本发明涉及祛除低密度粒细胞的方法技术领域，特别涉及外周血单个核细胞中祛除低密度粒细胞的方法。
背景技术：
系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus,sle)患者的外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcells,pbmcs)中存在一类不同于普通中性粒细胞的粒细胞，称为低密度粒细胞(low-densitygranulocytes,ldgs)。ldgs的细胞表面标记与成熟的自体或健康对照的中性粒细胞类似，高表达中性粒细胞表面标记cd15、cd10、cd11b、cd11c和cd16，但是它们的细胞核形态与中性粒细胞不同，为不成熟的细胞核表型。ldgs表现出前炎症细胞的特点，激活后会损伤内皮细胞，并大量分泌肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor，tnf)、ⅰ型和ⅱ型干扰素(interferon，ifn)等细胞因子。
被病原微生物或细胞因子激活后，ldgs可以释放由dsdna、组蛋白、蛋白酶类和抗菌肽等形成的中性粒细胞胞外网状陷阱(neutrophilextracellulartraps，nets)去诱捕并杀灭病原微生物。与同源的中性粒细胞和健康对照的中性粒细胞相比，ldgs表现出了更强的nets形成能力，且更易形成nets。nets除了起防御作用外，对免疫系统也有调节作用。体外培养pbmcs做淋巴细胞相关研究时，其内所含的异常增多的ldgs可能会在短短几小时内大量形成nets。而nets对培养的t淋巴细胞有广泛的影响，可以使cd4+t细胞群集，使活化标记cd25和cd69上调，导致tcr相关的信号激酶zap70的磷酸化，并使cd4+t细胞的激活阈值下调。与发生nets的中性粒细胞和树突状细胞的共培养，导致了t细胞的激活，并使ifn-γ和il-17的分泌显著增加。
可见在做pbmcs培养时，ldgs通过形成nets对t细胞的影响不容忽视。除了昂贵且复杂的流式分选或磁珠分选，非常有必要发现一种简单易用的从 pbmcs中祛除ldgs的方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于，针对上述的问题，提供外周血单个核细胞中祛除低密度粒细胞的方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：
外周血单个核细胞中祛除低密度粒细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步，将分离的外周血单个核细胞重悬在未加胎牛血清的rpmi1640培养基中；
第二步，吸取细胞浓度1×105/ml的培养基溶液，放入孔板中，所述的孔板，具体是96孔板或48孔板或24孔板或12孔板或6孔板，选取96孔板时，每孔加入100ul，选取48孔板时，每孔加入300ul，选取24孔板时，每孔加入0.6ml，选取12孔板时，每孔加入1.5ml，选6孔板时，每孔加入3ml；
第三步，将孔板放入浓度为5％的co2细胞培养箱中静置培养1小时；
第四步，吸取上清液加入到离心管中，并加入两倍体积的磷酸缓冲盐溶液，放入离心机中离心10分钟；
第五步，去除上清液后用rpmi1640培养基重悬外周血单个核细胞备用。
本发明的有益效果是，解决了从pbmcs中祛除ldgs的技术难题。由于自身免疫病中pbmcs中ldgs普遍异常升高，而且pbmcs中所含的ldgs会严重影响t细胞的功能，所以在以t细胞为研究对象的研究中，需要祛除pbmcs中的ldgs。目前从pbmcs中祛除ldgs的方法有磁珠分选和流式分选。这两种方法利用磁珠标记或荧光标记的单克隆抗体分别与目标细胞受体进行特异性结合而获得特定细胞株，分为阳性选择和阴性选择。阳性选择获得的t细胞，由于结合了特异性抗体，可能会影响细胞的某些功能。而阴性选择时需要使用多种抗体去结合非目的细胞而保留t细胞，所以分选成本比很高。这两种分选方法费时费力，分选成本很高，完全不适合临床应用。本发明所述方法 解决了这一难题，从pbmcs中祛除ldgs省时省力，不增加额外费用，适合临床及科研应用。
附图说明
