高灵敏度的突变基因检测方法

专利名称：高灵敏度的突变基因检测方法
技术领域：
本发明涉及检测掺杂于野生型基因簇中的已知突变基因的方法。
背景技术：
癌症是与心脏疾病、脑血管疾病并列的三大生活习惯病之一，是日本目前最大的死亡原因。癌症发生通常是构成人体的一部分细胞发生癌化，成为癌细胞而引起的。多数情况下，细胞的癌化是缘于与细胞分裂、细胞增殖等相关的基因的突变。这种成为癌症原因的基因突变多数情况是基因碱基序列上的一个碱基置换为其它碱基的点突变。为了癌症的早期治疗，重要的是早期发现癌细胞。癌细胞的有无通常是由检体采集病理组织切片或细胞，在固定、染色后由细胞检验者等在显微镜下进行诊断。但是，这种病理诊断方法要求组织形态学的专业知识和技术，而且直到获得结果需要数天时间，且具 有难以大量处理的技术问题。因此，近年来应用PCR法等基因扩增方法，开发了在基因水平迅速且简便地检测癌细胞的方法。可举出例如，将PNA (Peptide Nucleic Acid,肽核酸)、LNA (Locked Nucleic Acid，锁核酸)等核酸类似物用作引物、探针的突变基因检测方法。PNA是指也被称为肽核酸的人工化学合成的核酸类似物。具有将由戊糖和磷酸构成的核酸基本骨架置换为以甘氨酸为单元的无电荷的多酰胺骨架的结构。与DNA、RNA相t匕，更为特异性且更强力地与具有互补碱基序列的核酸结合。另一方面，由于是化学合成物质，因而具有核酸聚合酶、核酸酶不作用的性质。利用这种性质，已知如非专利文献I所示，使用野生型ras基因特异性的PNA低聚物进行PCR法，由此抑制野生型基因，仅选择性扩增突变基因的方法等。LNA是也被称为锁核酸的核酸类似物(专利文献1)，是具有通过核糖核苷的核糖环的2’ -氧与4’ -碳间的亚甲基键形成环的结构的分子的总称。与PNA相同地，与具有互补碱基序列的核酸的亲和性高，与DNA、RNA相比，更为特异性且更为强力地结合。另一方面，与PNA不同的是，除了具有对核酸酶的敏感性之外，还可发挥作为核酸聚合酶的引物的功能。利用这种性质，也报道有如非专利文献2所示，使用LNA探针通过PCR法检测增大静脉血栓栓塞病发病率的V因子Leiden突变(Factor V Leiden mutation)的方法。但是，通常由检体获得的细胞群体的大多数是具有野生型基因的正常细胞，仅极少掺杂具有突变基因的癌细胞。因此，即使进行采用了上述那样的基因扩增方法的突变基因检测方法，野生型基因的背景仍然高，故检测灵敏度低，而且结果的可靠性也不能说是充分的。因此，在实际临床中用作基因检查方面仍残留有许多问题。但是，这种从大量的野生型基因中检测突变基因的技术不仅对于癌症的早期发现，而且对于临床上癌症的治疗也具有极其重要的意义。其显著的实例是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer:以下记为NSCLC)的分子靶向药物吉非替尼(Gefitinib :商品名寸’’Iressa、7 7卜9七木力制造销售)或埃罗替尼(Erlotinib :商品名“夕^ /S'，，Tarceva、中外制药制造销售)的敏感性。NSCLS是占肺癌病例的约75%的疾病。由于进行性快，所以半数以上的患者在发现癌症时多数已经是不能手术的状态，而且死亡率也高。对于这类进行性肺癌，通常通过将使用了作为抗癌剂的钼制剂、多西他赛(Docetaxel)的化学疗法与放射疗法并用来进行治疗，但除了一部分病例之外，并未取得充分的效果(非专利文献3)。以往抗癌剂的作用是广泛阻断DNA合成或细胞分裂，而吉非替尼、埃罗替尼却是以人上皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor :以下记为EGFR)为祀。EGFR在细胞外结构域与上皮生长因子(EFG)等配体结合时会形成二聚体，引起细胞内结构域的酪氨酸激酶活化。该活性引起自身磷酸化，激活下游的细胞内信号传导通路。从EGFR的活化参与细胞增殖、NSCLC患者的多数确认到EGFR基因的突变、并且NSCLC患者中观察到了EGFR蛋白质的过量表达等结果，认为EGFR基因的突变是NSCLC的发病原因之一。吉非替尼通过阻断EGFR的自身磷酸化而具有阻断信号传导的作用，因而被称为分子靶向剂。吉非替尼在日本于2002年获得批准。通过该治疗剂的给药，一部分NSCLC患者中观察到了戏剧性的治疗效果。另一方面，也发生有间质性肺炎等副作用导致死亡的例子。对于吉非替尼的这种作用效果的二面性，原因尚不清楚，但近年来在非专利文献4和5中，发·表了 EGFR的基因突变与吉非替尼的有效性的密切关系。根据这些文献，由于吉非替尼的给药而获得了良好治疗效果的NSCLC患者(吉非替尼敏感性患者)均在EGFR基因上的特定位置具有突变。即，暗示吉非替尼并不是作为EGFR的活性阻断剂起作用，而是作为突变EGFR的活性阻断剂发挥作用。因此，只要能够检测EGFR基因上的特定突变的有无，则可以研究对NSCLC患者给予吉非替尼的好坏。如上述实例所示，掺杂于野生型基因簇中的突变基因的检测在实现癌症的早期发现、对应各个患者的量身治疗方面极为重要，因而期望开发可以简便、并且高灵敏度地检测这种突变基因的方法。作为这种方法，公知的是通过对目标部位使用由具有野生型基因的序列的PNA构成的钳引物(clamp primer)、与含有LNA且由突变基因的序列构成的突变探针来进行基因扩增反应，可以迅速、简便、高精度并且高灵敏度地检测掺杂于基因库中的突变基因的有无的 “PNA-LNA-PCR Clamp 法”(专利文献 2)。根据PNA-LNA-PCR Clamp法，即使基因库中的突变基因的掺杂率为O. 1%也可以检测，另外，也基本检测不到伴随扩增反应出现的背景。进而，直至出现结果所需的时间为约2小时即可。另外，如非专利文献6中所示，第20外显子中也已知I种点突变，报道了检测该突变的 PNA-LNA-PCR Clamp 法。现有技术文献 专利文献
专利文献I :日本特表2002-521310号公报 专利文献2 :日本专利第4216266号说明书 非专利文献
非专利文献 I :Thiede C. et al.，Nucleic Acids Res.，1996，24，983-984 非专利文献 2 0rum H. et al.，Clin Chem.，1999,45 :11 ； 1898-1905 非专利文献 3 :Muhsin M. et al. ,Nat. Rev. Drug Discov. , 2003, 2 (7);515_516. 非专利文献 4:Paez G. J. et al.，Science，2004，304 ; 1497-1500非专利文献 5:Lynch T. J. et al. , N Engl J Med, 2004,350 ；2129-2139 非专利文献 6 Miyazawa H. et al. , Cancer Sci. ,2008,99 ;595_600。

发明内容
发明要解决的技术问题
