填充床细胞培养装置的大量细胞收获方法
【技术领域】
[0001] 本发明是有关于一种大量细胞收获方法，特别是关于一种用于填充床细胞培养装 置的大量细胞收获方法。
[0002] 本发明请求于2014年1月6日提交的美国专利14/148, 631，名称为"PACKED-BED CELL⑶LTURE AND HARVEST DEVICE"的优先权，并将其及此处所引用文件，或引用文件所引 用文件以参考文件方式纳入。
【背景技术】
[0003] 培养细菌、酵母菌及霉菌的大规模细胞培养制程已经广泛发展且行之有年，而上 述物种因为都具有强韧的细胞壁及/或细胞外基质，因此具有较佳的环境适应力。这些微 生物结构所产生的环境适应能力正是这些微生物可快速进行高效细胞培养制程的重要因 素。举例而言，细菌细胞可生长于利用激烈搅拌、培养翻动及打气技术的超大容积培养液 中，以在生长期间能达到良好的通气效果同时可维持培养细胞的生命力。相反地，由于真核 细胞、动物细胞、哺乳类动物细胞及/或组织相较于微生物细胞更加地细致及脆弱，因此培 养这些细胞所需的技术往往更加困难。在一般生物反应器中微生物培养所需的激烈曝气及 搅拌所造成的巨大剪力（shear force)很容易让这些细胞受损。
[0004] 请参照图1，其为一示意图显示公知技术的填充床（Packed-bed)培养装置。填 充床生物反应器1. 1包含可提供细胞生长及保护细胞避免剪力的多孔性基材1. 3 (porous matrix)。由于多孔性基材具有大量的表面积，因此相较于其它系统可达到较高的细胞密 度。通常每一毫升的基材可轻易地达到5~10X10 7的细胞密度。然而，由于填充床作为 一个深度过滤器，并且在液体进入填充床后无法混合，因此接种物被沿着过填充床的流动 路径所困住，并在填充床内产生非均相及具有梯度的细胞分布1. 4。
[0005] 在培养过程之中，营养和氧气也会沿着填充床流道消耗并耗尽，使得氧气和营养 在流道的开始时十分丰富但在流道的末端变得过低或是耗尽。上述所有原因造成细胞于填 充床生物反应器内无法均质生长，并妨碍传统填充床生物反应器的放大能力。
[0006] 收获细胞是在填充床生物反应器的另一个重要问题。细胞通常难以从填充床生物 反应器的多孔基材分离，因为非常难以对基材床内进行搅拌，而上述步骤对于胰蛋白酶处 理后使细胞从基材分离细胞是必不可少的。因此，细胞的来源，例如填充床细胞培养系统 所需的细胞接种物通常必须由其它细胞培养装置所提供，例如组织培养瓶，滚瓶，细胞工厂 (Cell Factory, Nalgene Nunc International),微载体搅拌罐系统等。由于需要同时从多 个细胞培养装置收集细胞以用于收集足够在填充床生物反应器内播种的细胞接种物，如此 使得细胞收获程序过于冗长并产生容易被污染的风险。
[0007]为了使填充床系统的放大变得更加有效率，一个可以直接从一个填充床系统收获 细胞并将它们传送到另一个更大规模的填充床系统的细胞收获系统，可以使填充床系统成 为一个"容器到容器"的封闭传输系统。那么就能够降低准备接种物的风险和劳动成本。因 此，填充床生物反应器的放大就可以不再依赖于其它细胞培养装置。
[0008] 另一个问题是当细胞是在不同培养系统以不同培养原则培养时可能引起细胞特 性的变化。一个使用相似的培养原则装置的放大程序可以减轻对细胞行为改变的质疑，而 细胞行为改变可能会影响细胞培养程序的产出结果。
[0009] 因此，发展可由填充床细胞培养装置进行细胞收获的装置和方法是当前重要的发 展目标。
