，在细胞生长空间以基 材乘载装置填充的情况下，空隙体积2. 8为细胞生长空间的10% v/v以上，较佳者为33% v/v以上。
[0036]图3为示意图显示本发明的固定床细胞培养装置，其中培养槽以多个基材乘载装 置宽松填充，基材乘载装置内部埋设多孔基材。基材乘载装置为球状，以韧性材料制成，并 设置了孔洞以使营养和细胞自由渗透和交换。
[0037]图4为示意图显示本发明的固定床细胞培养装置，其中培养槽以多个基材乘载装 置宽松填充，基材乘载装置内部埋设多孔基材。基材乘载装置为圆柱状，以韧性材料制成， 并设置了孔洞以使营养和细胞自由渗透和交换。
[0038]图5为示意图显示本发明的固定床细胞培养装置，其中培养槽以多个基材乘载装 置宽松填充，基材乘载装置内部埋设多孔基材。基材乘载装置为长柱状，以韧性材料制成， 并设置了孔洞以使营养和细胞自由渗透和交换。
[0039] 参照图7,其为示意图显示依据本发明一较佳实施例的细胞培养装置。填充床系 统可以是一个内循环细胞培养系统，其中培养槽7. 1包含一通风口 7. 2。基材乘载装置7. 3 填充于篮子7. 4内部，藉由限制基材乘载装置7. 3的移动。培养槽7. 1底部设有一螺旋桨 7. 5,用于液体再循环。培养液7. 6淹没整个填充床并于培养槽7. 1内再循环，如箭头所示。
[0040] 参照图8,图8为示意图显示依据本发明一较佳实施例的细胞培养装置，其具有外 部再循环，其中培养槽8. 1包含基材乘载装置8. 4。混合容器8. 2具有通风口 8. 3和以作为 入口和出口的通口 8. 7。培养液8. 5通过蠕动泵8. 8或其它方式在培养槽8. 1和混合容器 8. 2之间被重新循环。混合容器8. 2具有螺旋桨8. 6以均质化培养期间的培养液8. 5。培 养液8. 5重新循环于培养槽8. 1和混合容器8. 2之间，如箭头所示。
[0041] 参照图9,其为示意图显本发明一较佳实施例的细胞培养装置。填充床系统可以是 一个双向并且间歇淹没及露出细胞培养系统，其中培养槽9. 1包含通风口 9. 3,并以基材乘 载装置9. 4填充。混合容器9. 2有通风口 9. 3及连接培养槽9. 1和混合容器9. 2之间的开 口 9. 7。培养液9. 5通过压力和真空或其它装置在培养槽9. 1与混合容器9. 2之间转移。 当培养液9. 5从混合容器9. 2流到培养槽9. 1时，培养液9. 5可能淹没基材乘载装置9. 4， 或者当培养液9. 5从培养槽9. 1流向混合容器9. 2时，基材乘载装置9. 4可能会露出。混 合容器9. 2具有螺旋桨9. 6,用以均质化培养期间的培养液9. 5。培养液9. 5的流动路径， 如箭头所示，是通过培养槽9. 1和混合容器9. 2之间。
[0042] 参照图6,其为示意图显示本发明的细胞收获装置。培养槽6. 1设置有宽松填充内 部的基材乘载装置6. 3和选择性的通风口 6. 2。在细胞培养完成后，培养槽6. 1连接到试剂 套组，其包含进行整个细胞消化（cell digestion)和收集程序的必要试剂和容器。试剂套 组可含但不限于磷酸缓冲生理盐水（phosphate buffer saline)6. 6,胰蛋白酶/EDTA6. 7， 胰蛋白酶抑制剂6. 8,培养液6. 9,废液容器6. 5,及细胞收获容器6. 10。每个容器都有一个 入口 /出口 6. 12和选择性的通风口 6. 2。每个容器放置在秤或天平或其它手段来测量和控 制重量。液体流动可由懦动泵或其它驱动工具6. 4来控制。
