本发明适用于生物化工领域，具体涉及一种重组大肠杆菌菌株生产长链二元酸的方法。
背景技术：
a,ω-长链二元酸是指含有10个以上碳原子的直链二元羧酸。它是一类用途很广的重要精细化工原料，广泛应用于芳香剂、防腐剂和聚合物等。
a,ω-长链二元酸在自然界不存在，目前根据长链二元酸的不同碳原子个数有两种方法进行生产，一种是化学合成法，一种是生物发酵法。化工合成法主要是以石油原料进行生物转化(liuetal.,2011，biomacromolecules，12:3291–3298)，但是采用化学法生产有其局限性，首先是化学合成法的条件苛刻、生产工艺复杂，而且产物产率低、危险性大、易污源环境。微生物发酵法则相对来说条件比较温和，而且污染较小。
关于微生物发酵法，目前有报道在利用炼油副产物如十二烷烃或其衍生物作为底物(w.luetal.,2010,chem.soc.,132,15451./p.fickersetal.,2005,biotechnol.lett.,27,859.)，利用酵母进行发酵生产长链二元酸。但是以炼油副产物十二烷烃或其衍生物作为底物会存在供给限制，而且原料不可持续性，而且酵母生长和发酵周期长，增大了成本，产物多样性比较差，因此寻找或构建一些发酵周期短，生产工艺简单微生物或重组菌株利用可持续性原料进行此类发酵生产具有重要的意义。
目前也有在大肠杆菌中通过表达ω-羟化酶，如食油假单胞来源alk系列单氧酶(manfredschreweetal.,catal.2011,353,3485–3495)或者细胞色素p450系列单氧酶(sumirehondamalcaetal.,commun.,2012,48,5115–5117)等，将添加的底物脂肪烃、脂肪酸酸或者脂肪酸甲酯等转化为相应的ω-羟基化产物，如果产物是ω-羟基脂肪酸则可以在醇还原酶和醛还原酶的作用下进一步转化为a,ω-二元酸。大肠杆菌生长周期比酵母短，但是这种转化方式需要外源添加底物，而且不同链长脂肪烷烃或其衍生物进入细胞困难，虽然也有通过表达外膜蛋白alkl基因(mattijsketal.,2012,appliedandenvironmentalmicrobiology,5724–5733)提高脂肪酸甲酯的细胞输入，但是相对来说产率还是比较低。因此如何能让细胞自行进行相应链长脂肪烷烃或其衍生物的合成，进而进一步在胞内通过末端羟化酶进行氧化是本领域技术人员研究的方向。
技术实现要素：
本发明的目的是克服了现有技术的不足，提供一种重组大肠杆菌菌株生产长链二元酸的方法，即在基因工程微生物中利用可持续碳源实现长链二元酸的微生物发酵法生产。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种重组大肠杆菌菌株，所述重组大肠杆菌菌株是通过敲除或弱化了大肠杆菌中的脂肪酸β-氧化降解的路径基因获得的。
本发明提供的另一个目的是提供一种由上述重组大肠杆菌菌株生产长链二元酸的方法，所述的方法是通过所述重组大肠杆菌菌株利用可持续性碳源积累得到长链脂肪酸，并进一步将所述长链脂肪酸转化得到长链二元酸。
具体的，所述方法通过在所述重组大肠杆菌菌株中表达长链脂肪酸的合成基因以及调控基因得到所述的长链脂肪酸。
更为具体的，所述长链脂肪酸的合成基因为具有序列表中seqidno:1核苷酸序列的加州月桂来源的硫酯酶fatb基因。
更为具体的，所述长链脂肪酸的调控基因为大肠杆菌来源的fadr基因。
具体的，所述方法通过在所述重组大肠杆菌菌株中表达ω-羟化酶、醇还原酶和醛还原酶，从而将积累的所述的长链脂肪酸转化形成所述的长链二元酸。
更为具体的，所述的ω-羟化酶包括alkbfgt系列单氧酶和细胞色素p450羟化酶。
更为具体的，所述的醇还原酶为醇还原酶alkj。
更为具体的，所述的醛还原酶为醛还原酶alkh。
具体的，所述的碳源为葡萄糖。
