来自多能细胞的前部前肠内胚层的形成的制作方法

专利名称：来自多能细胞的前部前肠内胚层的形成的制作方法
技术领域：
本发明涉及(至少部分涉及)来自多能细胞的组织前体细胞群的形成方法，更具体地涉及来自多能细胞的前部前肠内胚层(anterior foregut endoderm)的形成方法。
背景技术：
胚胎干细胞(ES)为衍生自囊胚内细胞团的多能细胞，并在人类和小鼠中均可在特定条件下保持多能状态。ES细胞理论上可分化成一切体细胞和生殖细胞类型。因此，将ES细胞分化成各种细胞类型和组织的适当条件的研发使得对于未来细胞替代疗法充满期许。多能细胞还可通过将成年体细胞重编程为多能状态(例如，诱导多能干细胞，或iPS细胞)，提供患者特异的多能细胞的形成途径来获得，这将克服与ES细胞来源的组织移植相关的排斥问题。发育开始于原肠胚形成过程，在此期间，来自囊胚内细胞团的未分化细胞分化成三种胚层，由这三种胚层形成机体的所有组织。外胚层形成皮肤及其附属物、神经系统和肾上腺组织。中胚层发育成泌尿生殖系统、结缔组织、肌肉、骨骼、软骨、血管、血液和心脏。内胚层产生肠、肝、胰腺、食管、气管、肺和衍生自最前部前肠内胚层的咀嚼器(pharyngealapparatus)。沿胚胎的背腹侧、前后部和左右轴发生复杂的图式形成(patterning)过程，导致这些胚层中的特定结构域定形，随后将发育成特定组织和器官。图式形成伴随着复杂的分子变化。因此获得富集或纯的成熟细胞功能群显得至关重要，需要顺次(sequentially)施加发育信号(developmental cues),从而引导活体内多能细胞的分化。

发明内容
本发明至少部分基于发现了由多能干细胞，如人类胚胎干细胞和诱导多能干细胞形成前部前肠内胚层的方法。在某些实施方案中，本发明提供前部前肠内胚层细胞的富集细胞群。在某些实施方案中，本发明提供咽内胚层细胞(pharyngeal endoderm cell)的富集细胞群。这些细胞群可通过本文所述方法获得。如本文所使用的，术语“细胞群”是指分离的细胞群，而不是存在于动物中的正常发育所产生的细胞群。
在某些实施方案中，本发明提供用于衍生前部前肠内胚层的方法，所述方法包括在无活化素A下用BMP抑制剂或TGF-P信号传导抑制剂培养定形内胚层(definitiveendoderm)。在一些实施方案中，在无活化素A下用BMP抑制剂和TGF-P信号传导抑制剂二者培养定形内胚层细胞。在优选实施方案中，BMP抑制剂为头蛋白(Noggin)，TGF-^信号传导抑制剂为SB-431542。在某些实施方案中，本发明提供由多能细胞，如ES细胞或iPS细胞衍生前部前肠内胚层的方法，所述方法包括诱导所述多能细胞形成例如表达本文所述的标记物EPCAM、CXCR4和C-KIT的定形中胚层，然后由本文所述的定形中胚层衍生前部前肠内胚层。在某些实施方案中，通过本文所述方法所衍生的前部前肠内胚层细胞表达F0XA2，并包括与在所述定形内胚·层细胞中S0X2和⑶X2的表达相比升高的S0X2表达水平和降低的⑶X2表达水平。在优选实施方案中，本发明提供一种由多能细胞，如ES或iPS细胞、最优选人ES或iPS细胞来制备前部前肠内胚层细胞的富集群的方法,其包括(i)在碱性FGF(bFGF)、骨形态发生蛋白4 (BMP4)和活化素A的存在下培养所述多能细胞从而诱导所述多能细胞形成定形内胚层细胞；和(ii)在BMP抑制剂如头蛋白或腱蛋白(Chordin)或卵泡抑素(follistatin)和/或TGF-P信号传导抑制剂如SB-431542的存在下，和在无活化素A下，培养所述定形内胚层细胞，从而诱导定形内胚层细胞形成前部前肠内胚层细胞。在某些实施方案中，本发明提供一种影响前部前肠内胚层细胞的增殖、分化或存活的试剂的鉴别方法，所述方法包括在要试验试剂的存在和不存在下培养前部前肠内胚层富集细胞群，并比较所述细胞在所述试剂存在和不存在下的增殖、分化或存活，其中在所述试剂存在下的差异表示鉴别出影响所述细胞的增殖、分化或存活的试剂。在某些实施方案中，本发明提供一种参与细胞分化的基因的鉴别方法，所述方法包括分离定形内胚层细胞和前部前肠内胚层细胞，并比较所述定形内胚层细胞和所述前部前肠内胚层细胞的基因表达谱，其中鉴别出在所述定形内胚层细胞和所述前部前肠内胚层细胞之间差异表达的基因表示参与细胞分化的基因。在某些实施方案中，本发明提供一种抗体的鉴别方法，所述抗体识别从定形内胚层向前部前肠内胚层发展的分子标记物，所述方法包括将抗体温育于前部前肠内胚层的富集细胞群，并筛选出与所述前部前肠内胚层的结合显著高于与所述定形内胚层的结合的抗体。在某些实施方案中，本发明提供一种诱导前部内胚层/咽内胚层(anterior/pharyngeal)的腹侧(ventral)细胞命运(fate)或咽囊命运的方法,所述方法包括施用选自由Wnt配体、Wnt信号传导激活剂、BMP、表皮生长因子(EGF)和成纤维细胞生长因子组成的组中的一种或多种因子。在某些实施方案中，本发明提供一种在细胞中诱导甲状旁腺命运的方法，所述方法包括用音猬因子(Sonic Hedgehog，SHH)和成纤维细胞生长因子(FGF)培养腹面发育的前部前肠内胚层细胞。在某些实施方案中，本发明提供一种在细胞中诱导肺命运的方法，所述方法包括在维甲酸的存在下用FGF和Wnt信号传导激活剂培养腹面发育的前部前肠内胚层。另外提供通过本文所述方法生产的细胞和细胞群(例如，富集群)。除另外规定外，本文所使用的所有科技术语与本发明所述领域普通技术人员所通常理解的含义相同。本文所述的方法和材料用于本发明；也可使用本领域已知的其他适合的方法和材料。材料、方法和实施例仅为示例性，并不意于限制。将本文所提及的所有公开物、专利申请、专利、序列、数据库条目(database entries)和其他文献的全部内容引入以作参考。在冲突的情况下，将调控本说明书，包括定义。从以下详细描述和附图，以及从权利要求书中，本发明的其他特性和优势将显而易见。