图1是本发明的关于ldgs在自身免疫病中普遍异常升高的统计示意图。
图2是本发明的关于离心力对清除pbmcs中ldgs影响的统计图。
图3是本发明的清除pbmcs中ldgs优于先沉淀后离心的统计图。
图4是本发明的ldgs清除率优于其他方法的统计图。
图5是本发明的祛除ldgs后对pbmcs中t细胞比例无明显影响的统计图。
图6是本发明的祛除ldgs后对pbmcs中t细胞比例几乎无影响的统计图。
具体实施方式
外周血单个核细胞中祛除低密度粒细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步，将分离的外周血单个核细胞重悬在未加胎牛血清的rpmi1640培养基中；
第二步，吸取细胞浓度1×105/ml的培养基溶液，放入孔板中，所述的孔板，具体是96孔板或48孔板或24孔板或12孔板或6孔板，选取96孔板时，每孔加入100ul，选取48孔板时，每孔加入300ul，选取24孔板时，每孔加入0.6ml，选取12孔板时，每孔加入1.5ml，选6孔板时，每孔加入3ml；
第三步，将孔板放入浓度为5％的co2细胞培养箱中静置培养1小时；
第四步，吸取上清液加入到离心管中，并加入两倍体积的磷酸缓冲盐溶液，放入离心机中离心10分钟；
第五步，去除上清液后用rpmi1640培养基重悬外周血单个核细胞备用。
本发明在实际临床试验中，以2012年11月到2014年4月期间在中日友好医院住院治疗患者作为临床对象，其中55例皮肌炎 (dermatomyositis,dm)患者和15例多发性肌炎(polymyositis,pm)患者满足b/p诊断标准作为dm组和pm组，42例类风湿关节炎(rheumatoidarthritis,ra)患者满足2010ra分类标准作为ra组，25例sle患者满足1997acr关于sle分类标准作为sle组。19例性别和年龄匹配的健康志愿者作为对照组，各组基本资料见表1。
表1.研究人群的基本信息
1.pbmcs的分离
采用edta抗凝管抽取10ml健康对照和患者的全血，在6小时内采用密度梯度离心法分离pbmcs。具体步骤为：①将4ml的histopaque-1077分离液加入15ml离心管，其上小心加入5ml到8ml全血；
②采用水平离心机400×g离心30分钟；③最上层为血浆，其下依次为 pbmcs和红细胞沉淀层，小心从上吸取血浆，分装后冻存在-80℃备用；④用1ml移液器轻柔吸取pbmcs云雾层，将pbmcs加入新的15ml离心管，加入磷酸盐缓冲液10ml轻柔吹打洗涤细胞；⑤300×g离心10分钟，若pbmcs中混有较多红细胞可用低渗盐水溶红；⑥用0.2％的低渗盐水溶红30秒，再加入1.6％的高渗盐水平衡渗透压(选用步骤)；
⑦用磷酸盐缓冲液再洗1次后，将pbmcs重悬入磷酸盐缓冲液中，血细胞计数板计数后，根据需要的细胞数计算细胞悬液量；⑧每例取1×106细胞用于流式测定ldgs；
2.ldgs的测定
pbmcs中ldgs的测定采用流式细胞术。单核细胞高表达cd14，低表达或不表达cd15；而ldgs高表达cd15，低表达或不表达cd14。采用fitc-标记的抗cd15抗体(biolegend)和pe标记的抗cd14抗体(biolegend)，可以容易的区分出ldgs。用单标的样本调节电压补偿，用对应的同型对照抗体消除非特异性染色。检测采用贝克曼coulter流式细胞仪。具体步骤为：①新鲜分离的pbmcs，用血细胞计数板计数后取含有1×106个细胞的细胞悬液加入流式管，每例样本取两管；②其中一管加入cd14-pe和cd15-fitc,另一管加入相应的同型对照，旋涡器混匀后室温避光孵育20分钟③每管中加入2ml磷酸盐缓冲液洗液，振荡混匀，1500rpm离心5分钟，弃上清，重复一次。④弃上清，加入4％的多聚甲醛0.4ml固定；⑤epics-xl型流式细胞仪检测同型对照，同时调整电压和颜色补偿，在散射图中设定全门，收集30000个细胞，读取免疫表型为cd14lo/cd15+和cd14－/cd15+亚群的百分比。
3.采用不同离心力分离pbmcs对ldgs比例的影响
