生物质加工的制作方法

专利名称：生物质加工的制作方法
生物质加工相关申请本申请要求2010年7月19日提交的美国临时申请号61/365，493的优先权。所述临时申请的全部公开内容以引用方式并入本文。背景纤维素和木质纤维材料在许多应用中大量地生产、加工和使用。这些材料往往使用一次，然后就作为废物丢弃，或直接就被当做废弃材料，例如污水、甘蔗渣、锯屑和秸杆。各种纤维素和木质纤维材料、其用途以及应用已经在美国专利号7，074，918、6，448，307,6, 258，876,6, 207，729,5, 973，035 和 5，952，105 以及各种专利申请中描述，这些专利申请包括“FIBROUS MATERIALS AND COMPOSITES’TCT/US2006/010648 (2006 年 3 月23 日提交)和“FIBROUS MATERIALS AND COMPOSITES”美国专利申请公布号 2007/0045456。概述 —般来讲，本发明涉及含碳材料,诸如含糖材料(例如，生物质材料、生物质衍生材料或几丁质)，尤其是纤维素和木质纤维材料，和糖化含糖材料的生物加工。本文公开的生物加工技术包括使含糖材料与微生物组合，所述微生物利用含糖材料或其糖化衍生物来生产产品或中间体。这种工艺通常在流体介质中进行，并且在一些实施方式中包含发酵。典型的生物质资源含有纤维素、半纤维素，和木质素加上较少量的蛋白质、可提取物和矿物质。可将纤维素和半纤维素部分中所含有的复合糖加工成可发酵食糖，所述可发酵食糖然后可由生物加工转化成许多产品，如醇或有机酸。所获产品取决于利用的微生物和生物加工发生的条件。不同于如玉米、葡萄等的传统发酵原料，纤维素和木质纤维材料通常含有相对来说低至可忽略水平的营养物。对于已例如通过制浆来加工的原料，例如废纸和废纸浆来说，尤其如此。因此，当使用此类原料时，发酵通常进行缓慢(如果发生)，并且可能难以获得高浓度的乙醇。虽然可将市售营养物包(如蛋白胨或酵母氮碱)添加至发酵介质，但是此类材料通常比较昂贵，从而影响大规模发酵工艺的经济可行性。发明者已发现，通过将特定营养物添加至生物加工介质以给微生物喂食，可显著提高生物加工的效率，并且可显著降低成本。营养物包括食品产品，例如，谷物或蔬菜；食品产品的残留物，例如，如米糠的作物产品的残留物，或肉类产品的残留物，例如，牛肉、鸡肉、猪肉等的汤汁、炼油、肉汤或提取物；或其混合物。这些在本文中一起被称为“以食品为主的营养物源”。因为使用以食品为主的营养物源，所以可以相对较低的成本将营养提供至发酵工艺，从而降低由所述工艺生产的产品的总成本。以食品为主的营养物源的食糖含量可能较低，这是因为主要或单独使用材料作为营养物源，而不是作为发酵原料。因此，可使用不被重视为食糖源的材料。在一些实施方式中，递送以食品为主的营养物源作为营养物包的一部分，所述营养物包可包括一种或多种额外成分。在一些优选实施方式中，营养物包进一步包括氮源，例如，尿素、氨、硫酸铵和其混合物。一方面，本发明的特征为一种方法，所述方法包括使原料(包括含碳材料，如纤维素或木质纤维材料和/或糖化纤维素或木质纤维材料)与微生物和以食品为主的营养物源组合来形成混合物，所述微生物利用所述原料来生产产品或中间体。一些实施方式包括以下特征中的一个或多个。在一些情况下，以食品为主的营养物源选自由以下组成的组:谷物、蔬菜、谷物的残留物、蔬菜的残留物、肉类的残留物(例如，汤汁、提取物、肉汤或炼油)，和其混合物。例如，营养物源可选自由以下组成的组:小麦、燕麦、大麦、大豆、豌豆、豆荚、马铃薯、玉米、米糠、玉米粉、小麦麸、肉类产品残留物，和其混合物。产品可以是或包括例如选自由以下组成的组的燃料:氢气、醇、有机酸、烃和其混合物。例如，产品可包括选自由以下组成的组的醇:甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、乙二醇、丙二醇、1，4-丁二醇、丙三醇和其混合物。在一些情况下，产品可以是选自由以下组成的组的有机酸:甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、棕榈酸、硬脂酸、草酸、丙二酸、丁二酸、戊二酸、油酸、亚油酸、羟基乙酸、乳酸、Y-羟基丁酸和其混合物。烃包括例如甲烷、乙烷、丙烷、异丁烯、戊烷、正己烷和其混合物。也可生产其它产品和中间体。利用步骤可以包括例如糖化和/或发酵。在一些情况下，利用步骤包括同时糖化和发酵(simultaneous saccharification and fermentation ;SSF)。微生物可以包括例如酵母和/或酶，如本文中详细描述的任何酵母和酶。在一些情况下，糖化可以在约3.8至