图la-1示出在头蛋白(NOGGIN)/SB-431542处理的定形内胚层中AFE标记物的诱导。(la)hES细胞中活化素A-介导的定形内胚层诱导期间F0XA2、MIXL1、S0X17、S0X2和⑶X2mRNA的表达。数据表示为P -肌动蛋白(ACTIN)(还称为ACTB)标准化的mRNA的定量，按比例的最大诱导百分比。如图(条带)上方所示添加细胞因子。(Ib)在活化素A诱导的第5天定形内胚层的标记物CXCR4、C-KIT和EPCAM的典型的流式细胞术分析。示出两个生物学独立的实验。(Ic)在用列于左下图的因子诱导定形内胚层后第5天处理的培养物中F0XA2、S0X2、CDX2、PAX9和TBXl mRNA在第9天的表达(参见左上图)(n=3个生物学重复；*，显著不同于所有其他条件，P<0. 0001 ;单因素方差分析(one-way ANOVA))。d0,分化开始前；d5，第5天。(Id)在sFRP存在和不存在下用头蛋白/SB-431542(SB)诱导定形内胚层后第5天处理的培养物中S0X2和PAX9在第9天的表达(*，P〈0. 05，n=3个生物学重复)。(Ie)在如前所述分化为神经外皮层(第I天添加头蛋白/SB-431542)，或者在内胚层诱导后(内胚层诱导至第5天，随后添加头蛋白/SB-431542)的hE S细胞中BRACHYURY和PAX6 mRNA在第9天的表达。对于BRAYCHURY，将暴露于活化素A并经历原肠胚形成的第
3.5天hES细胞用作阳性对照(*，P〈0. 0001, n=3个实验，所述实验由各三个生物学重复组成)。(If)在定形内胚层诱导至第5天后用头蛋白/SB-431542平行处理的或者在肝脏条件(h印atic condition)下培养的培养物中 0DD1、CDX2、EVX1、CREB313、CEBPA、TBX1、PAX9、S0X2和FGFSmRNA在第9天的表达(n=3个实验，所述实验由各三个生物学重复组成)。(Ig)在HDF2和HDF9 hiPS细胞中活化素A诱导的第5天定形内胚层的标记物CXCR4和C-KIT的典型的流式细胞术分析。(lh，i)在用无血清分化基质(对照，ctrl)或头蛋白/SB-431542诱导定形内胚层后，从第5天处理的培养物中HFGD2和HDF9hiPS细胞中F0XA2、S0X2和PAX9mRNA第9天的表达(参见左上图)(n=3个生物学三次重复，*显著不同于基质对照)。图2a_c示出头蛋白/SB-431542诱导的AFE细胞的功能特性。(2a)在示意性示于图上方的两个条件下形成的HE S2衍生细胞中S0X2、NKX2.1、NKX2. 5、PAXl和P63的表达(n=6个培养孔，来自两个独立 实验；*，显著不同于头蛋白/SB-431542 ；P<0. 05)，WKFBE WNT3a、KGF、FGF10、BMP4和EGF。(2b)在示意性示于图上方的三个条件下形成的HES2衍生细胞中NKX2. 1、NKX2. 5和PAXl的表达(n=4_6个培养孔，来自三个独立实验；*，显著不同于其他条件；P〈0. 05)。(2c)腹侧AFE诱导效率的示意性概述图。WKFBE :WNT3a、KGF、FGFlO,BMP4 和 EGF。
图2d_e说明由hES和hIPS细胞形成的AFE的功能。(2d)在示意性示于图上方的条件下分化成AFE的HDF2 (上)和HFD9 (下)hiPS细胞中S0X2、NKX2.1和PAXl mRNA的表达(n=4-6个培养孔，来自2个独立实验，*，显著不同于头蛋白/SB-431542条件)。(2e)使用头蛋白/SB-431542接着用WKFBE分化成推定的腹侧AFE的HES2细胞中EPCAM的表达(左侧峰同种型(isotype)对照，右侧峰EPCAM)。图3a_b示出来自体外形成的腹侧AFE的肺和咽囊标记物的诱导。(3a)在示意性示于图上方的两个条件下形成的HE S2衍生细胞中PAX1、NKX2.1、F0XP2、GATA6和FOXJl的表达(n=4-6个培养孔，来自三个独立实验，*，显著不同于WKFBE条件；P〈0. 05)。WKFBE WNT3a、KGF、FGF10、BMP4和EGF。(3b)在图中所示因子的存在下在腹面发育的AFE中SFTPC和GCM2mRNA的诱导。
具体实施例方式胚胎形成期间，前部内胚层和咽内胚层的形成是体平面(body plan)建立和多器官系统如耳部、腭扁桃体、胸腺、甲状旁腺、甲状腺、肺、食管和气管发育中至关重要的步骤。继其形成以后，定形内胚层逐渐分化成内胚层亚谱系。更后期的内胚层形成中肠和后肠。肺野(lung field)前部的咽内胚层形成四个露头，称为咽囊。各咽囊发育成具体器官如咽鼓管和鼓膜的内叶(第一囊)、腭扁桃体(第二囊)、胸腺(第三前囊)、甲状旁腺(第三背囊和第4囊)和甲状腺的束旁C细胞(第四囊)。甲状腺由咽的室底(floor)适当地发育。肺、食管和气管衍生自囊远端的前部前肠内胚层。产生前部前肠内胚层/咽内胚层细胞群的能力在这些组织的细胞替代疗法中、在对影响细胞生长和分化的试剂的分析中和在组织发育和分化的研究中将会是有用的。然而，目前还没有从多能细胞形成前部前肠内胚层细胞群的方法，而调控前部前肠内胚层形成的分子机制还并未明确。获得前部前肠内胚层细胞群将会是有利的，从而更好的理解它们的形成和组织发育。迄今为止还不能够分离或形成前部前肠内胚层细胞的富集群。本发明提供用于获得前部前肠内胚层群的方法其通过诱导多能细胞分化成定形内胚层，随后使定形内胚层 图式形成(patterning)为前部命运。前部前肠内胚层可随后被诱导分化成由其衍生的任何组织。在某些实施方案中，腹侧前部前肠内胚层、甲状旁腺和肺标记物由前部前肠内胚层/咽内胚层诱导。因此，本发明提供由多能细胞形成前部前肠内胚层细胞群的方法。此类细胞群对于鉴别影响细胞生长和分化的试剂、对于鉴别参与组织发育的基因以及对于形成细胞替代疗法用分化细胞和组织是有用的。如本文所使用的，“前部前肠内胚层”是指发育成肝的内胚层前部的内胚层。本领域普通技术人员将容易理解“前部前肠内胚层”由此包括，例如咽内胚层及其他更加高度分化的内胚层细胞群，而由术语“前部前肠内胚层”所包括的各种细胞类型可呈现分子标记物的不同表达模式。本领域普通技术人员将容易理解“前部前肠内胚层”发育成各种组织，如扁桃体、鼓膜、甲状腺、甲状旁腺、胸腺、气管、食管、胃、肺和喉/咽。多能细胞如ES细胞直接分化成定形内胚层可通过应用高浓度的活化素A来实现。该策略的科学基础为通过成形素结节(morphogen nodal)的信号传导需要内胚层形成。活化素A激活与结节相同的受体，但作为可溶性细胞因子存在。尽管存在促使E S细胞分化成定形内胚层的可用方法，但目前还没有活体外使定形内胚层前部化(anteriorize)和衍生(或分离)前部前肠内胚层的可用方法。胚胎组织表达典型的分子标记物组。内细胞团细胞表达转录调控因子0CT3/4、NANOG和S0X2。