由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：本发明中通过构建重组大肠杆菌菌株，利用可持续性碳源生产长链二元酸，其主要通过在野生型的大肠杆菌菌株中敲除脂肪酸β-氧化降解的路径基因构建重组菌株，而后在此重组菌株中共表达长链脂肪酸的合成基因以及调控基因以进行长链脂肪酸的积累，而后在此菌株中通过表达ω-羟化酶、醇还原酶和醛还原酶，将积累的长链脂肪酸转化成长链二元酸。该方法克服了现有技术中采用化学法制备长链二元酸过程中所存在的反应条件苛刻、生产工艺复杂、危险性大、易污染环境的问题，同时还大大提高了产物的产率。
附图说明
图1为实施例4中十二碳脂肪酸ω-羟化过程；
图2为实施例4中pgec47质粒alk羟化酶体系示意图；
图3为实施例6中cyp153am.aq.-cprbm3融合蛋白反应机理结构图；
图4为实施例7中mj1/pgec47ms检测结果图；
图5为实施例7中mj1/pez07-alkbfgtms检测结果图；
图6为实施例7中mj1/pez07-cb3mms检测结果图；
图7为实施例9中mj1/pez07-fatb-fadr-alkbfgtms检测结果图。
具体实施方式
下面来对本发明的技术方案作进一步的阐述。
实施例1重组菌株mj1的构建
a,ω-十二碳二元酸合成的前体物是十二元酸，但是在细胞内脂肪酸会在fadd基因编码的脂肪acyl-coa合成酶、fade基因编码的acyl-coa脱氢酶和fadb基因编码的enoyl-coa等的作用下通过β-氧化途径逐步降解。因此，首先需要将β-氧化途径基因进行阻断或者弱化，使细胞可以在其他脂肪酸合成酶基因的表达下能够积累脂肪酸。
以野生型w3110菌株作为基础菌株敲除fadd基因弱化脂肪酸降解路径，菌体构建过程为：以pkd4为模板，引物对fadd-k-f/fadd-k-r扩增敲除片段(引物序列见表1)，电转化大w3110电转感受态细胞，涂布于卡那抗性平板筛选，得到的克隆利用验证引物fadd-200-f/fadd-200-r进行菌液pcr验证(引物序列见表1)，得到的重组菌株w3110(δfadd)，即mj1菌株。
具体的构建用引物和构建方法详见文献介绍。(datsenkoka,wannerbl.,2000,procnatlacadsciusa,97:6640–6645./tomoyababaetal.,2006,molecularsystemsbiology.)
实施例2长链脂肪酸合成表达质粒pez07-fatb的构建
根据seqidno:1，合成加州月桂umbellulariacalifornica来源的acyl-[acp]thioesterase基因fatb，连入puc57载体(购自苏州金唯智生物技术有限公司)，获得质粒puc57-fatb。fatb基因主要用于催化长链脂肪酸，尤其是十二碳脂肪酸的合成。
利用无缝克隆重组技术构建表达质粒pez07-fatb。pez07是本实验室利用利用biovector中国质粒载体菌株细胞基因保藏中心的ptrc99a和pcl1920构建的，具有奇霉素抗性并以trc为启动子的低拷贝质粒。以上述基因合成的质粒puc57-fatb为模板，引物对fatb-n-f/fatb-x-r扩增两端分别含有同源区域的基因fatb(引物对序列见表1)，并进行回收；回收后通过无缝克隆重组酶将fatb基因与ncoi和xhoi双酶切回收的载体pez07进行ezclone，转化大肠杆菌感受态细胞tg1，完成质粒pez07-fatb的构建。最后将构建得到的重组质粒pez07-fatb转化宿主mj1，得到mj1/pez07-fatb。