较为容易地自患者采集的检体中，末梢血液、正常细胞的混入造成多数情况下肿瘤细胞的比率降低。例如，胸腔积液检体中混入大量含有正常细胞的末梢血液，则肿瘤细胞的比率降低，结果，预测被认为含有在肿瘤细胞中的突变基因的比例降低。同样地，对于刷片洗涤液检体，采集时混入被刷片所挤压出的正常细胞，会发生同样的情况。这样，对于肿瘤细胞比例容易降低的检体，在检测灵敏度和可靠性方面并不充分，期望能够以更高灵敏度进行检测的方法。专利文献2中记载的实施例中，示出了可以检测最大O. 1%的突变型基因。但该实施例却是混合有仅克隆EGFR基因的特定区域的质粒而得的基因库的结果。由临床上使用的检体而得的基因库中，EGFR基因之外的人基因组DNA占大多数，EGFR基因在混合 存在有各种基因的基因库中所占的比例较混合质粒而得的基因库低。因此，EGFR突变型基因的检测灵敏度有时降低。另外，自临床检体所得的基因库混有来自正常细胞的人基因组DNA (含正常EGFR基因)的可能性高，从而要求以更高的灵敏度检测突变基因。作为供于例如以PNA-LNA-PCR Clamp法为代表的以往的高灵敏度检测方法的基因库，本发明人通过实施利用PNA Clamp法的前扩增步骤(预扩增)，提高突变基因的比例，并通过后续步骤的PNA-LNA-PCR Clamp法高灵敏度地进行检测，从而发明了具有以往以上的高灵敏度的突变基因检测方法。因此，本发明的课题在于提供各种高灵敏度检测方法、特别是PNA-LNA-PCR Clamp法的改良方法来作为可以迅速、简便、高精度、而且高灵敏度地检测掺杂于基因库中的突变基因的有无的方法。用于解决技术问题的方法
前述技术问题可通过本发明所述的下述技术方案解决
[I]突变基因检测方法，其是检测掺杂于基因库中的已知突变基因的有无的方法，该方法包括
(1)使(Ia)钳引物，其由与具有野生型基因的序列或野生型基因的互补序列的目标部位的全部或一部分杂交的PNA构成，
(Ib)可以对包含具有突变基因的序列的目标部位的区域进行扩增的引物，与 (Ic)前述基因库，
在基因扩增用反应液中共存，通过基因扩增方法对包含突变基因的目标部位的区域选择性地进行扩增的步骤，
(2)将前述步骤(I)中所得的扩增产物或其一部分作为模板，通过基因检测方法对包含突变基因的目标部位的检测区域选择性地进行检测，由此检测该突变基因的有无的步骤；
[2][I]的突变基因检测方法，其中前述步骤(2)是
使(2a)钳引物，其由与具有野生型基因的序列的目标部位的全部或一部分杂交的PNA构成，且具有与步骤(I)中所用钳引物(Ia)相同或不同的碱基序列，
(2b)突变探针，其与具有突变基因的序列的目标部位的全部或一部分杂交，且序列的至少一部分由LNA构成，与
(2c)前述步骤(I)中所得的扩增产物或其一部分，
在基因扩增用反应液中共存，通过基因扩增方法对包含突变基因的目标部位的检测区域选择性地进行扩增，由此检测该突变基因的有无的步骤；
[3][I]的突变基因检测方法，其中前述步骤(2)是
使(2a’)钳引物，其由与具有野生型基因的互补序列的目标部位的全部或一部分杂交的PNA构成，且具有与步骤(I)中所用钳引物(Ia)相同或不同的碱基序列，
(2b)突变探针，其与具有突变基因的互补序列的目标部位的全部或一部分杂交，且序列的至少一部分由LNA构成，与
(2c)前述步骤(I)中所得的扩增产物或其一部分，
在基因扩增用反应液中共存，通过基因扩增方法对包含突变基因的目标部位的检测区域选择性地进行扩增，由此检测该突变基因的有无的步骤；
[4][2]或[3]的突变基因检测方法，其中前述步骤(2c)中的基因扩增方法为PCR法；
[5][2] [4]的突变基因检测方法，其中前述突变探针包含RNA ；
[6][2] [5]的突变基因检测方法，其中前述突变探针的一个末端被荧光物质所标记，另一个末端被抑制前述荧光物质的淬灭剂所标记；
[7][2] [5]的突变基因检测方法，其中将前述突变基因的检测区域的扩增产物用核酸染色剂进行染色；
[8][2] [7]的突变基因检测方法，其中通过荧光强度的增加来经时性地检测前述突变基因的检测区域的扩增产物的增加；
[9][2] [8]的突变基因检测方法，其中前述突变为点突变；
[10][2] [8]的突变基因检测方法，其中前述突变为缺失突变；
[11][2] [10]的突变基因检测方法，其中前述钳引物的链长为14碱基 18碱基；
[12][I]的突变基因检测方法，其中前述步骤(2)中的基因检测方法为侵染法、TaqMan-PCR法、蝎形探针扩增法(> ^ 一才> 7 — Λ <法)、DNa芯片法、PCR-RFLP法、PCR-SSCP 法、PCR-HRM 法、gFCS 法、Southern 印迹法；
[13][I] [12]的突变基因检测方法，其中前述突变基因为人上皮生长因子受体的突变基因。发明效果
根据本发明，即使是如胸腔积液检体、刷片洗涤液检体等肿瘤细胞的比例容易降低的检体那样通过公知的各种高灵敏度检测方法、特别是PNA-LNA-PCR Clamp法也难以检测的检体，也可以高灵敏度且高精度地检测掺杂于基因库中的突变基因的有无。


[图I]用于说明实施方式I的原理的说明图。[图2]用于说明实施方式5的原理的说明图。
具体实施例方式本发明方法是公知的各种高灵敏度检测方法、特别是PNA-LNA-PCR Clamp法(例如，专利第4216266号说明书中记载的PNA-LNA-PCR Clamp法)的改良方法，作为实施各高灵敏度检测方法(主要检测步骤)的前阶段，进行特定的前扩增步骤(预扩增)。例如，利用PNA-LNA-PCR Clamp法作为高灵敏度检测方法时，作为PNA-LNA-PCR Clamp法的选择性扩增和检测步骤(以下，称为主扩增步骤)的前阶段，除了进行特定的前扩增步骤(预扩增)之外，可以与通常的PNA-LNA-PCR Clamp法相同地实施。以下，例示能够适用于本发明的各种高灵敏度检测方法，然后对作为本发明优选方式的通常的PNA-LNA-PCR Clamp法，基于实施方式I 实施方式12进行说明，并对本发明方法的前扩增步骤进行说明。作为能够适用于本发明的高灵敏度检测方法，只要是可以检测掺杂在野生型基因簇中的已知突变基因(特别是掺杂率低的突变基因)的基因检测方法，则没有特别限定，可举出例如，PNA-LNA-PCR Clamp法、侵染法、TaqMan-PCR法、蝎形探针扩增法等基因扩增方法、或 DNA 芯片法、PCR-RFLP 法、PCR-SSCP 法、PCR-HRM 法、gFCS 法、Southern 印迹法等基 因鉴定方法。以下，以使用PNA-LNA-PCR Clamp法作为高灵敏度检测方法时的方式为例，对本发明进行说明，但本发明并不限于PNA-LNA-PCR Clamp法。<实施方式1>
