酸结构单元或其类似物。该结构单元优选地选自氨基-羧酸，例如α-氨基羧酸或其他类型的羧酸，如β-或甚至ω-氨基-羧酸。该氨基酸结构单元可选自基因编码的L- α -氨基-羧酸和/或其D-对映体和/或选自非天然存在的氨基酸结构单元。该肽化合物的单个结构单元通过共价键连接，优选通过天然酰胺键连接(“肽键”)键合或其他共价键，如甲酰胺、氨基甲酸酯、酯、硫酯、醚、硫醚、四唑、噻唑、逆酰胺和硫代酰胺键。本发明的主题也是肽化合物变体，其中简单的氨基酸结构单元被修饰。具体地说，所述结构单元修饰包括单个氨基酸的取代，特别是通过保守取代，其中一个氨基酸被相似化学结构的另一个氨基酸所置换而未改变肽的功能性。此外，根据本发明，单个氨基酸修饰也可以包括用氨基酸模拟物对单个氨基酸的取代。因此，该氨基酸结构单元也可以选自氨基酸模拟物。氨基酸模拟物指结构与氨基酸的一般学结构不同但是以与天然存在的氨基酸相似的方式发挥作用的化学化合物。在科学和专利文献中充分描述了这些非天然残基；以下描述了一些作为天然氨基酸残基的模拟物的示例性非天然残基和指南。芳族氨基酸的模拟物为例如D-或L-萘基丙氨酸；D-或L-苯基甘氨酸、D-或L-2-噻吩基丙氨酸(thieneylalanine) ;D_ 或 L-2-, 3_ 或 4_ 花基丙氨酸(pyreneylalanine) ;D_ 或 L-3-噻吩基丙氨酸;D-或L- (2-吡啶基)-丙氨酸；D-或L- (3-吡啶基)-丙氨酸；D-或L- (2-吡嗪基)-丙氨酸；D_或L- (4-异丙基)-苯基甘氨酸；D-(三氟甲基)-苯基甘氨酸；D-(三氟甲基)-苯丙氨酸；D_对氟-苯丙氨酸；D-或L-对联苯基苯基丙氨酸；D-或L-对甲氧基-联苯基-苯丙氨酸；D-或L-2-吲哚(烷基)丙氨酸；和D-或L-烷基丙氨酸。在上下文中，术语“烷基”是指取代或未取代的甲基、乙基、丙基、己基、丁基、戊基、异丙基、异丁基、仲异丁基或异戊基。非天然氨基酸的芳族环包括，例如，噻唑基、苯硫基、吡唑基、苯并咪唑基、萘基、呋喃基、吡咯基和吡啶基芳族环。如上述定义的本发明的肽化合物，因此可以包括“模拟物”和“肽似物”形式。术语“模拟物”和“肽模拟物”指合成的化学化合物，并具有与本发明的肽化合物基本相同的结构和/或功能特性。该模拟物可以完全由合成的、非天然氨基酸类似物组成，或者可以是部分天然氨基酸和氨基酸的部分非天然类似物的嵌合分子。该模拟物还可以包括任何数量的天然氨基酸的保守取代，只要这种取代同样不会充分改变模拟物的结构和/或活性。本发明的式I和/或式Ia的肽化合物的具体例子包括选自以下的氨基酸序列Q-N-DGE-C-H-V-1-D-D-S-H-RGD-V-F-T-Q(SEQ ID NO:1)或N-DG E-C-H-V-1-D-D-S-H-RGD-V-F-T-Q(SEQ ID NO:2)其中该氨基酸残基如上述所定义。该氨基酸残基优选地是L-氨基酸残基。关于优选的序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2，Q是具有谷氨酰胺侧链的氨基酸残基，优选L-谷氨酰胺；N是 具有天冬酰胺侧链的氨基酸残基，优选L-天冬酰胺；C是具有半胱氨酸侧链的氨基酸残基；H是具有组氨酸侧链的氨基酸残基；优选L-组氨酸；V是具有缬氨酸侧链的氨基酸残基，优选L-缬氨酸；1是具有异亮氨酸侧链的氨基酸残基，优选L-异亮氨酸；S是具有丝氨酸侧链的氨基酸残基，优选L-丝氨酸；F是具有苯丙氨酸侧链的氨基酸残基，优选L-苯丙氨酸；T是具有苏氨酸侧链的氨基酸残基，优选L-苏氨酸；并且D、G、E和R如上文对通式I的肽化合物所定义，即分别优选地为L-天冬氨酸、甘氨酸、L-谷氨酸和L-精氨酸。