专利名称：用于生产生物燃料的帕米尔绿球藻的培养的制作方法
技术领域：
本发明涉及帕米尔绿球藻的提纯方法，培养该藻类的方法，以及提高其油脂含量的方法。该富油藻类可用于生物燃料的大规模生产。
背景技术：
可持续的能源供应和环境保护，现在被认为是本世纪国际社会，特别是美国，所面临的两个最关键的问题。例如，美国严重依赖石油进口，尤其是交通运输行业消耗了化石燃油国内用量的三分之二。石油进口成本占美国贸易赤字增长的三分之一，对美国经济的负担越来越重。尽管美国可以继续增加石油进口，但全球石油供应不是无限的。即使根据乐观的估计，世界石油资源约为2. 2-3. 9万亿桶，是已探明储量的近两倍，但在30年至50年内，世界的石油供应将会告罄。中国，印度和其他国家的新兴市场和快速增长的经济体对石油的需求进一步地加剧了竞争和价格波动。此外，世界上存在着化石能源的大量使用的问题，以及美国、尤其是美国运输行业存在对外国石油进口存在严重依赖，美国同时面临着上述问题的交汇。交通运输业燃料的使用推动国家的石油进口需求，并造成约一半的温室气体排放量，美国和全球的化石燃料使用和温室气体排放对气候造成变化，这是另一个越来越受到关注的问题。石油进口和消费构 成的对经济和环境的影响还是一个重要的国家安全问题。在全球石油完全枯竭前，能够以何种量、何种速度、以及何种程度地减少对化石燃料的需求，并通过提供可持续供应的可再生能源，同时在国内控制温室气体的排放量，将决定所产生的影响的严重程度。微藻属于光合微生物，可以从环境利用无机营养素(如氮，磷)生产有机的化合物，如蛋白质，颜料，和油脂。微藻是淡水和海洋生物系统中发现的微小藻类。它们大多是单细胞微生物。已知微藻比农业作物的增长速度快10-20倍，某些微藻可积累大量的脂类或油(占干重的30%至60%)。其结果是，使用微藻作为生物燃料特别是生物柴油的生产原料的替代资源，相关技术方案的研究工作已经深入开展。虽然微藻的生物柴油生产只处于实验室规模，尚无由微藻生产的生物柴油的商业化产品。我们所面临的挑战是如何将具备性价比和高效率的技术、系统及流程成功地进行开发和商业化。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的是通过提供一种培养和提纯微藻帕米尔绿球藻(Chlorococcum pamirum)的方法，以便优化细胞株的成长使得微藻的油脂生产也得以优化。本发明所提供的方法诱导和提高帕米尔绿球藻细胞内油脂积累。此处所公开的方法适合于大规模的富油微藻生产。更具体地说，本发明提供了用于优化帕米尔绿球藻菌株生长和诱导帕米尔绿球藻细胞内油脂积累的生长培养基和培养条件。一方面，本发明 提供了一种增加微藻帕米尔绿球藻中的油脂积累的方法，包括在
培养基中培养微藻。另一方面，本发明提供了一种用于生产富油微藻的培养基，该培养基包括微量元素和从硝酸钠、硫酸镁、碳酸钠、氯化钙、乙二胺四乙酸二钠和磷酸氢二钾及等等类似物中所选取的无机化合物。在一个实施例中，该培养基中含有约O. 025-1. 75克/升的硫酸镁，约O. 5-3. 6克/升碳酸钠，约O. 025-0. 20克/升的氯化钙，约O. 001-0. 005克/升的乙二胺四乙酸二钠，约O. 075-1. 5克/升的3水合磷酸氢二钾，约O. 2-2毫升/升A5微量元素(乏氮)。在另一个实施例中，该培养基中还含有约O. 25-2. 5克/升硝酸钠。在另一个实施例中，该培养基中含有约O. 25-2. 5克/升硝酸钠，约O. 025-1. 75克/升硫酸镁，约O. 5-3. 