专利名称：在具有另外木糖异构酶活性的重组发酵单胞菌属中改善的木糖利用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物学和基因工程领域。更具体地，鉴定了在发酵单胞菌属(Zymomonas)中具有高活性木糖异构酶,其提供了改善的木糖利用和乙醇生产。
背景技术：
通过微生物生产乙醇提供了一种替代化石燃料的可供选择的能源，因此成为当前研究的重要领域。理想的情况是，产生乙醇以及其它有用产物的微生物能够利用木糖作为碳源，这是因为木糖是水解的木质纤维素生物质中的主要戊糖。生物质可提供丰富可用的低成本碳底物。已经对在天然情况下并不利用木糖的运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)和其它细菌乙醇菌原进行基因工程改造以用于木糖利用，其通过导入编码如下的基因1)木糖异构酶，其催化木糖向木酮糖的转化；2)木酮糖激酶,它将木酮糖磷酸化以形成5-磷酸木酮糖；3)转酮醇酶；以及4)转醛醇酶。所使用的编码区一般来自大肠杆菌(E. coli)基因。对运动发酵单胞菌菌株进行木糖代谢的工程改造(US 5514583，US5712133，US6566107, WO 95/28476，Feldmann 等人(1992) Appl. Microbiol. Biotechnol. ,38 :354-361,Zhang 等人(1995) Science 267 :240-243),以及对掠桐发酵杆菌(Zymobacter palmae)菌株的工程改造(Yanase 等人(2007)Appl. Environ. Mirobiol. 73 :2592-2599)已经获得成功。然而，工程化的菌株通常不像在葡萄糖上那样在木糖上生长并且产生乙醇。已经通过在木糖培养基上进行的连续传代而驯化了针对木糖利用进行工程改造的菌株，其产生了具有改善的木糖利用的菌株，如美国专利7，223，575和美国专利7，741，119中所描述。在共同拥有并共同待决的美国专利申请公开US 20090246846A1中公开了通过以来自突变的高活性运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子(Pgap)进行的大肠杆菌木糖异构酶表达而改善木糖利用的工程改造。依然需要对于在木糖利用中具有进一步改善的发酵单胞菌属菌株和其它细菌乙醇菌原。发明概述本发明提供了表达高活性木糖异构酶的重组木糖利用型发酵单胞菌属或发酵杆菌属(Zymobacter)细胞,其提供了改善的木糖利用和乙醇生产。因此，本发明提供了选自发酵单胞菌属和发酵杆菌属的重组细菌菌株，其包含编码具有木糖异构酶活性的多肽的异源核酸分子，其中所述多肽是组I木糖异构酶且被包括在标识为EC 5. 3.1. 5的酶的分类中，并且所述菌株利用木糖作为碳源。可用于本发明的木糖异构酶是当使用利用SEQ ID NO :2、24、32、34、42、54、66、68、78、96、100、106、108、122、126、128、130、132、135、137 和 142 准备的序型隐蔽马尔科夫模型(Profile Hidden MarkovModel)查询时,给出1E-15或更低的E值得分的酶；所述查询使用hmmsearch算法进行，其中Z参数设定为10亿。或是基于使用GAPPENALTY= 10、GAP LENGTHPENALTY = 0.1、以及Gonnet 250系列的蛋白质权重矩阵的默认参数的Clustal W比对方法，与选自 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146 和 147 的氨基酸序列具有至少90%的同一性的酶。或当与SEQ ID NO :66的参照氨基酸序列比较时具有以下保守氨基酸或以下保守氨基酸的90%的酶a)在位置226处的亮氨酸， b)在位置223处的甲硫氨酸，c)在位置191处的异亮氨酸，d)在位置195处的苏氨酸、丝氨酸或缬氨酸，e)在位置88处的甲硫氨酸、苏氨酸或quaninef)在位置290处的组氨酸，g)在位置221处的谷氨酸或天冬氨酸，h)在位置242处的苯丙氨酸、缬氨酸或亮氨酸，i)在位置243处的组氨酸，j)在位置193处的亮氨酸、苯丙氨酸或甲硫氨酸，k)在位置256处的谷氨酰胺，I)在位置213处的甘氨酸，m)在位置288处的脯氨酸、酪氨酸、丙氨酸或丝氨酸，和n)在位置249处的谷氨酰胺。在另一个实施方案中，本发明提供了改善重组细菌细胞中木糖利用的方法，其包括a)提供选自发酵单胞菌属和发酵杆菌属的重组细菌菌株，所述重组细菌菌株包含木糖利用途径，包含不属于组I的木糖异构酶；以及b)导入编码具有木糖异构酶活性的多肽的异源核酸分子，其中所述多肽是组I木糖异构酶。或者，本发明提供了生产乙醇的方法，其包括a)提供本发明的重组细菌菌株；以及b)在所述菌株生产乙醇的条件下，使(a)的菌株与木糖接触。