式I和/或式Ia的肽化合物进一步优选的例子包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的氨基酸序列，其中Q可被具有另一种中性极性侧链的氨基酸残基取代，例如N、C、S、Y或T ;N可被具有另一种中性极性侧链的氨基酸残基取代，例如Q、C、S、Y或T ;C可被具有另一种中性极性侧链的氨基酸残基取代，例如N、T、Q、Y或S ;H可被具有另一种带正电荷侧链的氨基酸残基取代，例如R或K ;V可被具有含另一种中性非极性侧链的氨基酸残基取代，例如A、F、G、1、L、M、P或W ；I可被具有含另一种中性非极性侧链的氨基酸残基所取代，例如A、F、G、V、L、M、P或W ;S可被具有另一种中性极性侧链的氨基酸残基所取代，例如N、C、Q、Y或T ; 可被具有另一种中性非极性侧链的氨基酸残基取代，例如4、￥、6、1、1^^、？或1;
T可被具有另一种中性极性侧链的氨基酸残基取代，例如N、C、Q、Y或S ;并且D可被具有另一种带负电荷侧链的氨基酸残基取代，例如E，条件是该三肽DGE和RGD的氨基酸残基D是具有天冬氨酸侧链的氨基酸残基，优选L-天冬氨酸。式I和/或式Ia的肽化合物的进一步优选的例子包括选自以下的氨基酸残基N-N-DGE-C-H-V-1-D-D-S-H-RGD-V-F-T-Q(SEQ ID NO:7)Q-N-DGE-C-H-V-1-D-D-S-H-RGD-V-F-S-Q(SEQ ID NO:8)或Q-N-DGE-C-H-V-1-D-D-S-H-RGD-V-F-Q-T(SEQ ID NO:9)。本发明的式II的肽化合物的具体例子包括选自以下的氨基酸序列Q-N-DGE-C-H-V(SEQ ID NO:3)或N-DGE-C-H-V(SEQ ID NO:4),其中该氨基酸残基如上述所定义。该氨基酸残基优选地为L-氨基酸残基。关于优选序列SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO:4，Q是具有谷氨酰胺侧链的氨基酸残基，优选L-谷氨酰胺；N是具有天冬酰胺侧链的氨基酸残基，优选L-天冬酰胺；C是具有半胱氨酸侧链的氨基酸残基，优选L-半胱氨酸；H是具有组氨酸侧链的氨基酸残基，优选L-组氨酸是具有缬氨酸侧链的氨基酸残基，优选L-缬氨酸；并且D、G和E如上文对通式II的肽化合物所定义，即分别优选地为L-天冬氨酸、甘氨酸和L-谷氨酸。本发明的式III的肽化合物的具体例子包括选自以下的氨基酸序列S-H-RGD-V-F-T(SEQ ID NO:5)或H-RGD-V-F-T(SEQ ID NO:6)，其中该氨基酸残基如上述所定义。该氨基酸残基优选地为L-氨基酸残基。关于优选序列SEQ ID N0:5和SEQ ID NO:6，S表示具有丝氨酸侧链的氨基酸残基，优选L-丝氨酸；H表示具有组氨酸侧链的氨基酸残基，优选L-组氨酸；V表示具有缬氨酸侧链的氨基酸残基，优选L-缬氨酸；F表示具有苯丙氨酸侧链的氨基酸残基，优选L-苯丙氨酸；并且T表示具有苏氨酸侧链的氨基酸残基，优选L-苏氨酸；并且R、G和D如上文对通式III的肽化合物所定义，即分别优选地为L-精氨酸、甘氨酸和L-天冬氨酸。本发明的肽化合物可以是直链或环状肽。本发明的单体肽化合物可以具有多至50个氨基酸残基的长度，优选多至45、30、35、20或15个氨基酸的长度。