6克/升碳酸钠，约O. 025-0. 20克/升氯化钙，约O. 001-0. 005克/升乙二胺四乙酸二钠，约O. 2-2毫升/升的A5微量元素(乏磷)。在另一个实施例中，该培养基中还含有浓度至少为O. 1% w/v的氯化钠。另一方面，本发明提供了一种用于生产生物柴油原料的方法，包括(a)在培养基中培育的微藻帕米尔绿球藻；(b)诱导油脂在微藻中富集，(C)从培养基分离富油微藻；(d)从富油微藻中提取脂类或油。另一方面，本发明提供了微藻帕米尔绿球藻在制备富油微藻中的用途。另一方面，本发明提供了帕米尔绿球藻在油料或脂类生产中的用途。另一方面，本发明提供了本文所述的方法在生产作为生物柴油原料的富油微藻中的用途。另一方面，本发明提供了一种微藻细胞集落，包括富油微藻帕米尔绿球藻，其中所述富油微藻细胞包括了高于正常培养条件下的微藻细胞所能产生的量的油脂。参照以下的附图具体实施方式
和权利要求书，将能够更好地理解本发明的各个方面。
图1A和图1B示出氮浓度对帕米尔绿球藻 生长的影响，测量参数包括(A) 550nm波长下的光强度，(B)干重。图2A和图2B示出磷浓度对帕米尔绿球藻生长的影响，测量参数包括(A) 550nm波长下的光强度，(B)干重。图3A和图3B示出了乏氮和/或乏磷时对帕米尔绿球藻生长(A.测量干重的变化)和油脂含量(B.占干重的百分比)的影响。
具体实施方式
已知帕米尔绿球藻是绿藻类微藻，并在德州大学奥斯汀分校藻类培养物保藏中心进行保藏，其UTEX保藏编号为2498。本发明涉及用于提纯和培养帕米尔绿球藻以及增加帕米尔绿球藻细胞中的油脂富集的方法和成分。一方面，本发明提供了一种增加油脂在帕米尔绿球藻中富集的方法，其特征在于在培养基中培养该微藻并引导油脂在微藻中富集。在该方面的一个实施例中，所述培养包括在含有培养基的琼脂平板上培养微藻细胞，以及在含有培养基的容器培养微藻细胞。在该方面的另一个实施例中，所述培养包括在含有培养基的琼脂平板上培养微藻细胞，在含有生长培养基的容器中培养微藻细胞；以及进一步地在光生物反应器中培养微藻。在该方面的另一个实施例中，所述的培养包括在上述方法步骤中，至少有一步对微藻细胞实施光照。在该方面的另一个实施例中，所述的培养包括在上述方法步骤中，每一步都对微藻细胞实施光照。在该方面的另一个实施例中，用于照明的光可以是荧光灯光，正常白天环境光，或太阳光。在该方面的另一个实施例中，所述荧光灯的光具有至少200 μ m0l m-2s—1的强度。在该方面的另一个实施例中，培养基中含有微量兀素和从硝酸钠、硫酸镁、碳酸钠、氯化钙、乙二胺四乙酸二钠、磷酸氢二钾，以及其它类似物中所选取的无机化合物。在该方面的另一个实施例中，培养基中成分包括约0. 25-2. 5克/升硝酸钠，约0. 025-1. 75克/升7水合硫酸镁，约0. 5-3. 6克/升碳酸钠，约0. 025-0. 20克/升氯化钙，约0. 001-0. 005克/升乙二胺四乙酸二钠，约0. 075-1. 5克/升3水合磷酸氢二钾，约0. 2-2晕升/升的A5微量兀素，pH值在7. 4-8. 2的范围内。在该方面的另一个实施例中，培养基由下述成分组成约0. 25-2. 5克/升硝酸钠，约0. 025-1. 75克/升7水合硫酸镁，约0. 5-3. 6克/升碳酸钠，约0. 025-0. 20克/升氯化钙，约0. 001-0. 005克/升乙二胺四乙酸二钠，约0. 075-1. 5克/升3水合磷酸氢二钾，约0. 2-2晕升/升的A5微量兀素，pH值在7. 4-8. 2的范围内。