4.2的pH下进行，且发酵可以在约4.8至5.2的pH下进行，并且所述方法可进一步包括在糖化与发酵之间调整pH。混合物可(在一些情况下)包括氮源，所述氮源可以是营养物包的一部分或可独立添加。氮源可以例如选自由以下组成的组:尿素、氨、硫酸铵和其混合物。在一些优选实施方式中，混合物进一步包含酶系统，所述酶系统被选择来从以食品为主的营养物源释放营养物，例如，氮、氨基酸和脂肪。例如，酶系统可以包括选自由以下组成的组的一种或多种酶:淀粉酶、蛋白酶和其混合物。在一些情况下，酶系统包含蛋白酶和淀粉酶。

除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域一般技术人员通常理解的相同含义。虽然在本发明的实践或检测中可以使用与本文中描述的那些类似或等价的方法和材料，但是合适的方法和材料如下所述。本文中提到的所有公布、专利申请、专利和其它参考文献均全部以引用方式并入本文。如果有冲突，则以本说明书(包括定义)为准。此外，所述材料、方法和实例仅是说明性的并且不希望限制。本发明的其它特征和优点将从以下详细描述和权利要求变得显而易见。


图1是说明通过生产葡萄糖溶液将原料转化为乙醇的流程图。图2是乙醇制造设施的示意图。图3是说明纤维素酶促水解成葡萄糖的图表。详细描述使用本文中所描述的方法和营养物包，可生物加工(例如，使用发酵)如纤维素和木质纤维材料的含碳材料和其糖化衍生物，以生产如本文中所描述的中间体和产品的有用中间体和产品。发明者已经发现，通过将低水平的食品产品和/或食品残留物添加至发酵批料，可获得高效发酵，从而产生浓度相对较高的乙醇，例如，达10%、15%、20%、25%或达30%或更高。在一些情况下，浓度可以是例如约0.lg/L至80g/L,例如，约0.lg/L至40g/L,约0.5g/L至20g/L，约lg/L至10g/L或在一些实施方式中为约lg/L至5g/L。所使用的浓度将取决于所使用的一种或多种材料的营养物分布而变化。适合的以食品为主的营养物源包括谷物，例如，小麦、燕麦和大麦，和蔬菜，例如，大豆、豌豆、豆荚、马铃薯，和玉米，以及此类材料的残留物，例如，米糠、玉米粉和小麦麸。这些只代表可使用的许多谷物和蔬菜的少量实例。如上文所论述，另外或替代地，以食品为主的营养物源可包括如牛肉、鸡肉、猪肉或其它肉类的汤汁、肉汤、提取物或炼油的肉类残留物。以食品为主的营养物源可包括两种或更多种谷物和/或蔬菜和/或肉类残留物的混合物。有利地，此等材料通常成本较低。在一些情况下，使用否则将被视为废物的材料，例如，否则将必须被垃圾填埋的食品产品或残留物。除了以食品为主的营养物源之外，优选的营养物包含有氮源。适合的氮源包括例如尿素、氨、硫酸铵和其混合物。在一些实施方式中，基于液体介质的容积以约l-10g/L、
2-8g/L或优选地3-6g/L的浓度添加氮源。可包括在营养物包内的其它化合物包括磷酸盐，所述磷酸盐由微生物用于复制。在优选实施方式中，将营养物包与酶的特定组合一起使用，所述酶的特定组合包括被选择以在纤维素或木质纤维材料上糖化的一种或多种酶，和被选择以从以食品为主的营养物源释放营养物(例如，氮、氨基酸和脂肪)的一种或多种酶。在一些情况下，酶的组合包括淀粉酶，以分解营养物源中的淀粉，和蛋白酶，以水解蛋白质并从营养物源生产肽类。下文将详细论述优选的酶组合。

现将论述可使用以食品为主的营养物源或营养物包的工艺。将纤维素和木质纤维材料转化为醇参考图1，用于制造醇(例如，乙醇)的工艺可包括例如选择性地机械处理原料(步骤110)，在此处理之前和/或之后，以另一物理处理(例如辐射，(例如，电子束辐射))选择性地处理原料，以进一步降低其抗性(步骤112)，糖化原料以形成食糖溶液(步骤114)，选择性地将溶液(或原料、酶和水，如果糖化在途中进行)输送(例如，通过管道、有轨车、卡车或驳船)至制造厂(步骤116)，然后生物加工处理的原料来生产所要的产品(步骤118)，然后进一步加工所述所要的产品，例如，通过蒸馏(步骤120)。如果希望，则可测量木质素含量(步骤122)并且可基于此测量来设定或调整工艺参数(步骤124)，如在2009年2月11日提交的美国临时申请号61/151，724中描述，所述美国临时申请的全部公开内容以引用方式并入本文。以食品为主的营养物源或营养物包在生物加工生物加工(步骤118)(例如，发酵)期间存在，并且在一些优选实施方式中也可在糖化步骤(步骤114)期间存在。在一些实施方式中，与适合于糖化、发酵和从以食品为主的营养物源释放营养物的酶组合一起，在步骤114开始时添加以食品为主的营养物源或营养物包。在第一组工艺条件(例如，温度和pH)下进行糖化，然后当糖化已进行至所要的程度时，调整(例如，通过将PH从4调整至5)工艺条件以允许发酵进行。