细胞观察装置以及细胞观察方法与流程

本发明涉及一种细胞观察装置以及细胞观察方法。

背景技术：

在对培养于培养容器内的细胞进行观察时，需要找出适于细胞观察的焦点位置。以往，已知为了检测对培养容器内的细胞的对焦位置，进行所谓包围曝光摄像(z-stackimaging)，即在偏移焦点位置的同时取得多张图像。关于包围曝光摄像，例如，在专利文献1中有所记载(第0019段)。

专利文献1：日本特开2015-82096号公报。

对于多个包围曝光图像(z-stackimages)，例如，通过求出其像素值的方差值，能够推测出对焦位置。然而，所述方差值在对焦位置附近发生急剧变化。因此，为了以良好的精度推测对焦位置，需要缩短摄像间隔。即，包围曝光摄像的拍摄张数越多，越能够准确地推测出对焦位置。然而，在摄像时，由于对细胞照射照明光，所以，包围曝光摄像的摄像次数越多，照明光对细胞造成的损伤就变得越大。因此，为了将照明光对细胞造成的损伤控制在最小、同时适当地对细胞进行观察，需要通过较少的张数的包围曝光摄像图像，以良好的精度准确地推测对焦位置。

技术实现要素：

本发明是鉴于上述情况而完成的，其目的在于，提供一种在抑制包围曝光摄像的摄像次数的同时，以良好的精度推测对焦位置的技术。

为解决上述课题，本申请的第一发明是一种对经二维培养的细胞进行观察的细胞观察装置，包括：摄像装置，其通过改变焦点位置来能够对容纳有所述细胞的容器进行摄像，照明装置，其对所述容器进行照射，控制部，其对所述摄像装置进行控制；所述控制部包括：包围曝光摄像控制部，其使所述摄像装置在改变所述焦点位置的同时、拍摄多个包围曝光图像，方差值计算部，其对每一张所述包围曝光图像计算像素值的方差值，边缘指标值计算部，其对每一张所述包围曝光图像计算表示边缘(edge)强度的边缘指标值，聚焦评价值计算部，其基于所述方差值和所述边缘指标值，对每一张所述包围曝光图像计算在所述对焦位置具有极小值的聚焦(focus)评价值，对焦位置推测部，其基于对每一张所述包围曝光图像的所述聚焦评价值，计算所述聚焦评价值具有极小值的所述焦点位置，从而对所述对焦位置进行推测。

本申请的第二发明是如第一发明所述的细胞观察装置，其中，所述边缘指标值计算部对每一张所述包围曝光图像进行高通滤波(high-passfilter)处理，生成高频分量图像，并基于所述高频分量图像计算边缘成分越多具有越大的值的所述边缘指标值。

本申请的第三发明是如第二发明所述的细胞观察装置，其中，所述边缘指标值计算部将所述高频分量图像的方差值作为所述边缘指标值。

本申请的第四发明是如第一发明至第三发明中任一项所述的细胞观察装置，其中，所述聚焦评价值计算部按照聚焦评价值＝方差值/(边缘指标值)^2来计算所述聚焦评价值。

本申请的第五发明是如第一发明所述的细胞观察方法，其中，所述控制部还具有观察用图像摄像控制部，所述观察用图像摄像控制部将从所述对焦位置推测部推测的所述对焦位置偏移规定的距离的位置作为焦点位置，使所述摄像装置拍摄所述细胞的观察用图像。

本申请第六发明是一种对经二维培养的细胞进行观察的细胞观察方法，其包括：a)包围曝光摄像工序，其在改变焦点位置的同时拍摄多个包围曝光图像；b)方差值计算工序，其对每一张所述包围曝光图像计算像素值的方差值；c)边缘指标值计算工序，其对每一张所述包围曝光图像计算表示边缘强度的边缘指标值；d)聚焦评价值计算工序，其基于所述方差值和所述边缘指标值，对每一张所述包围曝光图像计算在所述对焦位置具有极小值的聚焦评价值；e)对焦位置推测工序，其基于所述包围曝光图像中的所述焦点位置与所述聚焦评价值的关系，计算所述聚焦评价值具有极小值的所述焦点位置，从而对所述对焦位置进行推测。