在该方面的另一个实施例中，所述诱导油脂富集于微藻细胞是指在乏氮培养基中培养微藻细胞。在一个实施例中，该乏氮培养基的成分包括约0. 025-1. 75克/升7水合硫酸镁，约0. 5-3. 6克/升碳酸钠，约0. 025-0. 20克/升氯化钙，约0. 001-0. 005克/升乙二胺四乙酸二钠，约0. 075-1. 5克/升3水合磷酸氢二钾，约0. 2-2毫升/升的A5微量元素。在另一实施例中，乏氮培养基基本由以下成分组成0. 025-1. 75克/升7水合硫酸镁，约0. 5-3. 6克/升碳酸钠，约0. 025-0. 20克/升氯化钙，约0. 001-0. 005克/升乙二胺四乙酸二钠，约0. 075-1. 5克/升3水合磷酸氢二钾，以及约0. 2-2毫升/升的A5微量元素，pH值在约7. 4-8. 2的范围内。在该方面的另一个实施例中，所述诱导油脂富集在微藻细胞中，是指在乏磷环境培养微藻细胞。在一个实施例中，该乏磷培养基中含有约0. 25-2. 5克/升硝酸钠，约0. 025-1. 75克/升7水合硫酸镁，约0. 5-3. 6克/升碳酸钠，约0. 025-0. 20克/升氯化钙，约0. 001 0. 005克/升乙二胺四乙酸二钠，约0. 2-2毫升/升的A5微量元素。在该方面的另一个实施例中，乏磷培养基基本由以下成分组成约O. 25-2. 5克/升硝酸钠，约O. 025-1. 75克/升7水合硫酸镁，约O. 5-3. 6克/升碳酸钠，约O. 025-0. 20克/升氯化钙，约O. 001-0. 005克/升乙二胺四乙酸二钠，和大约O. 2-2毫升/升的A5微量元素，pH值在约7. 4-8. 2的范围内。在该方面的另一个实施例中，所述诱导油脂在微藻帕米尔绿球藻细胞中富集的光的强度是至少大于200mmol nT2s'在该方面的另一个实施例中，所述的诱导进一步包括在含有浓度至少为O. 1% w/V的氯化钠的培养基中培养微藻细胞。在一个实施例中，该培养基可以通过向普通培养基中添加适量的氯化钠方式获得。另一方面，本发明提供了一种用于提高微藻帕米尔绿球藻油脂富集的培养基，该培养基包括微量元素从硝酸钠、，硫酸镁、，碳酸钠、，氯化钙、，乙二胺四乙酸二钠、磷酸氢二钾，以及其它类似物中所选取的无机化合物。在该方面的一个实施例中，该培养基成分包括约O. 25-2. 5克/升硝酸钠，约O. 025-1. 75克/升7水合硫酸镁，约O. 5-3. 6克/升碳酸钠，约O. 025-0. 20克/升氯化钙，约O. 001 O. 005克/升乙二胺四乙酸二钠，约O. 075-1. 5克/升3水合磷酸氢二钾，以及约O. 2-2晕升/升的A5微量兀素。在该方面的另一个实施例中，该培养基基本由以下成分组成约O. 25-2. 5克/升硝酸钠，约O. 025-1. 75克/升7水合硫酸镁，约O. 5-3. 6克/升碳酸钠，约O. 025-0. 20克/升氯化钙约O. 001 O. 005克/升乙二胺四乙酸二钠，约O. 075-1. 5克/升3水合磷酸氢二钾，以及约O. 2-2晕升/升的A5微量兀素。在该方面的另一个实施例 中，该培养基包括约O. 025-1. 75克/升7水合硫酸镁，约O. 5-3. 6克/升碳酸钠，约O. 025-0. 20克/升氯化钙，约O. 001-0. 005克/升乙二胺四乙酸二钠，大约O. 075-1. 5克/升3水合磷酸氢二钾，约O. 2-2毫升/升的A5微量元素。在该方面的另一个实施例中，该培养基中有约O. 025-1. 75克/升7水合硫酸镁，约O. 5-3. 