在步骤118-120 (并且在一些情况下上文所述的所有步骤)中所使用的制造厂可以是例如现有基于淀粉或基于食糖的乙醇厂或已通过自生物加工系统(所述生物加工系统在典型乙醇厂中通常包括谷物接收设备、锤磨机、浆液混合器、蒸煮设备和液化设备)除去或停用上游设备而改造的厂。在一些情况下，可将由厂接收的原料直接输入至发酵设备中。在图2中示意地图示改造的厂。步骤110-112描述(例如)于2009年4月23日提交的美国专利号12/429，045中，所述美国专利号12/429,045的全部公开内容以引用方式并入本文。现将进一步论述步骤114、118和120 (糖化、发酵和蒸馏)，步骤114、118和120与通过生物加工来生产醇有关。趣化为了将原料转化为可发酵食糖，由糖化剂(例如，酶)水解原料中的纤维素，这个过程称为糖化。使用酶来处理包括纤维素的材料，例如，通过在溶剂(例如，水溶液)中组合材料和酶。酶和分解生物质(如生物质的纤维素和/或木质素部分)的破坏生物质的有机体含有或制造各种纤维素分解酶(纤维素酶)、木质素酶或各种小分子破坏生物质的代谢物。这些酶可以是协同作用降解生物质的结晶纤维素或木质素部分的酶复合物。纤维素分解酶的实例包括:内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和纤维二糖酶(β -葡萄糖苷酶)。参考图3，通过内切葡聚糖酶在随机位置初步水解纤维素底物产生低聚中间体。这些中间体随后被作为外切葡聚糖酶如纤维二糖水解酶的底物，以从纤维素聚合物的末端产生纤维二糖。纤维二糖是水溶性的1，4-连接的葡萄糖二聚体。最后纤维二糖酶裂解纤维二糖得到葡萄糖。例如，适合的糖化剂在以下材料部分中描述。如上文所述，优选地在糖化之前或期间添加以食品为主的营养物源或营养物包，并且添加酶，所述酶被选择来从以食品为主的营养物源释放营养物。例如，适合的酶在以下材料部分中描述。糖化工艺可以在制造厂中的储罐(例如，容积至少为4000L、40，000L.400, 000L或1，000，000L的储罐)中部分或完全地进行，且/或可以在转运中(例如，在滑轨车、油罐卡车中，或在超级油轮或船舱中)部分或完全地进行。完成糖化所需要的时间将取决于工艺条件和所使用的原料和酶。如果糖化是在受控的条件下在制造厂中进行，则纤维素可在约12-96小时内大体上全部转化为葡萄糖。如果糖化是在转运中部分或完全地进行，则糖化可进行得较久。通常优选在糖化期间混合储罐内含物，例如，使用如在美国临时申请号61/218,832中描述的射流混合，所述美国临时申请的全部公开内容以引用方式并入本文。表面活性剂的添加可提高糖化速率。表面活性剂的实例包括非离子型表面活性剂(如Tween 20或Tween 80聚乙二醇表面活性剂)、离子型表面活性剂或两性表面活性剂。通常优选所得葡萄糖溶液的浓度相对较高，例如，大于40重量％，或大于50重量％、60重量％、70重量％、80重量％、90重量％或甚至大于95重量％。如果糖化和发酵在不同位置进行，这样可减小待装运的体积，并且也抑制溶液中的微生物生长。然而，可使用较低浓度，在这种情况下以低浓度(例如，50ppm至150ppm)添加抗微生物添加剂(例如,广谱抗菌素)可为合意的。其它适合的抗菌素包括两性霉素B、氨苄青霉素、氯霉素、环丙沙星、庆大霉素、潮霉素B、卡那 霉素、新霉素、青霉素、嘿吟霉素、链霉素。抗圃素将在输送和存储期间抑制微生物生长，并且可按适合的浓度(例如，以重量计在15ppm与IOOOppm之间，例如，在25ppm与500ppm之间，或在50ppm与150ppm之间)使用。如果希望，则即使食糖浓度相对较高也可包括抗菌素。可通过限制与酶一起添加至原料的水量来获得相对较高浓度的溶液。可以例如通过控制糖化发生到什么程度来控制浓度。例如，可通过将更多原料添加至溶液来增加浓度。为了保持正在溶液中产生的食糖，可添加表面活性剂，例如，上文所论述的那些表面活性剂中一种。也可以通过增加溶液的温度来增加溶解度。例如，可使溶液维持在40_50°C、60-80°C，或甚至更高的温度下。在一些实施方案中，加工原料以将其转化为便利且浓缩的固体材料，例如，呈粉末、粒化或颗粒形式。浓缩材料可以呈提纯形式，或呈原始或天然形式。浓缩形式可具有例如介于约90重量％与约100重量％之间的总食糖浓度，例如，92重量％、94重量%、96重量％或98重量％的食糖。此类形式对于装运(例如)至生物加工设施(如生物燃料制造厂)可为尤其经济有效的。此类形式对于存储和搬运也可为有利的，比较容易制造和变成中间体和产品两者，从而为生物炼制厂关于将制造哪种产品提供了选择。