细胞培养用一次性器具、细胞培养装置及细胞制备方法

专利名称：细胞培养用一次性器具、细胞培养装置及细胞制备方法
技术领域：
本发明涉及用于将有用细胞的分离工序、分离的有用细胞的培养工序及培养的细胞的清洗·浓缩工序全部连贯地进行的细胞培养用一次性器具(disposable set)、细胞培养装置及细胞制备方法。
背景技术：
近年来，从患者本人或者提供者的体液、组织采集细胞并通过培养将其扩增、加工而向患部进行移植的治疗的所谓再生医疗·细胞医疗正受到重视。对于再生医疗·细胞医疗而言，在许多情况下，在从由体液、组织采集的细胞群之中分离出被用于治疗的有用细胞后，通过培养实施细胞扩增。培养得到的细胞可向皮肤、骨、软骨、角膜等进行移植，在它们的部分疾病中显示出其安全性和有效性，作为有益于患者的治疗方法，期望得到普及(例 如，参照非专利文献I)。近年来逐渐清楚在骨髓液、脐带血等中，存在具有能够分化成骨、软骨、肌肉、月旨肪等多种细胞的性质的附着性成体干细胞(例如，参照非专利文献2 4)。由于成体干细胞具有能够分化成多种多样的细胞、脏器的能力，因此使成体干细胞效率良好地分离、扩增的方法从再生医疗发展的角度来看是极为重要的。现在，就成体干细胞的分离而言，FicollPaque分离法(例如，参照非专利文献5)等密度梯度离心法是主流，但该方法为了将分离液与细胞分开而使用离心分离器，需要反复清洗细胞这样烦杂的操作，进而，伴随着由离心操作所致的对细胞的损害、由开放体系中的操作所致的污染的危险。另外，分离的成体干细胞被报道在骨髓液的有核细胞中存在频率非常小，对于成人而言在IO4 IO6个中存在I个(例如，参照非专利文献5)，需要通过培养而使之增殖到治疗所必需的数量。现在，成体干细胞的扩增一般是使用器皿、烧瓶、或者培养袋、培养用盒(cartridge)等，在CO2培养箱内于37°C的温度环境下进行培养。这种情况下，由于培养基更换、传代操作是人实施，因而每次进行这些操作都要有污染的风险、操作时间。因此，近年来开发出自动地实施细胞播种、培养基更换等培养操作、几乎不耗费人工的自动培养装置(例如，参照专利文献I 3)。然而，现在的自动培养装置装载的仅是自动地培养所需细胞的功能，而没有装载将所需细胞从体液或者组织分离这样的功能。另外，使目标细胞增殖到规定数量后，进行胰蛋白酶等酶处理、2价阳离子螯合剂等处理，将细胞从培养容器中剥离，剥离的细胞与这些酶液一起被回收，因此，需要另行进行除去胰蛋白酶等酶、2价阳离子螯合剂的操作。现在，作为最一般的细胞清洗方法，有离心分离法。本方法是以下方法通过离心分离操作，使细胞沉淀，除去上清后，加入新的清洗液，将细胞再悬浊，再次进行离心分离操作，通过重复本操作，从而进行细胞的清洗。但是，被指出该操作烦杂、封闭体系中的分离操作不容易等细胞清洗工序中的污染风险。另外，有使用无纺布等分离材料捕捉培养的细胞并回收清洗后的细胞的方法(例如，参照专利文献4)，但是与离心分离法同样，这样的技术是单独使用的，并非能够在I个装置中实施特定细胞的分离、培养、回收。专利文献专利文献I :日本特开2004-344128号公报专利文献2 :日本特开2004-089095号公报专利文献3 :日本特开2001-275659号公报专利文献4 :日本特开2008-086235号公报非专利文献
非专利文献I :Robert Paul Lanza等著，大野典也等监译再生医学 从TissueEngineering的基础到最前端技术 株式会社NTS, 2002年非专利文献2 :Pliard A. et al.，"Controlled Conversion of anTmmorti I i zedMesodermal Progenitor Cell Towards Osteogenic,Chondrogenicj or AdipogenicPathways. "，J. Cell Biol. 130 (6) ,pp. 1461-72，1995非专利文献3 :Mackay Α· Μ· et al. , ^Chondrogenic differentiationofcultured human mesenchymal Stem Cells from Marrow"，TissueEngineering4(4)，pp. 414-428，1998非专利文献4Angele P. et al.，"Engineering of OsteochondoralTissue withBone Marrow Mesenchymal Progenitor Cells in aDerivatived Hyaluronan GerationComposite Sponge〃，TissueEngineering 5 (6)，pp.545-553，1999非专利文献5 :Pittenger et al. ,iiMultiLineage Potential of AdultHumanMesenchymal Stem Cells"，Science Vol. 284no. 5411，pp. 143-147，1999

发明内容
如上所述，制备对细胞医疗或者再生医疗有用的细胞时，需要经过(I)播种的有用细胞的分离工序、(2)分离的有用细胞的培养工序、(3)培养的细胞的清洗、浓缩工序，但是现状是有仅进行(2)的培养工序的自动培养装置，其它(I)和(3)的工序通过另外的工序处理，被指出操作的烦杂、污染的风险等。另外，在像专利文献4这样的使用无纺布等分离材料捕捉并回收清洗后的细胞的方法中，使细胞回收液从与使细胞悬浊液流动的方向相反的方向流动而回收细胞，此时，作为注入细胞回收液的手段，可考虑泵的利用、压破储存有液体的袋的方法、利用落差的流过、使用注射器等来通过手动注入的方法等。但是，为了回收被捕捉的细胞，从浓缩细胞的角度讲，也有必要以少量细胞回收液一下子地回收，使用注射器、袋的方法依赖于手工操作，回收率的偏差也大。另外，利用落差的方法因流速不足而使细胞的回收率急剧减少。进而，利用泵的方法存在以下问题用注射器泵时，流速不足，细胞几乎无法回收，用滚子泵(roller pump)时,在结构上竖起时(可动时)的流速缓慢，在达到细胞回收所需要的压力之前规定量的细胞回收液会流走而使细胞的回收率降低。而且，如果作为注入细胞回收液下面的步骤而将回收的细胞以原样的压力输送到培养容器中，则会以非常高的压力撞击培养面，导致对细胞的损害(分化能力降低、存活性降低等)大，关于这方面应该解决的课题也很多。
因此，本发明鉴于上述状况而要解决的课题在于如下方面提供细胞培养用一次性器具、细胞培养装置及细胞制备方法，其能够将有用细胞的分离工序、分离的有用细胞的培养工序及培养的细胞的清洗、浓缩工序全部连贯地进行，能够实现不依赖大型设备的简单构成的封闭体系系统而提高操作性，并且能够制备安全性和品质高的有用细胞。为了解决上述课题，本发明所涉及的细胞培养用一次性器具的特征在于包含细胞培养容器，具有液体流入口和液体排出口 ；细胞分离套件，与上述液体流入口连接、用于分离在细胞培养中使用的细胞；以及细胞回收套件，与上述液体排出口连接，用于清洗浓缩在上述细胞培养容器中培养的细胞。在此，上述细胞分离套件优选包含从含有细胞的被处理液选择性地捕捉细胞的细胞分离材料，上述细胞回收套件优选包含捕捉培养的细胞并使夹杂物通过的细胞回收材料。另外，上述细胞分离套件优选由细胞分离过滤器、被处理液槽、废液槽、第I细胞 回收液导入部、以及第3管路构成；上述细胞分离过滤器容纳有从含有细胞的被处理液选择性地捕捉细胞的细胞分离材料；上述被处理液槽通过第I管路与上述细胞分离过滤器的上游侧连接，容纳有含有细胞的被处理液；上述废液槽通过第2管路与上述细胞分离过滤器的下游侧连接；上述第I细胞回收液导入部利用从上述第2管路的中途分支的管路进行连接，用于导入细胞回收液；上述第3管路从上述第I管路的中途分支，与上述细胞培养容器的液体流入口连接。