定形内胚层细胞表达转录调控因子F0XA2、S0X17和F0XA3。前部前肠内胚层细胞表达转录调控因子F0XA2和S0X2。咽内胚层细胞表达转录调控因子TBXl和S0X2.第三咽囊细胞表达转录调控因子PAX1/9、H0XA3和SIXl。胸腺上皮细胞表达转录调控因子FOXNl。前部前肠内胚层的肺野表达NKX2.1和GATA6。组织中前部前肠内胚层标记物的检测，在其内部和其本身，不足以证明衍生自ES细胞的前部前肠内胚层的存在。ES细胞在特定培养条件下保持在未分化状态。除去这些条件导致作为经历自发原肠胚形成(spontaneous gastrulation)的细胞范围的胚状体(embryoid bodies, EBs)的形成,造成随机形成经历随机分化的所有胚层的衍生物。经历随机分化的EB表达许多胚胎组织的标记物，包括前部前肠内胚层的标记物。由于前部前肠内胚层由此需要该组织具有除仅表达前部前肠内胚层的标记物以外的额外特性，从而抑制与前部前肠内胚层不相关的细胞命运，或者耗尽定形内胚层的和后部内胚层的(posteriorendodermal)信号，因此需要ES衍生组织的适当分类。用于形成衍生自咽和前部前肠内胚层的组织的方法可通过如下步骤来进行由多能细胞诱导定形内胚层，诱导定形内胚层从而形成前部前肠内胚层，随后进一步分化成例如咽内胚层，以及特化为特定的衍生物。定形内胚层的形成由人ES或iPS细胞形成定形内胚层可通过调整用于由鼠ES细胞发育成定形内胚层的实验步骤来完成。Kubo 等，Development 131:1651-1662 (2004) ;Gadue 等，Proc NatlAcadSci USA 103:16806-16811(2006) ;Gouon_Evans等，NatBiotechnol, 24:1402-1411(2006)。在非组织处理的塑料上用低浓度BMP4(如约0. 5-10ng/ml、如lng/ml)脉冲(pulse)人ES细胞，在低浓度BMP4和bFGF (如约5_20ng/ml、如约10ng/ml)下培养，然后在高浓度活化素A(50_500ng/ml、如75_ 150ng/ml、如约100ng/ml)下培养，从而导致胚状体(EB)的形成。EB几乎一致地由内胚层构成。内胚层的发育可通过CXCR4和c-KIT的表达来证实。通过5天内损失ES标记物、S0X2并顺次获得MIXL1、X0X17和F0ZXA2来完成内胚层的发育。在某些实施方案中，可使用其他多能干细胞代替ES细胞。例如，可使用成体干细胞(如从受试者，如要治疗的受试者的内耳、骨髓、间质、皮肤、脂肪、肝、肌肉或血液中获得的成体干细胞)；胚胎干细胞，或从胎盘或脐带获得的干细胞；祖细胞(如，衍生自内耳、骨髓、间质、肝、肌肉或血液的祖细胞)；和诱导的多能干细胞(如，iP S细胞)。在某些实施方案中，使用iP S细胞(参见，如，Maherali和Hochedlinger, Cell StemCell3:595-605 (2008)) o通常，优选人源细胞。由定形内胚层形成前部前肠内胚层已发现，尽管活化素A诱导内胚层，但活化素A使该组织后部化(posteriorize)。因此，前部前肠内胚层的制备需要在定形内胚层形成后减少或除去活化素A。在某些方面，本发明因而提供形成前部前肠内胚层的富集细胞群，以及耗尽中部内胚层和后部内胚层信号的方法。此群表达存在于前部前肠内胚层的分子标记物，并耗尽存在不存在于前部前肠内胚层的分子标记物。内胚层细胞群的特征和区别在于本领域已知的标记物。在定形内胚层中，ES标记物S0X2作为前部前肠内胚层的标记物而重现，而⑶X2为后部内胚层(后肠)的标记物。将通过活化素A诱导4至5天形成内胚层的细胞延长培养导致CDX2的增加和S0X2的损失，暗示在这些条件下后部化。定形内胚层的前部化(anteriorization)可通过除去或阻断活化素A并添加前部化成形素来完成。优选的前部化成形素为BMP和TGF-P信号传导的抑制齐[J。BMP和TGF-P信号传导的抑制剂可单独或组合使用。优选地，组合使用BMP和TGF-3信号传导的抑制剂。BMP抑制剂的实例为头蛋白、腱蛋白和卵泡抑素。优选的BMP抑制剂为头蛋白。TGF-P 信号传导抑制剂的实例为 Ly364947(SD208)、SM16、SB-505124、SB-431542和抗TGF-P抗体。优选的TGF-P信号传导抑制剂为SB-431542。在优选的实施方案中，使用头蛋白和SB-431542的组合来诱导定形内胚层的前部化。在某些实施方案中，在培养的第4-5天添加头蛋白和SB-431542的组合，从而诱导定形内胚层的前部化。用头蛋白和SB使定形内胚层的前部化可通过例如检测如S0X2、TBXl (咽)、PAX9(咽、胸腺)、F0XP2(肺、呼吸道表皮)、DLX3(食管)、F0XA2(定形内胚层)和/或S0X7(早期内胚层标记物)中的一种或多种的表达；和任选地检测PAX6(外胚层)和/或BRACHYURY(中胚层)的表达缺失·来证实。细朐群在某些实施方案中，本发明因此提供前部前肠内胚层细胞的富集细胞群。前部前肠内胚层的富集群包含至少25%、例如至少50%、至少75%、至少90%、至少95%、至少99%或至少99. 9%的前部前肠内胚层细胞。在某些实施方案中，本发明提供咽内胚层细胞的富集细胞群。咽内胚层的富集群包括至少25%、例如至少50%、至少75%、至少90%、至少95%、至少99%或至少99. 9%的咽内胚
层细胞。在某些实施方案中，本发明提供衍生前部前肠内胚层的方法，所述方法包括在无活化素A下用BMP抑制剂或TGF-P信号传导抑制剂培养定形内胚层。在优选的实施方案中，在无活化素A下用BMP抑制剂和TGF-P信号传导抑制剂二者培养定形内胚层。在某些实施方案中，BMP抑制剂为头蛋白。在本文所述方法的某些实施方案中，头蛋白以约 lng/ml MlOu g/ml、10ng/ml 至 I u g/ml、10ng/ml 至 500ng/ml、lOng/ml 至250ng/ml或lOng/ml至lOOng/ml的浓度存在于培养物中。在优选的实施方案中，头蛋白以约 25ng/ml 至 150ng/ml、50ng/ml 至 150ng/ml 或 75ng/ml 至 150ng/ml 的浓度存在于培养物中。在最优选的实施方案中，头蛋白以约100ng/ml的浓度存在于培养物中。在某些实施方案中，TGF-^抑制剂为SB-431542。在本文所述方法的某些实施方案中，SB-431542 以约 0.1 y m至 ImM、I u MM 100 u MU U MM 500 u MU U MM 250 u I u M至IOOii M的浓度存在于培养物中。在优选的实施方案中，SB-431542以约5 y M至250 y M、5iiM至100iiM、5iiM至50iiM或5iiM至25iiM的浓度存在于培养物中。在最优选的实施方案中，SB-431542以约IOiiM的浓度存在于培养物中。另外优选的是其中用于本发明方法的培养物包括浓度约75ng/ml至150ng/ml的头蛋白和浓度约为5 ii M至25 ii M的SB-431542的实施方案。腹侧前部前肠内胚层的诱导源自最前部前肠内胚层的大多数器官如胸腺、甲状旁腺、气管和肺源自于前部前肠内胚层的腹侧或腹外侧面。
