专利名称：增强免疫反应的人半乳凝素-9缺失体的制备及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白制备方法以及应用。具体而言，该蛋白是一种人半乳凝素-9 的缺失体，由人半乳凝素_9的C端的129个氨基酸序列所组成，通过钓取人半乳凝素_9的 C端基因，构建其原核表达系统，分离纯化而制备。所述蛋白具备促进DC细胞及巨噬细胞活 化功能，表现为增强细胞免疫反应，而缺失了人半乳凝素-9全蛋白的免疫抑制作用。所述 蛋白可以应用于抗病毒、抗感染药品的生产中。
背景技术：
半乳凝素(galectin)存在于各种生物体内，不仅分布于细胞核，也分布于细胞质 乃至细胞外基质。人半乳凝素-9(Gal-9)作为家族成员之一，除了能诱导嗜酸粒细胞聚集 和活化外，还介导细胞分化、凋亡、黏附、细胞间聚集、炎症反应的调控和肿瘤转移等。编码 Gal-9的基因于人类染色体定位在17ql 1. l，包含11个外显子，转录本长度约为1. 7kb。其 编码蛋白大约为36kDa，包含两个同源的糖识别结构域(cabohydraterecognition domain, CRD)，两者由一条肽链将其相连[Lipkowitz MS， Leal-Pinto E，Cohen BE，et al. galectin 9 is the sugar-regulatedurate transporter/channel UAT[J]. Glycoconj J，2004， 19(7-9) :491-498.]。 Gal_9在组织中分布广泛，已在人的肝脏、小肠、胸腺、肾脏、脾脏、肺 脏、心肌和骨骼肌等组织内发现。 通过结合表达于不同细胞表面的Tim-3分子，Gal_9蛋白分别发挥促进非特 异性免疫反应及下调特异性免疫应答的双向调节作用。具体的作用机制包括Gal-9分 子一方面在免疫反应初始阶段通过促进DC等炎症细胞的活化增强免疫反应、而另一方 面在免疫反应效应阶段通过抑制Thl细胞活性而双向调节体内的免疫反应[Nobumoto A， Galectin—9expandsunique macrophages exhibiting plasmacytoid dendritic cell_likephenotypes that activate NK cells in tumor—bearing mice. Clinlmm皿ol.; 130(3) :322-30. Anderson AC， Promotion of tissueinflammation by the immune receptor Tim_3 expressed on innateimmune cells. Science.2007 ;318 (5853): 1141-3. ] 。 Gal-9通过表达于DC、巨噬细胞等炎症细胞以及活化的T细胞表面的Tim_3分子 发挥作用。在自身免疫病中，Gal-9/Tim-3分子可以通过抑制T细胞的活性而缓解疾病的进 禾呈[Chou FC. Attenuation of Thl response through galectin_9and T-cell Ig mucin 3 interaction inhibits autoimmune diabetes inNOD mice. Eur J Immunol. 2009.]，但在 用外源Gal-9干预的过程中也存在激活体内炎症细胞的潜在危害；另一方面，Gal-9/Tim-3 相互作用可以通过增强DC细胞活性促进抗病毒及抗肿瘤免疫，但Gal-9/Tim-3对T细胞的 抑制则可能促进肿瘤或病毒的免疫逃避[Sharvan Sehrawat. Role of Tim-3/Galectin_9 Inhibitory Interaction in Viral-Inducedlmmimopathology :Shifting the Balance toward Regulators. Thejournal of Immunology,2009，182 :3191.Jihe ne Klibi. Blooddiffusion and Thl-suppressive effects of galectin_9_containingexosomes released by Epstein_Barr virus—infected nasopharyngealcarcinoma cells.
