本发明属于饲料添加剂技术领域，涉及一种提高奶牛产奶量和牛乳品质的酵母益生菌制剂及制备方法。
背景技术：
近年来国内外学者对益生菌的研究报道逐渐增多，益生菌在在提高畜牧养殖的经济效益上的效果不断被报道。随着经济与科技的发展，人们对动物食品的需求不仅在数量上，而且在质量上都提出了更高的要求，特别是对药物的残留提出更加严格的限制。益生菌的主要作用是通过动物消化道生物的竞争排斥作用，帮助动物建立有利于宿主的胃肠道微生物区系，预防腹泻，降低药物依赖，促进生长，提高饲料利用率，生产无污染、无公害的畜禽产品。因此，益生菌对于建立一个可持续的生态畜牧业具有广阔的应用前景。
当前动物益生菌产业中，缺乏专门针对某一种动物开发的益生菌产品。
技术实现要素：
本发明的目的之一是提供一种毕赤酵母菌菌株，其可以用于制备提高奶牛产奶量和牛乳品质的酵母益生菌制剂。
本发明的目的之二是提供一种由上述毕赤酵母菌菌种制得的提高奶牛产奶量和牛乳品质的酵母益生菌制剂及制备方法。
本发明的目的之三是上述酵母益生菌制剂的应用。
为此，本发明第一方面提供了一种毕赤酵母菌菌株，其为毕赤酵母菌dcrp株，保藏编号为：cgmccno.12209。
本发明第二方面提供了一种用于提高奶牛产奶量和牛乳品质的酵母益生菌制剂，其为本发明第一方面所述的毕赤酵母菌菌株作为发酵菌种进行发酵培养获得的毕赤酵母泥与脱脂乳粉、海藻糖、甘油和蔗糖混合后获得的酵母益生菌制剂前体混合物的冷冻干燥产物。
在本发明的一些实施例中，所述酵母益生菌制剂中毕赤酵母活菌数含量≥4.5×1010cfu/g。
在本发明的另一些实施例中，以质量份计，所述酵母益生菌制剂前体混合物的组成如下：
本发明第三方面提供了一种用于提高奶牛产奶量和牛乳品质的酵母益生菌制剂的制备方法，所述方法包括：
步骤b，将发酵菌种接种至发酵培养基中进行发酵培养获得毕赤酵母发酵液，经离心处理，获得毕赤酵母泥；
步骤c，将毕赤酵母泥与脱脂乳粉、海藻糖、甘油和蔗糖的混合后获得的酵母益生菌制剂前体混合物进行低温平衡后再进行预冻处理，获得预冻酵母益生菌制剂前体混合物；
步骤d，将预冻酵母益生菌制剂前体混合物冷冻干燥后获得酵母益生菌制剂；
其中，所述发酵菌种由相应的菌株经过种子培养获得；
所述发酵菌种的相应的菌株为与本发明第一方面所述的毕赤酵母菌菌株的16srdna的同源性至少为90％的菌株；
优选发酵菌种的相应的菌株为与本发明第一方面所述的毕赤酵母菌菌株的16srdna的同源性至少为95％的菌株；
进一步优选发酵菌种的相应的菌株为如本发明第一方面所述的毕赤酵母菌菌株。
在本发明的一些实施例中，以质量份计，所述酵母益生菌制剂前体混合物的组成如下：
根据本发明，步骤b中，所述发酵培养基以水作为溶剂，每1l水中的添加以下重量的组分：
在本发明的一些实施例中，所述发酵培养基的ph值为6.0-6.5。
根据本发明，在步骤b的在发酵培养过程中采用流加的方式补充碳源，并且补充碳源以补料培养基的方式加入。
在本发明的一些实施例中，所述补料培养基以水作为溶剂，每1l水中添加以下重量的组分：
根据本发明，在步骤b中，发酵菌种以种子培养液的方式加入，种子培养液的加入量以发酵培养基的总体积计为5v％-10v％。
在本发明的一些实施例中，种子培养液的ph值为6-6.5。
在本发明的一些实施例中，在步骤c中，低温平衡的温度为2-4℃，优选为4℃。
在本发明的一些实施例中，在步骤c中，低温平衡的时间为1-2h，优选为1h。
在本发明的一些实施例中，在步骤c中，预冻处理的-80℃至-60℃，优选为-80℃。
在本发明的一些实施例中，在步骤c中，预冻处理的时间为12-24h，优选为24h。
在本发明的一些实施例中，在步骤d中，冷冻干燥的温度≤-45℃，优选为-50℃至-45℃。
在本发明的一些实施例中，在步骤d中，冷冻干燥的时间≤2h。
本发明第四方面提供了一种如本发明第二方面所述的酵母益生菌制剂或如本发明第三方面所述的方法制备的酵母益生菌制剂在奶牛养殖中的应用，其中，所述酵母益生菌制剂的用量为每头奶牛每日饲喂5-10g。