进而，优选是将细胞储存袋与从上述第I管路的与上述第3管路相比上游侧的位置分支的管路连接而成的，所述细胞储存袋用于将由从上述第I细胞回收液导入部导入到上述细胞分离过滤器的上述细胞回收液回收的细胞暂时储存。进而，优选上述被处理液槽兼作细胞储存袋，所述细胞储存袋将由从上述第I细胞回收液导入部导入到上述细胞分离过滤器的上述细胞回收液回收的细胞暂时储存。另外，上述细胞分离过滤器优选使含有对细胞医疗或者再生医疗有用的细胞和夹杂细胞的被处理液流过而实质上使夹杂细胞通过，从而实质上捕捉对细胞医疗或者再生医疗有用的细胞，并且使上述细胞回收液向与上述被处理液流过的方向相反的方向流过，从而回收捕捉到的细胞。进而，优选上述第I细胞回收液导入部是容纳有上述细胞回收液的注射器，上述注射器的柱塞被以气体压力驱动的外部按压单元按压，对上述细胞分离过滤器进行上述细胞回收液的供给。进而，优选是通过管路将容纳有清洗液的清洗液槽与上述细胞分离过滤器的上游侧连接而成的。另外，优选是由从上述第3管路的中途分支的管路连接容纳有培养基的培养基槽和容纳有包含细胞剥离剂的细胞剥离液的细胞剥离液槽中的至少任一个而成的。进而，上述细胞回收套件优选由细胞回收过滤器、第4管路、废液槽、第2细胞回收液导入部、以及细胞回收槽构成，上述细胞回收过滤器容纳有捕捉培养的细胞并使夹杂物通过的细胞回收材料；上述第4管路与上述细胞培养容器的液体排出口和上述细胞回收过滤器的上游侧连接；上述废液槽通过第5管路与上述细胞回收过滤器的下游侧连接；上述第2细胞回收液导入部利用从上述第5管路的中途分支的管路连接，用于导入细胞回收液；上述细胞回收槽利用从上述第4管路的中途分支的管路进行连接，用于将由上述第2细胞回收液导入部导入到上述细胞回收过滤器的细胞回收液回收的细胞进行回收。进而，优选是使用于除去细胞凝集块的细胞滤过过滤器设在上述第4管路的中途而成的，优选是通过管路将容纳有清洗液的清洗液槽与上述细胞回收过滤器的上游侧连接而成的。另外，上述细胞回收过滤器优选使含有在上述细胞培养容器中培养而得的细胞的细胞悬浊液流过而捕捉被培养的细胞，使上述细胞回收液向与使上述细胞悬浊液流过的方向相反的方向流过，从而回收被捕捉的细胞。进而，优选上述第2细胞回收液导入部是容纳有上述细胞回收液的注射器，上述注射器的柱塞被以气体压力驱动的外部按压单元按压，对上述细胞回收过滤器进行上述细胞回收液的供给。为了解决上述课题，本发明所涉及的细胞培养装置的特征在于，使用上述细胞培 养用一次性器具并具备配设于该细胞培养用一次性器具的管路的适当部位的泵和控制装置，所述泵将压夹上述管路而开关其流路的流路开关阀和上述管路进行依次按压，所述控制装置进行上述流路开关阀的开关控制和上述泵的驱动控制。另外，为了解决上述课题，本发明所涉及的细胞培养装置的特征在于，使用上述第I细胞回收液导入部或者上述第2细胞回收液导入部是容纳有上述细胞回收液的注射器的上述细胞培养用一次性器具并具备配设于该细胞培养用一次性器具的管路的适当部位的泵、外部按压单元和控制装置，所述泵将压夹上述管路而开关其流路的流路开关阀和上述管路进行依次按压，所述外部按压单元以按压上述注射器柱塞的压力气体作为驱动源，所述控制装置进行上述流路开关阀的开关控制和上述泵的驱动控制以及上述外部按压单元的驱动控制。在此，上述压力气体的供给源优选是容纳有压力气体的储气瓶，进一步优选上述压力气体是二氧化碳。为了解决上述课题，本发明所涉及的细胞制备方法的特征在于，使用上述细胞培养装置，在封闭体系中连贯地进行如下工序播种的有用细胞的分离工序，在上述分离工序中被分离的有用细胞的培养工序，以及在上述培养工序中被培养的细胞的清洗、浓缩工序。如上所述，根据本发明所涉及的细胞培养用一次性器具、细胞培养装置及细胞制备方法，起到以下显著的效果将有用细胞的分离工序、在分离工序中被分离的有用细胞的培养工序及在培养工序中培养的细胞的清洗、浓缩工序全部连贯地进行，实现不依赖大型设备的简单构成的封闭体系系统而提高操作性，并且能够制备安全性和品质高的有用细胞。而且，使细胞回收液流过细胞分离过滤器而将回收的细胞暂时储存于被处理液槽或者细胞储存袋后移送到细胞培养容器，从而回收的细胞不会以原样的压力被输送到细胞培养容器，因此能够减少由细胞回收时的高压力所致的对细胞的损害。进而，第I细胞回收液导入部或者第2细胞回收液导入部是容纳有细胞回收液的注射器，利用以压力气体作为驱动源的外部按压单元来按压注射器的柱塞，从而与一般的滚子泵相比，可以短时间地达到细胞回收所需要的压力，因而能够一下子地回收比较少量的细胞回收液，因此细胞的回收率增高，并且回收率的偏差变小。


图I是表示本发明的实施方式I所涉及的细胞培养用一次性器具及细胞培养装置的概略构成图。图2是表示利用以压力气体作为驱动源的外部按压单元进行细胞回收液导入部的驱动的例子的纵向截面图，Ca)表示驱动前的状态，Ca)表示驱动结束的状态。图3是表示本发明的实施方式2所涉及的细胞培养用一次性器具及细胞培养装置的概略构成图。图4是示出回收细胞的软骨形成评价结果(阿尔新蓝染色)的图，Ca)表示实施例1，(b)表示参考例I。
具体实施方式
·对于本发明，以下具体地进行说明。对于本发明中所述的含有细胞的被处理液而言，只要是含有细胞的液体，就不对其物理、化学性状进行限定。具体地可以举出骨髓液、外周血(包括外周血、G-CSF动员外周血等)、血浆析离法产物(浓缩白血球溶液等)、淋巴液、脐带血、经血、精液等体液；从脏器或者组织等中利用胶原酶等分解酶处理以生物化学方式分离细胞或者通过超声波处理、均质器、锋利的刀具等以物理方式分离细胞而得到的处理液；对体细胞进行基因重组等而赋予多分化能力的细胞、例如iPS细胞等；由受精卵建立的ES细胞等；悬浮系细胞、细胞彼此凝集而得的球体状细胞等，但不限定于此。另外，上述体液、处理液可以在由细胞分离过滤器处理前用生理食盐水、磷酸缓冲液等适当的液体进行稀释，或者也可以通过离心分离等适当的方法进行浓缩。作为浓缩方法的具体例，可以举出使用Ficoll、Percoll> Lymphoprep、轻乙基淀粉(HES)、真空采血管等的密度梯度离心法等，但不限定于此。所谓本发明中的成体干细胞是指若在生物体外在任意条件下培养，则形成集落(细胞集团)并增殖而具有与各种分化诱导刺激相应的多分化能力的细胞。作为例子，可以举出造血干细胞、血管内皮前体细胞、间叶系干细胞等，但不限定于此。所谓本发明中的封闭体系是指本发明的细胞培养容器内的环境被与该容器外的环境隔断而不被外部环境的杂菌等污染的状态。应予说明，在细胞培养容器内外交换空气、CO2等气体时，优选设置具有阻止杂菌进入的孔径的过滤器，作为该过滤器的孔径，优选例如O. 45 μ m、0. 22 μ m。为了维持封闭体系，可以预先将袋、线路、各种过滤器等各部件以形成封闭体系的方式进行连接，也可以是各部件分开并能够在即将使用之前以保持封闭体系的方式连接各部件的结构。另外，本发明的细胞培养容器优选灭菌后使用。作为灭菌方法，可以举出高压蒸气灭菌、环氧乙烷气体灭菌、Y射线灭菌、电子束灭菌等，但本发明不限定于此。以下说明中的“管路”是例如聚氯乙烯、聚氨酯、硅酮等的管，在这些分支或者合流部可使用适当的连接器(接头)。另外，以下说明中的“流路开关阀”压夹上述管来开关其流路，例如使用夹管阀或者滚子阀等。
进而，以下说明中的“泵”利用滚子等依次按压上述管来输送，例如可使用滚子泵