3Blood.2009 ; 113 :1957.Keiko Nagahara， Galectin—9Increases Tim_3+Dendritic Cells and CD8+T Cells and EnhancesAntit咖or Immunity via Galectin_9_Tim_3 Interactions. The Jo證alof Immunology, 2008， 181 :7660. ] 。 Gal_9分子的双向调节作 用为该分子的应用带来不便。 我们通过对Gal-9的结构进行分析，分别表达了人Gal_9蛋白(Gal_9蛋白)及由 人Gal-9的C端序列构成的缺失体(Gal-9C蛋白)，并对其功能进行了对比研究，我们首次 发现了 Gal-9C蛋白不再具有介导T细胞凋亡而表现的抑制免疫反应的作用，而仅仅保留了 其促进DC及巨噬细胞活化，增强免疫反应的功能。这表明在特定的环境下，用Gal-9C蛋白 进行免疫干预只会特异性激活体内的炎症细胞促进免疫反应，而不在具有下调免疫应答的 副作用。基于我们的研究，我们表达并纯化了大量的Gal-9C蛋白，为抗病毒免疫等需要增 强免疫反应的免疫干预治疗提供了新的产品。
图1为Gal-9C蛋白与Gal-9蛋白对DC细胞激活作用图；
图2为Gal-9C蛋白与Gal-9蛋白对巨噬细胞激活作用图；
图3为Gal-9C蛋白与Gal-9蛋白诱导CD4T细胞凋亡
发明内容
为了更好的开发Gal-9的生物学效能，本发明一方面提供了一种提高免疫调节能 力的人Gal-9C蛋白，它是人半乳凝素-9的C端序列，长度为129氨基酸。在一个较佳的实 例中，所述的蛋白具有SEQ ID NO :7所示的氨基酸序列，所述的DNA序列具有SEQ ID NO :5 所示的DNA序列。 本发明提供了含有本发明所述的DNA序列的表达载体。本发明也提供了含有本发 明所述表达载体所转化的宿主细胞。在一个较佳的实例中，所述的主细胞是大肠杆菌或者 酵母细胞。 本发明提供了所述蛋白的新用途。该用途与人Gal-9全蛋白的功能发生了改变， 具体而言，人Gal-9全蛋白既有免疫增强作用，又有免疫抑制作用；而人Gal-9C蛋白只具备 增强免疫作用，而缺失了人半乳凝素_9全蛋白的免疫抑制作用。。 本发明的优点在于所述的Gal-9C蛋白具备促进DC细胞及巨噬细胞活化作用而 不再介导T细胞凋亡，Gal-9C蛋白的制备过程中，将人Gal-9全蛋白进行了改造，得到了可 以用做提高免疫力的潜在蛋白药物。
具体实施方案 下面结合具体的实施例，进一步阐述本发明。下面实施例中未表明具体条件的试 验方法，通常按照常规的条件。 实施例1目的基因的获得与原核表达系统的构建
1)基因调取 根据基因序列以及PET-32a载体的酶切位点，采用Sac 1、Xho I双酶切位点，钓取 PCR Gal-9C与Gal-9，设计基因引物如下
Gal-9C Ps :5， -ccggaattcttcatcaccacc-3， (SEQ ID NO :1) Gal_9C Pa :5， _ccgctcgagctatgtctgcacatggg_3， (SEQ ID NO :2) Gal_9 Ps :5， _ccggaattcgccttcagcggttcccagg_3， (SEQ ID NO :3) Gal_9 Pa :5， _tccagctgacccatgtgcagacataggg_3， (SEQ ID NO :4) 引物合成后，以人外周血单核细胞中提取的总RNA反转录生成的cDNA为模板，
钓取上述两段基因(SEQ ID NO :5以及SEQ ID NO :6) 。 PCR循环条件设置为94°C 5min ;
94°C 30s，60。C 30s，72。C 50s，循环35次；72。C 7min，4。C hold。 2)基因克隆 小量提取PET-32a质粒，用Sac I、 Xho I限制性内切酶将PET_32a质粒与调取的 目的基因Gal-9C与Gal-9各自双酶切，酶切条件37。C过夜(约12h)，将双酶切后回收的 载体与目的基因连接，将连接后含有目的基因的质粒载体转化入Top 10感受态细菌，用含 氨苄抗性的LB平板培养基涂板，37t:过夜培养，挑取单克隆测序；将测序完全正确的单克 隆菌提取质粒，转化入BL-21感受态大肠杆菌。
实施例2蛋白质的表达纯化
1)菌体的培养 挑取单克隆，活化后接种入大量LB液体培养基，置于37t:摇床中3、4小时，直至培 养基0D值约为0. 6时进行目的蛋白的诱导表达。诱导条件为Gal-9 :室温(25°C ) 、0. 05mM IPTG、1L LB液体培养基;Gal-9C :室温(25°C ) 、0. lmM IPTG。
