一种用于重金属铜离子去除的柠檬酸杆菌及其应用的制作方法

摘要

本发明属于环境微生物技术领域。它具体涉及一株柠檬酸杆菌(citrobactersp.)及其在含重金属铜离子废水去除中的应用。该菌株为柠檬酸杆菌(citrobactersp.jpg1)，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为cgmccno.13480。该菌株具有耐受重金属铜的能力，可用于含铜废水的处理。

本发明属于环境微生物技术领域。它具体涉及一株用于重金属铜离子去除的柠檬酸杆菌(citrobactersp.jpg1)及其应用。

背景技术：

铜是生物生长的必需元素，但是浓度过高时会产生毒性。当水中铜含量超过0.01mg/l时，不仅对水体自净有明显的抑制作用，而且会对水生生物产生毒性。铜作为一种重要的有色金属资源，被广泛应用于电子电气、轻工、机械制造、建筑工业、国防工业等领域。铜的冶炼、加工以及电镀等工业生产过程中都会产生大量含铜废水。通常情况下，含铜废水其质量浓度通常为几十至几百毫克每升，这些含铜废水如果不经过处理直接排放到环境中，将给环境带来极大危害。因此，含铜废水必须经过处理才能排放到环境之中。

目前，含铜废水的处理方法主要采用物理化学法或生物法。化学法如电渗析、化学沉淀存在过程繁琐，药品使用量大，沉渣多、后续处理难度系数大等缺点；物理法如活性炭吸附、离子交换等技术的稳定性能差，运行费用高等问题。重金属微生物吸附是利用细菌、真菌和藻类等微生物为吸附剂吸附液相中的重金属离子，再通过固液分离去除水溶液中金属离子的一种方法。作为一种新兴的重金属去除技术，微生物吸附在处理低浓度重金属工业废水中显示了独特的优势，具有高效、低耗、去除率高、环境友好等特点。研究表明，低浓度重金属离子废水浓度低于100mg/l时，微生物吸附方法好于物理化学方法。因此，微生物吸附重金属方法日益受到重视。

技术实现要素：

本发明的目的是针对低浓度含铜废水中二价铜离子的去除问题，提供一株柠檬酸杆菌(citrobactersp.jpg1)及其在含重金属铜离子废水去除中的应用。

本发明所提供的柠檬酸杆菌(citrobactersp.jpg1)菌株，于2016年12月22日保藏于“中国微生物菌种保藏中心管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)”，保藏登记号为cgmccno.13480，建议分类命名为柠檬酸杆菌(citrobactersp.)。

本发明所提供的柠檬酸杆菌citrobactersp.jpg1菌株是从吉林省某尾矿库的尾矿渣中分离。以二价铜离子为选择压力，在lb培养基中反复驯化培养获得。

柠檬酸杆菌citrobactersp.jpg1菌株在lb琼脂平板培养基上的菌落特征：菌落呈圆形，直径为3mm、乳白色、表面凸起湿润、边缘整齐。

柠檬酸杆菌citrobactersp.jpg1菌株的细胞特征：细胞呈球杆状，表面略显粗糙，细胞大小为0.5×0.8～1μm。

柠檬酸杆菌citrobactersp.jpg1菌株的生理生化特征：革兰氏阳性，甲基红、产吲哚试验、葡萄糖发酵试验、接触酶试验和柠檬酸盐还原试验反应结果为阳性，v-p试验结果为阴性。

柠檬酸杆菌citrobactersp.jpg1菌株的16srrna基因序列特征：菌株jpg1的16srrna基因序列长度为1337bp(序列如列表所示)，在genebank中的登录号为ku513787。通过与genebank同源序列比对可知，菌株jpg1与柠檬酸杆菌citrobacterfreundiihq010516b-1同源性达99％。

参照《伯杰氏鉴定细菌学手册》(第8版)，根据菌株形态学特征、生理生化特征，结合该菌的16srrna基因序列在genebank中的比对结果，分离的菌株jpg1鉴定为柠檬酸杆菌citrobactersp.。