坐寸O进而，流路开关阀的开关控制和泵的驱动控制可利用没有图示的可编程控制器等控制装置进行。另外，在以下说明中，将被处理液相对于细胞分离过滤器SF的入口侧和细胞悬浊液相对于细胞回收过滤器CF的入口侧分别称为“上游侧”，将不被细胞分离过滤器SF、细胞回收过滤器CF捕捉的废液的出口侧分别称为“下游侧”。实施方式I.以下，对于本发明的实施方式I所涉及的细胞培养用一次性器具和细胞培养装 置，用图I的概略构成图进行说明。细胞培养用一次性器具由以下构成具有液体流入口 Lin和液体排出口 Lout的细胞培养容器Ce、与液体流入口 Lin连接并用于使在细胞培养中使用的细胞分离的细胞分离套件A、以及与液体排出口 Lout连接并用于将在细胞培养容器CC中被培养的细胞清洗浓缩的细胞回收套件B，其在封闭体系中连接，以使得(I)播种的有用细胞的分离工序、(2)分离的有用细胞的培养工序、(3)培养的细胞的清洗、浓缩工序中的全部工序能够无菌地处理，并且使用后为了提高安全性而废弃。[细胞分离套件]细胞分离套件A用于分离在细胞培养中使用的细胞，本实施方式中，由细胞分离过滤器SF、被处理液槽Tl及细胞储存袋T2以及废液槽Wl和第I细胞回收液导入部Cl等构成。S卩，在细胞分离过滤器SF的上游侧通过管路LI与被处理液槽Tl连接，通过从管路LI的中途分支的管路Lll与细胞储存袋T2连接。另外，在细胞分离过滤器SF的下游侧通过管路L2与废液槽Wl连接，通过从管路L2的中途分支的管路L21与第I细胞回收液导入部Cl连接。进而，在管路Lll的下游侧从管路LI的中途分支的管路L3与细胞培养容器CC的液体流入口 Lin连接。在此，被处理液槽Tl容纳有包含利用任意方法制备得到的细胞的被处理液，为了在封闭体系的环境下移送上述被处理液，优选在被处理液槽Tl设有能够与被处理液的制备机构以无菌方式连接的注入口。〔细胞分离过滤器〕细胞分离过滤器SF具有从含有细胞的被处理液选择性地捕捉细胞的功能，被收纳于细胞分离过滤器SF中的细胞分离材料的特征在于，可以实质上使含有细胞的被处理液中的白血球和红血球通过。在此所述的“实质上使含有细胞的被处理液中的白血球和红血球通过”是指在使含有细胞的被处理液流过细胞分离材料时，被处理液中的白血球的30%以上以及红血球的80%以上在不被细胞分离材料捕捉的情况下通过。从作为目标细胞的成体干细胞的分离能力方面考虑，更优选的细胞分离材料是使被处理液中的白血球的45%以上以及红血球的85%以上通过的材料，进一步优选使被处理液中的白血球的60%以上以及红血球的90%以上通过，最优选使被处理液中的白血球的70%以上以及红血球的95%以上通过。只要达到如上所述的白血球和红血球的通过率、进而能够选择性地捕捉成体干细胞，就对细胞分离材料的物理、化学、生物化学性状等没有特别限定，关于其形态、孔径、密度、材质，具体地可以举出以下内容。就细胞分离材料的形态而言，没有特别限定，但从使之易于接触含有细胞的被处理液、接触的面积大的方面考虑，优选为连通孔结构的多孔体、纤维聚集体、织物等。更优选为由纤维构成的材料，进一步优选为作为纤维聚集体的无纺布。细胞分离材料由纤维或者纤维聚集体构成时，从成体干细胞的捕捉·回收率的观点考虑，其纤维径优选3 40 μ m的范围。如果构成细胞分离材料的纤维的纤维径比3 μ m细，则白血球等夹杂的有核细胞、红血球及血小板等的通过率降低,它们的除去效率降低。如果纤维径比40μπι粗，则变得易于引起有效接触面积降低、短路径(short path)，导致成体干细胞的捕捉·回收率降低。为了提高成体干细胞与细胞分离材料的相互作用、提高收 率，纤维径更优选5 35 μ m的范围，进一步优选5 30 μ m的范围。就细胞分离材料的孔径而言，从成体干细胞的捕捉 回收率的观点考虑，优选短径为3 μ m以上、长径为120 μ m以下。如果细胞分离材料的孔径的短径小于3 μ m,则白血球等夹杂的有核细胞、红血球和血小板的除去效率显著降低。如果细胞分离材料的孔径的长径大于120 μ m，则成体干细胞的捕捉变得困难。从白血球等夹杂的有核细胞、红血球和血小板的除去效率等观点考虑，优选孔径的短径为5 μ m以上，长径为80 μ m以下，从白血球等夹杂的有核细胞、红血球和血小板的除去效率以及成体干细胞的捕捉·回收率等观点考虑，进一步优选孔径的短径为5μπι以上，长径为70 μ m以下。在此所述的孔径是利用扫描型电子显微镜对细胞分离材料拍摄照片并将通过不同的2根以上的纤维交叉而形成的实质上的孔的长径和短径用图像解析装置测定50点以上而得到的值的平均值。就细胞分离材料的密度而言，从白血球等夹杂的有核细胞、红血球和血小板的除去效率以及成体干细胞的捕捉·回收率的观点考虑，优选为I. OX IO4 1.0X106g/m3的范围。从白血球等夹杂的有核细胞、红血球和血小板的除去效率的观点考虑，更优选为
2.5 X IO4 7. 5 X 105g/m3，进一步优选为5. O X IO4 5. O X 105g/m3的范围。在此所述的密度是细胞分离材料的重量(g)除以其体积(m3)而得到的值。细胞分离材料的材质优选为选自聚丙烯、聚乙烯、高密度聚乙烯、低密度聚乙烯等聚烯烃，聚酯，聚对苯二甲酸丁二醇酯，聚氯乙烯，聚乙烯醇，聚偏二氯乙烯、人造丝、维尼纶、聚苯乙烯、丙烯酸类聚合物(聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸羟基乙酯、聚丙烯腈、聚丙烯酸、聚丙烯酸酯等)、尼龙、聚氨酯、聚酰亚胺、芳纶、聚酰胺、铜氨纤维(Cupra)、芳纶纤维(Kevlar)、石墨、聚丙烯酸酯、酹、聚酯纤维(Tetron)、纸楽；、麻、纤维素、洋麻、壳多糖、壳聚糖、玻璃、棉等中的至少I种材质，更优选为选自聚酯、聚丙烯、聚苯乙烯、丙烯酸聚合物、人造丝、聚烯烃、维尼纶、聚乙烯、尼龙、聚氨酯等中的至少I种合成或者半合成的高分子。在组合2种以上的高分子作为细胞分离材料时，对其组合没有特别限定，可以举出由聚酯和聚烯烃、或者人造丝和聚烯烃、或者聚酯、人造丝及维尼纶等构成的组合。作为组合2种以上高分子时的纤维的形态，I根纤维可以是由成分彼此不同的高分子形成的纤维、或者不同成分彼此剥离分割而得到的分割纤维。
另外，也可以是将由成分不同的高分子单独形成的纤维分别复合化而得到的形态。在此所述的复合化，没有特别限定，可以举出将由2种以上纤维混杂的状态构成的形态、或者由高分子单独形成的形态分别贴合而成的复合化等，但本发明不限定于此。为了使细胞分离材料的性能更加提高，也可以进行材料的亲水化处理。通过亲水化处理，可以赋予以下效果抑制所需细胞以外的细胞的非特异性捕捉、提高使体液不失衡地在细胞分离材料中通过等的性能、提高所需细胞的回收效率等。作为亲水化处理方法，可以举出使水溶性多元醇，或者具有羟基、阳离子基团、阴离子基团的聚合物，或其共聚物(例如甲基丙烯酸羟基乙酯、甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯、或其共聚物等)吸附的方法，使聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇等水溶性高分子物质吸附的方法，将亲水性高分子固定于疏水性膜的方法(例如，使亲水性单体以化学方式结合于表面的方法等)，对细胞分离材料进行电子束照射的方法，通过在含水状态下对细胞分离材料照射放射线而使亲水性高分子交联不溶的方法，通过在干燥状态下对细胞分离材料进行热处理而使亲水性高分子不溶并固定的方法，用与亲水性高分子形成水不溶性复合物的成分对细胞分离材料进行处理的方法，对疏水性膜的表面进行磺化的方法，由聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮等亲水性高分子物质和疏水性聚合物原液(polymer dope)的混合物成膜的方法，通过碱性水溶液(NaOH、KOH等)处理而对膜表面赋予亲水基团的方法,将疏水性多孔膜在醇中浸溃后用水溶性聚合物水溶·液处理、干燥、然后通过热处理、放射线等进行不溶处理的方法，使具有表面活性作用的物质吸附的方法等。作为具有表面活性作用的物质，可以举出非离子性表面活性剂、卵磷脂、聚氧乙烯氢化蓖麻油、乙二胺四乙酸钠、失水山梨糖醇倍半油酸酯、D-山梨糖醇、脱氢胆酸、甘油、D-甘露醇、酒石酸、丙二醇、聚乙二醇(Microgol)、羊毛脂醇、甲基纤维素等。作为非离子性表面活性剂，大致分为多元醇脂肪酸酯系和聚氧乙烯系。作为多元醇脂肪酸酯系表面活性齐U，可以举出硬脂酸甘油酯系、山梨糖醇脂肪酸酯、山梨糖醇酰基酯等。