在一些情况下，粉末、粒化或颗粒材料还可以包括一种或多种材料，例如，添加剂或化学品(本文中所描述的)，如以食品为主的营养物或营养物包、氮源(例如尿素)、表面活性剂、酶，或本文中所描述的任何微生物。在一些情况下，使生物加工所需要的所有材料组合于粉末、粒化或颗粒材料中。此类形式对于输送至远程生物加工设施(如远程生物燃料制造设施)可为尤其便利的形式。此类形式对于存储和搬运也可为有利的。在一些情况下，粉末、粒化或颗粒材料(有或没有添加的材料，如添加剂和化学品)可由在上文引用结合的美国专利号12/429，045中描述的任何物理处理来处理。例如，对粉末、粒化或颗粒材料进行辐射可提高其溶解度并且在预期中间体或产品可能需要的情况下，可将材料消毒，以便生物加工设施可直接将材料整合至其工艺中。在某些情况下，可将粉末、粒化或颗粒材料(有或没有添加的材料，如添加剂和化学品)装载于结构或载体中以便于输送、存储或搬运。例如，结构或载体可包括或结合袋子或衬里，如可降解袋子或衬里。此类形式对于直接添加至生物加工系统可为尤其有用。遞通过使由糖化处理的生物质材料产生的低分子量食糖发酵，微生物可以生产许多有用的中间体和产物。例如，发酵或其它生物过程可以产生醇、有机酸、烃、氢气、蛋白质或任何这些材料的混合物。例如，可以使用酵母菌和发酵单胞菌(Zymomonas)进行发酵或转化。其它微生物在以下材料部分中论述。酵母的最佳pH是约pH4至pH5,而发酵单胞菌的最佳pH是约pH5至pH6。典型的发酵时间是约24小时至96小时，温度在26°C至40°C范围内，而嗜热微生物偏好更高的温度。在一些实施方案中，全部或一部分发酵工艺可在低分子量食糖完全转化为乙醇之前被中断。中间体发酵产品包括高浓度的食糖和糖。这些中间体发酵产品可用于制备人或动物消耗的食品中。另外或替代地 ，中间体发酵产品可在不锈钢实验型磨机中研磨成细小颗粒大小以产生面粉状物质。可以使用可移动的发酵罐，如在美国临时专利申请号60/832，735 (现在是公布的国际申请号WO 2008/011598)中描述的。类似地，糖化设备可以是可移动的。此外，糖化和/或发酵可以在转运期间部分或完全地进行。蒸篮发酵之后，可以使用例如“醪塔”蒸馏所得流体以使乙醇和其它醇与大部分水和残余固体分离。流出醪塔的蒸气可以是例如35重量％的乙醇并且可以被进料到精馏塔中。来自精馏塔的接近共沸的(92.5%)乙醇和水的混合物可以使用气相分子筛纯化至纯(99.5%)乙醇。可以将醪塔残渣传送至三级蒸发器的第一级。精馏塔回流冷凝器可以为所述第一级提供热量。第一级之后，可以使用离心机分离固体并且在旋转干燥器中干燥。可以将离心机流出液的一部分(25%)回收发酵并且将其余部分传送至第二蒸发器级和第三蒸发器级。大部分蒸发器冷凝液可以作为相当干净的冷凝液返回工艺中，只分离一小部分至废水处理以防止低沸点化合物的堆积。中间体和产品本文中论述的工艺和营养物可以用来将含糖材料(例如，纤维素或木质纤维材料)转化为一种或多种产品，如能量、燃料、食品和材料。产品的特定实例包括但不限于氢气、醇(例如,一元醇或二元醇,如乙醇、正丙醇或正丁醇)、(例如)含有大于10%、20%、30%甚至大于40%水的水合或水化醇、 食糖、生物柴油、有机酸(例如，乙酸和/或乳酸)、烃、副产品(例如，蛋白质，如纤维素分解蛋白质(酶)或单细胞蛋白质)，和任何这些产品的任何组合或相对浓度的混合物，以及选择性地与任何添加剂(例如，燃料添加剂)的组合。其它实例包括羧酸，如醋酸或丁酸、羧酸盐、羧酸和羧酸盐和羧酸酯(例如，甲酯、乙酯和正丙酯)的混合物、酮、醛、α、β不饱和酸如丙烯酸和烯烃如乙烯。其它醇和醇衍生物包括丙醇、丙二醇、1，4-丁二醇、1，3-丙二醇、任何这些醇的甲酯或乙酯。其它产品包括丙烯酸甲酯、异丁烯酸甲酯、乳酸、丙酸、丁酸、琥珀酸、3-羟基丙酸、任何所述酸的盐和任何所述酸和相应的盐的混合物。其它中间体和产品包括食品和医药产品，它们在美国专利号12/417，900中描述，其全部公开内容以引用方式并入本文。材料营养物包成分如上文所论述，优选营养物包含有以食品为主的营养物源、氮源，并且在一些情况下含有其它成分，例如，磷酸盐。适合的以食品为主的营养物源包括谷物和蔬菜，包括上文论述的那些和许多其它谷物和蔬菜。以食品为主的营养物源可以包括两种或更多种谷物和/或蔬菜的混合物。优选营养物包可以包括约2容重％至5容重％的以食品为主的营养物源(例如，