对实施方式I进行说明。本实施方式主要涉及权利要求2。本实施方式的概要是突变基因检测方法，其是检测掺杂于基因库中的已知突变基因的有无的方法，其中，使由与具有野生型基因的序列的目标部位的全部或一部分杂交的PNA构成的钳引物、与具有突变基因的序列的目标部位的全部或一部分杂交且序列的至少一部分由LNA构成的突变探针、与前述基因库在基因扩增用反应液中共存，通过基因扩增方法对包含突变基因的目标部位的检测区域选择性地进行扩增，由此检测该突变基因的有无。对于实施方式I的要件进行说明。首先，本发明中，关于DNA、RNA、核酸、基因、基因表达、编码、互补、模板、启动子、探针、引物、杂交、PCR等用语的定义，是与当前分子生物学、遗传学、基因工学等中通常广为使用的用语相同的含义。本发明中，“野生型基因”是指未发生突变，具有原本正常功能的含有遗传信息的基因。此处所说的遗传信息不仅包含mRNA、tRNA、rRNA、snRNA等编码信息的转录区域，还包含启动子等基因表达上必需的调节区域。本发明中，“突变基因”是指发生了突变的基因。“突变”是指DNA、RNA等的核酸序列的改变，相当于遗传学等中使用的碱基置换、插入、缺失、倒位、重复、易位等。该突变基因中，突变所存在的区域不仅包含转录区域，还包含启动子等基因表达上必需的调节区域。应予说明，突变不一定导致突变基因具有功能上的改变。本发明中，“基因库”是指由大量基因构成的基因群体。例如，相当于由患者的胸腔积液中所含的全部细胞所得的基因组DNA等。此时，不用管作为检测对象的基因中的突变基因的存在率如何。例如，可以100%为野生型基因，也可以50%为野生型基因而剩余50%为突变基因。另外，该库的基因可以是由细胞获得的基因组DNA，也可以是以由细胞制备的mRNA为模板进行反转录反应而得的cDNA，还可以是人工混合克隆化得到的大量基因而成的。本发明中，“序列”是指基因、引物或探针中的喊基的排列即喊基序列。该喊基序列可以由DNA、RNA等核酸构成，也可以由PNA、LNA等核酸类似物构成，还可以由它们的组合构成。本发明中，例如，在该碱基序列特别由DNA构成时记为“DNA序列”，而该碱基序列由PNA构成时记为“PNA序列”。另外，本发明中，“多聚核苷酸”是指由DNA、RNA、PNA、LNA、或者它们的组合构成的物质。本发明中，“目标部位”是指突变基因中观察到突变的碱基所存在的部位、或者是由突变导致碱基丧失的部位，包括野生型基因，本发明中是指作为检测目标的部位。例如，存在碱基置换时，野生型基因、突变基因均是指该碱基置换的碱基。另外，存在插入时，对于突变基因是指插入的碱基，对于野生型基因则是指碱基在突变基因中插入的部位。另外，存在缺失时，对于突变基因是指缺失所致碱基丧失的部位，对于野生型基因则是指突变基因中所失去的碱基。该目标部位的序列可以是显示具有编码遗传信息的序列一侧(以下称为有义侧)的序列，也可以是显示具有有义侧的互补序列侧(以下称为 反义侧)的序列。本发明中，“PNA”不仅包含通常的PNA，还包含基于PNA进行改良而得的具有与PNA类似性质的PNA衍生物。例如,相当于Active Motif社的gripNA等。本发明中，“钳引物”无论是在PNA-LNA-PCR Clamp法的主扩增步骤中使用，或者是在以下详述的前扩增步骤中使用，均是指由与目标部位杂交的PNA构成的引物。该钳引物的全序列由PNA构成。因此，作为引物进行杂交时，由于PNA的性质而对碱基序列显示非常高的选择性。另外，由于PNA不与核酸聚合酶、核酸酶作用的性质，因而该钳引物也不会发挥作为引物的功能，对核酸酶也具有完全的耐性。本实施方式的特征在于，该钳弓I物的碱基序列为野生型基因的序列的互补序列。该钳引物的碱基序列只要是与目标部位的一部分、或全部特异性杂交的序列，则没有特别限定。钳引物的长度只要是10碱基至25碱基则没有特别限定。基因库中，由于野生型基因的数量大于突变基因的数量，因而为了钳引物可以充分与野生型基因杂交，优选钳引物在基因扩增用反应液中的浓度为突变探针的浓度的10倍以上。例如，使突变探针的浓度为lOOnmol/L时，则使钳引物的浓度为lymol/L、优选5 μ mol/L左右。应予说明，钳引物的合成可以委托进行PNA低聚物的委托合成的各厂家进行。例如，可以委托7 7 f - -7' ^ )' >社来进行。本发明中，“LNA”不仅包含通常的氧基-LNA、硫基-LNA、氨基-LNA等LNA突变体，还包含基于LNA进行改良得到的具有与LNA类似性质的LNA衍生物。本发明中，“突变探针”是指与目标部位杂交，且DNA序列中的至少一个以上被置换为LNA的突变探针。本实施方式的特征在于，该突变探针的碱基序列是突变基因的序列的互补序列。该突变探针的碱基序列与目标部位的一部分、或全部特异性地杂交，Tm值优选为50°C至65°C、更优选为54°C至56°C的范围内即可，没有特别限定。突变探针的序列优选按照操作规程进行设计，Tm值通过LNA Tm prediction tool (http://Ina-tm. com/)来确认。该突变探针的碱基数量为10碱基至50碱基，优选为15碱基至25碱基。LNA的数目可以存在I个以上，也可以全部被置换为LNA。该突变探针中，对于与LNA置换的位置，当目标部位存在未见于野生型基因中的碱基时，优选将该碱基的至少一个以上用LNA置换。例如，突变为数个碱基的插入时，可以将插入的数个碱基中的至少一个以上用LNA置换。突变探针的合成可以委托进行LNA低聚物的委托合成的各厂家进行。例如，可由荷兰Exicon社或美国 Integrated DNA Technologies (IDT)社等进行。本发明中“基因扩增方法”是指使用扩增引物对包含目标部位的检测区域进行扩增的方法。本实施方式中使用的基因扩增反应只要可以扩增检测区域则没有特别限制。例如，可以是 PCR 法，可以是 ICAN 法(isothermal and chimeric primer-initiatedamplification of nucleic acids法,等温嵌合引物引发的核酸扩增法)、也可以是LAMP法(Loop-mediated isotheremal amplification法，环介导等温扩增法)。该基因扩增方法中，将用于进行基因扩增的化学反应称为“基因扩增反应”。本发明中，“基因扩增用反应液”是指含有前述基因扩增方法中进行基因扩增反应时所必需的试剂等的溶液。该基因扩增用反应液的组成根据所使用的基因扩增方法而有所不同，但通常基本在缓冲液中含有作为基质的4种脱氧核苷三磷酸(dATP、dTTP、dCTP、dGTP :以下统称为dNTP)、作为酶的DNA聚合酶、作为前述酶的辅因子的镁离子、与作为延伸用引物的扩增引物。前述dNTP的浓度可以在4种的各终浓度为100nmol/L至400nmol/L的范围研究最佳浓度。前述DNA聚合酶使用的是具有适于该基因扩增方法的性质的DNA聚合酶。例如，若为LAMP法则可以使用链置换型DNA聚合酶。前述镁离子浓度可以在终浓度为lmmol/L至6mmol/L的范围研究最佳浓度。前述“扩增引物”是指用于通过基因扩增方法扩增检测区域的引物。扩增引物由DNA、RNA等核酸、或LNA、或它们的组合构成。扩增引物的浓度可以在终浓度为100nmol/L至I μ mol/L的范围研究最佳浓度。此时，优选不存在与作为突变探针的5’侧的上游杂交的扩增引物。另外，此时引物序列中可以包含目标部位。扩增引物的数量只要可以通过前述基因扩增方法扩增包含目标部位的检测区域则没有特别限制。例如，I个引物可以以延伸方向相对的方式单独进行杂交时，扩增引物的数目可以是I个。另外，如果可以按延伸方向相互相对的形式与模板杂交时，也可以为不同的I个扩增引物。扩增引物的碱基数量为10碱基至40碱基的范围则没有特别限制，优选为15碱基至30碱基，特别优选为18碱基至25碱基。