另外，作为聚氧乙烯系表面活性剂，可以举出聚氧乙烯醇醚、聚氧乙烯酰基酯、聚氧乙烯山梨糖醇酰基酯、聚氧乙烯山梨糖醇单月桂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇三硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯等。这些物质可以各自单独使用，或者组合使用。另外，为了使成体干细胞对细胞分离材料的附着性提高，也可以将细胞附着性蛋白质、针对在成体干细胞上所表达的抗原的抗体固定在细胞分离材料上。作为细胞附着性蛋白质，可以举出纤维连接蛋白(Fibronectin)、层粘连蛋白(laminin)、玻璃粘连蛋白(vitronectin)、骨胶原等。作为抗体,在目标细胞是间叶系干细胞时，可以举出针对⑶73、⑶90、⑶105等的抗体，在目标细胞是造血干细胞时，可以举出针对⑶34、c-Kit、Sca-I等的抗体,在目标细胞是成肌细胞时,可以举出针对Myf5等的抗体等，但不限定于此。另外，也可以例如进行以细胞粘合难以发生的方式对表面进行亲水性处理、使细胞彼此凝集而促进球状体形成等的表面修饰。进而，也可以使作为细胞支撑体的支架(scaffold)在细胞培养容器内共存而促进细胞与支架的复合化、或者预先将细胞与支架的复合物等供给培养。细胞分离过滤器SF是收纳上述说明的细胞分离材料而成的，但是对于其形态、大小、结构材料等没有特别限定。细胞分离过滤器SF的形态可以采取球、容器、盒体、袋、管、柱等任意的形态，作为优选的具体例，例如可以举出容量为O. 5 1000ml、直径为O. 3 IOcm的透明或者半透明的圆柱状容器、或者一边长度为I 20cm的正方形或者长方形、厚度为O. I 5cm的四角柱状形态等，但本发明不限定于此。细胞分离过滤器SF可以使用任意的结构材料来制作。具体地可以举出非反应性聚合物、生物亲和性金属、合金、玻璃等。作为非反应性聚合物，可以举出丙烯腈-丁二烯-苯乙烯三元共聚物等丙烯腈聚合物；聚四氟乙烯、聚氯三氟乙烯、四氟乙烯与六氟丙烯的共聚物、聚氯乙烯等卤化聚合物；聚酰胺、聚砜、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯-丙烯酸类共聚物、聚碳酸酯、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯、聚苯乙烯、聚甲基戊烯等。作为容器材料有用的金属材料可以举出不锈钢、钛、钼、钽、金、及它们的合金、以及镀金合金铁、镀钼合金铁、钴铬合金、氮化钛被覆不锈钢等。作为容器材料，特别优选具有耐灭菌性的原材料，具体地可以举出聚丙烯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚酰亚胺、聚碳酸酯、聚砜、聚甲基戊烯等。
〔使用细胞分离过滤器的细胞分离方法〕接着，对于使用细胞分离过滤器SF的细胞分离方法进行说明。在使管路LI I上的流路开关阀￥11、管路1^3上的流路开关阀V3及管路L21上的流路开关阀V21关闭，使管路LI上的流路开关阀VI、V13及管路L2上的流路开关阀V2开启的状态下，驱动泵P1，由此通过管路LI使被容纳于被处理液槽Tl中的含有细胞的被处理液流过细胞分离过滤器SF。利用泵Pl流过时的流速可以举出O. I 100ml/min,但本发明并不限定于此。使含有细胞的被处理液流过细胞分离过滤器SF后，为了清洗夹杂的红血球等，优选进行细胞分离过滤器SF的清洗。这种情况下，细胞清洗液可以举出生理食盐液、林格液、在细胞培养中使用的培养基、磷酸缓冲液等一般的缓冲液，但从安全方面考虑，优选生理食盐液。清洗可以利用输送含有细胞的被处理液的泵来流过。这种情况下的流速可以举出O. I IOOml/min0清洗量根据细胞分离过滤器SF的容量不同而异，但优选以该过滤器容积的约I 100倍的体积进行清洗。〔被细胞分离过滤器捕捉的细胞的回收方法〕在细胞分离过滤器SF中细胞主要存在于上游侧的可能性高，因此，优选使第I细胞回收液导入部Cl位于细胞分离过滤器SF的下游侧。然后，使细胞回收液向与使含有细胞的被处理液流动的方向相反的方向从第I细胞回收液导入部Cr流过细胞分离过滤器SF，从而回收细胞。S卩，通过使流路开关阀VI、V2、V3关闭并使流路开关阀VII、V13、V21开启而从第I细胞回收液导入部Cl导入细胞回收液，从而从细胞分离过滤器SF回收细胞，该回收到的细胞经由管路LI和Lll而被储存在细胞储存袋T2内。或者，作为不具备图I中的细胞储存袋T2的构成，可以将细胞回收至被处理液槽Tl中。这样，将回收的细胞回收到细胞储存袋T2或者被处理液槽Tl中，而不会将回收到的细胞在原样的压力下输送到细胞培养容器Ce，从而能够减少由细胞回收时的高压力导致的对细胞的损害。细胞回收液的量和流速根据过滤器容量不同而异，优选以O. 5 20ml/sec注入过滤器容积的I 100倍量的细胞回收液，但不限定于此。作为对细胞分离过滤器SF导入细胞回收液的方法，也有利用滚子泵等输送的方法，但更优选使用如图2所示的以压力气体作为驱动源的外部按压单元D。即，利用容纳有细胞回收液的注射器构成第I细胞回收液导入部Cl，将注射器的外筒固定于固定用具E，利用作为外部按压单元D的例如气筒Dl的活塞杆推压注射器的柱塞，从而如图2 Ca) 图2(b)所示，注射器内的细胞回收液被挤出到管路L21内。气筒Dl的驱动可以通过利用流路切换阀D2切换从管路LO供给加压气体(是空气、氧、氮、二氧化碳等气体，没有特别限定，但从在CO2培养箱等中使用二氧化碳方面考虑，优选二氧化碳)的端口 P1、P2来进行，这样的驱动控制可利用没有图示的可编程控制器等控制装置进行。S卩，通过将加压气体供给到端口 P1，从而如图2 (b)所示，活塞杆突出，通过将加压气体供给到端口 P2，从而活塞杆回归到图2 Ca)的状态。
应予说明，通过使用容纳有加压气体的储气瓶作为加压气体的供给源，加压气体对管路LO的供给变得容易。尤其是，通过使加压气体的供给源为二氧化碳储气瓶，二氧化碳储气瓶从被用于CO2培养箱等方面出发易于利用，因此是更优选的实施方式。另外，按压注射器的柱塞时的压力优选O. 05MPa IMpa，从提高细胞的回收率且减少对细胞的损害的观点考虑，更优选O. IMPa O. 75MPa，从稳定的高细胞回收率及细胞的高功能表达的观点考虑，进一步优选O. 2MPa O. 5MPa。与一般的滚子泵相比，通过使用以压力气体作为驱动源的外部按压单元D，可以短时间地达到细胞回收所需要的压力，因而能够以比较少量的细胞回收液一下子地回收，因此，细胞的回收率提高，并且回收率的偏差减小。细胞回收液只要是等渗液，就没有特别限定，但是由细胞分离过滤器SF回收到的细胞紧接着在细胞培养容器CC中培养，因此优选具有使成体干细胞增殖的功能的液体、即成体干细胞的培养基作为细胞回收液。作为这种情况下的成体干细胞的培养基的具体例，可以举出 D-MEM(Dulbecco 改良 Eagle 培养基)、IMDMC Iscove 改良 Eagle 培养基)、RPMI1640培养基、MCDB133培养基、ASF培养基等培养基，但不限定于此。另外，为了提高回收的干细胞的增殖能力、分化能力，可以在上述培养基中加入血清、血浆等生物体成分、bFGF(碱性成纤维细胞增殖因子)、TGF-i3 (转化增殖因子-β )、胰岛素、转铁蛋白、层粘连蛋白、纤维连接蛋白(Fibronectin)等蛋白性因子、维甲酸、抗坏血酸、各种氨基酸、各种糖类、5-氮杂胞苷、2-巯基乙醇、亚硒酸钠、氢化可的松、地塞米松等低分子物质。进而，为了避免干细胞培养过程中的杂菌污染，可以在上述液体中加入卡那霉素、庆大霉素、青霉素、链霉素、多粘菌素B、万古霉素、两性霉素B等抗生素、抗真菌剂。另外，在这些培养基中也可以根据需要而添加5 20%左右的血清。〔细胞培养容器、及回收的细胞的培养方法〕就被储存在细胞储存袋T2或者被处理液槽Tl中的细胞悬浊液而言，通过使流路开关阀V13关闭、使流路开关阀Vll或Vl和V3开启并驱动泵P2，从而经由管路LlULl及L3或管路LI和L3移送至细胞培养容器CC。