和序列描述图1示出了进行木糖利用工程改造的发酵单胞菌属的乙醇发酵途径的示意图。图2是木糖异构酶的系统发育树的示意图，其显示了组I和组II分支。图3是组I木糖异构酶的系统发育树的示意图。
图4是ZW641对照菌株和使用具有表达来自密苏里游动放线菌(A. missourinesis) (355_1、355_2)、短乳杆菌(L. brevis) (356_1、356_2)或大肠杆菌(357-1,357-2)的木糖异构酶的密码子优化编码区的基因进行转化的ZW641菌株的生长曲线图。图5是ZW641对照菌株和使用具有表达来自密苏里游动放线菌(355_1)、短乳杆菌(356-2)或大肠杆菌(357-2)的木糖异构酶的密码子优化编码区的基因进行转化的ZW641菌株的木糖异构酶活性图，其通过半胱氨酸-咔唑法进行测量。图6是ZW641对照菌株和使用具有表达来自密苏里游动放线菌(AMxylA)、大肠杆菌(ECxylA)、昏暗地嗜皮菌(Geodermatophilusobscurus) (GOxylA)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis) (MSxylA)、Salinispora arenicola(SAxylA)或 Xylanimonas cellulosilytica (XCxylA)的木糖异构酶的密码子优化编码区的基因进行转化的ZW641菌株的生长曲线图。图7是ZW641对照菌株和使用具有表达来自密苏里游动放线菌(AMxylA)、大肠杆菌(ECxylA)、昏暗地嗜皮菌(GOxylA)、耻垢分枝杆菌(MSxylA)、Salinisporaarenicola(SAxylA)或 Xylanimonascellulosilytica(XCxylA)的木糖异构酶的密码子优化编码区的基因进行转化的ZW641菌株的木糖异构酶活性图，其通过半胱氨酸-咔唑法进行测量。表I是木糖异构酶组I蛋白的序型HMM表。表I是在此以电子版形式提交的，并且以引用方式并入本文。表2是XI蛋白的E值得分表，各蛋白由SEQ ID NO标明，所述E值得分使用所述组I序型HMM进行查询。表2是在此以电子版形式提交的，并且以引用方式并入本文。根据下面的详细描述和附带的序列描述可以更充分地理解本发明，下面的详细描述和所附的序列描述形成了本申请的一部分。下列序列符合37 C. F. R.1. 821-1. 825 ( “对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求-序列规则”)，并且与世界知识产权组织(WIPO)标准ST. 25 (1998)以及EPO和PCT的序列列表要求(规则5. 2和49. 5 (a-bis规则)，以及行政指导的208节和附录C)相一致。核苷酸的符号和格式以及氨基酸序列数据符合如37 C.F.R. § 1.822所示的规则。表3 :组I木糖异构酶的编码区和蛋白质的SEQ ID NO。对种子蛋白质给出Uniprot获取号(AC)并且对并非种子的蛋白质给出NCBI GI编号。
权利要求
1.选自发酵单胞菌属(Zymomonas)和发酵杆菌属(Zymobacter)的重组细菌菌株,包含编码具有木糖异构酶活性的多肽的异源核酸分子，其中所述多肽是组I木糖异构酶且被包括在标识为EC 5. 3.1. 5的酶的分类中，并且其中所述菌株利用木糖作为碳源。
2.根据权利要求1所述的重组细菌菌株，其中当使用利用SEQID NO :2、24、32、34、42、54、66、68、78、96、100、106、108、122、126、128、130、132、135、137 和 142 准备的序型隐蔽马尔科夫模型(Profile Hidden Markov Model)查询时,所述具有木糖异构酶活性的多肽给出1Ε-15或更低的E值得分；所述查询使用hmmsearch算法进行,其中Z参数设定为10亿。