6克/升碳酸钠，约O. 025-0. 20克/升氯化钙，约O. 001-0. 005克/升乙二胺四乙酸二钠，约O. 075-1. 5克/升3水合磷酸氢二钾，以及约O. 2-2毫升/升的A5微量元素(乏氮)。在该方面的另一个实施例中，该培养基包括约O. 25-2. 5克/升硝酸钠，约O. 025-1. 75克/升7水合硫酸镁，约O. 5-3. 6克/升碳酸钠，约O. 025-0. 20克/升氯化钙，约O. 001 O. 005克/升乙二胺四乙酸二钠，约O. 2-2晕升/升的A5微量兀素。在该方面的另一个实施例中，该培养基有约O. 25-2. 5克/升硝酸钠，约O. 025-1. 75克/升7水合硫酸镁，约O. 5-3. 6克/升碳酸钠，约O. 025-0. 20克/升氯化钙，约O. 001 O. 005克/升乙二胺四乙酸二钠，约O. 2-2毫升/升的A5微量元素(乏磷)。在该方面的另一个实施例中，前述的任一培养基中还进一步包含浓度至少为O. 1% w/v以上的氯化钠。另一方面，本发明提供了一种含有富油的微藻帕米尔绿球藻细胞株的微藻细胞集落，其中所述的富油微藻细胞的油脂富集水平高于在正常状态之下培养的微藻细胞。在该方面的一个实施例中，该细胞集落是从培养基中分离的。在该方面的另一个实施例中，该细胞集落被提纯。在该方面的另一个实施例中，该细胞集落的油脂水平至少高于正常油脂水平10%。在该方面的另一个实施例中，该细胞集落的油脂水平至少高于正常油脂水平20%。在该方面的另一个实施例中，该细胞集落的油脂水平至少高于正常油脂水平30%。在该方面的另一个实施例中，该细胞集落的油脂水平至少高于正常油脂水平50%。在该方面的另一个实施例中，该细胞集落的油脂水平至少高于正常油脂水平100%。在该方面的另一个实施例中，该微藻细胞集落包含至少占干重30%的油脂。在该方面的另一个实施例中，该微藻细胞集落包含至少占干重40%的油脂。在该方面的另一个实施例中，该微藻细胞集落包含至少占干重50%的油脂。在该方面的另一个实施例中，该微藻细胞集落包含约占干重至少50-70%的油脂。在该方面的另一个实施例中，该微藻细胞集落包含约占干重至少55-65%的油脂。本技术领域的一般技术人员将能够明白，在本发明的实施中初始细胞浓度通常不受限制，例如，本文所公开的细胞培养基中初始细胞浓度范围可以为10，000 1，000，000个细胞每毫升。另一方面，本发明提供`了一种用于生产生物柴油的原料的方法，其特征在于，包括(a)在培养基中培育的微藻帕米尔绿球藻；(b)诱导油脂在微藻中富集，(b)从培养基分离富油微藻；(C)从富油微藻中提取脂类或油。在该方面的一个实施例中，所述提纯方法包括转移微藻到含有培养基的琼脂平板上。在该方面的另一个实施例中，所述诱导油脂富集包括在从约5°C至约35°C的温度条件下培养微藻细胞。在该方面的另一个实施例中，所述诱导油脂富集包括在从约25°C至约30°C的温度条件下培养微藻细胞。在该方面的另一个实施例中，该方法进一步包括在乏氮介质中培育微藻细胞。在该方面的另一个实施例中，该方法进一步包括在乏磷介质中培育微藻细胞。在该方面的另一个实施例中，所述诱导油脂富集包括对微藻使用光照。在该方面的另一个实施例中，该用于照明的光包括荧光灯的光，白天的环境光或阳光。在该方面的另一个实施例中，该荧光灯的光具有200 μ mo I IrT2iT1的强度。在该方面的另一个实施例中，该方法进一步包括扩大微藻的培养规模。在该方面的另一个实施例中，该扩大培养规模包括保持微藻在含有生长培养基的琼脂平板上，在含有50-1000毫升培养基的反应器中培养微藻，以及在5-20升的光生物反应器中培养微藻。另一方面，本发明提供微藻帕米尔绿球藻在生产油脂中的用途。在该方面的另一个实施例中，通过在培养基中培育微藻帕米尔绿球藻使油脂富集。