本发明的另一个目的是提供采用柠檬酸杆菌citrobactersp.jpg1去除含铜废水中cu²⁺的方法。

以柠檬酸杆菌citrobactersp.jpg1菌株为活性成分制备的生物制剂也属于本发明的保护范围。

本发明的柠檬酸杆菌citrobactersp.jpg1，分离自从吉林省某尾矿库的尾矿渣。柠檬酸杆菌citrobactersp.jpg1的活细胞可使初始cu²⁺分别为100mg/l、50mg/l的含铜废水中cu²⁺的去除率分别为24％和44％。因此，本发明提供柠檬酸杆菌citrobactersp.jpg1菌株的活细胞可通过细胞壁的吸附和胞内积累作用去除含铜废水中的cu²⁺，在利用活性细菌的吸附作用去除含铜废水中cu²⁺方面具有良好的应用前景。

下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，并非对本发明的限制。

附图说明

图1为柠檬酸杆菌citrobactersp.jpg1在lb平板下生长的菌落形态照片(a)及其扫描电镜图片(b)

图2为柠檬酸杆菌citrobactersp.jpg1菌株的生长曲线

图3为柠檬酸杆菌citrobactersp.jpg1对重金属铜的耐受程度

图4为柠檬酸杆菌citrobactersp.jpg1活细胞对含铜废水中的cu²⁺去除率

具体实施方式

下述实施在实例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径购买获得。

下述实验方法如无特别说明均为常规方法，所有培养基中的溶剂均为蒸馏水。每个实验均为3个平行，并设置空白对照实验。

下述实验方法中菌株jpg1的生物量采用od600表征，即采用分光光度法测定菌株jpg1培养液在波长为600nm的吸光度值。

下述实验中采用的含铜废水由cucl2·2h2o配制而成。含铜废水中的初始cu²⁺浓度分别为100mg/l和50mg/l。

本发明中cu²⁺浓度采用火焰原子吸收(aa6300)测定。

实施例1.柠檬酸杆菌citrobactersp.jpg1的分离、纯化和鉴定。

柠檬酸杆菌citrobactersp.jpg1分离过程中使用的lb液体培养基组成为：蛋白胨2g，酵母粉1g，nacl2g，水200ml，ph7.0～7.5。

lb固体培养基的组成为：在上述液体培养基中加入琼脂16g/l。

柠檬酸杆菌citrobactersp.jpg1菌株分离自吉林省某尾矿库的尾矿渣，具体富集、分离、纯化过程如下：

将1g尾矿渣接种到生理盐水中(装液量为20ml/100ml三角瓶)，180rpm下振荡24h。吸取1ml悬液于离心管中，上清液加入99ml新鲜灭菌lb液体培养基中，30℃、180r/min条件下摇床振荡培养24h。扩大培养后的菌液，按5％接种量依次接种到含cu²⁺浓度为50、100、200mg/l的lb液体培养基中驯化培养2d。最后取驯化后的混合菌液1ml，加至9ml无菌水中，摇动混匀，稀释为10^-1倍稀释菌液，并依次稀释为10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9不同稀释倍数，选取10^-7、10^-8、10^-9稀释倍数的菌液进行涂布。吸取200ul菌液于事先倒好的lb固体平板上，用刮板均匀涂布，涂布完成后正面朝上，开盖静置数分钟，待液体干燥，将平板封口，倒置于生化培养箱中，最终获得一株耐铜的菌株，命名为jpg1。

采用形态观察、生理生化鉴定和16srrna基因测序对菌株jpg1进行鉴定。

在lb培养基上的可见直径为3mm、乳白色、表面凸起湿润，边缘整齐的菌落(图1a)。电镜下观察，菌株细胞呈球杆状，表面略显粗糙，细胞大小为0.5×0.8～1μm(图1b)。

生理生化鉴定结果：革兰氏阳性，甲基红、产吲哚试验、葡萄糖发酵试验、接触酶试验和柠檬酸盐还原试验反应结果为阳性，v-p试验结果为阴性。

菌株jpg1的16srrna基因序列测定和系统发育分析。将经纯化保存后的菌株接种到lb液体培养基180r/min中培养12h，离心收集菌体，重新悬浮，采用酚-氯仿法提取菌株的dna，0.8％琼脂糖电泳进行检测。采用细菌16srdna通用引物进行pcr扩增。其中，正向引物为27f(5'-agagtttgatcctggctcag-3')，反向引物为1492r(5'-ggctaccttgttacgactt-3')’。pcr反应条件为：先94℃6min；然后94℃45s，54℃45s，72℃90s，共30个循环；最后72℃延伸10min。pcr扩增产物送至上海生工生物工程股份有限公司测序。菌株jpg1的16srrna基因序列长度为1337bp，在genebank中的登录号为ku513787。通过与genebank同源序列比对可知，菌株jpg1与柠檬酸杆菌citrobacterfreundiihq010516b-1同源性达99％。菌株jpg1的16srrna基因序列如下：