本申请的第七发明是如第六发明所述的细胞观察方法，其中，所述工序c)包括：c1)高频分量图像生成工序，其对每一张所述包围曝光图像进行高通滤波处理、生成高频分量图像；以及，c2)边缘指标值计算工序，其基于所述高频分量图像，计算边缘成分越多具有越大的值的所述边缘指标值。

本申请的第八发明是如第七发明所述的细胞观察方法，其中，所述边缘指标值是所述高频分量图像的像素值的方差值。

本申请的第九发明是如第六发明至第八发明中任一项所述的细胞观察方法，其中，在所述工序d)中，多张所述包围曝光图像中的每一张包围曝光图像的所述聚焦评价值按照聚焦评价值＝方差值/(边缘指标值)^2来进行计算。

本申请的第十发明是如第七发明或第八发明所述的细胞观察方法，其中，所述工序c1)包括：c11)低频分量图像取得工序，其对多张所述包围曝光图像中的每一张包围曝光图像实施高斯滤波处理，从而取得低频分量图像；c12)高频分量图像生成工序，其对多张所述包围曝光图像中的每一张包围曝光图像，通过比较原图像和所述低频分量图像的各像素值，从而生成所述高频分量图像。

本申请的第十一发明是如第七发明或第八发明所述的细胞观察方法，其中，所述工序c1)包括：c13)傅里叶变换工序，其对多张所述包围曝光图像中的每一张包围曝光图像进行傅里叶变换；c14)低频分量除去工序，其除去进行傅里叶变换(fouriertransform)后的多张所述包围曝光图像的低频分量；c15)逆傅里叶变换工序，对已除去低频分量的傅里叶变换后的多张所述多张图像中的每一张包围曝光图像进行逆傅里叶变换(inversefouriertransform)。

本申请的第十二发明是如第六发明所述的细胞观察方法，其中，在所述工序e)中，对多个所述聚焦评价值中所述极小值附近的三个所述聚焦评价值进行抛物线拟合(parabolafitting)，由此，计算所述聚焦评价值具有极小值的所述焦点位置。