可通过用Wnt信号传导、FGF信号传导、BMP信号传导和EGF信号传导通路的一种或多种激动剂处理来进一步诱导由头蛋白/SB-431542所诱导的前部前肠内胚层，从而形成腹面发育的前部前肠内胚层。腹侧前部前肠内胚层的有效诱导依赖于用头蛋白/SB-431542的处理。诱导形成腹侧前部前肠内胚层的组织可由例如标记物NKX21和NKX2. 5来鉴定。在某些实施方案中，通过Wnt信号传导、FGF信号传导、BMP信号传导和EGF信号传导通路的两种或多种激动剂的组合来使前部前肠内胚层腹面发育(即，诱导形成腹面发育的前部前肠内胚层)。另外优选的是其中通过fct信号传导、FGF信号传导、BMP信号传导和EGF信号传导通路的两种或多种激动剂；Wnt信号传导、FGF信号传导、BMP信号传导和EGF信号传导通路的三种或多种激动剂；Wnt信号传导、FGF信号传导、BMP信号传导和EGF信号传导通路的四种或多种激动剂；或者fct信号传导、FGF信号传导、BMP信号传导和EGF信号传导通路的五种或多种激动剂的组合来使前部前肠内胚层腹面发育的实施方案。在某些实施方案中，fct信号传导的激动剂为介导典型Wnt信号传导的Wnt3a;可使用典型fct信号传导的任何诱导物，例如，Wnt/P-联蛋白通路激动剂糖原合成酶激酶30 (GSK3b)抑制剂或酪蛋白激酶(CKl)抑制剂。fct激动剂的非限制性实例包括编码P -联蛋白的DNA(如，编码￠-联蛋白的裸DNA、编码P -联蛋白的质粒表达载体、编码￠-联蛋白的病毒表达载体)、￠-联蛋白多肽、一种或多种fct/P-联蛋白通路激动剂(如，选自由 fct 配体、DSH/DVL-1, -2，-3、LRP6N、WNT3A、WNT5A 和 WNT3A, 5A 组成的组)、一种或多种糖原合成酶激酶3 0 (GSK3b)抑制剂(如，选自由以下物质组成的组氯化锂(LiCl)、Purvalanol A,奥罗莫星(olomoucine)、阿尔斯特保龙(alsterpaullone)、肯保龙(kenpaullone)、节基 _2_ 甲基-1，2，4_ 噻二唑烧(thiadiazolidine)_3，5_ 二酮(TDZD-8)、2-硫代(3-碘代苄基)-5-(1-吡啶基)-[1，3，4]-噁二唑(GSK3抑制剂II)、2，4-二苄基-5-氧噻二唑烷-3-硫酮(OTDZT)、(2' Z，3 ' E)_6_ 溴靛红-3'-肟(BIO)、a -4- 二溴苯乙酮(即，Tau蛋白激酶I (TPK I)抑制剂)、2_氯-1-(4, 5_ 二溴-硫苯-2-基)-乙酮、N-(4-甲氧基苄基)-N' -(5-硝基-1，3-噻唑-2-基)脲(AR-A014418)、靛红-5-磺酰胺；靛红-5-磺酸(2-羟乙基)-酰胺靛红-3’ -单肟；5-碘-靛红-3’ -单肟；5_氟靛红；5，5’ - 二溴靛红；5_硝基靛红；5_氯靛红；5_甲基靛红、5-溴靛红、4-苄基-2-甲基-1，2，4-噻二唑烷-3，5- 二酮(TDZD-8)、2-硫代(3-碘代苄基)-5-(1-吡啶基)_[1，3，4]-噁二唑(GSK3抑制剂II) >2, 4- 二苄基_5_氧噻二唑烷_3_硫酮(OTDZT)、(2' Z,3/ E)-6-溴靛红-3'-肟(BIO)、a-4-二溴苯乙酮(即，Tau蛋白激酶I (TPK I)抑制剂)、2_氯-1-(4,5-二溴-硫苯-2-基)-乙酮、(vi)N-(4-甲氧苄基)-N' _(5_硝基-1，3-噻唑-2-基)脲(AR-A014418)、H_KEAPPAPPQSpP_NH2 (L803)和 Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2 (L803-mts))、一种或多种与GSK3mRNA特异性结合的反义RNA或siRNA、一种或多种酪蛋白激酶I (CKl)抑制剂(如，与CKl mRNA特异性结合的反义RNA或siRNA)、一种或多种蛋白酶抑制剂、一种或多种蛋白酶体抑制剂。当将WNT3a用于本文所述方法时，Wnt3a以约 lng/ml MlOu g/ml、10ng/ml 至 I u g/ml、10ng/ml 至 500ng/ml、lOng/ml 至 250ng/ml或lOng/ml至lOOng/ml的浓度存在于培养物中。在优选的实施方案中，Wnt3a以约25ng/ml至150ng/ml、50ng/ml至150ng/ml或75ng/ml至150ng/ml的浓度存在于培养物中。在进一步优选的实施方案中，fct3a以约100ng/ml的浓度存在于培养物中。
在优选的实施方案中，使用FGF信号传导的激动剂，例如FGF7、FGF9或FGF10。为了用于本文所述方法，FGF7 或 FGFlO 以约 lng/ml 至 10 y g/ml、10ng/ml 至 I ii g/ml、IOng/ml至500ng/ml、10ng/ml至250ng/ml或lOng/ml至lOOng/ml的浓度存在于培养物中。在优选的实施方案中，FGF7 或FGFlO 以约 25ng/ml 至 150ng/ml、50ng/ml 至 150ng/ml 或 75ng/ml至150ng/ml的浓度存在于培养物中。在最优选的实施方案中，FGF7和FGFlO 二者均以约10ng/ml的浓度存在于培养物中。在某些实施方案中，可使用FGF信号传导的其他激动剂，例如 FGF1、2、3、5、6、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22 或 23。