扩增引物间的距离，即检测区域为100碱基至5000碱基(5kb :以下将1000碱基表示为Ikb)的范围则没有特别限制，优选为150碱基至2kb。扩增引物的序列，只要可以通过前述基因扩增方法扩增包含目标部位的检测区域，Tm值为50°C至65°C的范围内，优选为55°C至60°C的范围内，则没有特别限制。扩增引物的序列的设计可以按照操作规程进行，也可以使用适当的引物设计用软件进行。例如，可以使用 Primer3 software (http://frodo.wi.mit.edu/cgi_bin/primer3/primer3. cgi)等。前述突变探针可作为扩增引物发挥功能。缓冲液具有可获得前述DNA聚合酶活性的最佳pH和最佳盐浓度。根据使用的基因扩增方法，也可以进一步含有核糖核酸酶H (RNaseH)、反转录酶(RT)等。另外，对于基因扩增用反应液，市售有各种基因扩增法的反应用的各种反应液，也可以使用上述市售试剂盒中所附带的反应液。将Taq DNA聚合酶作为酶时，列举该基因扩增用反应液的基本组成的一例，则为 IOmmoI/L Tris-HCL (pH8. 3) /50mmol/L KCl/2mmol/L MgCl2/2. 5U Taq DNA聚合酶。当然，并不受该条件所限定。本发明中，“检测区域”是指包含使用前述扩增引物进行前述基因扩增反应所扩增的目标部位的区域。检测区域的扩增产物，除了来自扩增引物的部分之外，被扩增为由DNA序列构成的碎片。根据本发明，检测区域的来自突变基因的部分被选择性地扩增。因此，也可以将该检测区域的扩增产物用于后续扩增的核酸的检测中。本发明中，“共存”是指在基因扩增用反应液中共同存在，处于相互影响的状态。
将PNA-LNA-PCR Clamp法的原理例示于图1，并在以下进行说明。应予说明，图I的例子例示了突变基因的突变为点突变、且基因扩增反应为PCR法的情况。(探针和引物对模板的杂交)
首先，使由作为野生型基因(0103 )的目标部位(0101)的互补序列的PNA构成的钳弓I物 (0105)、和作为突变基因(0104)的目标部位(0102)的互补序列且由含LNA的DNA构成的突变探针(0106)、与扩增用引物(0107)、以及基因库一起共存于基因扩增用反应液中。通常由于野生型基因在基因库中大量存在，因而稍微过量地添加钳引物。因此，钳引物、突变探针、扩增用引物杂交于作为检测对象的基因上的各自的互补序列上。由于目标部位相同，因而钳引物与突变探针的全部或一部分碱基序列相互一致。所以两者在目标部位上的杂交应当是相互竞争的。但是，PNA与LNA对互补的碱基序列分别具有高的特异性，因而突变即使仅是I碱基的差别，实际上也如图I (A)所示，钳引物的大多数与野生型基因的目标部位杂交，而突变探针的大多数与突变型基因的目标部位杂交。(引物延伸反应)
接着，通过基因扩增方法对该基因扩增用反应液进行引物的延伸反应。如图I (B)所示，由于钳引物不会发挥作为引物的功能，因而不会发生延伸反应。所以，包含野生型基因的目标部位的检测区域的扩增被钳引物的杂交所抑制。另一方面，LNA不具有如PNA那样的阻断引物延伸的性质。即，突变探针由于可发挥作为引物的功能，因而引起延伸反应，如图I (C)所示在扩增引物之间，包含突变基因的目标部位的检测区域得到扩增。(基因扩增反应循环)
延伸反应结束后，使钳引物、突变探针与扩增用引物再次杂交于作为检测对象的基因上的各自的互补序列上。对于再杂交的反应，例如，在PCR法的情形中，增加加热至90°C前后的热变性处理，但该处理取决于基因扩增方法也不一定是必须的。例如，相当于ICAN法、LAMP法那样可在50°C至65°C的恒定温度下扩增的情况。利用基因扩增方法，可以通过重复基因扩增反应的循环而选择性地扩增包含突变基因的目标部位的检测区域。循环数取决于基因扩增方法、或者所使用的DNA聚合酶的种类而不同，但只要是30循环至55循环的范围则没有特别限定。优选为35循环至50循环，特别优选为40循环至45循环。(扩增产物的检测)
进行通过前述基因扩增方法而扩增的突变基因的检测区域的检测。对于该检测方法，只要可以确认突变基因的检测区域的扩增，则对该检测方法没有限定。例如，可以将基因扩增反应后的溶液用苯酚氯仿(I I)溶液进行除蛋白质处理后，将水层直接，或者在使用乙醇沉淀或适当的纯化试剂盒纯化后，使用分光光度计对波长260nm的吸光度进行测定，也可以将扩增产物通过电泳用琼脂糖凝胶、或聚丙烯酰胺凝胶展开后，使用适当的探针通过Southern杂交法进行检测,还可以通过使用了金纳米粒子的层析杂交法(々口 7卜/、<7''J ￥ ^七一'> 3 >法)进行检测，也可以测定扩增了的基因所致的溶液的浊度。或者也可以将扩增引物的5’末端预先荧光标记，在基因扩增反应后通过琼脂糖凝胶、或聚丙烯酰胺凝胶进行电泳后，将荧光发光采集至成像板中，使用适当的检测装置进行检测。以上的检测方法中，除了前述对照之外，通过与各适当对照的结果进行比较，可以获得可靠性更高的结果。另外，通过利用测序来确认扩增产物中的突变基因的目标部位的存在，可以获得更加精确的结果。
<实施方式2>
对实施方式2进行说明。本实施方式主要涉及权利要求3。本实施方式的概要是突变基因检测方法，其是检测掺杂于基因库中的已知突变基因的有无的方法，其中，使由与具有野生型基因的互补序列的目标部位的全部或一部分杂交的PNA构成的钳引物、与具有突变基因的互补序列的目标部位的全部或一部分杂交且序列的至少一部分由LNA构成的突变探针、与前述基因库在基因扩增用反应液中共存，通过基因扩增方法对包含突变基因的目标部位的检测区域选择性地进行扩增，由此检测该突变基因的有无。S卩，前述实施方式I是以作为检测对象的基因的有义侧的序列为模板来检测突变基因的方法，而本实施方式是以作为检测对象的基因的反义侧的序列为模板来检测突变基因的方法。所以，本实施方式的特征在于，该钳引物的碱基序列与野生型基因的有义侧是相同序列。进而，其特征在于，该突变探针的碱基序列与突变基因的有义侧是相同序列。其缘由在于，本发明的突变基因的检测所用的模板并不限定于有义侧的序列，也可以使用反义 侧的序列。与实施方式I仅在该点上不同，关于其它要件、原理，与实施方式I相同，因而此处省略其说明。所以，在本发明中，模板的序列可以使用有义侧和反义侧的任一者。优选为本发明中所用钳引物序列中的嘌呤残基数目少的一侧，或鸟嘌呤残基没有3个以上连续的一侧。其原因在于，嘌呤残基数目增加、或鸟嘌呤残基3个以上连续时，PNA的溶解会变得困难。〈实施方式3>