本申请的第十三发明是如第六发明所述的细胞观察方法，其中，f)设定从所述工序e)推测的所述对焦位置偏移规定的距离的位置为焦点位置，对所述细胞进行摄像。

根据本申请的第一发明至第十三发明，能够在抑制包围曝光图像的摄像张数的同时，以良好的精度推测对焦位置。

附图说明

图1是细胞观察装置的概要图。

图2是表示细胞观察装置的控制系统的框图。

图3是表示在细胞观察装置中进行的细胞观察处理的流程的流程图。

图4是表示进行包围曝光摄像的摄像范围的图。

图5是以1μm的间隔表示焦点位置与方差值d2的关系的示例的图。

图6是示意性地表示焦点距离与细胞的外观的关系的图。

图7是以3μm的间隔表示焦点位置与方差值d2的关系的示例的图。

图8是以4μm的间隔表示焦点位置与方差值d2的关系的示例的图。

图9是表示焦点位置与包围曝光图像的高频分量图像的像素值的方差值的关系的示例的图。

图10是以1μm的间隔表示焦点位置与聚焦评价值的关系的示例的图。

图11是以3μm的间隔表示焦点位置与聚焦评价值的关系的示例的图。

图12是以4μm的间隔表示焦点位置与聚焦评价值的关系的示例的图。

图13是表示观察用图像的摄像范围的图。

图14是表示在变形例的细胞观察装置中进行包围曝光摄像的摄像范围的图。

图15是表示在变形例的细胞观察装置中的焦点位置与聚焦评价值的关系的示例的图。

图16是表示在变形例的细胞观察装置中的焦点位置与高频分量图像的像素值的平均值的关系的示例的图。

图17是表示在变形例的细胞观察装置中的焦点位置与聚焦评价值的关系的示例的图。

图18是表示在变形例的细胞观察装置中的焦点位置与聚焦评价值的关系的示例的图。

图19是变形例的细胞培养容器的立体图。

其中，附图标记说明如下：

1细胞观察装置；

9、9a培养容器；

10控制部；

30摄像装置；

40照明装置；

50移动机构；

71包围曝光摄像控制部；

72方差值计算部；

73边缘指标值计算部；

74聚焦评价值计算部；

75对焦位置推测部；

76观察用焦点位置确定部；

77观察用图像摄像控制部；

92、92a细胞；

d1包围曝光图像；

d2方差值；

d3边缘指标值；

d4聚焦评价值；

d5推测对焦位置；

d6观察用焦点位置。

具体实施方式

下面，参见附图对本发明的实施方式进行说明。

＜1.细胞观察装置的构成＞

图1是本发明的一个实施方式的细胞观察装置1的概要图。本实施方式的细胞观察装置1取得是对保持于培养容器9内的细胞的图像的装置，该培养容器9载置于容器支承部21。如图1所示，本实施方式的培养容器9是由玻璃、树脂等形成的陪替氏培养皿(petridish)。培养容器9将培养液91容纳于其内部，并且将作为观察对象的细胞92保持于培养液91中。

通过在培养容器9的内部对细胞92进行培养，沿着培养容器9的底部对细胞92进行二维培养。

如图1所示，细胞观察装置1具有装置主体20、摄像装置30、照明装置40、移动机构50、操作部60以及控制部10。

装置主体20是支承摄像装置30和照明装置40的壳体。摄像装置30和照明装置40以能够在相对装置主体20的水平方向上移动的方式被支承。另外，装置主体20具有支承培养容器9的容器支承部21。培养容器9在其底部成为下侧的水平姿势下、被设置于容器支承部21。

摄像装置30配置于容器支承部21的下方。摄像装置30在改变焦点位置的状态下能够对容纳细胞92的培养容器9进行摄像。即，摄像装置30通过从下方对培养容器9进行摄像，取得容纳细胞92的培养容器9的图像数据。对摄像装置30而言，例如，可通过具备透镜等光学系统和电荷耦合器件(ccd)、互补金属氧化物半导体(cmos)等摄像元件的相机实现。

照明装置40配置于容器支承部21的上方。照明装置40在摄像装置30动作时，从上侧对作为摄像对象的培养容器9照射白色的照明光。由此，容纳于培养容器9的细胞92被照明光照射。

此外，照明装置40只要对培养容器9内的细胞92照射照明光即可。因此，照明装置40的光源的位置不限于培养容器9的上方。照明装置40的光源也可以是下述构成：其配置于远离培养容器9上方的位置，并通过反射镜等光学系统使照明光照射于培养容器9。

另外，在本实施方式中，摄像装置30配置于培养容器9的下方，照明装置40配置于培养容器9的上方，但是，本发明的细胞观察装置并不限于这样的结构。也可以将摄像装置30配置于培养容器9的上方，并将照明装置40配置于培养容器9的下方。另外，也可以将摄像装置30和照明装置40都配置于培养容器9的上方，也可以将两者都配置于培养容器9的下方。

移动机构50是用于使摄像装置30和照明装置40在相对装置主体20的水平方向上移动的机构。移动机构50移动摄像装置30和照明装置40，而不会改变摄像装置30与照明装置40的相对位置。

在本实施方式的细胞观察装置1中，使用摄像装置30的摄像范围和使用照明装置40的光照射范围都小于培养容器9的大小。因此，为了对培养容器9的整体进行摄像，需要使摄像装置30与照明装置40在水平方向上移动，同时进行多次摄像。

当在培养容器9中的规定的位置取得图像数据时，首先，移动机构50将摄像装置30和照明装置40配置于规定的位置。由此，配置摄像装置30的摄像范围和照明装置40的照射范围以使它们在取得图像数据的对象位置重叠。而且，在从照明装置40朝向培养容器9照射照射光的同时，摄像装置30对培养容器9进行摄像。此时拍摄的图像中包括沿着培养容器9的底部保持的细胞92。