【发明内容】
[0010] 本发明的目标为提供一种自填充床细胞培养装置大量收获细胞的方法，藉以轻易 地达成任何实务的生产量级。
[0011] 在本发明一实施例中，一种大量细胞收获方法，包含：提供填充床细胞培养装置， 其具有培养槽，培养槽具有于培养槽内所界定的细胞生长空间，其中细胞生长空间系以多 个多孔基材宽松填充，多个细胞生长于多孔基材上，以及一个空隙体积为细胞生长空间中 未被多孔基材占据的空间；执行细胞分离步骤，其至少包含摇动或旋转培养槽，其中空隙体 积足够大使得多孔基材彼此碰撞或是撞向培养槽以产生动量从而使得细胞从多孔基材分 离；以及收获细胞。
[0012] 在本发明的另一实施例，一种大量细胞收获方法，包含：提供填充床细胞培养装 置，其具有培养槽，培养槽具有于培养槽内所界定的细胞生长空间，其中细胞生长空间系以 多个基材乘载装置宽松填充，其中基材乘载装置具有多孔并且包含多孔基材于其中，多个 细胞生长于多孔基材上，以及一个空隙体积为细胞生长空间中未被多孔基材占据的空间； 执行细胞分离步骤，其至少包含摇动或旋转培养槽，其中空隙体积足够大使得基材乘载装 置彼此碰撞或是撞向培养槽以产生动量从而使得细胞从多孔基材分离；以及收获细胞。
[0013] 以下藉由具体实施例配合附图详加说明，使本发明的目的、技术内容、特点及其所 达成的功效更容易被了解。
【附图说明】
[0014] 图1为示意图显示一个现有技术的填充床培养装置。
[0015] 图2a和2b为示意图显示本发明一较佳实施例的填充床培养槽，其中图2b是图2a 的放大视图。
[0016] 图2c为示意图显示固定床细胞培养装置，其显示本发明的分配梯度剖面。
[0017]图3为示意图显示本发明的固定床细胞培养装置，其中培养槽以多个球状的基材 乘载装置宽松填充。
[0018]图4为示意图显示本发明的固定床细胞培养装置，其中培养槽以多个圆柱状的基 材乘载装置宽松填充。
[0019]图5为示意图显示本发明的固定床细胞培养装置，其中培养槽以多个长柱状的基 材乘载装置宽松填充。
[0020] 图6为示意图显示本发明的细胞收获装置。
[0021] 图7为示意图显示依据本发明一较佳实施例的细胞培养装置，其具有内部再循 环。
[0022] 图8为示意图显示依据本发明一较佳实施例的细胞培养装置，其具有外部再循 环。
[0023] 图9为示意图显示本发明一较佳实施例的细胞培养装置，其采用间歇淹没和露出 的方式。
[0024] 图10为示意图显示根据本发明一较佳实施例的细胞回收率。
【具体实施方式】
[0025] 本发明的实施例可用以从大规模填充床细胞培养装置收获细胞。本发明是有关培 养细胞例如真核细胞，动物细胞，哺乳动物细胞及/或组织等较困难和复杂的生物科学技 术，因为这些细胞较微生物细胞更加的细致和脆弱。
[0026] 大多数填充床细胞培养装置是无法进行细胞收获，因为基材床是固定的，并抑制 在一定的空间内，而容器的材质是玻璃或金属，如不锈钢，因此无法进行细胞收获。一些市 售的填充床细胞培养装置能够执行细胞回收，如CESCO Bioengineering Co.，Ltd.所售的 BelloCell (www. cescobio. com. tw)，其中容器是由具弹性的塑料制成。其容器内装有100ml 基材。经过胰蛋白酶处理，并通过拍击塑料，塑料容器的弹力所产生的动能可以被转移到 基材本身，并迫使细胞被弹出基材造成移位以进行细胞收获。然而，当相同的构造被放大到 1升以上时，回收率会大幅度下降，因为大部分拍击器壁所产生的动能无法穿透并转移到载 体床内深层的基材上。