3.根据权利要求1所述的重组细菌菌株，其中所述具有木糖异构酶活性的多肽 I)当与SEQ ID NO 66的参照氨基酸序列比较时具有以下保守氨基酸 a)在位置226处的亮氨酸， b)在位置223处的甲硫氨酸， c)在位置191处的异亮氨酸， d)在位置195处的苏氨酸、丝氨酸或缬氨酸， e)在位置88处的甲硫氨酸、苏氨酸或quanine， f)在位置290处的组氨酸， g)在位置221处的谷氨酸或天冬氨酸， h)在位置242处的苯丙氨酸、缬氨酸或亮氨酸， i)在位置243处的组氨酸， j)在位置193处的亮氨酸、苯丙氨酸或甲硫氨酸， k)在位置256处的谷氨酰胺， 1)在位置213处的甘氨酸， m)在位置288处的脯氨酸、酪氨酸、丙氨酸或丝氨酸，和 η)在位置249处的谷氨酰胺；或 2)具有部分(I)的保守氨基酸的至少90%。
4.根据权利要求1所述的重组细菌菌株，其中基于使用GAPPENALTY=10、GAP LENGTHPENALTY = O.1、以及Gonnet 250系列的蛋白质权重矩阵的默认参数的Clustal W比对方法，所述木糖异构酶具有的氨基酸序列与选自SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146和147的氨基酸序列具有至少90%的同一性。
5.根据权利要求1所述的重组细菌菌株，其中所述木糖异构酶分离自选自以下的微生物游动放线菌属(Actinoplanes)、节杆菌属(Arthrobacter)、链霉菌属(Streptomyces)、栖热菌属(Thermus)、嗜热棒菌属(Thermobaculum)、滑柱菌属(Herpetosiphon)、酸杆菌门(Acidobacteria)、玫瑰弯菌属(Roseiflexus)、亚栖热菌属(Meiothermus)、异常球菌属(Deinococcus)、亚栖热菌属(Meiothermus)、斯氏菌属(Stackebrandtia)、克里布所菌属(Kribbella)、木聚糖单胞菌属(Xylanimonas)、拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)、细小链抱菌属(Catenulispora)、链抱囊菌属(Streptosporangium)、地嗜皮菌属(Geodermatophilus)、放线束丝菌属(Actinosynnema)、糖单孢菌属(Saccharomonospora)、酸栖热菌属(Acidothermus)、嗜热裂抱菌属(Thermobifida)、类诺卡氏菌属(Nocardioides)、两面神菌属(Janibacter)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、雷夫松氏菌属(Leifsonia)、棍状杆菌属(Clavibacter)、小单孢菌属(Micromonospora)、盐水孢菌属(Salinispora)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、琼斯氏菌属(Jonesia)、中村氏菌属(Nakamurella)、放线菌属(Actinomyces)、动弯杆菌属(Mobiluncus)、短状杆菌属(Brachybacterium)、布坦堡菌属(Beutengergai)、弗兰克氏菌属(Frankia)和放线细菌属(Actinobacterium)。
6.根据权利要求5所述的重组细菌菌株，其中所述木糖异构酶分离自密苏里游动放线菌(Actinoplanes missouriensis)。
7.根据权利要求4所述的重组细菌菌株，其中基于使用GAPPENALTY=10、GAP LENGTHPENALTY = O.1、以及Gonnet 250系列的蛋白质权重矩阵的默认参数的Clustal W比对方法，所述具有木糖异构酶活性的组I多肽与选自SEQ ID NO :24、66、134、140、143、145和147的氨基酸序列具有至少90%的同一性。
8.改善重组细菌细胞中木糖利用的方法，包括 a)提供选自发酵单胞菌属和发酵杆菌属的重组细菌菌株，所述重组细菌菌株包含木酮糖激酶、转酮醇酶、转醛醇酶，并且任选地包含不属于组I的木糖异构酶；以及 b)导入编码具有木糖异构酶活性的多肽的异源核酸分子，其中所述多肽是组I木糖异构酶； 其中木糖利用与包含不属于组I的木糖异构酶的相同菌株相比是改善的。