2)蛋白分离纯化 诱导十二个小时左右，收集菌体(7000rpm、5mins)，将表达两种蛋白的菌体分别用 PBS重悬后，放入液氮冻融两、三次，再加入少量溶菌酶(fC、l小时)尽量使菌体裂解，最后 超声破碎(每次IO分钟，共两次)。离心(10000rpm、10mins)取上清过滤后上镍柱纯化。 将过滤后上清用不含杂蛋白的镍柱上柱，之后用平衡液(20mM PBS+500mM NaClpH :7. 8)洗 掉杂蛋白，然后依次用20mM进一步洗掉杂蛋白，200mM咪唑进行洗脱，收集目的蛋白。
实施例3蛋白质功能验证
1) Gal-9与Gal-9C促炎检测 分别用人DC细胞以及巨噬细胞分别与不同浓度的含有Gal-9蛋白的样本与含有 Gal-9C蛋白的样本，在37t:共孵育12_24h，收集细胞培养上清，ELISA法检测TNF-a分泌情 况。ELISA结果如图1与图2 :Gal-9与Gal_9C均能促进炎性因子分泌。
2) Gal-9与Gal_9C诱导T细胞凋亡检测 将人的淋巴细胞用Gal-9与Gal-9C两种蛋白分别共孵育4小时后将细胞用 Annexin V_PE以及CD4-FITC染色，检测CD4+T细胞的凋亡情况。流式检测结果如图3 :Gal-9 有明显的诱导CD4+T细胞凋亡作用。 上述两个结果表明，Gal-9既有提高免疫力，又具有抑制免疫力的作用；而Gal-9C 仅仅保留了提高免疫力的作用。 上述实施例仅供说明本发明之用，而并非是对本发明的限制，有关技术领域的普 通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以作出各种变化和变型，因此所 有等同的技术方案也应属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由各权利要求限定。
〈110〉中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所
〈120〉增强免疫反应的人半乳凝素_9缺失体的制备及应用〈160>8〈210>1〈211>21<212>廳〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物〈400>1ccggaattct tcatcaccac c〈210〉2〈211>26〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物〈400>2ccgctcgagc tatgtctgca catggg〈210>3〈211>28〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物〈400>3ccggaattcg ccttcagcgg ttcccagg〈210>4〈211>28〈212>DNA〈213>人工序列<220>〈223〉引物〈400>4tccagctgac ccatgtgcag acataggg〈210>5<211>390〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉
6
〈223〉〈400>5ttcatcaccaccattctgggagggctgtacccatccaagtccatcctcctgtcaggcact
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一种增强免疫反应的人半乳凝素-9缺失体的制备方法，该缺失体由人半乳凝素-9蛋白的C端氨基酸序列构成。
2. 根据权利要求1所述的人半乳凝素_9缺失体，其特征在于，所述的缺失体由人半乳 凝素_9蛋白的C端基因序列所编码(SEQ ID NO :5)。
3. —种表达载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的DNA序列。
4. 一种宿主细胞，其特征在于，它被权利要求3所述的表达载体所转化。
5. 根据权利要求3所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞是大肠杆菌或酵母 细胞。
6. 将权利要求1所述的人半乳凝素_9的缺失体应用于提高免疫，所述蛋白具备促进 DC细胞及巨噬细胞活化功能，表现为增强细胞免疫反应。
7. 根据权利要求6所述的一种人半乳凝素_9缺失体应用于提高免疫，其特征在于，所 述蛋白丧失了人半乳凝素_9全蛋白的免疫抑制作用。
全文摘要
本发明公开了增强免疫反应的人半乳凝素-9缺失体的制备方法，含有蛋白DNA序列的表达载体以及用该表达载体转化的宿主细胞。本发明还提供了人半乳凝素-9缺失体在提高细胞免疫方面的应用。所述蛋白具备促进DC细胞及巨噬细胞活化功能，表现为增强细胞免疫反应，而缺失了人半乳凝素-9全蛋白的免疫抑制作用。
文档编号A61P37/04GK101792489SQ200910260048
公开日2010年8月4日 申请日期2009年12月24日 优先权日2009年12月24日
发明者冯健男, 李育蓉, 沈倍奋, 韩根成, 黎燕 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所