在优选的实施方案中，EGF信号传导的激动剂为EGF。为了用于本文所述方法，EGF以约 lng/ml MlOu g/ml、10ng/ml 至 I u g/ml、10ng/ml 至 500ng/ml、lOng/ml 至 250ng/ml或lOng/ml至lOOng/ml的浓度存在于培养物中。在优选的实施方案中，EGF以约25ng/ml至150ng/ml、50ng/ml至150ng/ml或75ng/ml至150ng/ml的浓度存在于培养物中。在最优选的实施方案中，EGF均以约20ng/ml的浓度存在于培养物中。在优选的实施方案中，BMP信号传导的激动剂为BMP-4，尽管在某些实施方案中可使用另外的BMP，例如BMP-1至-20中的任一种，如BMP 2-7中的任一种。为了用于本文所述方法,BMP-4 以约 lng/ml 至 10 u g/ml、10ng/ml 至 I u g/ml、10ng/ml 至 500ng/ml、10ng/ml至250ng/ml或lOng/ml至lOOng/ml的浓度存在于培养物中。在优选的实施方案中，BMP-4以约 25ng/ml 至 150ng/ml、50ng/ml 至 150ng/ml 或 75ng/ml 至 150ng/ml 的浓度存在于培养物中。在最优选的实施方案中，BMP-4均以约10ng/ml的浓度存在于培养物中。在最高度优选的实施方案中，？6 7、？6 1036 、81^-4和1社3&分别以10、10、20、10和100ng/ml的浓度存在。来自腹面发育的内胚层的早期肺标记物的诱导可通过用维甲酸(RA)与选自由Wnt配体、Wnt信号传导激活剂、BMP、表皮生长因子(EGF)和成纤维细胞生长因子组成的组的一种或多种因子的组合处理来诱导表达肺标记物GATA6的腹面发育的前部 前肠内胚层。在某些实施方案中，通过在Wnt3a、FGF10、FGF7、BMP4、EGF和RA的存在下培养定形内胚层来促进肺标记物的诱导(例如，表达肺标记物的细胞或组织的形成)。在优选的实施方案中，维甲酸为全反式-反式维甲酸(ATRA)。为了用于本文所述方法，ATRA 以约 InM 至 10iiM、lnM 至 100iiM、5nM 至 10iiM、5nM 至 liiM、50nM 至 I y M 和IOOnM至5 ii M的浓度存在于培养物中。在优选的实施方案中，ATRA以约IOOnM至I y M或Iii M至5 ii M的浓度存在于培养物中。在最优选的实施方案中，ATRA以约I U M的浓度存在于培养物中。在某些实施方案中，将ATRA与上述因子组合使用，从而诱导更偏向与咽区相对的肺野的腹侧前部前肠。末端肺标记物SP-C的诱导继续用Wnt3a、FGF10、FGF7、BMP4、EGF和RA处理到第19天，产生低水平的末端肺泡II型细胞标记物SP-C。当在第11天时将这些因子替换为Wnt3a、FGF7和FGFlO时实现了 SP-C的最佳表达。在优选的实施方案中，在RA与两种或多种fct信号传导、FGF信号传导和BMP的激动剂组合的存在下由腹面发育的前部前肠内胚层诱导末端肺标记物SP-C。在某些实施方案中，Wnt信号传导的激动剂为Wnt3a ;还可如本文所述使用其他激动剂。为了用于本文所述方法，Wnt3a 以约 lng/ml M 10 u g/ml、10ng/ml Mlu g/ml、10ng/ml至500ng/ml、lOng/ml至250ng/ml或lOng/ml至lOOng/ml的浓度存在于培养物中。在优选的实施方案中，Wnt3a 以约 25ng/ml 至 150ng/ml、50ng/ml 至 150ng/ml 或 75ng/ml 至150ng/ml的浓度存在于培养物中。在进一步优选的实施方案中，Wnt3a以约100ng/ml的浓
度存在于培养物中。在某些实施方案中，FGF信号传导的激动剂为FGF7或FGFlO ;如本文所述还可使用其他激动剂。为了用于本文所述方法，FGF7或FGFlO以约lng/ml至10 y g/ml、10ng/ml至I u g/ml> 10ng/ml 至 500ng/ml、10ng/ml 至 250ng/ml 或 10ng/ml 至 100ng/ml 的浓度存在于培养物中。在优选的实施方案中，FGF7或FGFlO以约25ng/ml至150ng/ml、50ng/ml至150ng/ml或75ng/ml至150ng/ml的浓度存在于培养物中。在最优选的实施方案中，FGF7和FGFlO均以约10ng/ml的浓度存在于培养物中。在最高度优选的实施方案中，FGF7、FGFlO和Wnt3a分别以10、10和100ng/ml的
浓度存在。特异性甲状旁腺标记物GCMB的诱导当在Wnt3a、FGF 10、FGF7、BMP4、EGF的存在下使前肠内胚层腹面发育，随后在第11天除去这些因子并添加SHH、FGF 8或者二者时实现了由腹面发育的前肠内胚层诱导特异性甲状旁腺标记物。在优选的实施方案中，通过SHH和FGF8信号传导的一种或多种激动剂的组合，由腹面发育的前肠内胚层诱导特异性甲状旁腺标记物SP-C。在优选的实施方案中，SHH信号传导的激动剂为SHH。为了用于本文所述方法，SHH以约 lng/ml MlOu g/ml 、10ng/ml 至 I u g/ml、10ng/ml 至 500ng/ml、lOng/ml 至 250ng/ml或lOng/ml至lOOng/ml的浓度存在于培养物中。在优选的实施方案中，SHH以约25ng/ml至150ng/ml、50ng/ml至150ng/ml或75ng/ml至150ng/ml的浓度存在于培养物中。在进一步优选的实施方案中，fct3a以约100ng/ml的浓度存在于培养物中。在优选的实施方案中，FGF信号传导的激动剂为FGF8。为了用于本文所述方法，FGF8 以约 lng/ml 至 10u g/ml、10ng/ml 至 I U g/ml>10ng/ml 至 500ng/ml、10ng/ml 至250ng/ml或lOng/ml至lOOng/ml的浓度存在于培养物中。在优选的实施方案中，FGF8以约 25ng/ml 至 150ng/ml、50ng/ml 至 150ng/ml 或 75ng/ml 至 150ng/ml 的浓度存在于培养物中。在最优选的实施方案中，FGF8均以约10ng/ml的浓度存在于培养物中。在最高度优选的实施方案中，FGF8和SHH分别以10和100ng/ml的浓度存在。筛诜方法在某些实施方案中，本发明提供一种影响前部前肠内胚层细胞的增殖、分化或存活的试剂的鉴别方法。所述方法包括在要试验试剂的存在下培养前部前肠内胚层细胞的富集群，并比较所述细胞在所述试剂存在和不存在时的增殖、分化或存活，其中在所述试剂存在下的差异表示鉴别出影响所述细胞增殖、分化或存活的试剂。在某些实施方案中，本发明提供一种参与细胞分化的基因的鉴别方法。所述方法包括分离定形内胚层细胞和前部前肠内胚层细胞，并比较所述定形内胚层细胞和所述前部前肠内胚层细胞的基因表达谱，其中鉴别出在所述定形内胚层细胞和所述前部前肠内胚层细胞之间差异表达的基因表示参与细胞分化的基因。测定基因谱的方法是本领域公知的。