具体地说，通式I的肽化合物可以优选地具有至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸残基，优选至少19或20个氨基酸残基的长度。通式Ia的肽化合物可以优选地具有至少11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 个，优选至少 16、17、18、19 或 20 个，更加优选至少 19或20个氨基酸残基的长度。通式II的肽化合物可以具有至少4、5、6、7、8或10个氨基酸残基，优选至少5、7或8个氨基酸残基的长度。最后，通式III的肽化合物可以具有至少7、8、10或12个氨基酸残基，优选至少为7或8个氨基酸残基的长度。本发明进一步的优选的实施方案涉及如上所述的肽化合物，例如与另外的活性剂(优选另外的抗病毒活性剂)结合的通式1、la、II和/或III的肽化合物。优选地，另外的活性剂为另外的抗病毒肽化合物，即通式1、Ia、II和/或III的另外的肽化合物。因此，本发明的优选的实施方案包括式1、la、II和/或III的肽化合物的任何一种的组合。在非常优选的实施例中，本发明涉及式II的肽化合物的组合物(其包含活性三肽DGE)和式III的肽化合物(包含活性三肽RGD)的组合。这种组合的具体例子由SEQ ID N0:3和/或SEQ ID NO:4的肽化合物以及SEQ ID N0:5和/或SEQ ID NO:6的肽化合物的组合表示。在另外的实施方案中，本发明的肽化合物可以与在胃肠道内具有活性的益生菌微生物组合使用。特别是，这些益生菌微生物是通过胃肠道，特别是肠道的定殖，并改善、刺激和稳定肠道微生物菌丛平衡而有益地影响宿主的活体微生物。该益生菌微生物可以选自细菌、酵母菌和/或杆菌属，优选地选自细菌，更优选地选自乳酸菌。合适的乳酸菌的例子包括乳杆菌属(例如，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)和罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreutarii)、双歧杆菌属(Bifidobacteria)、乳球菌属(例如,乳酸乳球菌)和链球菌属。根据本发明的一个优选的实施方案，式1、la、II和/或III的肽化合物是来自马科动物乳凝集素(特别是马和驴乳凝集素)的天然存在的氨基酸序列部分的肽化合物。所述马科动物乳凝集素可以分离自生物材料，例如分离自马科动物乳。基于天然存在的马科动物乳凝集素序列的序列部分，本发明的一个具体的实施方案涉及式(I)的肽化合物，其中(a)W是⑴氨基酸序列CHVIDDSH,其中
所述氨基酸残基如上述所定义，优选L-氨基酸残基；(ii)与其具有至少50%，特别是75%的同一性的氨基酸序列，或(iii)具有⑴的至少4个相邻氨基酸的氨基酸序列；(b’)Z是⑴氨基酸序列ASGPCFPNCQN,其中所述氨基酸残基如上述所定义，优选L-氨基酸残基；(ii)与其具有至少50%，特别是75%的同一性的氨基酸序列，或(iii)具有⑴的至少2个，优选至少4个相邻氨基酸的氨基酸序列，和/或(C，)Z，是⑴氨基酸序列VFTQYICSC PRG YTGTHCE其中所述氨基酸如上述所定义，优选L-氨基酸残基；(ii)与其具有至少50%，特别是75%的同一性的氨基酸序列，或(iii)具有(i)的至少4个相邻氨基酸的氨基酸序列。可替代地，本发明的肽化合物可以通过肽合成获得，例如通过Fmoc/tBu化学在固相中进行肽合成。