本发明有益技术效果
本发明涉及一种奶牛源毕赤酵母菌菌株，其具有提高奶牛产奶量和牛乳品质的作用。本发明还涉及一种提高奶牛产奶量和牛乳品质的酵母益生菌制剂及其制备方法与应用，该酵母益生菌制剂是以毕赤酵母菌菌株作为发酵菌种进行发酵培养获得的毕赤酵母泥与脱脂乳粉、海藻糖、甘油和蔗糖混合后获得的酵母益生菌制剂前体混合物的冷冻干燥产物，其中的毕赤酵母活菌数含量≥4.5×1010cfu/g。将该酵母益生菌制剂用于饲喂奶牛，结果表明，该制剂具有促进奶牛泌乳量增加，调节奶牛瘤胃微生物结构，改善奶牛瘤胃发酵的作用，这为奶牛酵母益生菌在饲料加工中的应用奠定基础。
附图说明
图1为毕赤酵母在固体培养基平板上培养36h的生长图；
图2示出本发明的奶牛源毕赤酵母活菌制剂；
图3示出实施例2中毕赤酵母菌制剂对奶牛泌乳量的影响；
图4示出实施例2中毕赤酵母菌制剂对牛乳中体细胞数目的影响。
菌种保藏
毕赤酵母菌(pichiakudriavzevii)，由北京科技大学分离、鉴定，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(简称：cgmcc；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)进行保藏，保藏日期：2016年3月14日，保藏编号：cgmccno.12209。本发明中该菌株在被命名为毕赤酵母菌dcrp株(pichiakudriavzeviistraindcrp)。
具体实施方式
为使本发明容易理解，下面将详细说明本发明。
如前所述，当前动物益生菌产业中，缺乏专门针对某一种动物开发的益生菌产品。为开发专门针对奶牛的母益生菌产品，本发明人首先根据奶牛瘤胃微生物生理特性对高产奶牛的瘤胃液酵母菌进行初步筛选，结合生理指标和分子生物学技术确定筛选微生物的种属；本发明人经过不懈的研究探索，终于从高产奶牛瘤胃液中成功分离得到一株具有提高奶牛产奶量和牛乳品质作用的酵母属益生菌菌株，经分离鉴定为毕赤酵母菌dcrp株(pichiakudriavzeviistraindcrp)，检测结果表明，该菌株具有提高奶牛产奶量和牛乳品质的能力。进一步研究结果表明，以该毕赤酵母菌dcrp株为发酵菌种，经发酵、离心、清洗、添加保护剂、冷冻干燥等步骤可以制得奶牛源酵母菌制剂。经试验，该制剂对泌乳中期奶牛有促进泌乳量增加，调节奶牛瘤胃微生物结构，改善奶牛瘤胃发酵的作用。本发明正是基于上述发现作出的。
因此，本发明第一方面所涉及的毕赤酵母菌菌株为奶牛源奶牛源酵母益生菌，具有提高奶牛产奶量和牛乳品质作用，其采用以下固体筛选培养基进行筛选和培养获得，该固体筛选培养基的组成如下(1000ml去离子水中)：
本发明筛选用于提高奶牛产奶量和牛乳品质的毕赤酵母菌菌株的方法包括以下步骤：
(1)奶牛进食2h后无菌条件下抽取奶牛瘤胃液，置于无菌离心管中在冰浴条件下转移至实验室备用，在无菌条件下对奶牛瘤胃液分别进行梯度为100、10-1、10-2、10-3倍的稀释。
(2)将稀释后不同浓度的奶牛瘤胃液分别接种到固体培养基上，30℃倒置培养36h，通过菌落形态观察并结合普通显微镜镜检，挑取菌落进行多次划线分离，筛选得到一批酵母菌株，通过摇瓶培养获取纯培养物。
经真菌rdna-its序列测序并用blast工具与在线数据库比对，该酵母与毕赤酵母pichiakudriavzevii菌株同源性高达99％，确认该酵母为毕赤酵母。基于上述，该菌株被鉴定并命名为毕赤酵母菌dcrp株(pichiakudriavzeviistraindcrp)。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(简称：cgmcc)进行保藏，保藏编号：cgmccno.12209。
毕赤酵母菌dcrp株在固体培养基1平板上培养36h的生长图如图1所示。