对实施方式3进行说明。本实施方式主要涉及权利要求4。本实施方式的概要是突变基因检测方法，其中，基于前述实施方式I或2的方法，进而基因扩增方法为PCR法。本实施方式中，关于与前述实施方式I相同的要件等，省略其说明，此处仅关于本实施方式的特征性要件等进行说明。本发明中的“PCR法”除了基于最基本原理的PCR法之外，还包含以其为基础开发的PCR法的变形方法。例如，相当于巢式PCR法或RT-PCR法等。本实施方式的基因扩增用反应液的条件与实施方式I的基因扩增用反应液的条件相同，因而此处省略其说明，以下说明本实施方式的特征性方法。对于该PCR法中使用的DNA聚合酶的种类，只要具有延伸扩增引物的活性，则没有特别限制，优选为耐热性DNA聚合酶。例如，除了 Taq DNA聚合酶或Pfu DNA聚合酶之外，还可以使用K7相关的各公司独自开发的各种耐热性DNA聚合酶。该循环的反应可以是包含热变性和退火/延伸反应的两步PCR，也可以是包含热变性、退火和延伸反应的3步PCR。另外，使用巢式PCR法时，对于第2轮基因扩增反应的条件，除了代替最初反应中所用的扩增引物(以下，记为外扩增引物)，而使用第二轮反应中使用的扩增引物(以下，记为内扩增引物)方面，和将最初的基因扩增反应后的基因扩增用反应液的稀释产物用作模板方面，只要可以抑制非特异性扩增产物的扩增，则没有特别限制。例如，可以与最初的反应条件相同，也可以基于扩增产物的量等进行增减反应循环数等适当改变。I组内扩增引物中，至少一序列与外扩增引物的序列相比I碱基以上位于3’侦彳(下游侧)即可。例如，一内扩增弓I物的序列可以与外扩增弓I物的序列相同，任一内扩增弓I物的序列也可以与外扩增弓I物的序列基本重复。最初的基因扩增反应后的基因扩增用反应液的稀释可以在ι/ ο7倍至1/105倍的范围研究最佳的条件。优选为5/107倍至5/106倍的范围内。PCR法是最为广泛使用的基因扩增方法，因而不仅最适于该方法的各种试剂、仪器等可以容易获得，而且基于该方法的革新技术也多、通用性极高。另外，对于进行分子生物学、基因工程的通常的研究室或检验室来说，多数已经设置有PCR法所需的试剂、仪器，不必购入新的试剂或危机，从该方面来看也是便利的。<实施方式4>
实施方式4主要涉及权利要求5。本实施方式的概要是突变基因检测方法，其特征在于，基于实施方式I至3中的任一方法，进而突变探针包含RNA。本实施方式中，关于与前述实施方式I至3中任一者相同的要件等，省略其说明，此处仅关于本实施方式的特征性要件等进行说明。
本实施方式中，突变探针的一部分包含RNA。由此，例如后述实施方式5中，当突变探针与扩增产物形成杂交时，通过用RNaseH进行处理，可以使该RNA分解，荧光物质与淬灭剂分离，从而使荧光物质的抑制解除，而发出荧光。便利的是通过测定由此产生的荧光可以检测突变基因等。<实施方式5>
对实施方式5进行说明。本实施方式主要涉及权利要求6。本实施方式的概要是突变基因检测方法，其中，基于实施方式I至4中任一方法，进而突变探针的一个末端被荧光物质所标记，另一末端被抑制前述荧光物质的淬灭剂所标记。本实施方式中，关于与前述实施方式I至4中任一者相同的要件等，省略其说明，此处仅关于本实施方式的特征性要件等进行说明。本发明中，“荧光物质”是指具有下述性质的物质通过吸收特定波长的激发光而成为激发状态，在恢复到原本的基底状态时发出荧光。标记所用的荧光物质只要是可以标记于突变探针的末端，则没有特别限制。例如，可以是FAM、TET、HEX、Cy3、Cy5、Texas Red、TAMRA, FITC 等任一者。本发明中，“淬灭剂”是指荧光物质的激发能量吸收物质等。使用的种类可以是BHQU BHQ2、Dabcyl等任一者。其中，取决于该要抑制物质的种类，荧光的抑制范围有所不同，因而需要对在一个突变探针上配组的可以抑制荧光物质的发光的淬灭剂的种类进行选择。可以抑制发光的选择范围内则没有特别限制。例如，荧光物质为FAM或TET时，可以选择抑制范围的波长稍微靠短波(480nm 580nm)的BHQ1，或在荧光物质为Cy3或Texasred时,可以选择抑制范围的波长稍微靠长波(550nm 650nm)的BHQ2。本发明中，“末端”是指突变探针的碱基序列中的5’末端、或者3’末端。本发明中，“被…所标记”是指前述荧光物质和淬灭剂通过化学结合附于突变探针的末端部。即，意指前述荧光物质与前述淬灭剂中，任一者在5’末端、而另一者在3’末端化学地结合。通常荧光物质大多结合于5’末端，但只要可得到相同的效果则荧光物质也可以结合于3’末端，没有特别限制。另外，3’末端结合有淬灭剂、或者荧光物质时，突变探针不会发挥作为扩增用引物的功能。这是因为淬灭剂、荧光物质阻断延伸反应的缘故。所以此时，需要至少一个杂交于突变探针的5’侧即上游的扩增引物。进而，为了使杂交于目标部位的突变探针不会妨碍该扩增引物的延伸，理想的是使基因扩增方法中使用的DNA聚合酶具有5’ 一 3’核酸外切酶活性。
(实施方式5的检测方法)
本实施方式中的检测方法优选的是利用由前述荧光物质发出的荧光。但是，对于本实施方式的突变探针，通常状态下即使对标记于一末端的荧光物质照射激发光，也由于存在于另一末端的淬灭剂的抑制而不会发出荧光。所以，本实施方式中为了利用荧光，需要解除淬灭剂所致的抑制。只要可以解除淬灭剂所致的，则方法没有特别限制。例如，对于5’末端被荧光物质标记的突变探针，可以将与该突变探针的上游杂交的扩增用引物、与具有5’一 3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶加入基因扩增用反应液中，通过PCR法进行基因扩增反应，由此利用DNA聚合酶的5’ 一 3’核酸外切酶活性将突变探针分解，使荧光物质从突变探针中游离出来，从而解除淬灭剂所致的抑制。或者，如前述实施方式4所述，通过用RNA构成突变探针的一部分，也可以利用RNaseH的活性来解除。本实施方式的检测原理的一例例示于图2，以下进行说明。应予说明，图2的例子表示了突变基因的突变为点突变，基因扩增反应为使用了具有5’ 一3’核酸外切酶活性的 DNA聚合酶的PCR法的情况。(探针和弓I物对模板的杂交)
首先，使由作为野生型基因(0203)的目标部位(0201)的互补序列的PNA构成的钳引物(0205)、和作为突变基因(0204)的目标部位(0202)的互补序列且由含LNA的DNA构成的突变探针(0206)、与2种扩增用引物(0207)、以及基因库一起共存于基因扩增用反应液中。此时突变探针的5’侧结合有荧光物质(0209)，而3’侧结合有淬灭剂(0210)。通常，淬灭剂抑制着荧光物质的荧光发光。与前述图I说明相同地，由于PNA与LNA对互补序列的强的特异性，因而突变即使仅是I碱基的差别，也如图2 (A)所示，钳引物的大多数与野生型基因的目标部位杂交，而突变探针的大多数与突变型基因的目标部位杂交。(引物延伸反应)
接着，通过基因扩增方法对该基因扩增用反应液进行引物的延伸反应。如图2 (B)所示，由于钳引物不会发挥作为引物的功能，因而不会发生延伸反应。另外，由于PNA的核酸酶耐性，使得即使在用于延伸反应的DNA聚合酶具有如Taq DNA聚合酶那样的5’ 一 3’核酸外切酶活性(0208)时，也不会受到其分解。所以，对于包含野生型基因的目标部位的检测区域的扩增，即使令以夹持钳引物的方式设计的扩增用引物2种共存，也会被钳引物的杂交所抑制。另一方面，LNA不具有PNA那样的阻断引物延伸的性质、或对核酸核酸酶的耐性。其中，突变探针的3’侧结合有淬灭剂，因而延伸反应受到阻断。所以此时，在2种扩增用引物(0207)间发生延伸反应。即，由于延伸反应中使用的DNA聚合酶的5’ 一3’核酸外切酶活性，突变引物被分解，在扩增引物间，包含突变基因的目标部位的检测区域得到扩增。该分解使得荧光物质游离，从而解除淬灭剂所致的抑制。通过检测由该游离的荧光物质发出的荧光物质，可以检测扩增的突变基因。<实施方式6>