另外，在对培养容器9的整个底部取得图像数据时，首先，移动机构50将摄像装置30和照明装置40配置于规定的初始位置。然后，使用照明装置40照射照明光、使用摄像装置30进行摄像，并使用移动机构50移动摄像装置30和照明装置40，并反复进行上述操作，由此，可在对培养容器9的整个底部进行扫描的同时进行摄像。

操作部60具备显示部61和输入部62。在显示部61中，表示从控制部10输入的培养容器9的图像数据。在显示部61中，例如，使用液晶显示器。操作者能够从输入部62输入对控制部10的指令。在输入部62中，例如，使用键盘、鼠标。

控制部10是用于对细胞观察装置1内的各部分进行动作控制的部位。如图1中示意性地表示，本实施方式的控制部10由计算机构成，该计算机具备中央处理单元(cpu)等运算处理部11、随机存取存储器(ram)等存储器12以及硬盘驱动器等存储部13。

图2是表示细胞观察装置1的控制系统的框图。如图2所示，控制部10分别与摄像装置30、照明装置40、移动机构50、显示部61以及输入部62电连接。

控制部10将存储于存储部13的计算机程序131、数据132暂时读取至存储器12，运算处理部11基于该计算机程序131以及数据132进行运算处理，由此，对细胞观察装置1内的各部分进行动作控制。由此，进行在细胞观察装置1中的细胞观察处理。此外，控制部10可由电路构成。

另外，如图2所示，控制部10作为通过软件而实现的处理部，具备包围曝光摄像控制部71、方差值计算部72、边缘指标值计算部73、聚焦评价值计算部74、对焦位置推测部75、观察用焦点位置确定部76以及观察用图像摄像控制部77。

包围曝光摄像控制部71使摄像装置30在改变焦点位置的同时拍摄多个图像。即，包围曝光摄像控制部71使摄像装置30进行包围曝光摄像。另外，将通过包围曝光摄像取得的多个图像称作包围曝光图像d1。

方差值计算部72对每一张包围曝光图像d1计算像素值的方差值d2。边缘指标值计算部73对每一张包围曝光图像d1计算表示边缘的强度的边缘指标值d3。关于边缘指标值d3的具体内容，在后面进行说明。

聚焦评价值计算部74，使用方差值计算部72计算的方差值d2和使用边缘指标值计算部73计算的边缘指标值d3，对每一张包围曝光图像d1计算聚焦评价值d4。关于聚焦评价值d4的具体内容，在后面进行说明。

对焦位置推测部75，基于对每一张包围曝光图像d1的聚焦评价值d4推测对焦位置，计算推测对焦位置d5。推测对焦位置d5是聚焦评价值d4具有极小值的焦点位置。

观察用焦点位置确定部76，基于推测对焦位置d5确定观察用焦点位置d6，该观察用焦点位置是拍摄观察用图像时的焦点位置。观察用图像摄像控制部77将观察用焦点位置d6作为焦点位置，使摄像装置30拍摄培养容器9中的细胞92的图像。

＜2.关于细胞观察处理＞

接着，参见图3对细胞观察装置1中进行的细胞观察处理进行说明。图3是表示本实施方式的细胞观察处理的流程的流程图。

在细胞观察处理中，首先，将培养容器9配置于容器支承部21(步骤s101)。此时，操作者可以手动将培养容器9载置于容器支承部21。或者，细胞观察装置1可以具备移动机构，该移动机构自动将培养容器9载置于容器支承部21。

接着，包围曝光摄像控制部71使摄像装置30进行包围曝光摄像(步骤s102)。图4是表示进行包围曝光摄像的摄像范围a1的图。在图4中表示出从下方观察到的保持于容器支承部21的培养容器9的状态。此外，在图4中，关于培养容器9内的细胞92，省略图示。在本实施方式中，进行包围曝光摄像的摄像范围a1设置于培养容器9的中央。此外，进行包围曝光摄像的摄像范围a1不限于培养容器9的中央。优选将摄像范围a1设定于细胞92的多个区域。