严格按照sigma公司histopaque-1077分离液说明书分离pbmcs，此 方法定为标准方法。为了分析增大离心力是否能祛除pbmcs中异常增多的ldgs，本研究中进一步比较了400×g离心30分钟(标准方法)、600×g离心30分钟和800×g离心30分钟对pbmcs中ldgs比例的影响。
4.本发明所述方法对pbmcs中ldgs比例的影响
淋巴细胞是悬浮细胞，而中性粒细胞、单核细胞和ldgs更容易贴壁生长。利用这一特性，对分离的pbmcs在培养板中静置培养1小时，利用ldgs主动贴壁的特点将ldgs从pbmcs中除掉。将分离的pbmcs重悬在未加胎牛血清的rpmi1640中，细胞浓度1×105/ml，96孔板每孔100ul，48孔板每孔300ul，24孔板每孔加0.6ml,12孔板每孔加1.5ml,6孔板中每孔加3ml。5％co2细胞培养箱中静置培养1小时后，轻柔吸取上清加入15ml离心管，并加入两倍体积的磷酸盐缓冲液，300×g离心10分钟后，用磷酸盐缓冲液重悬，取2×105个细胞行流式抗体染色，采用流式细胞仪测定ldgs。
5.全血沉淀3小时对pbmcs中ldgs比例的影响
edta抗凝的全血正置在试管架上3小时，轻柔吸取上清血浆加入15ml离心管，300×g离心10分钟后轻柔吸取血浆，避免碰到细胞团，加入磷酸盐缓冲液10ml洗涤细胞一次，，300×g离心10分钟后磷酸盐缓冲液重悬细胞，取2×105个细胞行流式抗体染色，采用流式细胞仪做ldgs测定。此方法命名为全血沉淀后离心法。
6.pbmcs中t细胞比例的测定
采用fitc-标记的抗cd15抗体(biolegend)、pe标记的抗cd3抗体(bd)和pe-cy5标记的抗cd8抗体(bd)三色标记行流式细胞仪检测，也可以容易的测定出pbmcs中的ldgs比例。同时对pbmcs中t细胞比例和cd8+t细胞比例进行测定，以明确不同祛除ldgs的方法对pbmcs中t细 胞比例的影响。具体步骤参见测定ldgs部分。
7.统计分析
采用graphpadprism5软件进行组间比较和制图，数据符合正态分布的采用配对t检验，不符合正态分布的采用mann-whitneyu检验。p<0.05认为差异具有统计学意义。
8.结果
8.1pbmcs中ldgs的比例在5组间的比较
如图1所示，ⅱ图中，4种疾病中ldgs在pbmcs中比例的比较dm：皮肌炎；sle：系统性红斑狼疮；ra：类风湿关节炎；pm：多发性肌炎；#表示dm、sle和pm组ldgs比例显著高于健康对照(p<0.001)；$表示ra组ldgs比例显著高于健康对照(p<0.05)。统计采用mann-whitneyu检验，ⅰ图为在流式散射图，图中ldgs的细胞复杂程度和细胞大小明显大于单核细胞，ldgs的分布接近中性粒细胞。相比较于健康对照pbmcs中的ldgs比例(1.28％±0.73％)，dm患者(8.41％±10.87％，p<0.0001)、pm患者(8.41％±10.39％,p<0.0001)、ra患者(4.05％±6.97％,p＝0.0249)和sle患者(7.53％±11.52％,p＝0.0006)中的ldgs比例均显著升高；相比较于阳性对照sle患者，dm、pm和ra患者pbmcs中ldgs比例升高或降低的程度均未达到显著性水平(p＝0.0677，p＝0.2884，p＝0.0768)。而dm组和pm组显著高于ra组比例(p<0.0001,p＝0.006)。说明在这几种常见的自身免疫病中ldgs在pbmcs中的比例都显著高于健康对照。
8.2离心力对pbmcs中ldgs比例的影响
如图2所示，与标准方法相比，600×g离心30分钟和800×g离心30 分钟都能减少pbmcs中ldgs的比例，但差异未达到统计学水平(p＝0.1572,p＝0.1156)。进一步比较600×g离心30分钟和800×g离心30分钟的结果，800×g离心30分钟的方法不能更明显地减少pbmcs中ldgs的比例(p＝0.6477)。说明一定范围内提高离心力有助于减少pbmcs中的ldgs，但是离心力大于600×g不能进一步明显减少pbmcs中的ldgs。单靠提高离心力不能完全移除pbmcs中的ldgs。
8.3本发明所述方法对pbmcs中ldgs比例的影响