进一步可替代地，本发明的肽化合物可在任何适合的宿主内重组产生，例如在原核细胞中或在用编码本发明的肽化合物的核酸分子转化或转染的真核细胞或非人生物内，特别包含 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ IDNO:4,SEQ ID NO:5,SEQID N0:6、SEQ ID NO:7,SEQ ID N0:8或SEQ ID NO:9的氨基酸序列。所述核酸分子可以作为载体的组分或任何适合的媒介物被转运到宿主内。在另外的实施方案中，本发明涉及一种多聚化合物，其包含如上所述的多种肽化合物作为单元，例如式1、la、II和/或III的肽化合物，其中单个肽化合物单元共价连接，例如通过共价键或多官能键，例如双-或三官能部分，如双-或三官能氨基酸。在多聚体化合物中的单个单体肽单元可以相同或不同。例如，本发明的多聚体化合物可以包括2、3、4、5、6、7、8个拷贝或更多的肽化合物，例如式1、la、II和/或III的化合物。该多聚化合物可以包括在基质上聚合的肽化合物，例如基于多肽、单糖、寡糖或多糖或有机聚合物的基质，优选直链有机聚合物。例如，该基质可以选自聚(N-烷基(甲基)丙烯酰胺)、聚(N，N-二烷基(甲基)丙烯酰胺)、多聚氰胺、葡聚糖、环糊精、聚乙二醇和/或聚乙烯吡咯烷酮。肽化合物与基质的耦合优选通过肽化合物的N端和/或C端发生，例如使用允许耦合到反应性基团的同双官能和/或杂双官能连接体，例如基质上的羟基、氨基、巯基或羧基基团。本发明的多聚化合物具有直链或支链结构，特别是树突状结构。在另外的实施例中，所述多聚化合物选自⑴Pc-(J1-Pc) ^J1-(Pc)m, (IVa)其中P。是如上所定义的式1、Ia、II和/或III的肽化合物J1是共价键或双官能连接体，例如二醇如丙二醇，二羧酸如琥珀酸，二胺如乙二胺、氨基酸、羟基羧酸(例如羟基链烷酸)或二异氰酸酯，并且m是O或正整数，且m’是O或I ;(ii) [[(Pc)nlJu Jn2JJ2 (IVb)其中P。是如上所定义的式1、la、II和/或III的肽化合物；/’在每种情况下独立地是官能度至少为3的连接体,例如三官能团氨基酸如赖氨酸、鸟氨酸、去甲赖氨酸、氨基丙氨酸、天冬氨酸或谷氨酸，并且J2是官能度至少为2的连接体，并且
Ii1和n2在每种情况下独立地是整数，至少为2，优选2、3或4，更优选2，(iii) ([[(Pc)nlJu ]JJ2，In3J3 (IVc)其中P。是如上所定义的式1、la、II和/或III的肽化合物J1’和J2’在每种情况下独立地是官能度至少为3的连接体,例如三官能团氨基酸如赖氨酸、鸟氨酸、去甲赖氨酸、氨基丙氨酸、天冬氨酸或谷氨酸，J3是官能度至少为2的连接体，并且Ill、n2和n3在每种情况下独立地是整数，至少为2，优选2、3或4，更优选2。该多聚化合物(IVa)是多聚直链化合物，其中多种肽化合物通过共价键和/或同-双官能或异-双官能连接体J1相连。优选地，该多聚化合物包含式1、la、II和/或III的肽化合物的至多3个，更优选至多4、5、6、7或8个单元。在非常优选的实施方案中，式(IVa)的多聚直链化合物包含通过共价键相连，特别是通过天然酰胺键(“肽键”)相连的本发明的肽化合物的5个单元。该五聚体多聚直链化合物优选地包含SEQ ID NO: 1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5, SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或其组合的肽化合物的5个单元。因此，根据本发明的该优选的实施方案，多聚化合物(IVa)具有结构P。-(/-P。)^1-(Pe)1，其中P。为选自SEQID N0:1至9，优选SEQID N0:l、2、7、8或9的肽化合物，并且J1是共价键，优选肽键。该多聚化合物(IVb)和(IVc)是支链化合物，其中单个肽单元P。通过官能度至少为3的连接体相连。在另一个实施方案中，该多聚化合物(IVb)包含4个肽单元，并具有以下结构