在包围曝光摄像中，首先，包围曝光摄像控制部71使移动机构50驱动，从而将摄像装置30和照明装置40配置于摄像范围a1的摄像位置。接着，包围曝光摄像控制部71使照明装置40和摄像装置30驱动，一边改变焦点位置一边拍摄多个包围曝光图像d1。

接着，对于摄像范围a1，对推测对焦位置d5进行推测(步骤s102～步骤s107)。首先，方差值计算部72对多张包围曝光图像d1中的每一张包围曝光图像d1的计算像素值的方差值d2。图5是表示在以1μm的间隔改变焦点位置、同时取得包围曝光图像d1时的焦点位置(横轴)与方差值d2(纵轴)的关系的示例的图。图6是示意性地表示焦点距离与细胞的外观的关系的图。

如图5所示，方差值d2具有两个极大值和一个极小值。方差值d2在对焦位置具有极小值，在从对焦位置分别向近距离方向和远距离方向偏移一定距离的焦点位置具有极大值。

如图6中示意性地表示，由于细胞是透明的，所以，在对焦位置，细胞内部与细胞外部的亮度相近。因此，包围曝光图像d1的方差值d2较低、为极小值。另外，随着接近对焦位置，边缘强度变强，但是，在极其靠近对焦位置的位置，边缘强度变弱。而且，在对焦位置，细胞处于几乎不能辨认的状态。

如果将焦点位置从对焦位置向近距离方向偏移，则细胞内部看起来比细胞外部白。由于细胞内部与细胞外部的亮度差异很大，所以，在从对焦位置向近距离方向偏移一定距离的位置，包围曝光图像d1的方差值d2为极大值。如果将焦点位置进一步地向近距离方向偏移，则图像模糊，方差值d2逐渐变小。

另一方面，如果将焦点位置从对焦位置向远距离方向偏移，则细胞内部看起来比细胞外部黑。由于细胞内部与细胞外部的亮度差异很大，所以，在从对焦位置向远距离方向偏移了一定距离的位置，包围曝光图像d1的方差值d2为极大值。如果将焦点位置进一步地向远距离方向偏移，则图像模糊，方差值d2逐渐变小。

因此，以较短的间隔取得多个包围曝光图像d1，并求出各包围曝光图像d1的方差值d2，由此，能够推测出对焦位置。在图5的示例中，方差值d2在焦点位置11μm处为极小值，在其前后的焦点位置中，焦点位置12μm处的方差值d2是比焦点位置10μm处的方差值d2接近该极小值的值，因此，能够推测在焦点位置11μm以上且小于12μm的范围内存在对焦位置。

以此方式，通过对方差值d2中的极小值附近的值进行拟合(fitting)，能够推测出对焦位置。然而，在极小值附近，方差值d2的倾斜度陡峭，因此，为了以良好的精度推测对焦位置，需要以充分短的间隔来取得多个包围曝光图像d1。为了以短的间隔取得包围曝光图像d1，包围曝光图像d1的摄像次数变多。即，对作为摄像对象的细胞92造成的损伤变大，并且包围曝光摄像时间也变长。然而，如果增大取得包围曝光图像d1时的焦点位置的间隔，将难以准确地推测出方差值d2的极小值的焦点位置。

图7是以3μm的焦点位置的间隔表示图5的示例中的包围曝光图像d1的方差值d2的图。图8是以4μm的焦点位置的间隔表示图5的示例中的包围曝光图像d1的方差值d2的图。如图7和图8所示，如果增大包围曝光图像d1取得时的焦点位置的间隔，则难以获知极小值的位置。因此，对焦位置的推测精度下降。由此，在该细胞观察装置1中，使用通过下述步骤s104～步骤s106求出的聚焦评价值d4推测对焦位置，计算推测对焦位置d5。