将上述构建的到的重组菌株和对照菌株mj1/pez07进行摇瓶发酵检测十二碳脂肪酸的合成。具体发酵过程如下：首先分别接种上述2个重组菌的3个不同转化子接种于4ml添加100ng/mlspe抗性的lb培养基，于37℃、200rpm培养过夜。次日，分别取过夜培养的菌液100ul加入到2ml含spe抗性的lb培养基，37℃、200rpm培养3.5h左右，全部加入到18ml的改良m9发酵培养基中，改良m9发酵培养基配方及微量元素tm2母液成分详见表2。然后，转接过后于37℃、250rpm培养4-5h，每瓶加入诱导剂iptg使其终浓度为1mm，继续37℃、250rpm培养过夜。最后，发酵过夜后取出400ul发酵液加入800ul的氯仿，将离心管置于涡旋振荡器上剧烈震荡，震荡5-10min后将离心管在12000rpm离心1min，吸取下层0.22um有机滤膜进行gc检测。检测结果显示对照菌株mj1/pez07没有十二碳脂肪酸检测到，而菌株mj1/pez07-fatb可以检测到0.45g/l十二碳脂肪酸，依据ms结果产物为饱和和不饱和十二碳脂肪酸混合物，具体为十二酸和5-烯十二酸，其结构式分别为式a和式b。
上述结果说明，表达加州月桂来源的fatb可以实现十二碳脂肪酸的合成，但是目前的产量偏低，还需要进行优化进一步提高其产量。
表1质粒构建引物表
表2摇瓶发酵培养基配制及tm2母液成分如表2-1与2-2所示：
表2-1
表2-2
实施例3长链脂肪酸合成表达质粒pez07-fatb的构建
大肠杆菌fadr基因是脂肪酸合成和降解相关转录基因的一个调控子，文献显示过表达fadr有助于提高脂肪酸的合成量，因此在实施例1表达质粒pez07-fatb的基础上再共表达fadr基因，以期提高十二碳脂肪酸的产量。
利用无缝克隆重组技术构建表达质粒pez07-fatb-fadr。以mg1655基因组为模板，引物对fadr-p-f/fadr-h-r扩增两端分别含有同源区域的基因fatr(引物对序列见表1)，并进行回收；回收后通过无缝克隆重组酶将fadr基因与psti和hindiii双酶切回收的质粒pez07-fatb进行ezclone，转化大肠杆菌感受态细胞tg1，完成质粒pez07-fatb-fadr的构建。最后将构建得到的重组质粒pez07-fatb-fadr转化宿主mj1，得到mj1/pez07-fatb-fadr。
按照实施例1的摇瓶发酵方法进行mj1/pez07-fatb、mj1/pez07-fatb-fadr摇瓶发酵比较。gc结果显示mj1/pez07-fatb、mj1/pez07-fatb-fadr得到的十二碳脂肪酸的含量分别为0.55g/l和3.55g/l，上述结果说明fadr基因的表达可以有效的提高脂肪酸的合成。
上述实验结果说明可以在大肠杆菌中利用可持续性碳源，如葡萄糖等进行长链脂肪酸的合成，因此后面需要寻找合适的羟化酶基因，将合成的长链脂肪酸进一步氧化还原成长链二元酸。
实施例4含alk羟化酶体系质粒pgec47表达确认
上述实施例中重组菌株积累的十二碳脂肪酸需要合适的ω-羟化酶才能转化成十二碳二元酸，参考相关文献信息，本发明选取了2种ω-羟化酶alk系列和细胞色素p450系列ω-羟化酶进行生物转化和表达比较，以期获得酶活较高的羟化酶进行上述氧化反应，ω-羟化反应过程详见图1。
alk体系羟化酶主要来自pgec47，大小为34902bp，其具有烷烃羟化酶体系，可使微生物在以中链烷烃(c6-c12)为唯一碳源的条件下，将烷烃进行ω-羟化，进入β-氧化途径供菌体生长，alk相关基因详见图2。pgec47质粒alk羟化酶体系主要含有两个操纵子，一个是alkst，一个是alkbfgthijk。alks基因主要是编码一种转录调节因子，在有中链烷烃存在的情况下，激活alk启动子及其后各基因的表达。alkb是一类亚铁血红素单氧酶，反应过程用两个电子还原氧原子生成水，另一个氧原子被整合到底物末端的甲基位置完成氧化，这个反应过程除了alkb基因外，还需要一个可溶的nadh-红素养还蛋白还原酶基因alkt和可溶的红素养还蛋白alkg，三者一起构成ω-单氧酶，有文献报道alkbgt还可以将ω-羟化产物进一步进行氧化成ω-醛和酸，但是酶活性要低很多。alkh和alkj分别为醇还原酶和醛还原酶，可以将ω-羟化产物进一步进行氧化成ω-醛和ω-酸。