3-4容重％的米糠粉或4-5容重％的玉米粉)、约3g/L至4g/L的氮源(例如，约3.5g/L尿素)和约8g/L至12g/L的非离子表面活性剂(例如，约10g/L Tween 80表面活性剂)。用于释放营养物的酶如上文所论述，优选糖化和/或发酵混合物进一步包括酶系统，所述酶系统被选择来从以食品为主的营养物源释放营养物，例如，氮、氨基酸和脂肪。例如，酶系统可包括选自由以下组成的组的一种或多种酶:淀粉酶、蛋白酶和其混合物。在一些情况下，酶系统包含蛋白酶和淀粉酶。适合的蛋白酶的实例为FERMGEN 酸蛋白水解酶，FERMGEN 酸蛋白水解酶可从Genencor (Danisco的部门)购得。这种酶为真菌蛋白酶，所述真菌蛋白酶由具有甘油、硫酸钠和苯甲酸钠的水溶液中的5-10%曲霉酸性蛋白酶(Aspergillop印sin) I组成。适合的淀粉酶的实例为STARGEN 酶，STARGEN 酶可从Genencor(R) (Danisco的部门)购得。这种酶为葡糖淀粉酶和ct-淀粉酶掺和物,含有用里氏木霉(Trichoderma reesei)表达的河内曲霉(Aspergillus kawachi) α _淀粉酶和来自里氏木霉的葡糖淀粉酶。在一些优选实施方式中，淀粉酶和蛋白酶各自以基于所添加的以食品为主的营养物源的重量约0.5重量％至1.5重量％的浓度而包括在内，例如，各自约I重量％。与在相同以食品为主的材料正用作糖化和发酵的原料，而不是作为营养物源时通常需要的浓度相比，这些浓度为非常低的浓度。例如，当FERMGEN 酶和STARGEN 酶用于将玉米和谷物糖化并且发酵成乙醇时，那些酶的推荐浓度分别为26-38%w/w和20-34%w/w。虽然优选使用蛋白酶和淀粉酶的组合，但是在一些情况下可单独使用一种或其它酶，且/或可使用能够从以食品为主的营养物源释放营养物的其它酶。牛物质材料生物质可以是例如纤维素或木质纤维材料。这些材料包括纸和纸类产品(例如聚乙烯涂布纸和牛皮纸)、木材、木材相关材料，例如刨花板、草、稻壳、甘蔗渣、黄麻、大麻、亚麻、竹子、剑麻、蕉麻、稻草、柳枝稷、苜蓿、干草、玉米芯、玉米秣草、椰子毛和α -纤维素含量高的材料，例如棉花。原料可以从未用过的废弃纺织材料(例如零料)、用后废物(例如碎布)获得。当使用纸产品时，它们可以是未用过的材料(例如废弃未用过的材料)，或它们可以是用后废物。除了未用过的原材料以外，还可以使用用后的、工业上的(例如废料)和加工废物(例如来自纸加工的流出液)作为纤维来源。生物质原料还可以来自或源于人(例如污水)、动物或工厂废物。其它纤维素和木质纤维材料已经在美国专利号6，448，307、6，258，876,6, 207，729,5, 973，035 和 5，952，105 中描述。在一些实施方案中， 生物质材料包括本身是或包括具有一个或多个β-1,4-键并具有介于约3，000与50，000之间的数均分子量的材料的糖。这种糖本身是或包括纤维素，所述纤维素通过β (1，4)-糖苷键的缩合从(β-葡萄糖)衍生而得。这种键本身与存在于淀粉和其它糖中的α (I，4)-糖苷键有差异。糖化剂适合的酶包括能够降解生物质的纤维二糖酶和纤维素酶。适合的纤维二糖酶包括以商品名N0V0ZYME188 销售的来自黑曲霉(Aspergillusniger)的纤维二糖酶。纤维素酶能够降解生物质，可能是来源于真菌或细菌。合适的酶包括来自以下菌属的纤维素酶:杆菌(Bacillus)、假单胞菌(Pseudomonas)、腐质菌(Humicola)、镰刀菌(Fusarium)、喜热菌(Thielavia)、顶抱霉菌(Acremonium)、金抱子菌属(Chrysosporium)和木霉菌(Trichoderma),并且包括以下菌种:腐质菌、鬼伞菌(Coprinus)、喜热菌、镰刀菌、毁丝菌(Myceliophthora)、顶孢霉菌、头孢霉菌(Cephalosporium)、小柱孢属(Scytalidium)、青霉菌(Penicillium)或曲霉菌(AspergilluS)(参见,例如 EP 458162)，特别是由选自以下菌种的菌株产生的那些:特异腐质霉菌(Humicola insolens) (二级分类为嗜热革节孢菌(Scytalidium thermophilum),参见,例如美国专利号4，435, 307)、灰盖鬼伞菌(Coprinus cinereus)、尖刀镰孢菌(Fusarium oxysporum)、对嗜热毁丝菌(Myceliophthora thermophila)、大型亚灰树花菌(Meripilus giganteus)、太瑞斯梭孢壳霉菌(Thielavia terrestris)、枝顶孢菌(Acremonium sp.)