[0043] 本技术领域人员可以理解细胞收获，例如在带液体摇动与或带液体旋转的程序。 带液体旋转的方式可为间歇地顺时针和逆时针旋转，旋转速度从l〇rpm至500rpm。较佳旋 转速度范围为l〇〇rpm到300rpm。
[0044] 在一实施例中，细胞收获程序可以下列方式执行：
[0045] 步骤1、在细胞培养结束之后，连接试剂套组之前，藉由打入收获罐将培养槽6. 1 内的培养液丢弃。
[0046] 步骤2、通过管6. 12连接培养槽6. 1与试剂套组。
[0047] 步骤3、从容器6. 6通过蠕动泵6. 4或其它方式引进磷酸缓冲生理盐水6. 6进入培 养槽6.1。缓冲液的传输量可以由天平6. 11或其它方式控制。然后可旋转培养槽6.1或 轻摇以通过一些手段来冲洗基材乘载装置内的基材6. 3。然后从培养槽6. 1通过蠕动泵或 其它驱动工具6. 4转移磷酸缓冲生理盐水6. 6到废液容器6. 5。这个步骤可重复两次或三 次。
[0048] 步骤4、接着由蠕动泵或其它驱动工具6. 4从容器6. 7转移胰蛋白酶/EDTA6. 7 溶液到培养槽6.1。移转试剂量是由天平6. 11或其它方式所控制。然后可旋转或轻摇 培养槽6. 1以通过一些手段来冲洗基材乘载装置内的基材6. 3。可实施5至20分钟孵育 (incubation)以使胰蛋白酶有效的消化细胞。然后可以从培养槽6. 1通过蠕动泵或其它驱 动工具6. 4转移胰蛋白酶溶液6. 7到废液容器6. 5。可在从培养槽6. 1移除胰蛋白酶溶液 6. 7之后，进一步进行孵育。
[0049] 步骤5、选择性地从容器6. 8通过蠕动泵或其它驱动工具6. 4引入胰蛋白酶抑制剂 6. 8到培养槽6. 1。试剂的转移量可以通过例如天平6. 11或其它方式进行控制。然后可旋 转或轻摇培养槽6. 1以通过一些手段来冲洗基材乘载装置6. 3。然后可以从培养槽6. 1通 过蠕动泵或其它驱动工具6. 4转移胰蛋白酶抑制剂6. 8溶液到废液容器6. 5。
[0050] 步骤6、可在消化之后施加剧烈摇动及/或带或不带液体地旋转，以迫使基材乘载 装置6. 3彼此碰撞或被混合的液体冲洗。这样可以帮助细胞到从多孔基材移位。
[0051] 步骤7、如果是未带液体摇动的情形，容器6. 9中的培养液6. 9可接着从容器6. 9 通过蠕动泵或其它驱动工具6. 4被引入到培养槽6. 1。移转培养液的量可以通过天平6. 11 或其它手段来控制。接着可剧烈摇动培养槽6. 1以通过一些手段来冲洗基材乘载装置6. 1 使得细胞从多孔基材洗掉。含有细胞的培养液6. 9接着可以从培养槽6. 1经由蠕动泵或其 它驱动工具6. 4转移到细胞收获容器6. 10。
[0052] 重复步骤6和步骤7,以收集从基材乘载装置6.3的大部分细胞。
[0053] 本发明进一步通过下面的工作实施例说明，其不应被解释为进一步限制了。
[0054]例1
[0055] 提供2L具有多孔基材的填充床培养槽，亦即200克BioNOC 11载体（CESC0 Bioengineering Co.，Ltd.)并且空隙空间小于10%。细胞收获程序是由抽入磷酸缓冲生 理盐水（PBS)并冲洗3分钟，之后将的PBS抽出到废液容器而完成。重复步骤三次，随后抽 入0. 25 %胰蛋白酶/EDTA以淹没载体达10分钟。将胰蛋白酶/EDTA溶液抽出到废液容器 以丢弃，和接着再孵育细胞10分钟。进行160rpml分钟的上下摇动，以便从多孔基材撞出 细胞。抽入1. 5升培养液，并顺时针和逆时针方向间歇以lOOrprn的速度旋转培养槽以冲洗 并洗出细胞。然后抽出培养液并收集于收获容器。重复进行5次的摇动，旋转和收取培养 液步骤。对收获的细胞进行计数，并与初始细胞密度进行比较，其中初始细胞密度是是由10 个载体的平均细胞数进行估算。