首先要确认构建的质粒pgec47是否可以使其宿主微生物在烷烃或其衍生物为唯一碳源的培养基中存活。将pgec47转化宿主mj1，得到重组菌株mj1/pgec47，将此菌株单克隆在上述摇瓶发酵固体培养基平板上划线，此固体培养基添加抗生素12.5mg/l四环素和100mg/l奇霉素，此外不添加葡萄糖，改用2.5mm癸酸甲酯作为碳源，同时添加0.025％双环丙基酮dcpk作为诱导剂，培养2天左右划线处有菌落出现，接种抗性试管生长正常，镜检为大肠杆菌，说明购买的pgec如文献所述可以使其微生物在烷烃或其衍生物为唯一碳源的培养基进行生长，说明alk系列基因功能正常。
实施例5alk羟化酶相关表达质粒构建
首先构建pez07-alkbfgt质粒检验单氧化反应。以pgec47质粒为模板，引物对bfg-n-f/bfg-x-r扩增基因alkbfg(引物序列见表1)，并进行回收；回收后通过无缝克隆重组酶将alkbfg基因与ncoi和xhoi双酶切回收的载体pez07进行无缝克隆，转化大肠杆菌感受态细胞tg1，完成质粒pez07-alkbfg的构建。随后将质粒pez07-alkbfg进行xhoi和ecori双酶切，和以pgec47质粒为模板，引物对alkt-xhoi-f/alkt-ecori-r扩增的基因片段alkt进行无缝克隆(引物序列见表1)，转化大肠杆菌感受态细胞，完成质粒pez07-alkbfgt的构建。将质粒pez07-alkbfgt转化宿主mj1，得到重组菌株mj1/pez07-alkbfgt，随后会在摇瓶发酵过程添加底物癸酸甲酯检测其羟化酶活力。
实施例6细胞色素p450系列羟化酶相关表达质粒构建
脂肪酸的ω-端氧化还可以被细胞色素p450进行催化，而细菌cyp153a单氧酶对c5-c12烷烃或其衍生物具有较高的ω-羟化能力。德国学者danielscheps将海杆菌属来源的cyp153a与芽孢杆菌来源p450bm3的还原酶基因进行融合，得到的融合蛋白cyp153am.aq.-cprbm3可以将实现十二碳脂肪酸或其相应脂肪酸甲酯转化到ω-羟基十二碳脂肪酸，融合蛋白及反应过程详见图3，而且scheps研究结果显示将此融合蛋白基因的g307a进行点突变后会显著提高其转化活力。
根据seqidno:2，合成cb3m即cyp153am.aq.-cprbm3基因，且含有点突变g307a，连入puc57载体(购自苏州金唯智生物技术有限公司)，获得质粒puc57-cb3m。
以puc57-cb3m质粒为模板，引物对cb3m-ncoi-f/cb3m-xhoi-r扩增基因cb3m(引物序列见表1)，并进行回收；回收后通过无缝克隆重组酶将cb3m基因与ncoi和xhoi双酶切回收的载体pez07进行无缝克隆，转化大肠杆菌感受态细胞tg1，完成质粒pez07-cb3m的构建。将质粒pez07-cb3m转化宿主mj1，得到重组菌株mj1/pez07-cb3m，随后在摇瓶发酵过程添加底物癸酸甲酯检测其羟化酶活力。
实施例7alk羟化酶和细胞色素p450羟化酶转化能力摇瓶比较
上述构建的2类羟化酶转化宿主后进行摇瓶发酵，通过添加底物癸酸甲酯检测羟化产物进行酶活转化能力比较。选择癸酸甲酯而没有选择十二碳酸，主要是因为十碳甲酯和十二碳脂肪酸结构相似，而且比十二碳脂肪酸更容易进入细胞进行转化。羟化过程和图1类似，底物和可能的三种产物分子量分别是186、202、200、216。通过gc图谱或者ms分析判定是否发生羟化反应。
与实施例1发酵过程类似，将上述构建得到的两种羟化酶的重组菌株以及对照菌株mj1/pgec47分别接种于4ml添加100ng/mlspe抗性的lb培养基，于37℃、200rpm培养过夜。次日，分别取过夜培养的菌液100ul加入到2ml含spe抗性的lb培养基，37℃、200rpm培养3.5h左右，全部加入到18ml的发酵培养基中，转接过后于37℃、250rpm培养4-5h，添加底物癸酸甲酯，使其终浓度为5g/l，同时加入诱导剂iptg使其终浓度为1mm，继续37℃、250rpm培养过夜。最后，发酵过夜后取出400ul发酵液加入800ul的氯仿，震荡5-10min后将离心管在12000rpm离心1min，0.22um有机滤膜进行gc检测。