另一方面，本发明提供了作为生产生物柴油的原料的富集油脂的微藻帕米尔绿球藻细胞集落的用途。在该方面的一个实施例中，该细胞集落中的含油水平为高于自然状态下的微藻帕米尔绿球藻细胞株至少10%，至少20%，至少30%，至少40%，至少50%，至少60%，至少100%，或至少为120%。在该方面的另一个实施例中，该细胞集落的含油水平是干重的30% -70%。在该方面的另一个实施例中，该细胞集落的含油水平是干重的40% -70%。在该方面的另一个实施例中，该细胞集落的含油水平是干重的50% -65%。在该方面的另一个实施例中，该细胞集落的含油水平是干重的55% -60%。另一方面，本发明提供帕米尔绿球藻细胞株的富油细胞集落或其单个的变化形式在生产油料和/或脂质中的应用。在该方面的一个实施例中，该细胞集落中的含油水平为高于自然状态下的微藻帕米尔绿球藻细胞株至少10%，至少20%，至少30%，至少40%，至少50%，至少60%，至少100%，或至少为120%。在该方面的另一个实施例中，该细胞集落的含油水平干重的30% -70%。在该方面的另一个实施例中，该细胞集落的含油水平干重的40% -70%。在该方面的另一个实施例中，该细胞集落的含油水平干重的50% -65%。
在该方面的另一个实施例中，该细胞集落的含油水平干重的55% -60%。本文所用术语“约”，是指到基线值的百分之十(10%)内的值的范围。即，例如，“约100”指的是在90和110之间的范围内的值。当术语“约”用于描述范围时，是指上限值和下限值可以在基线值的百分之十(10%)范围内变动。本文所用术语“该”可表示单数和复数形式。通常地，当一个名词无论是以单数或以复数形式使用时，它同时表示单数和复数形式的该名词。本文所用的术语“生物燃料”，通常是指以某种方式来源于生物质的一种燃料。该术语涵盖了固体生物质、液体燃料和沼气。然而，在本发明中，专门指生物柴油。本文所用的术语“生物柴油”，是指通常已知的脂肪酸酯(例如，甲基、乙基、丙基、等等)。根据本发明所生产的微藻主要含有脂质(包括油-甘油三酯、游离脂肪酸、磷脂、等)。在对微藻进行培养后，首先收获微藻生物团，然后将其萃取，得到脂质(油和其它类脂)。这些脂质将被用作生产生物柴油的原料。例如，油脂丰富的微藻提取的脂类可以根据已知的化学反应和/或化学工程流程(例如，通过酯化和/或酯交换)很容易地转化为生物柴油。在本专利中，术语“油”和“脂质”有时可以互换使用。通过本发明提供的富油微藻生产的生物柴油具有广泛的应用，其中包括，但不限于，使用在标准的柴油发动机或转换的柴油发动机的车辆、火车、飞机等，或作为住宅或商业锅炉使用的加热燃料。该生物柴油可以单独使用，或与石油柴油混合。它也可以被用作一个采暖用油的低碳替代品。这些用途或其他用途取决于普通技术人员和现有技术，其中的描述仅仅是为了说明目的，但不做为限制。本文所使用的术语“乏氮介质”或“乏氮培养基”，是指培养基中包含没有添加含任何形式氮的化合物(例如，硝酸盐、亚硝酸盐、铵、等)。在一个实施例中，该乏氮介质含有O. 025-1. 75克/升7水合硫酸镁，约O. 5-3. 6克/升碳酸钠，约O. 025-0. 20克/升氯化钙，约O. 001-0. 005克/升乙二胺四乙酸二钠，约O. 075-1. 