在使用方差值计算部72计算出各包围曝光图像d1的方差值d2后，或在计算出方差值d2的同时，边缘指标值计算部73计算出与各包围曝光图像d1相对的边缘指标值d3(步骤s104～步骤s105)。作为边缘指标值d3，使用表示各包围曝光图像d1的边缘强度的值。即，作为边缘指标值d3使用的值，各包围曝光图像d1的边缘成分越多具有越大的值。本实施方式的边缘指标值d3是对各包围曝光图像d1进行高通滤波处理而生成的高频分量图像的方差值。

为了计算边缘指标值d3，边缘指标值计算部73首先对各包围曝光图像d1进行高通滤波处理，从而生成高频分量图像。本实施方式的边缘指标值计算部73对各包围曝光图像d1实施高斯滤波处理，从而取得低频分量图像。然后，将处理前的包围曝光图像d1与高斯滤波处理后的低频分量图像的像素值的差分值进行平方，由此，进行高通滤波处理。即，通过比较作为原图像的包围曝光图像d1与低频分量图像的各像素值，生成高频分量图像。此外，高通滤波处理并不限于该方法。例如，边缘指标值计算部73也可以对各包围曝光图像d1实施傅里叶变换(fouriertransform)，除去傅里叶变换后的图像的低频分量，然后，对每一张已除去低频分量的傅里叶变换后的图像进行逆傅里叶变换(inversefouriertransform)，由此，进行高通滤波处理。在此情况下，作为傅里叶变换，例如，可进行快速傅里叶变换(fft)。另外，作为逆傅里叶变换，例如，可进行fft的逆变换(inversefft,ifft)。

接着，边缘指标值计算部73计算边缘指标值d3(步骤s105)，该边缘指标值是各高频分量图像的像素值的方差值。图9是表示关于图5的示例的包围曝光图像d1的焦点位置(横轴)与边缘指标值d3(纵轴)的关系的图。如上所述，随着接近对焦位置，边缘强度变强，并且在极其靠近对焦位置的位置，边缘强度变弱。因此，边缘指标值d3随着接近对焦位置而变大，并且在极其靠近对焦位置的位置变小。

在使用方差值计算部72进行的方差值d2的计算(步骤s103)、使用边缘指标值计算部73进行的边缘指标值d3的计算(步骤s104～s105)结束后，接着，聚焦评价值计算部74计算聚焦评价值d4(步骤s106)。

本实施方式中的聚焦评价值d4是对各包围曝光图像d1用方差值d2除以边缘指标值d3的平方而得到的值。即，聚焦评价值d4用(聚焦评价值d4)＝(方差值d2)/(边缘指标值d3)^2表示。

图10是表示关于图5的示例的包围曝光图像d1的焦点位置与聚焦评价值d4的关系的图。方差值d2在对焦位置为极小值，边缘指标值d3在对焦位置附近为比较大的值，因此，聚焦评价值d4在对焦位置为极小值。因此，通过对聚焦评价值d4为极小值的焦点位置进行推测，能够计算推测对焦位置d5。

图11是以3μm的焦点位置的间隔表示图10所示的聚焦评价值d4的图。图12是以4μm的焦点位置的间隔表示图10所示的聚焦评价值d4的图。

如图5、图7和图8所示，对于在极小值附近的倾斜度大的方差值d2而言，如果增大焦点位置的间隔，则曲线形状的差异很大。然而，如图10所示，聚焦评价值d4与图5所示的方差值d2相比，在极小值附近的倾斜度较小。因此，如图10至图12所示，对于聚焦评价值d4而言，即使增大焦点位置的间隔，与方差值d2相比，曲线形状的变形较小。因此，与将方差值d2为极小值的焦点位置作为对焦位置来推测的情况相比，如果将聚焦评价值d4为极小值的焦点位置作为对焦位置来推测，能够以良好的精度计算推测对焦位置d5。

在对步骤s106中的聚焦评价值d4进行计算后，对焦位置推测部75计算聚焦评价值d4具有极小值的推测对焦位置d5，从而推测对焦位置(步骤s107)。具体而言，对焦位置推测部75在与多个包围曝光图像d1对应的多个聚焦评价值d4中，对作为极小值的聚焦评价值d4、与焦点位置相邻的两个聚焦评价值d4这三个聚焦评价值d4进行抛物线拟合(parabolafitting)。即，对焦位置推测部75对焦点位置与该三个聚焦评价值d4的关系进行二次函数近似。而且，将近似二次函数为极小值的焦点位置作为推测对焦位置d5计算。