对实施方式6进行说明。本实施方式主要涉及权利要求7。本实施方式的概要是突变基因检测方法，其中，基于前述实施方式I至4中任一者，进而将前述突变基因的检测区域的扩增产物用核酸染色剂染色。本实施方式中，关于与前述实施方式I至3中任一者相同的要件等，省略其说明，此处仅关于本实施方式的特征性要件等进行说明。本发明中，“核酸染色剂”是指结合或插入核酸、或核酸类似物并对它们进行染色的试剂的总称。例如，相当于插入双链核酸的碱基对间进行核酸染色的嵌入剂。嵌入剂也已知有许多种类。例如有，溴化乙锭(EB)、碘化丙啶(PI)、DAPI、吖啶橙、各种Hoechst、各种SYBR、各种SYNT0X、各种TOTO等，对该扩增产物进行染色时，只要可以充分染色则对其种类没有特别限制。本发明中，“染色”不仅意指可通过目视确认的扩增产物的呈色，还包含通过照射激发光而确认染色的荧光染色。(实施方式6的检测方法)
核酸染色剂以前述嵌入剂为代表，均通过照射特定波长的激发光而发出特有的荧光。所以，本实施方式中的检测方法优选可以利用该荧光发光。对于染色的方法 或时期，只要结果可以染色则没有特别限制。例如，可以在基因扩增反应后浸溃于溶解有核酸染色剂的染色液中进行染色，也可以在反应中进行染色。检测方法只要可以检测染色的扩增产物则没有特别限制。例如，可以用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶进行电泳后，将经核酸染色剂染色的凝胶在透照器上照射激发光，通过目视比较确认预想扩增产物大小的位置的条带与对照条带，也可以通过捕光仪(化学发光荧光照相装置)检测由荧光物质发出的发光后，使用解析软件进行与对照荧光强度的比较定量，由此进行检测。<实施方式7>
对实施方式7进行说明。本实施方式主要涉及权利要求8。本实施方式的概要是突变基因检测方法，其中，基于前述实施方式I至6中任一方法，进而通过荧光强度的增加来经时性地检测突变基因的检测区域的扩增产物的增加。本实施方式中，关于与前述实施方式I至6中任一者相同的要件等，省略其说明，此处仅关于本实施方式的特征性要件等进行说明。本发明中的“经时性”是指时间经过性。所以，“经时性地检测扩增产物的增加”是指随着基因扩增反应的时间经过，检测扩增产物的增加。检测通过“荧光强度的增加”来进行。此处所说的“荧光”是指实施方式5中所述的荧光物质或实施方式6中所述的核酸染色剂被激发、返回基底状态时发出的荧光等。(实施方式7的检测方法)
对于本实施方式的检测方法，只要可以经时性地检测反映扩增产物的增加的荧光强度的增加，则对其检测方法没有限制。例如，可以如实施方式5所述，末端经荧光标记的突变探针通过具有5’ 一 3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶分解，将5’游离，从而实时地检测发出的荧光(TaqMan探针法)。或者，也可以实时地检测含有末端经荧光标记的RNA的突变探针由于添加RNaseH而因其活性将RNA部分分解从而发出的荧光(Cycling探针法)。或者，如实施方式6所示将SYBER Green I等核酸染色剂加入基因扩增用反应液中，在基因扩增反应的同时进行染色。可以边照射激发光边对嵌入的该核酸染色剂发出的荧光的强度进行测定来测定扩增产物的增加。<实施方式8>
对实施方式8进行说明。本实施方式主要涉及权利要求9。本实施方式的主旨是突变基因检测方法，其中，基于前述实施方式I至7中任一方法，进而前述突变为点突变。本实施方式中，关于与前述实施方式I至7中任一者相同的要件等，省略其说明，此处仅关于本实施方式的特征性要件等进行说明。
本发明中，“点突变”是指关于作为检测对象的基因，不仅包含碱基序列上的I碱基发生置换的突变，也包含I碱基插入的突变。所以，该点突变中，I碱基的置换、或被插入的部位成为目标部位。本实施方式中使用的突变探针的特征在于，目标部位具有突变基因的序列，且至少目标部位被LNA置换。例如，在突变为I碱基置换且基于实施方式I时，相当于该突变探针的序列为突变基因的互补序列，进而至少被置换的该I碱基的序列被LNA置换。这样，即使野生型基因与突变基因仅为一个碱基的区别，突变探针也可以特异性地与突变基因杂交。另外，具有野生型基因的序列的钳引物变得难以与该突变基因杂交，突变探针与钳引物相对于目标部位的序列特异性变得明确。<实施方式9>
对实施方式9进行说明。本实施方式主要涉及权利要求10。本实施方式的概要是突变基因检测方法，其中，基于前述实施方式I至7中任一方法，进而前述突变为缺失突变。本实施方式中，关于与前述实施方式I至7中任一者相同的要件等，省略其说明，此处仅关于本实施方式的特征性要件等进行说明。本发明中，“缺失突变”是指关于作为检测对象的基因，野生型基因的碱基序列上的一个碱基丧失的情形、或二个碱基以上的连续性丧失的突变。所以，不限于遗传学上的缺失的含义。例如，相当于染色体的易位或倒位、或者反转录病毒的插入等使作为检测对象的基因发生分裂的情形。所以，该缺失突变中，野生型基因的碱基序列上的一个碱基丧失的部位、或二个碱基以上的连续性丧失的部位成为目标部位。对于本实施方式中使用的突变探针，目标部位具有突变基因的序列，且突变探针的序列中至少一者以上被LNA所置换。特别地，目标部位中存在未见于野生型基因中的特异性碱基序列时，优选该特异性碱基序列中至少一者以上被LNA所置换。例如，突变为3个碱基插入时，优选将插入的3个碱基中至少一个以上用LNA置换。突变探针只要具有该特异性碱基序列的全部或一部分即可。另外，目标部位中不存在可见于野生型基因中的碱基时，即为遗传学上的缺失的情形中，突变探针的序列中，优选将至少任一者以上用LNA置换。特别优选的是，作为缺失的结果，所连结部位的碱基中至少一者被LNA所置换。通过本实施方式，即使是缺失突变，突变探针也可以向突变基因特异性、且牢固地杂交。<实施方式10>
对实施方式10进行说明。本实施方式主要涉及权利要求11。本实施方式的概要是权利要求2至10中任一项所述的突变基因检测方法，其中，基于前述实施方式I至9中任一方法，进而前述钳引物的链长为14碱基至18碱基。本实施方式中，关于与前述实施方式I至9中任一者相同的要件等，省略其说明，此处仅关于本实施方式的特征性要件等进行说明。本实施方式的特征在于，钳引物为14碱基至18碱基这方面。由PNA构成的钳引物为13碱基以下则得不到充分的钳效果(々9 > C 7 co効果)，而为19碱基以上则存在引物自身的合成精度降低等问题。但是，对于14碱基至18碱基的范围内，本发明中无论任何长度都未见显著差异。作为本发明的钳引物的链长，本实施方式具有最适、且充分的长度。〈实施方式11>
对实施方式11进行说明。本实施方式主要涉及权利要求13。本实施方式的概要是突变基因检测方法，其特征在于，基于前述实施方式I至10中任一方法，进而前述突变基因为人EGFR的突变基因。本实施方式中，关于与前述实施方式I至10中任一者相同的要件等，省略其说明，此处仅关于本实施方式的特征性要件等进行说明。(检测用基因库的制备)