在某些实施方案中，本发明提供一种抗体的鉴别方法，所述抗体识别从定形内胚层向前部前肠内胚层发展的分子标记物。所述方法包括将抗体温育于前部前肠内胚层细胞的富集群，并筛选出与所述前部前肠内胚层细胞的结合显著高于与所述定形内胚层的结合的抗体。温育和筛选抗体的方法是本领域内公知的。优选的抗体为单克隆抗体。细胞替代疗法在形成细胞替代疗法用细胞或组织，从而治疗因由其衍生的组织的损害或缺失所引起的病况中，通过本文所述方法由多能细胞衍生的前部前肠内胚层是有用的，所述病况诸如，例如但不限于，由于遗传突变、自身免疫攻击或手术移除(如甲状腺机能亢进或甲状腺癌)所引起的甲状腺无功能(甲状腺功能减退)或者由于遗传因素或者在手术消融后产生的甲状旁腺功能减退；肺损伤；如由同种异体造血干细胞移植(HSCT)所引起的胸腺表皮损伤或由于先天性疾病(迪乔治综合症(Digeorgesyndrome)和Nude/SCID综合症)而缺失胸腺表皮。在某些实施方案中，细胞如通过本文所述方法衍生自ES或Ip sz细胞的胸腺上皮细胞(TEC)还可改善人源化小鼠模型(图l·e)。免疫中的主要挑战是建立具有人类免疫系统的小鼠模型。目前，最佳模型为由人脐带血造血干细胞和祖细胞新生移植的免疫缺陷型Ragl+ilr2g+或NOD-SCIDilr2g+小鼠。在该小鼠中，所有主要造血血统(hematopoieticlineage)均被重构，甚至次淋巴器官的结构也类似“人类”的。然而，除了同种异体反应性以外，人的T细胞应答弱，且外周T细胞的内稳态异常(Manz，Immunity. 26:537-541 (2007)；Traggiai 等人，Science. 304:104-107 (2004) ；Legrand 等人，Methods MolBiol. 415:65-82 (2008) ；Gimeno 等人，Blood. 104:3886-3893 (2004))。该具有更强 T 细胞活性的改进模型为BLT小鼠(Lan等人，Blood. 2006;108:487-492 ;Melkus等人NatMed. 12:1316-1322(2006)) o 这是NOD—SCIDilrfg+小鼠，其在肾包膜(kidney capsule)下移植有人胎儿胸腺和肝，随后移植有胎儿肝脏CD34+祖细胞。在这些小鼠中，观察到先天以及限于MHC I和II型的T细胞依赖性免疫应答。有趣的是，所有T细胞的发育均发生在移植人胸腺中，而不是在内源小鼠胸腺中。这些数据表明，人胸腺组织的存在对于开发人源化小鼠可能是关键的。结果就是，TEC是胸腺的必要组分，ES或iPS衍生的TEC还可用于构建改进的人源化小鼠。此外，通过使用患者特异性iPS细胞，可以在小鼠模型中获取人的疾病易感性中的某些遗传多样性和免疫应答。最终，iPS技术将允许同源人类组织的共移植。在此类小鼠中，可研究在自身免疫或感染时的器官或组织特异性免疫应答，或者可试验疫苗。作为一个实例，自身免疫或免疫介导的疾病的小鼠模型可通过向免疫缺陷小鼠移植如本文所述衍生的骨髓干细胞和TEC(如，来自皮肤细胞衍生的iPS细胞)来构建，两种细胞均来自患有自身免疫或免疫介导的疾病(如，风湿性关节炎、糖尿病、多发性硬化症、牛皮癣或结肠炎)的人类受试者。在某些实施方案中，骨髓干细胞和TEC 二者均来自同一受试者，而在某些实施方案中，它们来自不同的受试者。骨髓血干细胞将进入人源胸腺，并在此制备T细胞。这可用于在小鼠中模拟自身免疫性疾病(以及任何其他免疫介导的疾病)。在某些实施方案中，所述方法进一步包括移植源自人类自身免疫靶组织(如，糖尿病中的胰岛)的iPS。实施例在以下实施例中进一步描述本发明，但这些实施例不限制权利要求书中所述的本发明的范围。实施例1.来自人类胚胎和诱导的多能干细胞的前部前肠内胚层的形成将以下材料和方法用于该实施例。细胞和培养条件。在以8，000-12, 000个细胞/cm2铺板的鼠胚胎成纤维细胞上培养hESC(HES2，国立卫生研究院代码ES02，来自ES细胞国际组织；传代25 - 33)。每日更换DMEM/F12、20%敲除血清替代物(Gibco)、0.1mM 疏基乙醇(Sigma-Aldrich)和 20ng/ml的FGF-2(R&D)的培养基。用胰蛋白酶，洗涤并以1:5至1:10的稀释度重新铺板来传代细胞。如hES2 —样培养HDF2和HDF9 (hiPS细胞系)。将hES和hiPS培养物保持在5%C02/空气的环境中，并将hES分化物保持在5%C02/5%02/90%N2的环境中。内胚层诱导。通过在含有Y-27632 (IOiiM)的Matrigel (Gibco)上传代24h来耗尽小鼠胚胎成纤维细胞，并在低粘附盘(low-adherence dishes, Costar)上形成胚状体。在胚状体形成和分化期间，以相同浓度(1:1稀释)重新接种J1ES2细胞，而HDF和HDF 9需要较高接种(2:1-4:1浓度)以便有效地形成内胚层。在补充有N2 (Gibco)、B27 (Gibco)、抗坏血酸(5O u g/ml, Sigma)、Glutamax (2mM, Invitrogen)、单硫代甘油(0. 4 u M, Sigma)的 DMEM/F12 (Invitrogen)培养基中进行分化。将以下浓度的因子用于初始划线(primitive streakformation)、内胚层诱导、前部内胚层/咽内胚层诱导和随后的前后部及背腹模式形成人 BMP-4, lng/ml 和 10ng/ml ; AbFGF, 2. 5ng/ml ;人活化素 A, 100ng/ml ;人头蛋白，200ng/ml ；Y-27632, I u M ； SB-431542, IOuM ； A FGF10, lOng/ml ；人 FGF7, lOng/ml ；鼠 EGF, 20ng/ml ;和人 WNT3a，100ng/ml。