、枝顶孢霉菌(Acremonium persicinum)、Acremonium acremonium、Acremonium brachypenium、Acremoniumdichromosporum、Acremonium obclavatum、Acremonium pinkertoniae、Acremonium roseogriseum、Acremonium incoloratum 和 Acremonium furatum ;优选来自以下菌种:特异腐质霉菌DSM 1800、尖刀镰孢菌DSM 2672、对嗜热毁丝菌CBS 117.65、头孢霉菌RYM-202、枝顶孢菌CBS 478.94、枝顶孢菌CBS 265.95、枝顶孢霉菌CBS 169.65、Acremonium acremonium AHU 9519、头抱霉菌 CBS 535.71、Acremonium brachypeniumCBS 866.73、Acremonium dichromosporum CBS 683.73、Acremonium obclavatum CBS311.74、Acremonium pinkertoniae CBS 157.70、Acremonium roseogriseum CBS 134.56、Acremonium incoloratum CBS 146.62和Acremonium furatum CBS299.70H。纤维素分解酶还可以从金抱霉菌(Chrysosporium)获得，优选Chrysosporium Iucknowense菌株。此外，可以使用木霉菌(特别是绿色木霉菌(Trichoderma viride)、里氏木霉菌(Trichodermareesei)和康宁木霉菌(Trichoderma koningii))、嗜喊芽抱杆菌(alkalophilicBacillus)(参见，例如美国专利号3，844，890，和EP458162)和链霉菌(参见，例如EP458162)。可以使用酶复合物，如可以ACCELLERASE 商品名称从Genencor 购得的那些，例如Accellerase 1500酶复合物。Accellerase 1500酶复合物含有多个酶活性，
主要有外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶(2200-2800CMC U/g)、半纤维素酶和β -葡萄糖苷酶(525-775pNPG U/g)，并且pH为4.6至5.0。酶复合物的内切葡聚糖酶活性用羧甲基纤维素活性单位(carboxymethyIcellulose activity units ；CMC U)表达,而 β -葡萄糖苷酶活性用ρΝΡ葡萄糖苷活性单位(pNP-glucoside activity units ；pNPG U)报告。另一适合的酶复合物是Accellerase Duet酶复合物。Accellerase Duet酶复合物也含有多个酶活性，主要有外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶(2400-3000CMCU/g)、半纤维素酶(包括木聚糖酶，>3600ABX U/g)和β -葡萄糖苷酶(MOOpNPG U/g)，并且pH为4.3至4.6。酶复合物的内切葡聚糖酶活性用羧甲基纤维素活性单位(CMC U)表达，而β_葡萄糖苷酶活性用PNP葡萄糖苷活性单位(pNPG U)报告，并且木聚糖酶活性用酸性桦木木聚糖酶单位(AcidBirchwood Xylanase Units ；ABXU)报告。在一些实施方案中，使用Accellerase 1500 或Accellerase Duet酶复合物与N0V0ZYME 188纤维二糖酶的掺和物。发酵剂在发酵中使用的微生物可以是天然微生物和/或工程微生物。例如，微生物可以是细菌(例如纤维素分解细菌)、真菌(例如酵母)、植物或原生生物(例如海藻)、原生动物或类真菌原生生物(例如黏菌)。当有机体相容时，可以使用有机体的混合物。合适的发酵微生物具有将糖(如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、寡糖或多糖)转化成发酵产品的能力。发酵微生物包括以下菌株:酵母菌属(Sacchromycesspp.),例如酿酒酵母(面包 酵母)、糖化酵母(Saccharomyces distaticus)、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum);克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces),例如马克斯克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxianus)种、脆壁克鲁维酵母菌(Kluyveromyces fragilis)种；念珠菌属(Candida),例如伪热带念珠菌(Candida