权利要求
1.一种长度至多为50个氨基酸的包含由通式(I)表示的氨基酸序列的肽化合物 Zn-DGE-W111-RGD-ZJ r 式(I) 或其盐，其中 每个Z、Z’和W是氨基酸残基，特别是a -氨基羧酸残基， n为0至12的数字，特别是I至6，并且更特别是I至2，并且 m为0至12的数字，特别是I至10，并且更特别是5至8，并且 r为0至20的数字，特别是I至12，并且更特别是I至4，并且其中 D是具有天冬氨酸侧链的氨基酸残基，优选L-天冬氨酸， G是具有甘氨酸侧链的氨基酸残基， E是具有谷氨酸侧链的氨基酸残基，特别是L-谷氨酸，并且 R是具有精氨酸侧链的氨基酸残基，特别是L-精氨酸； 并且其中式(I)的肽化合物可包含L和/或D-氨基残基，优选L- 氣基酸残基。
2.根据权利要求1所述的肽化合物，其中所述氨基酸序列由通式(Ia)表示([Y1]nl_ [Y2]也-DGE-[Y3]n3-[Yjn4-[Y5]n5)-W，-([Xjml-X2-RGD-X3-X4-X5)式(Ia) 或其盐，其中1、Y2和Y3独立地为具有中性极性侧链的氨基酸残基，优选地具有丝氨酸(S)、天冬酰胺(N)、半胱氨酸(C)、谷氨酰胺(Q)、酪氨酸(Y)或苏氨酸(T)侧链， Y4是具有带正电荷侧链的氨基酸残基，优选地具有组氨酸(H)、精氨酸(R)或赖氨酸⑷侧链， Y5是具有中性非极性侧链的氨基酸残基，优选地具有苯丙氨酸(F)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、脯氨酸(P)或色氨酸(W)侧链，D是具有天冬氨酸侧链的氨基酸残基，优选L-天冬氨酸， G是具有甘氨酸侧链的氨基酸残基， E是具有谷氨酸侧链的氨基酸残基，优选L-谷氨酸， Ii1、n4和n5独立地为0或I ; n2和n3为0或1，条件是n2和n3中至少一个是I ; X1和X5独立地为具有中性极性侧链的氨基酸残基，优选地具有丝氨酸(S)、天冬酰胺(N)、半胱氨酸(C)、谷氨酰胺(Q)、酪氨酸(Y)或苏氨酸(T)侧链， X2为具有带正电荷侧链的氨基酸残基，优选地具有组氨酸(H)、精氨酸(R)或赖氨酸⑷侧链， X3和X4独立地为具有中性非极性侧链的氨基酸残基，优选地具有苯丙氨酸(F)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、脯氨酸(P)或色氨酸(W)侧链； R是具有精氨酸侧链的氨基酸残基，特别是L-精氨酸， G是具有甘氨酸侧链的氨基酸残基， D是具有天冬氨酸侧链的氨基酸残基，优选L-天冬氨酸，并且 1111是0 或 1， 并且W’是共价化学键或连接体基团，优选肽连接体基团，包含I至10个氨基酸残基，优选I至5个，更优选I至3个氨基酸残基，并且其中所述式Ia的肽化合物可包含L-和/或D-氨基酸残基，优选L-氨基酸残基。