作为细胞培养容器CC，只要能够培养在被回收的细胞中所含有的成体干细胞并将该细胞数扩增，就可以使用任何器具、装置，但从操作简便方面，杂菌污染、交叉污染等危险性低方面考虑，优选使用细胞培养袋、细胞培养盒、或者细胞培养皿。另外，这些结构体的材质可以举出聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、氯乙烯、聚乙烯、聚烯烃、苯乙烯丁二烯热塑性树脂等弹性体、聚碳酸酯、聚丙烯等，但不限定于此。细胞培养容器CC的形状在平面视图中为圆形或者多角形等未特别限定的形状，但为了能够培养许多的细胞并且实现节省空间化，优选底面积大的扁平形状。另外，细胞培养袋、细胞培养盒或者细胞培养皿可以以堆叠在一起的多级形式使用，以使得能够一次培养大量细胞，也可以采取容器内部被分离成多级而能够一次培养许多细胞的形式。进而，细胞在细胞培养容器CC中的播种数也根据细胞的种类不同而异，但优选每单位培养面积为5X IO2 3X 104(个/cm2)，从细胞的增殖性和回收率的观点考虑，更优选为I X IO3 I X IO4(个 /cm2)。〔细胞回收套件]细胞回收套件B用于清洗浓缩被培养的细胞，本实施方式中，由细胞回收过滤器·CF、细胞滤过过滤器RF、废液槽W2及第2细胞回收液导入部C2以及细胞回收槽T3等构成。S卩，与细胞培养容器CC的液体排出口 Lout连接的管路L4介由细胞滤过过滤器RF与细胞回收过滤器CF的上游侧连接。另外，在细胞回收过滤器CF的下游侧利用管路L5连接废液槽W2，利用从管路L5的中途分支的管路L51连接第2细胞回收液导入部C2。进而，在细胞回收过滤器CF的上游侧利用从管理L4分支的管路L6连接细胞回收槽T3。〔培养细胞从细胞培养容器中的剥离方法〕接着，对于培养细胞从细胞培养容器CC剥离的方法进行说明。将在细胞培养容器CC中培养规定期间的细胞利用胰蛋白酶等酶处理、螯合剂处理等剥离，介由管路L4导入到细胞回收过滤器CF。此时，被剥离的细胞一部分形成凝集块，如果以原样的状态输送至细胞回收过滤器，则有可能堵塞过滤器。因此，在从细胞培养容器CC到细胞回收过滤器CF之间，设置孔径为30 μ m 500 μ m、更优选为50 μ m 400 μ m的细胞滤过过滤器RF，在除去细胞的凝集块后流过到细胞回收过滤器CF。就利用细胞剥离剂对细胞的处理的时间而言，作为目标，优选I 15分钟，可以摇动细胞培养容器Ce，以使得细胞剥离剂在容器整体范围内均匀地扩展。对于像间叶系干细胞这样细胞外基质的分泌量多的细胞而言，如果持续培养，直至细胞扩展到例如培养皿的一面而不再增加的铺满(confluent)状态，则在利用细胞剥离剂进行处理时，难以作为单细胞回收，存在回收率降低的可能性。另外，如果在增殖初期回收，则细胞数量少的可能性高。因此，在回收细胞时，细胞占有的面积相对于培养面积的比例优选为50%以上。另夕卜，出于上述理由，更优选70% 90%的范围，但本发明不限定于此。就用细胞剥离剂剥离的细胞而言，可以将全部细胞供给接下来的细胞回收工序，也可以将一部分细胞残留在细胞培养容器内，而继续再次培养。还可以通过重复数次本操作而进行细胞数量的扩增。〔细胞回收过滤器〕
细胞回收过滤器CF具有利用被收纳在其中的细胞回收材料来捕捉培养的细胞并使夹杂物通过的功能。在此所述的夹杂物可以举出作为细胞培养基所含有的目标细胞的成体干细胞以外的细胞、细胞膜片段等固体物、来自细胞的分泌物、细胞培养基、在细胞剥离时使用的胰蛋白酶等酶、螯合剂等。细胞回收材料的材质优选选自以下材质中的至少一种聚丙烯、聚乙烯、高密度聚乙烯、低密度聚乙烯等聚烯烃、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯等聚酯，聚氯乙烯，聚乙烯醇，聚偏二氯乙烯，人造丝，维尼纶，聚苯乙烯，丙烯酸类(聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸羟基乙酯、丙烯腈、丙烯酸、丙烯酸酯等)，尼龙，聚氨酯，聚酰亚胺，芳纶，聚酰胺，铜氨纤维(Cupra),芳纟仑纤维(Kevlar),石墨,聚丙烯酸酯,酹,聚酯纤维(Tetron),纸浆，麻，纤维素，洋麻，壳多糖，壳聚糖，玻璃，棉等，更优选选自聚酯、聚苯乙烯、丙烯酸类、人造丝、聚烯烃、维尼纶、聚乙烯、尼龙、聚氨酯等中的至少I种合成高分子。在组合2种以上的合成高分子作为细胞回收材料时，对其组合没有特别限定，可以举出由聚酯和聚烯烃、或者人造丝和聚烯烃、或者聚酯、人造丝及维尼纶等构成的组合。作为组合2种以上合成高分子时纤维的形态，I根纤维可以是由成分彼此不同的合成高分 子形成的纤维、或者可以是不同成分彼此剥离分割的分割纤维。另外，可以是将由成分不同的合成高分子单独形成的纤维复合化的形态。在此所述的复合化没有特别限定，可以举出将由2种以上的纤维混杂的状态构成的形态、或者由合成高分子单独形成的形态分别贴合而成的复合化等，但本发明不限定于此。另外，细胞回收材料的形状可以是连通孔结构的多孔体形状，也可以是纤维聚集体、织物等，但更优选为无纺布。从成体干细胞的回收率方面考虑，细胞回收材料的纤维径优选3 40 μ m。如果比3 μ m细，则与白血球的相互作用增高，不需要的细胞的除去效率降低。另外，如果比40 μ m粗，则变得易引起有效接触面积降低、短路径，从而导致成体干细胞的回收率降低。为了提高成体干细胞与过滤器的相互作用、提高收率，更优选5 35 μ m。进一步优选为5 μ m 30 μ m0就细胞回收材料的孔径而言，从成体干细胞的捕捉性方面考虑，优选短径为3 μ m以上且长径为120 μ m以下。如果细胞回收材料孔径的短径小于3 μ m，则存在夹杂物的除去效率降低的可能性。如果细胞回收材料孔径的长径大于120 μ m，则成体干细胞的捕捉变得困难。从红血球等比较大的夹杂物的除去效率考虑，细胞回收材料的孔径更优选为5 80 μ m,从成体干细胞的捕捉性考虑，进一步优选为5 30 μ m。在此所述的孔径是利用扫描型电子显微镜对细胞回收材料拍摄照片，利用图像解析装置将由不同的2根以上的纤维交叉而形成的实质上的孔的长径和短径测定50点以上而得的值的平均值。细胞回收过滤器CF的形态可以采取球、容器、盒体、袋、管、柱等任意形态，作为优选的具体例，例如可以举出容量为O. I 1000ml、直径为O. 3 15cm的透明或者半透明的圆柱状容器，或者一边长度O. I 20cm的正方形或者长方形、厚度为O. I 5cm的四角柱状形态等。另外，细胞回收过滤器CF可以以切断成合适的大小的平板状来处理体液，还可以以卷成辊状的形状来进行体液的处理。以辊状使用时,通过从该辊的内侧向外侧处理体液，也可以进行所需细胞的捕捉，或者与此相反地，也可以使体液从辊的外侧流入到内侧而进行成体干细胞的捕捉。以上，举出了具体例，但本发明不限定于此。〔使用细胞回收过滤器的培养细胞的清洗浓缩方法〕接着，对于使用细胞回收过滤器CF的培养细胞的清洗浓缩方法进行说明。对于含有用于剥离培养规定期间后的细胞的胰蛋白酶等酶、螯合剂等的细胞悬浊液，在使管路L6上的流路开关阀V6和管路L51上的流路开关阀V51关闭并使管路L4上的流路开关阀V4和管路L5上的流路开关阀V5开启的状态下，驱动泵P3，从而从细胞培养容器CC通过管路L4输送到细胞回收过滤器CF。将含有胰蛋白酶等酶、螯合剂等的细胞悬浊液流过到细胞回收过滤器CF后，为了清洗残留在过滤器内的胰蛋白酶等酶、螯合剂等，优选进行细胞回收过滤器的清洗。