对于本实施方式中使用的基因库，为了检查人EGFR的突变基因的有无，使用由其对象者获得的基因组DNA或cDNA。优选由该对象者的唾液、或胸腔积液、或刷片洗涤液等支气管洗涤液、或由手术得到的组织的一部分、病理组织切片等通常用于肺癌诊断的全部试样获得。由这些试样制备基因组DNA、mRNA的方法可以是，例如，如碱法那样所通常广为使用的
基因组DNA、mRNA的制备方法。另外，也可以使用市售的DNA制备试剂盒或mRNA制备试剂盒。由mRNA制备cDNA的方法也可以是使用了 RT的通常所广泛使用的方法。另外，也可以使用市售的cDNA制备试剂盒。(对于EGFR的已知的突变基因)
如非专利文献4和5中所示，迄今为止来自NSCLC患者的EGFR基因突变报道有以下所示的11种。该11种突变大致分为4种点突变和7种缺失突变的二类。另外，该全部突变存在于编码EGFR的细胞内酪氨酸激酶结构域的第18外显子、第19外显子或第21外显子中的任一处。另外,如非专利文献6所示，第20外显子中也已知I种点突变。1.G719C:是第18外显子的第2155碱基(以起始密码子A作为第I碱基的cDNA上的碱基编号，以下相同)G置换为T的点突变基因，结果，人EGFR蛋白质的第719甘氨酸残基置换为半胱氨酸残基。2.G719S :是第18外显子的第2155碱基G置换为A的点突变基因，结果，人EGFR蛋白质的第719甘氨酸残基置换为丝氨酸残基。3. E746-A750del-1 :是第19外显子的从第2235碱基G至第2249碱基C为止的15碱基缺失的缺失突变基因，结果，人EGFR蛋白质的第746谷氨酸残基至第750丙氨酸残基缺失。4. E746-A750del-2 :是第19外显子的从第2236碱基G至第2250碱基A为止的15碱基缺失的缺失突变基因，结果，人EGFR蛋白质的第746谷氨酸残基至第750丙氨酸残基缺失。5. L747-A750delT751S :是第19外显子的从第2240碱基T至第2251碱基A为止的12碱基缺失的缺失突变基因，结果，人EGFR蛋白质的第747亮氨酸残基至第750丙氨酸残基缺失，另外第751胸腺嘧啶脱氧核苷残基置换为丝氨酸残基。6. L747-S752delP753S :是第19外显子的从第2240碱基T至第2257碱基C为止的16碱基缺失的缺失突变基因，结果，人EGFR蛋白质的第747亮氨酸残基至第752丝氨酸残基缺失，另外第753脯氨酸残基置换为丝氨酸残基。7. L747-E740delA750P :是第19外显子的从第2239碱基T至第2247碱基A为止的9碱基缺失的缺失突变基因，结果，人EGFR蛋白质的第747亮氨酸残基至第740谷氨酸残基缺失，另外第750丙氨酸残基置换为脯氨酸残基。8. L747-S752delE746V :是第19外显子的从第2238碱基A至第2255碱基C为止的18碱基缺失的缺失突变基因，结果，人EGFR蛋白质的第747亮氨酸残基至第752丝氨酸残基缺失，另外第746谷氨酸残基置换为缬氨酸残基。9. S752-I759del :是第19外显子的从第2254碱基T至第2277碱基C为止的24碱基缺失的缺失突变基因，结果，人EGFR蛋白质的第752丝氨酸残基至第759异亮氨酸残
基缺失。10. L858R :是第21外显子的第2573碱基T置换为G的点突变基因，结果，人EGFR蛋白质的第858赖氨酸残基置换为精氨酸残基。11. L861Q :是第21外显子的第2582碱基T置换为A的点突变基因，结果，人EGFR蛋白质的第861赖氨酸残基置换为谷氨酸残基。以上，对于使用基因库作为起始材料(被检试样)的、通常的PNA-LNA-PCR Clamp法，基于具体实施方式
I 11进行了说明，但本发明中可以使用基因库作为起始材料，在特定钳引物的存在下，通过基因扩增方法将包含突变基因的目标部位的区域选择性扩增后 (前扩增步骤)，将所得扩增产物或其一部分(优选为所得扩增产物的稀释物)作为模板，实施通常的PNA-LNA-PCR Clamp法中的主扩增步骤。应予说明，如上所述，本发明中还可以代替PNA-LNA-PCR Clamp法而使用公知的各种高灵敏度检测方法。前扩增步骤中使用的“钳引物”(以下，称为前扩增步骤用钳引物)，只要是由与具有野生型基因的序列或野生型基因的互补序列的目标部位的全部或一部分杂交的PNA构成，则没有特别限定。对于前扩增步骤用钳引物，关于与主扩增步骤用钳引物相同的要件等，省略其说明，这里仅关于前扩增步骤用钳引物的特征性要件等进行说明。前扩增步骤用钳引物的碱基序列可以与主扩增步骤用钳引物相同，也可以是不同的碱基序列。例如，主扩增步骤用钳引物为与具有野生型基因的序列(例如，有义序列)的目标部位的全部或一部分杂交的序列时，前扩增步骤用钳引物可以为与具有野生型基因的序列(有义序列)的目标部位的全部或一部分杂交的序列，也可以为与具有野生型基因的互补序列(反义序列)的目标部位的全部或一部分杂交的序列。前者的情形中，主扩增步骤用钳引物的序列与前扩增步骤用钳引物的序列可以完全一致、部分一致(即，部分重复)、或不含重复序列。相反，主扩增步骤用钳引物为与具有野生型基因的互补序列(例如，反义序列)的目标部位的全部或一部分杂交的序列时，前扩增步骤用钳引物可以为与具有野生型基因的序列(有义序列)的目标部位的全部或一部分杂交的序列，也可以为与具有野生型基因的互补序列(反义序列)的目标部位的全部或一部分杂交的序列。后者的情形中，主扩增步骤用钳引物的序列与前扩增步骤用钳引物的序列可以完全一致、部分一致、或不含重复序列。前扩增步骤中所用的钳引物的使用浓度根据作为模板的基因库量、存在于基因库中的野生型基因的量而不同，通常为O. 01 μ mol/L至10 μ mol/L。优选为O. 05 μ mol/L至5 μ mol/L、特别优选为 O. I μ mol/L 至 I μ mol/L。对于前扩增步骤中使用的“扩增引物”和“基因扩增用反应液”，关于与主扩增步骤中使用的相同的要件等省略其说明，这里仅关于前扩增步骤的特征性要件等进行说明。(前扩增反应)
使含有野生型基因和突变型基因的基因库、PNA钳引物、与扩增引物在基因扩增用反应液中共存。通常由于野生型基因在基因库中大量存在，因而稍微过量地添加钳引物。因此，钳引物、扩增用引物会杂交于作为检测对象的基因上的各自的互补序列上。野生型基因和突变型基因的目标部位由于除了突变位置之外为相同序列，因而钳引物对目标部位的杂交应当是相互竞争。但是，PNA对互补碱基序列分别具有高的特异性，因而突变即使仅是I碱基的差别，实际上钳引物的大多数也会杂交于野生型基因的目标部位。接着，通过基因扩增方法对该基因扩增用反应液进行引物的延伸反应。钳引物不会发挥作为引物的功能，因而不会发生延伸反应。所以，包含野生型基因的目标部位的区域的扩增被钳引物的杂交所抑制。另一方面，由于突变型基因的大多数不与钳引物杂交，因而抑制引物延伸的要因不存在，发生扩增引物引起的延伸反应，从而使包含突变基因目标部位的区域被选择性扩增。所得扩增产物直接、或者适当稀释后，将其全部或一部分作为模板，实施后续的主要检测步骤。例如，通常将所得扩增产物在不抑制主要检测步骤的扩增的不含核酸酶的溶 齐U，例如，经灭菌处理的超纯水中，稀释至100 10000倍，用作模板。该前扩增步骤也可以在主要检测步骤之前实施2次以上。〈实施方式12>