3.根据权利要求1所述的肽化合物，包含以下氨基酸序列 Q-N-DGE-C-H-V-1-D-D-S-H-RGD-V-F-T-Q(SEQ ID NO:1) N-DGE-C-H-V-1-D-D-S-H-RGD-V-F-T-Q(SEQ ID NO:2) N-N-DGE-C-H-V-1-D-D-S-H-RGD-V-F-T-Q(SEQ ID NO:7) Q-N-DG E-C-H-V-1-D-D-S-H-RGD-V-F-S-Q(SEQ ID NO:8)或 Q-N-DGE-C-H-V-1-D-D-S-H-RGD-V-F-Q-T(SEQ ID NO:9)， 其中所述氨基酸残基如权利要求1中所定义，优选L-氨基酸残基。
4.一种长度至多为50个氨基酸的包含由通式(II)表示的氨基酸序列的肽化合物 [YJnl-[Y2]^-DGE- [Y3]n3- [Y4]n4- [Y5]n5 式(II) 或其盐，其中1、Y2和Y3独立地为具有中性极性侧链的氨基酸残基，优选地具有丝氨酸(S)、天冬酰胺(N)、半胱氨酸(C)、谷氨酰胺(Q)、酪氨酸(Y)或苏氨酸(T)侧链， Y4是具有带正电荷侧链的氨基酸残基，优选地具有组氨酸(H)、精氨酸(R)或赖氨酸⑷侧链， Y5是具有中性非极性侧链的氨基酸残基，优选地具有苯丙氨酸(F)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、脯氨酸(P)或色氨酸(W)侧链，D是具有天冬氨酸侧链的氨基酸残基，优选L-天冬氨酸， G是具有甘氨酸侧链的氨基酸残基， E是具有谷氨酸侧链的氨基酸残基，优选L-谷氨酸， Ii1、n4和n5独立地为0或I ; n2和n3为0或I,条件是n2和n3中至少有一个是I ; 并且 其中式(II)的肽化合物可包含L-和/或D-氨基酸残基，优选L-氨基酸残基。
5.根据权利要求4所述的肽化合物，包含以下氨基酸序列 Q-N-DGE-C-H-V(SEQ ID NO:3) 或N-DGE-C-H-V(SEQ ID NO:4)， 其中所述氨基酸残基如权利要求4中所定义，优选L-氨基酸残基。
6.一种长度至多为50个氨基酸的包含由通式(III)表示的氨基酸序列的肽化合物 [XJnl-X2-RGD-X3-X4-X5 式(III) 或其盐，其中 X1和X5独立地为具有中性极性侧链的氨基酸残基，优选地具有丝氨酸(S)、天冬酰胺(N)、半胱氨酸(C)、谷氨酰胺(Q)、酪氨酸(Y)或苏氨酸(T)侧链， X2是具有带正电荷侧链的氨基酸残基，优选地具有组氨酸(H)、精氨酸(R)或赖氨酸⑷侧链， X3和X4独立地为具有中性非极性侧链的氨基酸残基，优选地具有苯丙氨酸(F)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、脯氨酸(P)或色氨酸(W)侧链， R是具有精氨酸侧链的氨基酸残基，优选L-精氨酸， G是具有甘氨酸侧链的氨基酸残基， D是具有天冬氨酸侧链的氨基酸残基，优选L-天冬氨酸，并且 Hl1为O或I,并且 其中所述式(III)的肽化合物可以包含L-和/或D-氨基酸残基，优选L-氨基酸残基。
7.根据权利要求6所述的肽化合物，包含以下氨基酸序列S-H-RGD-V-F-T(SEQ ID NO:5) 或H-RGD-V-F-T(SEQ ID NO:6) 其中所述氨基酸残基如权利要求6中所定义，优选L-氨基酸残基。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的肽化合物，与另外的活性剂，例如权利要求1至7中任一项所定义的另外的抗病毒肽化合物组合。