这种情况下，细胞清洗液可以举出生理食盐液、林格液、在细胞培养中使用的培养基、磷酸缓冲液等一般的缓冲液。清洗可以利用输送含有胰蛋白酶等酶、螯合剂等的细胞悬浊液的泵而使之流过。这种情况下的流速可以举出O. I 100ml/min。清洗量根据细胞回收过滤器CF的容量不同而异，但优选以该过滤器容积的约I 100倍的体积进行清洗。在细胞回收过滤器CF中，细胞主要存在于上游侧的可能性高，因此，优选使第2细胞回收液导入部C2位于细胞回收过滤器CF的下游侧置。然后，使细胞回收液向与使上述细胞悬浊液流动的方向相反的方向从第2细胞回收液导入部C2流过到细胞回收过滤器CF，从而回收细胞。即，使流路开关阀V4、V5关闭，使流路开关阀V6、V51开启，从第2细胞回收液导入部C2导入细胞回收液，从而从细胞回收过滤器CF回收的细胞可以经由管路L4、L6而被储存在细胞回收槽T3内来获得最终产物的细胞。作为细胞回收槽T3，可以使用任意器具，但从杂菌污染、交叉污染等危险性低方面、搬运简便方面等考虑，优选使用袋、试管、管等。另外，这些结构体的材质可以举出聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、氯乙烯、聚乙烯、聚烯烃、苯乙烯-丁二烯热塑性树脂等弹性体、聚碳酸酯、聚丙烯等，但不限定于此。 细胞回收液的量和流速根据过滤器容量不同而异，优选以O. 5 20ml/sec注入过滤器容积的I 50倍量的细胞回收液，但不限定于此。细胞回收液只要是等渗液，就没有特别限定，但为了将从细胞回收过滤器CF回收的细胞用于移植等，优选生理食盐液、林格液等在实践中被用于医疗用途的溶液，血浆，血清，或者在生理食盐液、林格液等中添加白蛋白、血浆、血清而得的溶液等。作为对细胞回收过滤器CF导入细胞回收液的方法，也有利用滚子泵等输送的方法，但更优选使用如图2所示的以压力气体作为驱动源的外部按压单元D。即，利用容纳有细胞回收液的注射器构成第2细胞回收液导入部C2，将注射器的外筒固定于固定用具E，通过作为外部按压单元D的例如气筒Dl的活塞杆推压注射器的柱塞，从而如图2 Ca) 图2(b)所示，注射器内的细胞回收液被挤出到管路L51内。气筒Dl的驱动可以通过利用流路切换阀D2切换从管路LO供给加压气体(是空气、氧、氮、二氧化碳等气体，没有特别限定，但从在CO2培养箱等中使用二氧化碳方面考虑，优选二氧化碳)的端口 P1、P2来进行，这样的驱动控制可利用没有图示的可编程控制器等控制装置进行。即，通过将加压气体供给到端口 P1，从而如图2 (b)所示，活塞杆突出，通过将加压气体供给到端口 P2，从而活塞杆回归到图2 Ca)的状态。另外，按压注 射器的柱塞时的压力优选O. 05MPa IMPa，从提高细胞的回收率且减少对细胞的损害的观点考虑，更优选O. IMPa O. 75Mpa，从稳定的高细胞回收率和细胞的高功能表达的观点考虑，进一步优选O. 2MPa O. 5MPa。与一般的滚子泵相比，通过使用以压力气体作为驱动源的外部按压单元D，可以短时间地达到细胞回收所需要的压力，因而能够以比较少量的细胞回收液一下子地回收，因此，细胞的回收率提高并且回收率的偏差减小。实施方式2.接着，用图3的概略构成图，对于本发明的实施方式2所涉及的细胞培养用一次性器具和细胞培养装置进行说明。图3中的与图I相同符号表示相同或者相当的部分，因此以下对于与图I相同符号的内容，有时省略详细说明。本实施方式示出如下更优选的方法用细胞分离过滤器SF从含有成体干细胞的被处理液分离成体干细胞，将分离的细胞在细胞培养容器CC中培养后，利用细胞回收过滤器CF，由酶、螯合剂等清洗细胞，在浓缩的状态下回收。[细胞分离套件]就实施方式2的细胞分离套件A而言，没有实施方式I的细胞回收袋T2，在细胞回收中并用被处理液槽Tl，在实施方式I的细胞分离套件A的基础上，利用从管路LI的中途分支的管路L12连接清洗液槽WA1，利用从管路L3的中途分支的管路L31连接培养基槽T4，利用从管路L31的中途分支的管路L32连接细胞剥离液槽T5。〔细胞回收套件]就实施方式2的细胞回收套件B而言，在实施方式I的细胞回收套件B的基础上，废液槽W3通过管路L7与细胞培养容器CC的液体排出口 Lout连接，利用从管路L6的中途分支的管路L8连接清洗液槽WA2。就被收纳在被处理液层Tl中的含有成体干细胞的被处理液而言，与实施方式I同样地驱动泵Pl，从而通过管路LI流过到细胞分离过滤器SF。被处理液在细胞分离过滤器SF中的流过速度没有特别限定，但以被处理液相对于细胞分离材料的厚度的通过速度(线速度)表示时，优选处于O. I 1000mm/min的范围。如果线速度低于O. lmm/min,则处理时间长期化,如果高于1000mm/min,则因被处理液的流水压而导致成体干细胞变得难以被分离材料捕捉。更优选的线速度为O. 5 500mm/min，进一步更优选为I 250mm/min。在使含有成体干细胞的被处理液流过到细胞分离过滤器SF之前，用生理食盐液等等渗液进行细胞分离过滤器SF的清洗时，使流路开关阀V1、V3和V21关闭并使流路开关阀V2和管路L12上的流路开关阀V12开启，驱动泵Pl，从而容纳在清洗液槽WAl中的生理食盐液等清洗液介由管路L12和管路LI而流过到细胞分离过滤器SF，废液介由管路L2而被容纳在废液槽Wl中。此时的线速度没有特别限定，但优选处于O. I 1000mm/min的范围。通过使含有成体干细胞的被处理液流过到细胞分离过滤器SF，被处理液中的成体干细胞被细胞分离材料捕捉，没有捕捉到的红血球、成体干细胞以外的有核细胞、血浆成分、酶、用于稀释的缓冲液等不需要的成分通过管路L2被移送到废液槽W1。
通过使含有成体干细胞的被处理液流过到细胞分离过滤器SF，成体干细胞被细胞分离材料捕捉，但同时存在一部分红血球、有核细胞残留在细胞分离材料中的可能性。为了除去这些不需要的细胞，可以介由管路L12和管路LI使清洗液从清洗液槽WAl流过到细胞分离过滤器SF。这种情况下的清洗液流入口优选处于与流过到细胞分离过滤器SF的被处理液流入口相同的位置、或其上游侧。在此使用的清洗液只要是对成体干细胞不造成负面影响的液体，就没有特别限定，作为具体例，可以举出生理食盐液、林格液、血清、血浆、在细胞培养中使用的培养基、磷酸缓冲液等一般的缓冲液等。从对成体干细胞的负面影响小、在实践中在医疗用途中使用的方面考虑，优选使用生理食盐液。在任何情况下，清洗液的流过条件均优选以使被处理液流过到细胞分离过滤器SF的情况为基准的条件。通过将清洗液流过到细胞分离过滤器SF中，残留在细胞分离过滤器SF内的除了成体干细胞以外的不需要的细胞通过管路L2与清洗液一起从细胞分离过滤器SF内被移送到废液槽Wl中。就被细胞分离过滤器SF捕捉的成体干细胞而言，由第I细胞回收液导入部Cl介·由管路L21将细胞回收液流过到细胞分离过滤器SF，从而介由管路LI而暂时储存在被处理液槽Tl中，介由其后的管路L1、L3被移送到细胞培养容器CC，直接培养。此时，如果使用干细胞培养用培养基等具有使干细胞增殖的功能的液体作为细胞回收液，则可以在移送后直接培养，因而优选。另外，在细胞分离过滤器SF中成体干细胞主要存在于上游侧的可能性高，因此管路L21优选与位于细胞分离过滤器SF下游侧的管路L2连接。进而，根据需要，使管路L3上的流路开关阀V3关闭，使管路L31上的流路开关阀V31开启，并驱动泵P2，从而可以从充填有培养基的培养基槽T4经由管路L31和L3对细胞培养容器CC进行培养基的追加。将由细胞分离过滤器SF回收的成体干细胞用细胞培养容器CC培养，扩增到所需细胞数，但此时，可以在保持作为成体干细胞的性质的情况下扩增，也可以被分化诱导成适当的特定细胞、组织。在保持作为成体干细胞的性质的情况下扩增的细胞组合物，被分化诱导成特定细胞、组织的细胞组合物均被包括在本发明的范畴内。另外，在细胞培养容器CC中，被扩增到所需细胞数的成体干细胞可以在其后残留一部分细胞，进而接着在细胞培养容器CC内继续培养。在剥离于细胞培养容器CC内增殖的细胞时，通过驱动泵P4，从而将培养基从管路L7排液到废液槽W3。另外，在细胞培养容器CC内残留培养基时，由于培养基中的蛋白质成分、二价阳离子等的影响而导致存在细胞剥离剂的效力变差的可能性，因此通过驱动泵P2，经由管路L12和管路L3将清洗液槽WAl内的清洗液注入到细胞培养容器CC内，从而可以清洗残留的