肝脏条件如前所述，并包含 BMP-4，50ng/ml ；bFGF, lOng/ml ；VEGF, lOng/ml ；HGF, lOng/ml ；TGF a , 20ng/ml ;地塞米松，40ng/ml。除了购自 Toc ris 的SB-431542和Y-27632和地塞米松(Sigma)以外所有因子均购自R&D systems。按如下顺序添加因子 第I天，Y-27632 ;第1-5天，BMP4、bFGF和活化素A ;第5_9天，头蛋白和SB-431542 ;第7-19天，WNT3a、FG F10、BMP4、FGF 7和EGF。对于肝分化，按如下顺序添加因子■ 第I天，Y-27632 ;第1-5天，BMP4、bFGF和活化素A ;第5_9天，地塞米松、bFGF、HGF、VEGF, EGF、TGFa和BMP4 。 对于某些实验，将500 u M全反式维甲酸(Sigma)添加到培养物中。在第5天，胰蛋白酶(Gibco)化胚状体，并以10，000-50，000个细胞/cm2铺板到明胶涂布的组织培养-处理盘(Fisher)上。第11天成形素的筛选(Fig. 2h)包括成对和较高数量级地添加FGF(FGF10+FGF7)(R&D Systems)、SU-5402 (EMDChemicals)、Wnt5a (R&D Systems)、WNT3a (R&D Systems) >sFRPl (R&D Systems)、BMP4、头蛋白、SHH (R&D Systems)、环巴胺(EMD Chemicals)、SB-431542, TGF-^ I (R&D Systems)、DAPT (EMD Chemicals)、维甲酸(Sigma)、DEAB (Sigma)、EGF (R&D Systems)、酪氨酸憐酸化抑制剂(tyrophastin) AG-1478 (EMD Chemicals)和WPI066(EMD Chemicals)。定量PCR。使用 Trizol (Invitrogen)，相锁管(phase lock tubes) (5 '已接触抗原(Prime))和 RNeasy 试剂盒(Qiagen)提取总 RNA。用 DNase I (Qiagen)处理1-2 y g总RNA,并使用随机六聚体和Superscript III (Invitrogen)将其反转录。使用 SybrGreen(Invitrogen)检测扩增物。在 ABI 7900HT 热循环仪(thermocycler)(Applied Bio systems)上进行实时定量PCR，程序为95°C IOmin的步骤，随后95°C，15s和60°C , lmin,40个循环。所有实验用SYBR GreenER定量PCR超混合物(quantitativePCRSuperMix) (Invitrogen)进行三次。将各基因的变性曲线用于证实DNA产物的同质性(homogeneity)。根据基因组DNA稀释系列的标准曲线获得绝对定量。参照通过持家基因GAPDH和￠-肌动蛋白测定的内参(input)使目标基因的定量值标准化。各培养孔的qPCR进行三次。引物序列示于表I。表1.基因正向引物 (5' -3')和反向引物(5' -3')
权利要求
1.一种前部前肠内胚层细胞的富集细胞群。
2.根据权利要求1所述的细胞群，其包括至少约50%的前部前肠内胚层细胞。
3.根据权利要求1或2所述的细胞群，其中所述前部前肠内胚层细胞为咽内胚层细胞。
4.一种衍生前部前肠内胚层细胞的方法，所述方法包括用BMP抑制剂或TGF-P信号传导抑制剂培养定形内胚层细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其包括用所述BMP抑制剂和所述TGF-P信号传导抑制剂培养所述定形内胚层细胞。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中在无活化素A下培养所述定形内胚层。
7.根据权利要求4-6任一项所述的方法，其中所述BMP抑制剂为头蛋白、腱蛋白或卵泡抑素。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述BMP抑制剂为头蛋白。
9.根据权利要求4-8任一项所述的方法，其中所述TGF-P信号传导抑制剂为SB431542。
10.根据权利要求4-6任一项所述的方法，其中所述BMP为头蛋白，所述TGF-P信号传导抑制剂为SB-431542。
11.根据权利要求4-10任一项所述的方法，其中所述定形内胚层细胞为胚状体细胞。
12.根据权利要求4-11任一项所述的方法，其进一步包括在活化素A中培养所述定形内胚层细胞。
13.根据权利要求4-12任一项所述的方法，其中在无活化素A下用所述BMP抑制剂和所述TGF-P信号传导抑制剂培养所述定形内胚层细胞。
14.根据权利要求4-13任一项所述的方法，其中所述前部前肠内胚层细胞为人类细胞。
15.根据权利要求4-14任一项所述的方法，其中所述前部前肠内胚层细胞衍生自多能细胞。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述多能细胞为ES细胞。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述多能细胞为iPS细胞。
18.根据权利要求15-17任一项所述的方法，其中所述多能细胞为人类细胞。
19.根据权利要求4-18任一项所述的方法，其中所述前部前肠内胚层细胞表达Foxa2，与在所述定形内胚层细胞中Sox2和Cdx2的表达相比，其包括升高的Sox2表达水平和降低的Cdx2表达水平。
20.一种由多能细胞制备前部前肠内胚层细胞的富集群的方法，其包括 (i)在诱导所述多能细胞形成定形内胚层细胞的条件下培养所述多能细胞；和 (ii)在诱导所述定形内胚层细胞形成所述前部前肠内胚层细胞的条件下培养所述定形内胚层细胞，从而制备所述前部前肠内胚层细胞的富集群。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述多能细胞在bFGF、BMP4和活化素A的存在下培养，从而诱导所述多能细胞形成所述定形内胚层细胞。