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的肽化合物，其中 (i)所述式I的肽化合物具有至少6、8、10、12、14、16、19或20个氨基酸残基的长度，优选至少19或20个氨基酸残基的长度， (ii)所述式Ia的肽化合物具有至少11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸残基的长度，优选至少19或20个氨基酸残基的长度， (iii)所述式II的肽化合物具有至少4、6、7、8或10个氨基酸残基的长度，优选至少7或8个氨基酸残基的长度，且 (iv)所述式III的肽化合物具有至少7、8、10、12或14个氨基酸残基的长度，优选至少7或8个氨基酸残基的长度。
10.一种多聚化合物，包含多种根据权利要求1至9中任一项所定义的肽化合物作为单元，所述多聚化合物优选具有直链或支链结构，特别是树突状结构。
11.根据权利要求10所述的多聚化合物，其选自 (i)Pc- (J1-Pc) m-J1- (Pc) m> (IVa) 其中P。是根据权利要求1至9中任一项所定义的肽化合物； J1是共价键或双官能连接体，例如二醇，例如丙二醇；二羧酸，例如琥珀酸；二胺，例如乙二胺；氨基酸；羟基羧酸或二异氰酸酯，并且m是0或正整数，且m’是0或I ;(ii)[[(Pc)nlJu ]n2] J2 (IVb) 其中P。是如权利要求1至9中任一项所定义的肽化合物，J1’在每种情况下独立地是官能度至少为3的连接体，例如三官能氨基酸，如赖氨酸、鸟氨酸、去甲赖氨酸、氨基丙氨酸、天冬氨酸或谷氨酸，并且 J2是官能度至少为2的连接体，并且 H1和n2在每种情况下独立地是整数，至少为2，优选2、3或4，更优选2，(iii)([[(Pc)nlJu In2U2Mn3J3 (IVc) 其中P。是根据权利要求1至9中任一项所定义的肽化合物；/’和J2’在每种情况下独立地是官能度至少为3的连接体,例如三官能氨基酸,如赖氨酸、鸟氨酸、去甲赖氨酸、氨基丙氨酸、天冬氨酸或谷氨酸， J3是官能度至少为2的连接体，并且 H1^n2和n3在每种情况下独立地是整数，至少为2，优选2、3或4，更优选2。
12.根据权利要求10或11所述的多聚化合物，其与另外的活性剂，例如根据权利要求1至9中任一项所述的另外的抗病毒肽化合物或如权利要求10或11中所定义的另外的抗病毒多聚化合物组合。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的化合物，其用作药物，优选地用作预防和/或治疗病毒感染，特别是利用整合素的病毒感染，如轮状病毒、疱疫病毒、柯萨奇病毒、偏肺病毒、西尼罗病毒和/或口蹄疫病毒感染，特别是轮状病毒的药物。
14.一种用于医疗应用的组合物，其包含至少一种根据权利要求1至12中任一项所述的化合物以及药学上可接受的赋形剂、载体和/或稀释剂。
15.根据权利要求14所述的组合物，其用于口服施用，特别是呈粉末形式。
16.根据权利要求1至12中任一项所述的化合物，其用作食品添加剂，特别是用作儿童和/或新生儿食品例如奶粉的添加剂。
全文摘要
本发明涉及单体和多聚肽化合物，所述肽化合物具有抗病毒活性，特别是针对利用整合素的病毒，更特别是针对轮状病毒。本发明进一步涉及包含用于医疗应用或作为食品添加剂的所述肽化合物的组合物。
文档编号A23L1/29GK103037897SQ201180031914
公开日2013年4月10日 申请日期2011年5月31日 优先权日2010年5月31日
发明者A·康迪, D·莱波, C·法布雷斯, E·波尔蒂诺, S·兰多尔夫 申请人:罗塔拉斯迪斯股份责任有限公司