培养基。进行清洗时，驱动泵P4，将清洗液从管路L7排液到废液槽W3。接着，驱动泵P2，经由管路L32、L31和L3，将用于剥离细胞剥离液槽T5内的细胞的胰蛋白酶等酶、螯合剂等细胞剥离剂注入到细胞培养容器CC内。此时，可以进行细胞培养容器CC的摇动，以使得细胞剥离剂遍布细胞培养容器CC的整体。
就利用细胞剥离剂对细胞的处理时间而言，作为目标，优选I 15分钟，经过规定时间后，为了使细胞剥离剂失活，从培养基槽T4经由管路L31和L3追加培养基。在追加细胞培养基前，为了使细胞充分剥离，可以在加入了细胞剥离剂的状态下进行细胞培养容器CC的摇动。就混合有细胞剥离剂与培养基的细胞悬浊液而言，介由细胞滤过过滤器RF从管路L4流过到细胞回收过滤器CF，从而增殖的细胞被细胞回收过滤器CF捕捉。未被捕捉的细胞以外的有核细胞、血清成分、酶、螯合剂、培养基等不需要的成分通过管路L5而被移送到废液槽W2。由于存在用于细胞剥离的胰蛋白酶等酶、螯合剂等残留在细胞回收过滤器CF内的可能性，因此为了除去这些不需要的成分，可以通过管路L8、L6、L4使清洗液槽WA2内 的生理食盐液等清洗液流过到细胞回收过滤器CF。被处理液在细胞回收过滤器CF中的流过速度和清洗细胞回收过滤器CF时的流速没有特别限定，但以被处理液相对于过滤器厚度的通过速度(线速度)表示时，优选处于
O.I 1000mm/min的范围，更优选的线速度为O. 5 500mm/min,进一步优选为I 250mm/
mirio在此使用的清洗液只要是不对细胞造成负面影响的液体，就没有特别限定，作为具体例，可以举出生理食盐液、林格液等在实践中作为注射用剂使用的清洗液等。另外，清洗量根据细胞回收过滤器CF的容量不同而异，但优选以该过滤器容积的约I 100倍的体积进行清洗。被细胞回收过滤器CF捕捉的细胞可以通过使细胞回收液沿着与使细胞悬浊液流动的方向相反的方向流动来回收。具体而言，从第2细胞回收液导入部C2介由管路L51、L5而使细胞回收液流过到细胞回收过滤器CF，从而介由管路L4、L6回收到细胞回收槽T3。由于细胞在细胞回收过滤器CF中主要存在于上游侧的可能性高，因此管路L51优选与位于细胞回收过滤器CF下游侧的管路L5连接。作为细胞回收液，只要是对细胞不造成负面影响的液体，就没有特别限定，作为具体例，可以举出生理食盐液、林格液等在实践中作为注射用剂使用的溶液，血浆，血清等。另外，也可以在生理食盐液、林格液等中添加血浆、血清等而使用。(实施例I)使用由图3中的构成的细胞培养容器CC、细胞分离套件A及细胞回收套件B构成的细胞培养用一次性器具，使用在图3所示的位置具备流路开关阀和泵并且具备进行流路开关阀的开关控制和泵的驱动控制以及图2所示的外部按压单元D的驱动控制的控制装置的细胞培养装置。另外，作为细胞分离过滤器SF，使用容纳有细胞分离材料的过滤器，所述细胞分离材料是在具备出入口的外径为26mm、内径为22mm的圆筒状柱中层叠36片由聚酯和丙烯构成的无纺布(密度(单位面积重量(g/m2)/厚度(m))= 1.8X 105 (95/(5. 2 X 10_4) ) (g/m3)、纤维径=15± 10 μ m、孔径=5 50 μ m)并压缩直至无纺布的厚度成为9mm压缩而成的。首先，使清洗液槽WAl内的生理食盐液30ml通过管路L12和LI以30ml/min的流速流过到细胞分离过滤器SF而进行清洗。接着，在被处理液槽Tl中加入购入的人骨髓液20ml，将被处理液槽Tl内的人骨髓液通过管路LI以6ml/min的流速导入到细胞分离过滤器SF，对于由细胞分离过滤器SF导出的被处理液，从管路L2进行取样，利用自动血球计数装置(Sysmex K-4500)实施血球数的测定。接着，使清洗液槽WAl内的生理食盐液30ml通过管路L12和LI以6ml/min的流速流到细胞分离过滤器SF，从而进行红血球、白血球、血小板的清洗除去。接着，将含有胎牛血清10%的细胞培养基(a -MEM培养基(GIBC0公司制))150ml容纳在作为第I细胞回收液导入部Cl的注射器中作为细胞回收液。然后，利用使压力气体为二氧化碳的图2所示的外部按压单元D对上述注射器的柱塞进行按压，由与从第I细胞回收液导入部Cl通过管路L21和L2而使骨髓液流动的方向相反的方向，在流速为300ml/min、压力为O. 3Mpa下注入到细胞分离过滤器SF，由此从细胞分离过滤器SF通过管路LI而将目标细胞组分暂时储存在被处理液槽Tl中。接着，介由管路LI和L3移送到细胞培养容器CC (直径为250_)，从管路L3进行 取样，利用自动血球计数装置(Sysmex K-4500)实施血球数的测定。通过用通过前的血球数去除细胞分离过滤器SF通过后的血球数而求得血球的通过率,结果红血球和血小板的通过率均为95%以上，白血球的通过率为70%。另外，通过用细胞分离过滤器SF通过前的血球数去除回收溶液中的细胞数而求得细胞的回收率，结果如表I所示，红血球为O. 5%，血小板为4%，白血球为25%。如上可知，利用细胞分离过滤器SF，红血球和血小板大体上被除去。[表I]
I红血球回收率(％ )~j白血球回收率(％) I血小板回收率(％)
实施例I O. 5254
比较例I 低于I259将含有被输送到细胞培养容器CC的细胞组分的细胞回收液在5%C02培养箱内于370C的温度环境下进行14天培养。此时，每2 3天进行培养基更换，使细胞增殖到细胞培养容器CC底面积大致铺满(confluent)。接着，示出培养来自人骨髓液的间叶系干细胞后的清洗浓缩方法。作为细胞回收过滤器CF，使用容纳有细胞回收材料的过滤器,所述细胞回收材料是在具备出入口外径为26mm、内径为22mm的圆筒状柱中层叠36片由聚酯构成的无纺布(密度(单位面积重量(g/m2)/厚度(m)) = 1.6X 105 (85/ (5.3X 10-4)) (g/m3)、纤维径=12±2 μ m、孔径=10 26 μ m)并压缩直至无纺布的厚度成为9mm而成的。使在清洗液槽WA2内的生理食盐液30ml通过管路L8以30ml/min的流速流过到细胞回收过滤器CF，从而进行清洗。接着，通过管路L7将细胞培养基排液到废液槽W3，将清洗液槽WA2内的生理食盐液IOOml通过管路L8、L6和L4注入到细胞培养容器CC。接着，将细胞培养容器CC内的生理食盐液通过管路L7排液到废液槽W3，清洗细胞培养容器CC内。
接着，将细胞剥离液槽T5内的胰蛋白酶-EDTA液(TrypLE SeleCt，GIBC0公司制)75ml通过管路L32、L31和L3，加入到除去了生理食盐液的细胞培养容器CC中，在进行细胞培养容器CC的摇动后，在37°C的温度条件下静置10分钟后，再次进行细胞培养容器CC的fe动，从而剥尚细胞。接着，将培养基槽T4内的细胞培养基150ml通过管路L31和L3加入到细胞培养容器CC，制备剥离了培养细胞的细胞悬浊液。将该细胞悬浊液通过管路L4，介由细胞滤过过滤器RF (70 μ m),以10ml/min的流速流过到细胞回收过滤器CF，由细胞回收过滤器CF导出的废液通过管路L5而废弃在废液槽W2中。将导入到细胞回收过滤器CF并由细胞回收过滤器CF导出的细胞悬浊液从管路L5进行取样。