[0056] 表1.具有多孔基材且空隙空间小于10%的培养槽的实验结果
【主权项】
1. 一种自填充床细胞培养装置大量收获细胞的方法，包含： 提供填充床细胞培养装置，其具有培养槽，培养槽具有于培养槽内所界定的细胞生长 空间，其中 细胞生长空间以多个多孔基材宽松填充， 多个细胞生长于多孔基材上，以及 一个空隙体积，该空隙体积为细胞生长空间中未被多孔基材占据的空间； 执行细胞分离步骤，其至少包含摇动或旋转培养槽，其中空隙体积足够大使得多孔基 材彼此碰撞或是撞向培养槽以产生动量从而使得细胞从多孔基材分离；以及 收获细胞。
2. 如权利要求1所述的大量细胞收获方法，其特征在于，空隙体积大于细胞生长空间 的 25%v/v。
3. 如权利要求1所述的大量细胞收获方法，其特征在于，空隙体积大于细胞生长空间 的 33%v/v。
4. 如权利要求1所述的大量细胞收获方法，其特征在于，细胞为动物细胞。
5. 如权利要求1所述的大量细胞收获方法，其特征在于，细胞分离步骤更包含带液体 摇动或带液体旋转。
6. 如权利要求1所述的大量细胞收获方法，其特征在于，细胞生长空间大于500ml。
7. -种自填充床细胞培养装置大量收获细胞的方法，包含： 提供填充床细胞培养装置，其具有培养槽，培养槽具有于培养槽内所界定的细胞生长 空间，其中 细胞生长空间以多个基材乘载装置宽松填充，其中基材乘载装置具有多孔并且包含多 孔基材于其中， 多个细胞生长于多孔基材上，以及 空隙体积为细胞生长空间中未被基材乘载装置占据的空间； 执行细胞分离步骤，其至少包含摇动或旋转培养槽，其中空隙体积足够大使得基材乘 载装置彼此碰撞或是撞向培养槽以产生动量从而使得细胞从多孔基材分离；以及 收获细胞。
8. 如权利要求7所述的大量细胞收获方法，其特征在于，空隙体积大于细胞生长空间 的 10%v/v。
9. 如权利要求7所述的大量细胞收获方法，其特征在于，空隙体积大于细胞生长空间 的 33%v/v。
10. 如权利要求7所述的大量细胞收获方法，其特征在于，细胞为动物细胞。
11. 如权利要求7所述的大量细胞收获方法，其特征在于，细胞分离步骤更包含带液体 摇动或带液体旋转。
12. 如权利要求7所述的大量细胞收获方法，其特征在于，基材乘载装置的形状为球 状、圆柱状、棒状或椭圆球状。
13. 如权利要求7所述的大量细胞收获方法，其特征在于，细胞生长空间大于500ml。
【专利摘要】一种填充床细胞培养装置的大量细胞收获方法，其藉由提供以多个多孔基材及/或基材乘载装置宽松填充的细胞生长空间，当执行至少包含摇动或旋转培养槽的细胞分离步骤时，空隙体积足够大使得基材乘载装置彼此碰撞或是撞向培养槽以产生动量从而使得细胞从多孔基材分离以收获细胞。本发明的填充床细胞培养装置的大量收获细胞方法可轻易地达成任何实务生产量级。
【IPC分类】C12N5-07
【公开号】CN104762251
【申请号】CN201410164574
【发明人】李崇仁, 陈宏飞, 陈永琇, 刘骏逸, 傅正男, 王昱麒, 陈俊谷, 张景明, 何玉书
【申请人】赛宇细胞科技股份有限公司
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2014年4月21日
【公告号】US20140193901