gc检测结果显示与对照菌株mj1/pez07相比gc图谱在除底物位置还有2个出峰，但是很小，因此将样品进行ms检测确认。
mj1/pgec47菌株的总离子流ms检测结果见图4，结果显示底物癸酸甲酯含量已经很低，即分子量186，ms显示187；而且主要产物是3步羟化产物，即分子量为216，ms显示217；其次是1步羟化产物，即分子量为202，ms显示203。
mj1/pez07-alkbfgt菌株的总离子流ms检测结果显示底物残留的很多，产物量相比对照少很多(结果未显示)。提取离子流结果见图5，结果显示mj1/pez07-alkbfgt菌株的主要产物是1步羟化产物，即分子量为202，ms显示203，也有少量的3步羟羟产物，即分子量为216，ms显示217。
mj1/pez07-cb3m菌株的总离子流ms检测结果显示底物残留的很多，产物量相比对照少很多(结果未显示)，与mj1/pez07-alkbfgt菌株结果类似。提取离子流结果见图6，结果显示，mj1/pez07-cb3m菌株的只有1步羟化产物，即分子量为202，ms显示203，无其他产物可以检测到。
上述结果说明：1)mj1/pez07-alkbfgt和mj1/pez07-cb3m都可以实现癸酸甲酯的羟化转化反应；而且mj1/pez07-alkbfgt如文献报道，可以进行3步羟化反应，后面两步的催化活力显然没有第一步羟化快；2)mj1/pez07-alkbfgt相比较与mj1/pez07-cb3m可能具有更好的转化能力。
随后在脂肪酸合成基因基础上表达alkbfgt进行初步验证。
实施例8二元酸重组菌株mj1/pez07-fatb-fadr-alkbfgt的构建
实施6比较可以看出alk系列羟化酶可能具有更高的转化活力，因此将其构建到pez07-fatb-fadr上，期望将脂肪酸合成加强基因和羟化基因共表达后可以得到十二碳的ω-一步或多步羟化产物。
质粒pez07-fatb-fadr-alkbfgt重组质粒构建过程如下：首先，质粒pez07-fatb-fadr用hindiiisali双酶切，回收；然后，以pez07-alkbfgt质粒为模板，利用引物对bt-hindiii-f/bt-sali-r扩增基因alkbfgt，并进行回收；最后将酶切回收的质粒和扩增回收的片段通过无缝克隆重组酶进行无缝重组，转化大肠杆菌感受态细胞tg1，完成质粒pez07-fatb-fadr-alkbfgt的构建。将质粒pez07-fatb-fadr-alkbfgt转化宿主mj1，得到重组菌株mj1/pez07-fatb-fadr-alkbfgt，理论上此菌株具有脂肪酸合成和羟化酶基因，摇瓶发酵可以得到ω-羟基脂肪酸。
实施例9重组菌株mj1/pez07-fatb-fadr-alkbfgt摇瓶发酵
将上述构建的重组菌株mj1/pez07-fatb-fadr、mj1/pez07-fatb-fadr-alkbfgt分别挑取3个克隆接种于4ml添加100ng/mlspe抗性的lb培养基，于37℃、200rpm培养过夜。次日，分别取过夜培养的菌液100ul加入到2ml含spe抗性的lb培养基，37℃、200rpm培养3.5h左右，全部加入到18ml的发酵培养基中，转接过后于37℃、250rpm培养4-5h，加入诱导剂iptg使其终浓度为1mm，继续37℃、250rpm培养过夜。最后，发酵过夜后取出400ul发酵液加入800ul的氯仿，震荡5-10min后将离心管在12000rpm离心1min，0.22um有机滤膜进行gc检测。