基于菌落特征、菌株形态、生理生化特征与16srrna测定结果，将筛选到的菌株鉴定并命名为柠檬酸杆菌citrobactersp.jpg1。该菌株已于2016年12月22日保藏于“中国微生物菌种保藏中心管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)”，保藏登记号为cgmccno.13480。

实施例2.柠檬酸杆菌citrobactersp.jpg1菌株的生长曲线及其对cu²⁺的耐受程度检验。

为研究柠檬酸杆菌citrobactersp.jpg1的生长规律，将保存的菌种活化制成菌悬液按1％接种量接种到lb培养基中，在温度为28℃、摇床摇速为180rpm的摇床培养96h，然后分别在0、3、6、9、12、18、24、32、36、48h取样，测定菌液od600值，绘制柠檬酸杆菌citrobactersp.jpg1的生长曲线。柠檬酸杆菌citrobactersp.jpg1的生长曲线见图2。柠檬酸杆菌citrobactersp.jpg1的生长周期一般为48h。适应期约为0～9h；9～24h为对数生长期；24h后进入稳定期。

为研究柠檬酸杆菌citrobactersp.jpg1对cu²⁺的耐受程度，研究了该菌株在不同cu²⁺浓度抑制情况下的生长规律。将保存的菌悬液按1％接种量接种到lb培养基中，28℃、180rpm摇床培养8-12h。待菌液od600值生长到为0.2左右时混匀、分装，加入梯度稀释的含cu²⁺溶液，使各体系中cu²⁺浓度依次为0、0.25、0.5、1、2、3、4mm，继续摇床培养96h，然后在0、6、12、24、36、48、60、72、84、96h取样测定菌液od600值。柠檬酸杆菌citrobactersp.jpg1对cu²⁺的耐受情况下如图3。实验结果表明，柠檬酸杆菌citrobactersp.jpg1对cu²⁺的最小耐受浓度为3mm。当cu²⁺浓度在0～3mm时，菌株jpg1可以生长。当cu²⁺离子浓度为1mm时，对菌株jpg1的生长抑制率为50％。当cu²⁺浓度为0.25mm时，菌株jpg1生长基本不受影响，其最大生物量与cu²⁺浓度为0mm时的最大生物量相同。因此，菌株jpg1是典型的cu²⁺耐受菌株，具有环境应用前景。

实施例3.柠檬酸杆菌citrobactersp.jpg1对含铜废水中cu²⁺的生物吸附

细菌活细胞对重金属的吸附包括两个阶段：第一阶段是细菌表面对重金属的吸附作用，第二阶段是重金属离子直接经由细胞表面的离子通道或者与酶结合进入细胞，在胞内积累的过程。为研究柠檬酸杆菌citrobactersp.jpg1活细胞对含铜废水中cu²⁺的吸附作用，取活细胞(1.0g/l)，加入人工配制的含铜废水(cu²⁺浓度分别为50mg/l和100mg/l)，在摇床振荡吸附24h后，离心取样(8000r/min，5min)，测定上清浓度，计算吸附量。无菌水洗涤2次，收集菌体，加入10ml5mmedta，振荡30min，再次离心，收集菌体和上清液，上清液中铜量即为活细胞表面吸附铜的量，菌体加浓硝酸微波消解后，测量浓度，即为细胞胞内积累铜的量。菌株jpg1的活细胞对cu²⁺的胞外吸附和胞内积累结果如图4所示。当铜离子初始浓度为50mg/l时，菌株jpg1对cu²⁺总吸附量为22mg/g，去除率为44％。其中，表面吸附量为15.3mg/g(占总吸附量的70％)，胞内积累量为5.66mg/g(占吸附量的30％)。当铜离子初始浓度为100mg/l时，菌株jpg1对cu²⁺总吸附量为24mg/g，去除率为24％。其中，表面吸附量为16.05mg/g(占总吸附量的67％)，胞内积累量为6.06mg/g(占总吸附量的26％)。

由此可见，本发明提供的柠檬酸杆菌citrobactersp.jpg1可通过细胞外吸附和胞内积累作用去除含铜废水中cu²⁺，具备良好的应用前景。

genbank数据库中，获得登录号genbankaccessnumber-ku513787

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