如图3中所示，在标准方法分离pbmcs的基础上，利用中性粒细胞主动贴壁的特性，将分离的pbmcs在培养板中静置1小时后，检测上清液中ldgs的比例。结果提示离心后贴壁的方法(adherence)，即本发明所述方法，能显著降低pbmcs中ldgs的比例(p＝0.0314，图3a)。但对于ldgs比例极端升高的样本，该方法不能一次完全清除pbmcs中的ldgs。针对这些样本，可以采用延长贴壁时间的方法进一步增加ldgs的清除率。
8.4全血沉淀后离心法对pbmcs中ldgs比例的影响
如图3中的b所示，先离心后沉淀可以显著降低pbmcs中ldgs的比例，为了进一步简化方法，实验中尝试了先沉淀全血再离心的方法(sediment)。先沉淀后离心的方法也能降低pbmcs中ldgs的比例，但差异未达到统计学水平(p＝0.078，图3b)。由图3b可见，该方法也不能完全清除pbmcs中的ldgs，比例显著升高样本中的ldgs清除更差。
8.5比较4种祛除pbmcs中ldgs方法的清除率
为了不同方法间比较祛除pbmcs中ldgs的方法，实验中引入了ldgs清除率的概念。标准分离方法的结果减去各种祛除ldgs方法的结果，再各自除以采用标准方法的结果，即为ldgs的清除率。比较了本发明所述方法 (adherence)、先沉淀全血再离心的方法(sediment)、histopaque-1077分离液600×g离心30分钟的方法(600g)和histopaque-1077分离液800×g离心30分钟的方法(800g)中ldgs的清除率。结果如图4所示，adherence方法的ldgs清除率显著高于600g方法(p＝0.0057)和800g方法(p＝0.0073)；adherence方法与sediment方法相比的话有一定优势，但差异未达到统计学水平(p＝0.1927)。。由于sediment方法、600g方法和800g方法分离pbmcs时，部分患者pbmcs中的ldgs比例高于标准分离方法，所以ldgs清除率出现了负值，对于这些患者，这3种方法非但不能清除ldgs，反而ldgs的残留比标准方法还高，提示这3种方法祛除ldgs的稳定性较差。
8.6比较祛除pbmcs中ldgs的方法对pbmcs中t细胞比例的影响
在从pbmcs中祛除ldgs方面，相比较sediment方法，adherence方法展出了更好的稳定性和更高的清除率。但清除ldgs的目的，是为了富集淋巴细胞，所以实验中比较了这两种方法对pbmcs中t细胞比例的影响程度。与标准方法(standardm)，adherence方法对pbmcs中t细胞的比例影响较小(p＝0.8087，图5a)，而sediment方法使pbmcs中t细胞的比例降低较明显(p＝0.0533，图5b)但差异未达到统计学水平；adherence方法对pbmcs中t细胞的比例影响显著低于sediment方法(p＝0.0387，图5c)。与standardm方法相比，adherence方法对pbmcs中cd8+t细胞的比例影响较小(p＝0.3638，图5d)，而sediment方法使pbmcs中cd8+t细胞的比例降低较明显(p＝0.1238，图5e)；adherence方法对pbmcs中cd8+t细胞比例的影响似乎比sediment方法小，但差异未达到统计学水平(p＝0.1203，图5f)。这些结果提示adherence方法对 pbmcs中t细胞比例和cd8+t细胞比例的影响均较小。
8.7pbmcs中t细胞比例与血常规淋巴细胞比例的相关性在3种方法中的比较
如图6所示，为了进一步分析这3种方法对pbmcs中t细胞比例的影响，实验中分析了pbmcs中t细胞比例与血常规淋巴细胞比例的相关性。结果提示标准分离方法和adherence方法中pbmcs中t细胞比例与血常规淋巴细胞比例的相关性较好(p＝0.0325，p＝0.0004)，而sediment方法中pbmcs中t细胞比例与血常规淋巴细胞比例的相关性很差(p＝0.4249)，提示采用adherence方法分离全血使pbmcs中ldgs的比例与未分离的全血中淋巴细胞的比例一致性非常好。
总结
与最典型的自身免疫病sle患者类似，dm、pm和ra患者pbmcs中ldgs比例均显著高于健康对照，说明pbmcs中ldgs的比例升高在自身免疫病中是普遍的。在一定范围内提高离心力可以降低pbmcs中ldgs的比例，但ldgs清除率不稳定；离心后贴壁较沉淀后离心能显著减少pbmcs中ldgs的比例；本发明所述方法的ldgs清除率最高且对pbmcs中t细胞比例的影响最小。提示本发明所述方法是祛除pbmcs中ldgs的最有效最简便的方法。