5克/升3水合磷酸氢二钾，约O. 2-2晕升/升的A5微量兀素。本文所使用的术语“乏磷介质”或“乏磷培养基”，指的是培养基中包含没有添加含有任何形式的磷的化合物(例如，磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、酯、亚磷酸等)。在一个实施例中，该乏磷介质包含约O. 25-2. 5克/升硝酸钠，O. 025-1. 75克/升7水合硫酸镁，约O. 5-3. 6克/升碳酸钠，约O. 025-0. 20克/升氯化钙，约O. 001-0. 005克/升乙二胺四乙酸二钠，约O. 075-1. 5克/升3水合磷酸氢二钾，以及约O. 2-2毫升/升的A5微量元素。本文所用的术语“A5微量元素”，是指含一种溶液，包含硼酸(约2. 86克/升)，氯化锰(约1.81克/升)，4水合硫酸锌(约O. 222克/升)，钥酸钠(约O. 0177克/升)，5水合硫酸铜(约O. 07克/升)，或任何含有基本相似组分的类似用途的商业产品。当在本申请中提到一个化合物的水合物形式时，本技术领域技术人员将会明白，用相同化合物的相当量的无水形式或其他的溶剂化物(包括水合物)形式也可以用以代替水合物形式，因为它们将能够达到大致相同的目的，并提供大致相同的结果。因此，无水形式、水合物形式，和其它的溶剂化物形式，可以被认为是功能等同物，都包含在本发明中。本发明将通过下列非限制性实施例进一步说明。
实施例 实施例1
收集和提纯绿藻帕米尔绿球藻在北卡罗莱纳州福赛斯县亚金河，使用浮游植物网(5微米的孔径)收集细胞。用无菌培养基洗涤后，将收集的细胞涂布在含有生长培养基的琼脂平板上(参见图2所示)。用荧光灯照明平板一周后，平板的细胞被转移到使用微生物转移环路的新的平板，。经过3次转移，获得无菌单克隆。鉴定一个帕米尔绿球藻单克隆，选定其进一步培育。帕米尔绿球藻细胞株的细胞形状像椭球，在固定培养中细胞成为球形。
实施例2
培养帕米尔绿球藻物种微藻细胞
一般程序帕米尔绿球藻细胞在指数生长期分别接种到内径为4. 5厘米，或2. 8厘米圆柱内。最大培养体积相应分别为450毫升和250毫升的圆柱容器。本次诱导油脂富集的实验中使用的为内径为4. 5厘米的容器，而其他类型的圆柱被用于具有不同生长特征的实验中。每个培养圆柱内的该培养物被施加强度为ΙΟΟμπιοΙ HT2s-1的连续光照，温度为25°C，通气为O. 6升/分钟(过滤的空气，通过微孔过滤膜，孔径为O. 22微米)。
培养基和生长条件本发明所使用的实现帕米尔绿球藻有机体的加速增长及增加有机体内油脂含量的生长培养基中包含有以下成分浓度超过O.1 %的氯化钠，培养基的成分包括有O. 25 2. 5克/升硝酸钠，O. 025-1. 75克/升7水合硫酸镁，O. 5-3. 6克/升碳酸钠，O. 025-0. 20克/升氯化钙，O. 001 O. 005克/升乙二胺四乙酸二钠，O. 075-1. 5克/升3水合磷酸氢二钾，O. 2 2毫升/升A5微量元素，最终的pH值在7. 4-8. 2的范围内。根据本发明来培养帕米尔绿球藻物种的方法包括以下步骤
A.保持帕米尔绿球藻在含有上述培养基的琼脂平板上；B.在含有50毫升上述生长培养基的125ml烧瓶中培养上述的帕米尔绿球藻细胞株至少72小时。然后将细胞转移到含有I升上述介质的2升烧瓶中。C.然后在含I升培养基的2升烧瓶中培养该细胞株至少24小时。D.然后在8升柱式光生物反应器中培养帕米尔绿球藻至少120小时。在
发明者丰平仲, 胡征宇, 卢凡 申请人:美国科乐生物能源有限公司