[0027] 为了解决这个问题，将基材松散填充而使容器内产生更多的空隙体积，并藉由在 带液体或不带液体的情况下摇动基材本身或是在带液体的情况下旋转容器，可以将力量传 输到每个基材本身，而不是透过拍击容器的器壁转移。
[0028] 另一个问题是，当基材床不断放大，基材本身形成类似过滤器的功能并再次捕获 细胞，因此必须要增加清洗步骤以收获大部分的细胞。然而，如果收获时的时间太长，那么 细胞会倾向于重新附着于基材。通过内部封装有基材的基材乘载装置，可以将基材分配到 不同的组别之中，使得细胞有空间可流出而降低被重新捕获的机会。这将使得细胞收获效 率增加。因此，本发明旨在解决或改善从基材体积为500毫升至高达100升的细胞回收效 率，也就是在5X 109细胞到2X 1012细胞之间。当基材体积小于5L以下，仅增加基材床中 的空隙体积即可提高细胞回收率。当基材体积大于5L，通过采用基材乘载装置可以更有效 率地增强细胞回收率并避免细胞被基材本身重新捕获。
[0029] 参照图2a和2b为示意图显示根据本发明一较佳实施例的填充床培养槽，其中图 2b是图2a的放大视图。填充床培养槽有开口 2. 6作为空气入口和出口，槽顶开口 2. 7用以 引入细胞，培养液和缓冲溶液。作为空气入口和出口的开口 2. 6包含一空气过滤器。多孔 基材2. 3/多孔基材乘载装置2. 2被设置于填充床培养槽2. 1的内部。
[0030] 比较图1和图2c，相较于传统的填充床系统，本发明的分配梯度剖面2. 5可以大为 改善，而传统的填充床系统中较大的填充床造成沿着液体的流动方向的严重梯度下降，从 而限制了放大能力。
[0031] 基材乘载装置2. 2采用韧性材料，并具有孔洞使得营养和细胞可以渗透并进行交 换。基材乘载装置2. 2可以以不同的几何和形状设置。较佳者为，基材乘载装置为球状、圆 柱状、棒状或椭圆形。更具体地，基材乘载装置2. 2是采用韧性材料，例如聚丙烯、聚乙烯、 聚乙烯对苯二甲酸酯（polyethylene tetraphalate, PET)，或其它生物性相容材料。基材乘 载装置可以是多孔基材本身，或是封装多孔基材的多孔韧韧性胶囊或卡匣。基材乘载装置 2. 2的大小可为0. 5厘米直径至10厘米直径。较佳者为，基材乘载装置2. 2的直径大小可 以是从0.5厘米到5厘米。
[0032] 在一实施例中，基材乘载装置2. 2由两部分组成，并可组装形成基材乘载装置 2. 2。可以组装之前，将多孔基材2. 3封入到基材乘载装置，使得基材乘载装置2. 2装设有 多孔基材2. 3。
[0033] 基材乘载装置2. 2内部有包含有多孔基材2. 3。多孔基材2. 2较佳者为不织布纤 维基材，并经表面处理使其具有亲水性。更具体地，多孔基材是大孔材质，其孔径为50微米 至200微米，并且孔率大于70%。更具体地，多孔基材具有大量表面积用以截留细胞、粘附、 生长及透氧。
[0034] 细胞生长空间是以多孔基材2. 3/基材乘载装置2. 2宽松填充，使得多孔基材2. 3/ 基材乘载装置2. 2彼此碰撞或碰撞到培养槽或以液体冲洗以产生动量从而使得细胞从多 孔基材2. 3及/或基材乘载装置2. 2分离。
[0035] 此处所提到的"宽松填充"被定义为在细胞生长空间中具有较高比率的空隙体积 2. 8 (如图2a所示）。特定而言，在细胞生长空间以多孔基材填充的情况下，空隙体积2. 8为 细胞生长空间的25% v/v以上，较佳者为33% v/v以上。特定而言