接着，使清洗液槽WA2内的生理食盐液30ml通过管路L8以10ml/min的流速流到细胞回收过滤器CF，从而从被细胞回收过滤器CF捕捉的细胞进行在细胞剥离时使用的胰蛋白酶等细胞剥离剂的除去。接着，将血清IOml容纳在作为第2细胞回收液导入部C2的注射器作为细胞回收液。然后，利用使压力气体为二氧化碳的图2所示的外部按压单元D按压上述注射器的柱塞，由第2细胞回收液导入部C2通过管路L51和L5，从与使细胞悬浊液流动的方向相反的方向，以300ml/min的流速、O. 3MPa的压力注入到细胞回收过滤器CF，从而从细胞回收过滤器CF通过管路L6将清洗后的细胞回收到细胞回收槽T3。在此，通过用细胞回收过滤器CF通过前的细胞数去除细胞回收过滤器CF通过后的细胞数，从而求得细胞回收过滤器CF的培养细胞的通过率。另外，通过用细胞回收过滤器CF通过前的细胞数去除被细胞回收槽T3回收的培养细胞的细胞数，从而求得利用细胞回收过滤器CF的细胞回收率。应予说明，细胞数利用血球计数板进行测定。其结果是，如表2所示，在培养14天后得到的细胞数显示出达2. O X IO7个的非常高的值。将其与将后述比较例I (通常使用的干细胞分离方法)的骨髓液处理量(2ml)换算成在细胞分离过滤器SF中的处理液量(20ml)而得到的值进行比较，得到约2. 5倍的大量细胞。用细胞回收过滤器CF对上述细胞悬浊液处理时的细胞数为血球计数板的检测限以下，细胞的通过率成为0%，几乎全部细胞被细胞回收过滤器CF捕捉。如表2所示，此时的由细胞回收过滤器CF回收的细胞数为I. 8 X IO7个，回收率显示出90%这样的非常高的值。在此,就含有胰蛋白酶溶液的细胞悬浊液而言,可以将细胞悬浊液量从225ml减少到10ml，确认细胞得到浓缩。另外，如表2所示，在细胞悬浊液流过到细胞回收过滤器CF后用生理食盐液进行细胞回收过滤器CF的清洗时，细胞回收过滤器CF出口侧的生理食盐液中的最终胰蛋白酶浓度在通过280nm的紫外吸收光谱测定时为检测限以下，胰蛋白酶被充分地清洗除去。[表2]
权利要求
1.一种细胞培养用一次性器具，其特征在于，包含 细胞培养容器，具有液体流入口和液体排出口， 细胞分离套件，与所述液体流入口连接，用于分离在细胞培养中使用的细胞，以及 细胞回收套件，与所述液体排出口连接，用于清洗浓缩在所述细胞培养容器中培养的细胞。
2.根据权利要求I所述的细胞培养用一次性器具，其中，所述细胞分离套件包含从含有细胞的被处理液选择性地捕捉细胞的细胞分离材料。
3.根据权利要求I或2所述的细胞培养用一次性器具，其中，所述细胞分离套件由细胞分离过滤器、被处理液槽、废液槽、第I细胞回收液导入部、以及第3管路构成， 所述细胞分离过滤器容纳有从含有细胞的被处理液选择性地捕捉细胞的细胞分离材料， 所述被处理液槽通过第I管路与所述细胞分离过滤器的上游侧连接，容纳有含有细胞的被处理液， 所述废液槽通过第2管路与所述细胞分离过滤器的下游侧连接， 所述第I细胞回收液导入部利用从所述第2管路的中途分支的管路进行连接，用于导入细胞回收液， 所述第3管路从所述第I管路的中途分支，与所述细胞培养容器的液体流入口连接。
4.根据权利要求3所述的细胞培养用一次性器具，其中，是将细胞储存袋与从所述第I管路的与所述第3管路相比上游侧的位置分支的管路连接而成的， 所述细胞储存袋用于将由从所述第I细胞回收液导入部导入到所述细胞分离过滤器的所述细胞回收液回收的细胞暂时储存。
5.根据权利要求3所述的细胞培养用一次性器具，其中，所述被处理液槽兼作细胞储存袋， 所述细胞储存袋将由从所述第I细胞回收液导入部导入到所述细胞分离过滤器的所述细胞回收液回收的细胞暂时储存。
6.根据权利要求3 5中任一项所述的细胞培养用一次性器具，其中，所述细胞分离过滤器使含有对细胞医疗或者再生医疗有用的细胞和夹杂细胞的被处理液流过而实质上使夹杂细胞通过，从而实质上捕捉对细胞医疗或者再生医疗有用的细胞，并且使所述细胞回收液向与使所述被处理液流过的方向相反的方向流过，从而回收被捕捉的细胞。
7.根据权利要求3 6中任一项所述的细胞培养用一次性器具，其中，所述第I细胞回收液导入部是容纳有所述细胞回收液的注射器， 所述注射器的柱塞被以气体压力驱动的外部按压单元按压，对所述细胞分离过滤器进行所述细胞回收液的供给。
8.根据权利要求3 7中任一项所述的细胞培养用一次性器具，是通过管路将容纳有清洗液的清洗液槽与所述细胞分离过滤器的上游侧连接而成的。
9.根据权利要求3 8中任一项所述的细胞培养用一次性器具，是由从所述第3管路的中途分支的管路连接容纳有培养基的培养基槽和容纳有包含细胞剥离剂的细胞剥离液的细胞剥离液槽中的至少任一个而成的。
10.根据权利要求I 9中任一项所述的细胞培养用一次性器具，其中，所述细胞回收套件含有捕捉培养的细胞并使夹杂物通过的细胞回收材料。
11.根据权利要求I 10中任一项所述的细胞培养用一次性器具，其中，所述细胞回收套件由细胞回收过滤器、第4管路、废液槽、第2细胞回收液导入部、以及细胞回收槽构成， 所述细胞回收过滤器容纳有捕捉培养的细胞并使夹杂物通过的细胞回收材料， 所述第4管路与所述细胞培养容器的液体排出口和所述细胞回收过滤器的上游侧连接， 所述废液槽通过第5管路与所述细胞回收过滤器的下游侧连接， 所述第2细胞回收液导入部利用从所述第5管路的中途分支的管路进行连接，用于导入细胞回收液， 所述细胞回收槽利用从所述第4管路的中途分支的管路进行连接，用于将由从所述第2细胞回收液导入部导入到所述细胞回收过滤器的所述细胞回收液回收的细胞进行回收。
12.根据权利要求11所述的细胞培养用一次性器具，是使用于除去细胞凝集块的细胞滤过过滤器设在所述第4管路的中途而成的。
13.根据权利要求11或12所述的细胞培养用一次性器具，其中，所述细胞回收过滤器使含有在所述细胞培养容器中培养而得的细胞的细胞悬浊液流过而捕捉被培养的细胞，使所述细胞回收液向与所述细胞悬浊液流过的方向相反的方向流过，从而回收被捕捉的细胞。
14.根据权利要求11 13中任一项所述的细胞培养用一次性器具，其中，所述第2细胞回收液导入部是容纳有所述细胞回收液的注射器， 所述注射器的柱塞被以气体压力驱动的外部按压单元按压，对所述细胞回收过滤器进行所述细胞回收液的供给。
15.根据权利要求11 14中任一项所述的细胞培养用一次性器具，是通过管路将容纳有清洗液的清洗液槽与所述细胞回收过滤器的上游侧连接而成的。
16.一种细胞培养装置，其特征在于，使用权利要求I 15中任一项所述的细胞培养用一次性器具并具备配设于该细胞培养用一次性器具的管路的适当部位的泵和控制装置， 所述泵将压夹所述管路而开关其流路的流路开关阀和所述管路依次进行按压， 所述控制装置进行所述流路开关阀的开关控制和所述泵的驱动控制。
17.一种细胞培养装置，其特征在于，是使用权利要求7或14所述的细胞培养用一次性器具并具备配设于该细胞培养用一次性器具的管路的适当部位的泵、外部按压单元和控制装置而成的， 所述泵将压夹所述管路而开关其流路的流路开关阀和所述管路依次进行按压， 所述外部按压单元以按压所述注射器柱塞的压力气体作为驱动源， 所述控制装置进行所述流路开关阀的开关控制和所述泵的驱动控制以及所述外部按压单元的驱动控制。
18.根据权利要求17所述的细胞培养装置，其中，所述压力气体的供给源是容纳有压力气体的储气瓶。
19.根据权利要求18所述的细胞培养装置，其中，所述压力气体是二氧化碳。
20.一种细胞制备方法，其特征在于，使用权利要求16 19中任一项所述的细胞培养装置，在封闭体系中连贯地进行如下工序播种的有用细胞的分离工序，在所述分离工序中被分离的有用细胞的培养工序，以及在所述培养工序中被培养的细胞的清洗、 浓缩工序。
全文摘要
本发明的目的在于，能够将有用细胞的分离工序、分离到的有用细胞的培养工序及已培养的细胞的清洗·浓缩工序全部连贯地进行，能够实现不依赖大型设备的简单构成的封闭体系系统而提高操作性，并且能够制备安全性和品质高的有用细胞。利用细胞培养用一次性器具，由配设于该细胞培养用一次性器具的管路的适当部位的流路开关阀和泵、与控制这些的控制装置构成细胞培养装置，所述细胞培养装置由以下构成具有液体流入口(Lin)和液体排出口(Lout)的细胞培养容器(CC)，与液体流入口(Lin)连接的、用于使在细胞培养中使用的细胞分离的细胞分离套件(A)，与液体排出口(Lout)连接的、用于将细胞培养容器(CC)中培养得到的细胞清洗浓缩的细胞回收套件(B)。
文档编号C12N5/02GK102971411SQ20118003255
公开日2013年3月13日 申请日期2011年6月30日 优先权日2010年7月1日
发明者小林明, 市村昌纪, 中谷胜 申请人:株式会社钟化