pseudotropicalis)和 Candida brassicae、树干毕赤酵母菌(休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)的亲缘菌)、Clavispora属，例如鲁西坦念珠菌(Clavispora Iusitaniae)和 Clavispora opuntiae, Pachysolen 属，例如嗜鞋管囊酵母(Pachysolen tannophilus)种，Bretannomyces属，例如克劳森酒香酵母(Bretannomyces clausenii)种(Philippidis, G.P., 1996, Cellulose bioconversiontechnology, Handbook on Bioethanol:Production and Utilization, Wyman, C.E.编著，Taylor&Francis, Washington, DC, 179-212)。市售酵母菌包括例如Red Star /L.esaffre Ethanol Red(从 Red Star/Lesaffre, USA 购得)、FALI⑩(从 Fleischmann，s Yeast, (Burns Philip Food Inc., USA的一个分公司)如 、」)、SUPERSTART_ (从Alltech (现在是Lalemand)购得)、GERTSTRAND (从Gert Strand AB, Sweden购得)和FERMOL (从DSM Specialties购得)。还可以在发酵 中使用细菌,例如运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)和热纤梭菌(Clostridium thermocellum) (Philippidis, 1996，上述)。实施例1使用以下工序生产原料(在实施例2中被称为“XP” )。1500磅移送机的单位体积重量为301b/ft3的未用过的漂白白色牛皮纸板是从International Paper获得。使用闸刀式切割机将材料切割成81/4英寸乘以11英寸的碎片并且将材料进料给Munson旋转刀切割机，型号SC30。排出筛具有1/8英寸的孔。旋转刀片与固定刀片之间的间隙被设定为近似0.020英寸。旋转刀切割机剪切切割后的碎片，释放纤维材料。实施例2通过加热4L去离子水至50°C并且混合同时添加4容重％的米糠粉、3.405g/L尿素和10g/L Tween 80 表面活性剂来制备介质。接下来，按以下量添加三种酶:ACCELLERASE 酶 0.25mL/l 克 XP 原料STARGEN 酶 I 糠重 ％FERMGEN 酶 I 糠重 ％ACCELLERASE在O小时时添加，并且另两种酶在3小时时添加。然后，以增量添加XP原料，添加的量和频率由混合物和混合速度的一致性决定。添加材料达27小时周期，按150-275克的增量增加。添加的总量为1096克。在混合期间监视温度波动，以防止加热超过55°C，这样将易于使酶变性。在整个工艺期间，使用IKA R.0TOTRON 混合器以250rpm进行混合。温度维持在近似50°C处，并且pH为约3.7。在添加了原料的最后增量之后，在27小时处，允许批料继续糖化至从工艺开始总共70小时。此时，葡萄糖浓度为90g/L。糖化的混合物转送至BioFlow⑧115生物反应器用于发酵。然后改变参数，并且接种混合物，以启始发酵。使用Rushton推进器以250rpm进行混合,其中以0.025vvm提供空气，并且将pH调整为约5.0。温度降低为约30°C。pH控制是使用IM H3PO4 (酸控制)和IM NaOH (碱控制)来提供。接种基于以下比率:lmg Superstart 酵母比Ig葡萄糖。酵母是作为冻干的接种体直接添加至混合物。在这些条件下发酵20小时之后，混合物中乙醇的浓度为约50g/L，并且葡萄糖的浓度已经下降至约Og/L。这仅仅比相同条件下通过在含有1.7g/L YNB、2.27g/L尿素和
6.6g/L大豆蛋白胨的介质中发酵150g/L葡萄糖和40g/L木糖获得的乙醇浓度稍低。其它实施方案已经描述了本发明的许多实施方案。仍然，应理解的是，可以进行各种改变而不脱离本发明的精神和范畴。例如，虽然出于成本原因优选本文中公开的营养物包仅包括以食品为主的(并且尤其为蔬菜和/或谷物)营养物源，但是如果希望，则营养物包可以包括这些营养物源与其它非食品为主或非谷物/非蔬菜食品源的混合物。因此，其它 实施方案在以下权利要求的范畴之内。
权利要求