9.根据权利要求8所述的方法，其中当使用利用SEQID NO :2、24、32、34、42、54、66、68、78、96、100、106、108、122、126、128、130、132、135、137 和 142 准备的序型隐蔽马尔科夫模型查询时，所述具有木糖异构酶活性的多肽给出1E-15或更低的E值得分；所述查询使用hmmsearch算法进行，其中Z参数设定为10亿。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述具有木糖异构酶活性的多肽 I)当与SEQ ID NO 66的参照氨基酸序列比较时具有以下保守氨基酸 a)在位置226处的亮氨酸， b)在位置223处的甲硫氨酸， c)在位置191处的异亮氨酸， d)在位置195处的苏氨酸、丝氨酸或缬氨酸， e)在位置88处的甲硫氨酸、苏氨酸或quanine， f)在位置290处的组氨酸， g)在位置221处的谷氨酸或天冬氨酸， h)在位置242处的苯丙氨酸、缬氨酸或亮氨酸， i)在位置243处的组氨酸， j)在位置193处的亮氨酸、苯丙氨酸或甲硫氨酸， k)在位置256处的谷氨酰胺， I)在位置213处的甘氨酸， m)在位置288处的脯氨酸、酪氨酸、丙氨酸或丝氨酸，和 η)在位置249处的谷氨酰胺；或2)具有部分(I)的保守氨基酸的至少90%。
11.生产乙醇的方法,包括 a)提供权利要求1的重组细菌菌株；以及 b)在所述菌株生产乙醇的条件下，使(a)的菌株与木糖接触。
12.根据权利要求11所述的方法，其中当使用利用SEQID NO :2、24、32、34、42、54、66、68、78、96、100、106、108、122、126、128、130、132、135、137 和 142 准备的序型隐蔽马尔科夫模型查询时，所述具有木糖异构酶活性的多肽给出1E-15或更低的E值得分；所述查询使用hmmsearch算法进行，其中Z参数设定为10亿。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述具有木糖异构酶活性的多肽 I)当与SEQ ID NO :66的参照氨基酸序列比较时具有以下保守氨基酸 a)在位置226处的亮氨酸， b)在位置223处的甲硫氨酸， c)在位置191处的异亮氨酸， d)在位置195处的苏氨酸、丝氨酸或缬氨酸， e)在位置88处的甲硫氨酸、苏氨酸或quanine， f)在位置290处的组氨酸， g)在位置221处的谷氨酸或天冬氨酸， h)在位置242处的苯丙氨酸、缬氨酸或亮氨酸， i)在位置243处的组氨酸， j)在位置193处的亮氨酸、苯丙氨酸或甲硫氨酸， k)在位置256处的谷氨酰胺， 1)在位置213处的甘氨酸， m)在位置288处的脯氨酸、酪氨酸、丙氨酸或丝氨酸，和 η)在位置249处的谷氨酰胺；或 2)具有部分(I)的保守氨基酸的至少90%。
14.根据权利要求11所述的方法，其中基于使用GAPPENALTY = 10、GAP LENGTHPENALTY = 0.1、以及Gonnet 250系列的蛋白质权重矩阵的默认参数的Clustal W比对方法，所述木糖异构酶具有的氨基酸序列与选自SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、2、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、I18、120、122、124、126、128、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146和147的氨基酸序列具有至少90%的同一性。
15.根据权利要求11所述的方法，其中所述木糖异构酶分离自选自以下的微生物游动放线菌属、节杆菌属、链霉菌属、栖热菌属、嗜热棒菌属、滑柱菌属、酸杆菌门、玫瑰弯菌属、亚栖热菌属、异常球菌属、亚栖热菌属、斯氏菌属、克里布所菌属、木聚糖单胞菌属、拟诺卡氏菌属、细小链孢菌属、链孢囊菌属、地嗜皮菌属、放线束丝菌属、糖单孢菌属、酸栖热菌属、嗜热裂孢菌属、类诺卡氏菌属、两面神菌属、分枝杆菌属、雷夫松氏菌属、棍状杆菌属、小单孢菌属、盐水孢菌属、纤维单胞菌属、琼斯氏菌属、中村氏菌属、放线菌属、动弯杆菌属、短状杆菌属、布坦堡菌属、弗兰克氏菌属和放线细菌属。
全文摘要
据发现，表达来自密苏里游动放线菌的木糖异构酶的发酵单孢菌属在生长于包含木糖的培养基时具有改善的木糖利用、生长和乙醇生产。通过分子系统发生分析和序型隐蔽马尔科夫模型分析在结构上鉴定了与密苏里游动放线菌的木糖异构酶相关的木糖异构酶，从而提供了可用于改善木糖利用的木糖异构酶。
文档编号C12N9/92GK103003423SQ201180032513
公开日2013年3月27日 申请日期2011年6月28日 优先权日2010年6月29日
发明者R.Y.卡塞, M.齐, L.陶, P.V.维塔宁, J.杨 申请人:纳幕尔杜邦公司