gc检测结果显示重组菌株mj1/pez07-fatb-fadr、mj1/pez07-fatb-fadr-alkbfgt可检测到的十二碳脂肪酸含量分别为3.2g/l和2.0g/l,初步可以判断是有十二碳脂肪酸进行其他的反应，很有可能是ω-羟化，但是ω-羟化十二碳脂肪酸由于沸点高，因此需要进行ms检测确认。mj1/pez07-fatb-fadr-alkbfgt菌株ms检测总离子流结果见图7，结果显示产物十二碳脂肪酸即ms显示201基本没有了，对比对照菌株mj1/pez07-fatb-fadr，而且可以看到ω-羟基十二元酸，即217出峰，但是产量不高，而且提取离子流可以看到很少量的a,ω-十二碳二元酸，即231出峰；此外两个菌株的5-烯十二元酸占很大比例，而且看ms结果没有相应的羟化产物，可能是烯键存在的影响。
上述结果说明重组菌株mj1/pez07-fatb-fadr-alkbfgt可以实现十二元脂肪酸ω-羟基化，但是目前产物大多是ω-羟基十二元酸，因此需要在此质粒基础上进一步表达alkh和alkj，它们分别是醇还原酶和醛还原酶，可以将ω-羟基脂肪酸进一步氧化成ω-醛基脂肪酸和a,ω-十二碳二元酸。
实施例10ω-二元脂肪酸重组菌株构建和摇瓶发酵
上述实施例中重组菌株mj1/pez07-alkbfgt虽然也有少量的3步羟化产物积累，但是含量相对来说还是很低，因此需要在此质粒基础上进一步表达alkh和alkj，目标是将ω-羟基脂肪酸全部转化为a,ω-十二碳二元酸。
质粒pez07-fatb-fadr-alkbfgt-alkhj重组质粒构建过程如下：首先，质粒pez07-fatb-fadr-alkbfgt用sali单酶切，然后进行去磷酸化处理和回收；然后，以pgec47质粒为模板，利用引物对hj-sali-f/hj-sali-r扩增基因alkhj(引物序列见表1)，并进行回收；最后将酶切回收的质粒和扩增回收的片段通过无缝克隆重组酶进行无缝重组，转化大肠杆菌感受态细胞tg1，完成质粒pez07-fatb-fadr-alkbfgt-alkhj的构建。将质粒转化宿主mj1，得到重组菌株mj1/pez07-fatb-fadr-alkbfgt-alkhj，理论上此菌株已具备醇和醛还原酶基因，可以实现脂肪酸二元酸的生产。
将上述构建的重组菌株进行摇瓶发酵，过程和制样检测与实施例8类似。ms检测总离子流与上述类似，5-烯十二元酸比例最大，其次ω-羟基十二元酸仅在提取离子流结果看到少量，大部分都是a,ω-十二碳二元酸，即231出峰，说明alkhj表达正常，可以实现将ω-羟基十二碳酸转化成a,ω-十二碳二元酸。这些结果也说明了此大肠杆菌重组菌株可以实现利用可持续性碳源在微生物中进行长链二元脂肪酸的生产。在后续的研究过程首先需要减少不饱和脂肪酸的合成，最大化的提高长链脂肪酸的产量；其次，关于羟化基因alk系列ω-羟化酶的表达还需要进一步优化，以其获得更好的转化效率。
综上所述，本发明采用的微生物发酵法制备长链二元酸，首先通过改造微生物使终端β-氧化降解；然后，在改造后的微生物中表达脂肪酸合成酶和脂肪酸合成调节基因，利用可持续性碳源葡萄糖为原料使细胞积累a,ω-十二碳二元酸的前体物十二元酸；最后，在此基础上再表达脂肪酸羟化酶、脂肪醇和醛还原酶等，使细胞积累的十二元酸逐步转化为a,ω-十二元酸。整个制备过程，条件温和，工艺简单，对环境友好，且产物产率更高。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
序列表
<110>河北美邦工程科技股份有限公司
<120>一种重组大肠杆菌菌株生产长链二元酸的方法
<160>20
<210>1
<211>906
<212>dna
<213>人工序列
<400>1
1atgactttggaatggaaacccaagccgaaacttccacagctgctcgacgatcattttgga
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