22.根据权利要求20-21任一项所述的方法，其中所述定形内胚层细胞在BMP抑制剂或TGF-^信号传导抑制剂的存在下和在无活化素A下培养，从而诱导所述定形内胚层细胞形成所述前部前肠内胚层细胞。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述定形内胚层细胞在所述BMP抑制剂和所述TGF-^信号传导抑制剂的存在下和在无活化素A下培养，从而诱导所述定形内胚层细胞形成所述前部前肠内胚层细胞。
24.根据权利要求22或23所述的方法，其中所述BMP抑制剂为头蛋白或腱蛋白。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述BMP抑制剂为头蛋白。
26.根据权利要求22-25任一项所述的方法，其中所述TGF-P信号传导抑制剂的抑制剂为 SB-431542。
27.根据权利要求20-26任一项所述的方法，其中将所述多能细胞培养1-4天。
28.根据权利要求20-27任一项所述的方法，其中将所述定形内胚层细胞为培养2-6天的细胞。
29.根据权利要求20-28任一项所述的方法，其进一步包括分离所述前部前肠内胚层细胞。
30.根据权利要求20-29任一项所述的方法，其中所述多能细胞为ES细胞。
31.根据权利要求20-29任一项所述的方法，其中所述多能细胞为iPS细胞。
32.根据权利要求30或31所述的方法，其中所述多能细胞为人类细胞。
33.一种前部前肠内胚层细胞，其由权利要求4-19任一项所述的方法衍生。
34.一种前部前肠内胚层细胞的富集群，其通过权利要求20-32任一项所述的方法制备。
35.一种影响前部前肠内胚层细胞增殖、分化或存活的试剂的鉴别方法，其包括在要试验的试剂存在下培养权利要求1-3任一项所述的细胞群，并比较所述细胞在所述试剂存在和不存在下的增殖、分化或存活，其中在所述试剂存在下的差异表示鉴别出影响所述细胞增殖、分化或存活的试剂。
36.一种参与细胞分化的基因的鉴别方法，其包括分离定形内胚层细胞和前部前肠内胚层细胞，并比较所述定形内胚层细胞和所述前部前肠内胚层细胞的基因表达谱，其中鉴别出在所述定形内胚层细胞和所述前部前肠内胚层细胞之间差异表达的基因表示参与细胞分化的基因。
37.一种抗体的鉴别方法，所述抗体识别从定形内胚层向前部前肠内胚层发展的分子标记物，所述方法包括将抗体温育于权利要求1所述的富集细胞群，并筛选出与所述前部前肠内胚层的结合显著高于与所述定形内胚层的结合的抗体。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述抗体不能显著结合到所述定形内胚层。
39.根据权利要求1-3任一项所述的细胞群，其中所述前部前肠内胚层细胞为腹面发育的前部前肠内胚层细胞。
40.一种诱导前部前肠内胚层腹面发育的方法，其包括用选自由Wnt配体、Wnt信号传导激活剂、BMP、表皮生长因子(EGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)组成的组中的一种或多种因子来培养所述前部前肠内胚层。
41.根据权利要求40所述的方法，其包括用选自由Wnt配体、Wnt信号传导激活剂、BMP、表皮生长因子(EGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)组成的组中的两种或多种因子来培养所述前部前肠内胚层。
42.根据权利要求40或41所述的方法，其中所述因子选自由FGF7、FGFlO、EGF、BMP-4和Wnt3a组成的组。
43.一种在细胞中诱导肺命运的方法，其包括在维甲酸的存在下用选自由Wnt配体、Wnt信号传导激活剂、BMP、表皮生长因子(EGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)组成的组中的一种或多种因子来培养通过权利要求4-32任一项所述的方法所产生的前部前肠内胚层细胞，从而诱导所述腹面发育的前部前肠内胚层细胞呈现所述肺命运。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述呈现所述肺命运细胞的细胞表达一种或多种肺标记物。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述一种或多种肺标记物为Gata6或表面活性蛋白 C (SP-C)。
46.根据权利要求43所述的方法，其中通过用选自由Wnt配体、Wnt信号传导激活剂、BMP、表皮生长因子(EGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)组成的组中的一种或多种因子培养前部前肠内胚层来诱导所述腹面发育的前部前肠内胚层细胞。
47.根据权利要求46所述的方法，其中通过用选自由Wnt配体、Wnt信号传导激活剂、BMP、表皮生长因子(EGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)组成的组中的两种或多种因子培养前部前肠内胚层来诱导所述腹面发育的前部前肠内胚层细胞。
48.根据权利要求47所述的方法，其中通过用选自由Wnt配体、Wnt信号传导激活剂、BMP、表皮生长因子(EGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)组成的组中的两种或多种因子培养前部前肠内胚层来诱导所述腹面发育的前部前肠内胚层细胞。
49.一种在细胞中诱导甲状旁腺命运的方法，其包括用音猬因子(SHH)和成纤维细胞生长因子(FGF)培养腹面发育的前部前肠内胚层细胞。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述呈现所述甲状旁腺命运细胞的细胞表达甲状旁腺标记物。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述甲状旁腺标记物为GCMB。
全文摘要
本发明涉及诱导前部前肠内胚层分化的活体外方法，以及通过该方法生产的前部前肠内胚层富集群。此类富集群对于研究分化期间发生的分子事件以及对于产生细胞替代治疗用细胞是有用的。
文档编号C12N5/07GK103068970SQ201180031569
公开日2013年4月24日 申请日期2011年4月25日 优先权日2010年4月25日
发明者汉斯-威廉·斯诺克, M·格林 申请人:西奈山医学院