1.一种方法，其包括: 使原料与微生物和以食品为主的营养物源组合来形成混合物，所述原料包含纤维素或木质纤维材料和/或糖化纤维素或木质纤维材料，所述微生物利用所述原料来生产产品或中间体。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述以食品为主的营养物源选自由以下组成的组:谷物、蔬菜、谷物的残留物、蔬菜的残留物、肉类产品的残留物和其混合物。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述产品包括选自由以下组成的组的燃料:氢、醇、有机酸、烃和其混合物。
4.如权利要求1、2或3所述的方法，其中利用包括发酵。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述微生物包括酵母。
6.如权利要求4所述的方法，其中发酵是在约4.8至5.2的pH下进行。
7.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中利用包括糖化。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述微生物包括酶。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述酶包括半纤维素酶或纤维素酶。
10.如权利要求7所述的方法，其中糖化是在约3.8至4.2的pH下进行。
11.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述混合物进一步包含氮源。
12.如权利要求1 1所述的方法，其中所述氮源选自由以下组成的组:尿素、氨、硫酸铵和其混合物。
13.如权利要求2所述的方法，其中所述以食品为主的营养物源选自由以下组成的组:小麦、燕麦、大麦、大豆、豌豆、豆荚、马铃薯、玉米、米糠、玉米粉、小麦麸和其混合物。
14.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述混合物进一步包含酶系统，所述酶系统被选择来从所述以食品为主的营养物源释放营养物。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述酶系统包含选自由以下组成的组的一种或多种酶:淀粉酶、蛋白酶和其混合物。
16.如权利要求14所述的方法，其中所述酶系统包含蛋白酶和淀粉酶。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述酶系统进一步包含半纤维素酶或纤维素酶。
18.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述混合物进一步包含介质。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述以食品为主的营养物源在所述介质中的浓度为约 0.lg/L 至 10g/Lo
20.如权利要求3所述的方法，其中所述醇选自由以下组成的组:甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、乙二醇、丙二醇、1，4- 丁二醇、丙三醇和其混合物。
21.如权利要求3所述的方法，其中所述有机酸选自由以下组成的组:甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、棕榈酸、硬脂酸、草酸、丙二酸、丁二酸、戊二酸、油酸、亚油酸、羟基乙酸、乳酸、Y-羟基丁酸和其混合物。
22.如权利要求3所述的方法，其中所述烃选自由以下组成的组:甲烷、乙烧、丙烧、异丁烯、戊烷、正己烷和其混合物。
23.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述纤维素或木质纤维材料已经过处理以降低其抗性。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述纤维素或木质纤维材料已用辐射来处理。
25.如权利 要求24所述的方法，其中所述辐射包括电子束。
全文摘要
将生物质(例如，植物生物质、动物生物质和城市废物生物质)进行加工以生产有用的中间体和产品，如能量、燃料、食品或材料。例如，描述了可以使用原料材料(如纤维素和/或木质纤维材料)例如通过发酵来生产中间体或产品的方法。
文档编号C12P7/10GK103080327SQ201180032047
公开日2013年5月1日 申请日期2011年7月15日 优先权日2010年7月19日
发明者M·梅多夫, T·马斯特曼, S·贝, K·瓦里克 申请人:希乐克公司