此外，在本实施方式中，使用抛物线拟合计算推测对焦位置d5，但是，本发明不受此限定。对焦位置推测部75也可以使用等角线性拟合(equiangularlinefitting)计算推测对焦位置d5，还可以使用其他函数近似法计算推测对焦位置d5。另外，在包围曝光图像d1的焦点间隔充分小的情况下，可以将多个聚焦评价值d4中作为极小值的聚焦评价值d4的焦点位置直接作为推测对焦位置d5。

如果计算出推测对焦位置d5，接着，观察用焦点位置确定部76则设定观察用焦点位置d6(步骤s108)，该观察用焦点位置d6在观察用图像摄像时作为焦点位置。在控制部10中，预先将作为观察对象的细胞92的种类、用户所希望的观察状态等信息从输入部62输入。另外，在控制部10的存储部13中预先存储有数据表，该数据表中按照每种细胞的种类而记载了在近距离侧观察时的相对于对焦位置的适当偏移量和在远距离侧观察时的相对于对焦位置的适当偏移量。

当使用者所希望的观察状态为对焦位置时，观察用焦点位置确定部76设定推测对焦位置d5为观察用焦点位置d6。当使用者所希望的观察状态为近距离侧时，观察用焦点位置确定部76参照数据表中相应的近距离侧的适当偏移量，将从推测对焦位置d5向近距离侧偏移了该适当偏移量后的位置设定为观察用焦点位置d6。另外，当使用者所希望的观察状态为远距离侧时，观察用焦点位置确定部76参照数据表中相应的远距离侧的适当偏移量，将从推测对焦位置d5向远距离侧偏移了该适当偏移量后的位置设定为观察用焦点位置d6。即，在接下来的步骤s109中，当使用者所希望状态为近距离侧或远距离侧时，将从推测对焦位置d5偏移了规定距离的位置作为焦点位置，对细胞92进行摄像。

在确定观察用焦点位置d6后，拍摄作为观察对象的细胞92的观察用图像(步骤s109)。图13是表示进行观察用图像的拍摄的摄像范围b1～bn的图。在图13中表示出从下方观察到的保持于容器支承部21的培养容器9的状态。此外，在图13中，对于培养容器9内的细胞92，省略图示。

如图13所示，在本实施方式中，对培养容器9设置多个摄像范围b1～bn。在拍摄观察用图像时，如图13中的箭头所示，从摄像范围b1开始将n个摄像范围b1～bn以b2，b3，…，bn的顺序移动，同时进行摄像。即，反复进行使用移动机构50进行的摄像装置30和照明装置40的移动以及使用摄像装置30和照明装置40进行的摄像。由此，拍摄多个观察图像。在本实施方式中，一次能够进行摄像的摄像范围比培养容器9的尺寸小。因此，将培养容器9分成多个摄像范围b1～bn来进行摄像。

以此方式，根据多个包围曝光图像d1计算聚焦评价值d4，根据聚焦评价值d4推测对焦位置，由此，能够在抑制包围曝光图像d1的摄像张数的增加的同时，以良好的精度推测对焦位置。

＜3.变形例＞

以上对本发明的一个实施方式进行了说明，但是，本发明并不限于上述实施方式。

图14是表示在一个变形例的细胞观察装置中进行包围曝光摄像的摄像范围c1～c4的图。在图14中表示出从下方观察到的保持于容器支承部21的培养容器9的状态。此外，在图14中，对于培养容器9内的细胞92，省略图示。

在图14的示例中，进行包围曝光摄像的摄像范围c1～c4与离培养容器9中央的距离相同，且沿着周向均等地设置。以此方式，在三处以上的位置进行包围曝光摄像，计算每一个位置的推测对焦位置d5，由此，能以进一步良好的精度推测培养容器9的各位置的对焦位置。即，根据四个摄像范围c1～c4的推测对焦位置d5，能够以进一步良好的精度推测观察用图像的摄像范围b1～bn的各个位置的对焦位置。