对实施方式12进行说明。本实施方式主要涉及权利要求12。本实施方式是权利要求I所述的步骤(2) (B卩，主要检测步骤)中的选择性地检测包含突变基因的目标部位的检测区域的方法，是本领域技术人员通常所采用的检测手法。作为其一例，可举出侵染法、TaqMan-PCR 法、蝎形探针扩增法、DNA 芯片法、PCR-RFLP 法、PCR-SSCP 法、PCR-HRM 法、gFCS法、Southern印迹法。更理想的是已知检测灵敏度高的侵染法、或蝎形探针扩增法。
实施例以下，通过实施例对本发明进行具体说明，但它们并不限定本发明的范围。《实施例I:供于高灵敏度检测方法的模板DNA的前扩增步骤中的PNA钳引物添加效果的验证I》
本实施例中，以人基因组DNA库中掺杂的突变型EGFR基因为目标，对于缺失突变EGFR基因(外显子19中的E746-A750缺失突变)与点突变EGFR基因(外显子21中的L858R点突变)，各自针对供于高灵敏度检测方法(PNA-LNA-PCR Clamp法)的模板DNA的前扩增步骤中的PNA钳引物添加效果的有效性与检测灵敏度进行了验证。对于PNA-LNA-PCR Clamp法的条件，则参考日本专利第4216266号说明书。(材料)
作为突变EGFR基因，使用将由2丨j工卟44亍二一卜(Coriell Institute)
购入的培养细胞PC9 (EGFR外显子19 E746-A750缺失突变型)和11-18 (EGFR外显子21 L858R点突变型)通过规定方法培养、使用市售试剂盒(DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen社))提取的基因组DNA。另外作为野生型EGFR基因，使用由^ U工X O ”r工一卜购入的HapMapDNA。使用这些DNA，制备表I (PC9稀释系列、外显子19 E746-A750缺失突变型)或表
2(11-18稀释系列、外显子21 L858R点突变型)所示的17阶段的稀释系列各15 μ L。S卩，进行制备以使总EGFR基因拷贝数为500拷贝(作为人基因组DNA量，相当于1650pg)，总EGFR基因拷贝数中的突变EGFR基因拷贝数的比例为50%、10%、2%、0. 4%、0%。
同样地进行制备，
以使总EGFR基因拷贝数为100拷贝(作为人基因组DNA量，相当于330pg)，总EGFR基因拷贝数中的突变EGFR基因拷贝数的比例为50%、10%、2%、0. 4%、0% ；
以使总EGFR基因拷贝数为20拷贝(作为人基因组DNA量，相当于66pg)，总EGFR基因拷贝数中的突变EGFR基因拷贝数的比例为50%、10%、2%、0% ；
以使总EGFR基因拷贝数为5拷贝(作为人基因组DNA量，相当于16. 5pg)，总EGFR基因拷贝数中的突变EGFR基因拷贝数的比例为50%、10%、0%。PC9稀释系列(外显子19缺失)
[表I]
权利要求
1.突变基因检测方法，其是检测掺杂于基因库中的已知突变基因的有无的方法，该方法包括 (1)使(Ia)钳引物，其由与具有野生型基因的序列或野生型基因的互补序列的目标部位的全部或一部分杂交的PNA构成， (Ib)可以对包含具有突变基因的序列的目标部位的区域进行扩增的引物，与 (Ic)前述基因库， 在基因扩增用反应液中共存，通过基因扩增方法对包含突变基因的目标部位的区域选择性地进行扩增的步骤； (2)将前述步骤(I)中所得的扩增产物或其一部分作为模板，通过基因检测方法对包含突变基因的目标部位的检测区域选择性地进行检测，由此检测该突变基因的有无的步骤。
2.权利要求I所述的突变基因检测方法，其中前述步骤(2)是 使(2a)钳引物，其由与具有野生型基因的序列的目标部位的全部或一部分杂交的PNA构成，且具有与步骤(I)中所用钳引物(Ia)相同或不同的碱基序列， (2b)突变探针，其与具有突变基因的序列的目标部位的全部或一部分杂交，且序列的至少一部分由LNA构成，与 (2c)前述步骤(I)中所得的扩增产物或其一部分， 在基因扩增用反应液中共存，通过基因扩增方法对包含突变基因的目标部位的检测区域选择性地进行扩增，由此检测该突变基因的有无的步骤。
3.权利要求I所述的突变基因检测方法，其中前述步骤(2)是 使(2a’)钳引物，其由与具有野生型基因的互补序列的目标部位的全部或一部分杂交的PNA构成，且具有与步骤(I)中所用钳引物(Ia)相同或不同的碱基序列， (2b)突变探针，其与具有突变基因的互补序列的目标部位的全部或一部分杂交，且序列的至少一部分由LNA构成，与 (2c)前述步骤(I)中所得的扩增产物或其一部分， 在基因扩增用反应液中共存，通过基因扩增方法对包含突变基因的目标部位的检测区域选择性地进行扩增，由此检测该突变基因的有无的步骤。
4.权利要求2或3所述的突变基因检测方法，其中前述步骤(2c)中的基因扩增方法为PCR 法。
5.权利要求2 4中任一项所述的突变基因检测方法，其中前述突变探针包含RNA。
6.权利要求2 5中任一项所述的突变基因检测方法，其中前述突变探针的一个末端被突光物质所标记，另一个末端被抑制前述突光物质的淬灭剂所标记。
7.权利要求2 5中任一项所述的突变基因检测方法，其中将前述突变基因的检测区域的扩增产物用核酸染色剂进行染色。
8.权利要求2 7中任一项所述的突变基因检测方法，其中通过荧光强度的增加来经时性地检测前述突变基因的检测区域的扩增产物的增加。
9.权利要求2 8中任一项所述的突变基因检测方法，其中前述突变为点突变。
10.权利要求2 8中任一项所述的突变基因检测方法，其中前述突变是缺失突变。
11.权利要求2 10中任一项所述的突变基因检测方法，其中前述钳引物的链长是14碱基 18碱基。
12.权利要求I所述的突变基因检测方法，其中前述步骤(2)中的基因检测方法为侵染法、TaqMan-PCR法、蝎形探针扩增法、DNA芯片法、PCR-RFLP法、PCR-SSCP法、PCR-HRM法、gFCS 法、Southern 印迹法。
13.权利要求I 12中任一项所述的突变基因检测方法，其中前述突变基因为人上皮生长因子受体的突变基因。
全文摘要
作为可以迅速、简便、高精度、而且高灵敏度地检测掺杂于基因库中的突变基因的有无的方法，提供各种高灵敏度检测方法、特别是PNA-LNA-PCRClamp法的改良方法。作为主要检测步骤的前步骤，实施下述前扩增步骤，其中，使(1)钳引物，其由与具有野生型基因的序列或野生型基因的互补序列的目标部位的全部或一部分杂交的PNA构成，(2)可以对包含具有突变基因的序列的目标部位的区域进行扩增的引物，与(3)前述基因库，在基因扩增用反应液中共存，通过基因扩增方法对包含突变基因的目标部位的区域选择性地进行扩增。
文档编号C12N15/09GK102959091SQ201180032470
公开日2013年3月6日 申请日期2011年6月30日 优先权日2010年6月30日
发明者松本英郎, 大出明, 松田耕一郎, 藤本英也 申请人:三菱化学美迪恩斯株式会社