ldgs的细胞表面标记与成熟的自体或健康对照的中性粒细胞类似，高表达中性粒细胞表面标记cd15、cd10和cd16，不表达mhcⅱ类分子和cd86。但是细胞核形态与中性粒细胞不同，为不成熟的细胞核表型。ldgs可能代表一群在未知因素刺激下从骨髓中提前释放出来的幼稚中性粒细胞。自身免疫病中各种促炎细胞因子和物质表达较多，这些物质可能促进中性粒细胞前体细胞从骨髓中提前释放，或者干扰中性粒细胞前体细胞的分化能力。ldgs表现出前炎症细胞的表型，在受到刺激时，会大量分泌tnf、ⅰ型和ⅱ型ifn，这些特征会促发和加重组织损伤。另外，ldgs不但可以通过形成nets方式损 伤内皮细胞，还可以通过直接与内皮细胞接触而损伤内皮细胞。
与sle来源的正常密度的中性粒细胞和健康对照的中性粒细胞相比，ldgs表现出更强的nets形成能力，而且更易形成nets。体外培养pbmcs做淋巴细胞相关研究时，其内所含的异常增多的ldgs可能会在短短几小时内大量形成nets。而nets刺激对培养的t淋巴细胞有广泛的影响，使cd4+t细胞群集，上调了活化标记cd25和cd69，导致了tcr相关的信号激酶zap70的磷酸化，并下调了cd4+t细胞的激活阈值。与发生nets的中性粒细胞和树突状细胞的共培养，可导致了t细胞的激活，ifn-γ和il-17的分泌显著增加。可见在做pbmcs培养时，ldgs形成的nets对t细胞的影响不容忽视。
目前从混合细胞群中获取或除去某型细胞的方法有磁珠分选和流式分选。这两种方法都是利用磁珠标记或荧光标记的单克隆抗体分进行特异性结合而获得特定细胞株，分为阳性选择和阴性选择。阳性选择获得的细胞，由于结合了特异性抗体，可能会影响细胞的某些功能。而阴性选择时需要使用多种抗体去结合非目的细胞而保留目的细胞，所以分选成本比较高。所以发现一种简单易用的从pbmcs中祛除ldgs的方法是现实需求。
首先验证了提高离心力对pbmcs中ldgs比例的影响，结果发现较之400×g离心力，600×g离心力和800×g离心力均能降低ldgs比例，但是从600×g离心力提高到800×g离心力不能进一步显著降低ldgs比例，提示一定范围内提高离心力有助于降低ldgs比例,但是过大的离心力对祛除ldgs无益。本发明所述方法对标准方法分离的pbmcs进行贴壁处理，可以显著降低pbmcs中ldgs的比例，展示了最高的ldgs清除率。而先沉淀全血再离心血浆的方法虽也能在部分患者中祛除一部分ldgs，但结果不稳定，ldgs清除率不及本发明所述方法。可见在这几种方法的比较中，本发明所述方法是最高效、最稳定的祛除pbmcs中ldgs的方法。
一个好的方法不但要ldgs清除率高，而且对pbmcs中淋巴细胞的影响 要小。所以进一步比较了本发明所述方法和先沉淀后离心法对pbmcs中淋巴细胞的影响。本发明所述方法不但对pbmcs中t细胞的影响小，而且pbmcs中t细胞的比例与血常规淋巴细胞比例呈显著正相关，提示本发明所述方法能真实还原外周血中t细胞的比例。
一个好的方法不但要高效、对实验结果影响小，而且要简单易行。本发明所述方法非常易于实验操作。分离的pbmcs不管是用96孔板，还是48孔板，或者24孔板培养，只需接种细胞后静置1小时，再换新培养板就可实现。根据清除ldgs的情况及实验需要，可以适当延长静置时间，或者再换一个新培养板可能会几乎完全清除pbmcs中的ldgs。
总之，pbmcs中ldgs的比例异常增高在sle、pm、dm和ra中是普遍存在的，ldgs形成nets可能会影响这组疾病中针对pbmcs研究的结果。本发明所述方法可以在几乎不影响pbmcs中t细胞的前提下高效地祛除ldgs。培养pbmcs做淋巴细胞相关研究时，推荐细胞悬液加入培养板后先静置一小时，再换板后培养，可以高效、简便的祛除pbmcs中的ldgs，从而预防和减少残留的ldgs通过形成nets而影响t细胞相关的实验结果。
以上实例仅为本发明的较佳实例，并不用于限定本发明所描述的技术方案，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。