由此，进行包围曝光摄像的摄像范围不限于一个位置。另外，当在多个位置进行包围曝光摄像时，优选三个位置以上。此外，对于每一个观察用图像的摄像范围b2～bn，也可以进行包围曝光摄像。

图15是表示关于图5的示例的包围曝光图像d1的焦点位置与通过变形例的计算方法求出的聚焦评价值d4的关系的图。对于图15的示例的聚焦评价值d4而言，作为边缘指标值d3，使用各包围曝光图像d1的高频分量图像的像素值的平均值。另外，在图15的示例中，对于各包围曝光图像d1，与上述实施方式同样地设定用方差值d2除以边缘指标值d3的平方而得到的值为聚焦评价值d4。

图16是表示焦点位置与高频分量图像的像素值的平均值的关系的图。高频分量图像的像素值的平均值与高频分量图像的像素值的方差值一样，是表示边缘强度的值。即，对于高频分量图像的像素值的平均值而言，各包围曝光图像d1的边缘成分越多具有越大的值。如上所述，随着接近对焦位置，边缘强度变强，并且在极其靠近对焦位置的位置，边缘强度变弱。高频分量图像的像素值的平均值随着接近对焦位置而变大，并且在极其靠近对焦位置的位置变小。因此，能够将高频分量图像的像素值的平均值用作边缘指标值d3。

在图15以及图16的示例中，对聚焦评价值d4而言，与图5所示的方差值d2相比，在极小值附近的倾斜度也较小。因此，与将方差值d2为极小值的焦点位置推测为对焦位置时相比，如果将聚焦评价值d4为极小值的焦点位置推测为对焦位置，则能够以良好的精度计算推测对焦位置d5。

如图15和图16的示例那样，也可以使用各包围曝光图像d1的高频分量图像的像素值的平均值作为边缘指标值d3。

图17和图18是表示关于图5的示例的包围曝光图像d1的焦点位置与通过其他变形例的计算方法求出的聚焦评价值d4的关系的图。图17的示例中的聚焦评价值d4和图18的示例中的聚焦评价值d4，都是对于各包围曝光图像d1，设定用方差值d2除以边缘指标值d3的一次方而得到的值为聚焦评价值d4。即，聚焦评价值d4由(聚焦评价值d4)＝(方差值d2)/(边缘指标值d3)表示。

此外，在图17的示例中，将高频分量图像的像素值的方差值作为边缘指标值d3。在图18的示例中，将高频分量图像的像素值的平均值作为边缘指标值d3。无论是图17的示例还是图18的示例，对聚焦评价值d4而言，与图5所示的方差值d2相比，在极小值附近的倾斜度都较小。因此，与将方差值d2为极小值的焦点位置推测为对焦位置时相比，如果将聚焦评价值d4为极小值的焦点位置推测为对焦位置，则能够以良好的精度计算推测对焦位置d5。

如图17的示例和图18的示例那样，作为聚焦评价值d4，可以使用用方差值d2除以边缘指标值d3的一次方而得到的值。然而，如图10和图15所示，作为聚焦评价值d4，使用将方差值d2除以边缘指标值d3的平方而得到的值，在极小值附近的倾斜度变得更小，因而更优选。另外，作为聚焦评价值d4，还可以使用用方差值d2除以边缘指标值d3的三次方或者四次方而得到的值。

图19是表示变形例的培养容器9a的立体图。在图19的示例中，培养容器9a是具有多个凹部93a的孔板(wellplate)。多个凹部93a以二维的方式规则地排列。另外，各凹部93a具有透光性底部。在各凹部93a内，容纳培养液91a和作为观察对象的细胞92a。

如图19所示，在本发明的培养容器中，可以使用容纳培养液、细胞的部位被区分成多个区域的容器。

另外，对于在上述实施方式、变形例中出现的各要素，在不产生矛盾的范围内，可以对它们进行适当的组合。