所述毕赤酵母菌dcrp株的rdna-its序列如序列表中的sequenceno1所示，genebank登陆：ku291169(saccharomycescerevisiaestrainumy539internaltranscribedspacer1,partialsequence；5.8sribosomalrnagene,completesequence；andinternaltranscribedspacer2,partialsequence)。
本发明第二方面所涉及的用于提高奶牛产奶量和牛乳品质的酵母益生菌制剂为奶牛源奶牛源酵母益生菌制剂，是以本发明第一方面所述的毕赤酵母菌dcrp菌株作为发酵菌种进行发酵培养获得的毕赤酵母泥与脱脂乳粉、海藻糖、甘油和蔗糖混合后获得的酵母益生菌制剂前体混合物的冷冻干燥产物；优选酵母益生菌制剂中毕赤酵母活菌数含量≥4.5×1010cfu/g。
在本发明的一些具体实施例中，以质量份计，所述酵母益生菌制剂前体混合物的组成如下：
本发明第三方面所涉及的用于提高奶牛产奶量和牛乳品质的酵母益生菌制剂的制备方法，其包括：
步骤b，将发酵菌种接种至发酵培养基中进行发酵培养获得毕赤酵母发酵液，经离心处理，获得毕赤酵母泥；
步骤c，将毕赤酵母泥与脱脂乳粉、海藻糖、甘油和蔗糖的混合后获得的酵母益生菌制剂前体混合物进行低温平衡后再进行预冻处理，获得预冻酵母益生菌制剂前体混合物；
步骤d，将预冻酵母益生菌制剂前体混合物冷冻干燥后获得酵母益生菌制剂；
其中，所述发酵菌种由相应的菌株经过种子培养获得。
正如本领域技术人员所知，目前，国际上常使用16sribosomalrna(16srrna)来进行细菌的分子鉴定，因此在相似性的比较上可以用16srrna来进行比对而得到其同源性。所以本发明所使用的发酵菌株并不限定于本发明所使用的野外分离株，16srrna基因是细菌染色体上编码rrna相对应的dna序列，存在于所有细菌的染色体基因组中。
因此，本发明中，发酵菌种的相应的菌株为与本发明第一方面所述的毕赤酵母菌菌株(即毕赤酵母菌dcrp株)的16srdna的同源性至少为90％的菌株；优选发酵菌种的相应的菌株为与本发明第一方面所述的毕赤酵母菌菌株(即毕赤酵母菌dcrp株)的16srdna的同源性至少为95％的菌株；进一步优选发酵菌种的相应的菌株为如本发明第一方面所述的毕赤酵母菌菌株(即毕赤酵母菌dcrp株)。即在不改变毕赤酵母菌菌株(即毕赤酵母菌dcrp株)的16srdna的前提下，本领域技术人员可以通过简单的筛选或诱变本发明的毕赤酵母菌dcrp株，获得与本发明毕赤酵母菌dcrp株16srdna高度同源的菌株，并获得相应地具有相同或相似的提高奶牛产奶量和牛乳品质的功能的菌株。
根据本发明的一些实施方式，本发明所涉及的用于提高奶牛产奶量和牛乳品质的酵母益生菌制剂的制备方法还包括在步骤b之前种子培养的步骤a：将斜面毕赤酵母菌种接种至发酵培养基中，震荡培养，完成毕赤酵母菌的扩增，获得液体种子培养液(发酵菌种)。
在本发明的一些具体实施方式中，将斜面毕赤酵母菌种接种至发酵培养基中，ph6.0，培养温度35±0.5℃，以200rmp的转速振荡培养24-36h，获得液体种子培养液(发酵菌种)。
在本发明的一些实施例中，在所述种子培养液中，菌种的菌落形成单位(cfu)为(10-30)×108/ml。
根据本发明的一些实施方式，所述发酵培养为菌种游离的发酵培养，发酵菌种以种子培养液的形式接种到发酵培养基。例如，在步骤b中，发酵菌种以种子培养液的方式加入，种子培养液的加入量以发酵培养基的总体积计为5v％-10v％，优选为5v％。
在本发明的一些实施例中，所述种子培养液的ph值为6-6.5，优选ph值为6。
上述步骤b中，在4℃条件下，使用高速冷冻离心机以6000rpm的转速对毕赤酵母发酵液进行分离，离心处理10min后收集毕赤酵母泥。
根据本发明的一些实施方式，在上述制备方法中，所述发酵培养基以水作为溶剂，每1l水中的添加以下重量的组分：
为获得较高的毕赤酵母泥的产率，本发明人对发酵培养基进行了优化研究，结果表明发酵培养基按照以下组成配制有利于发酵培养，所述发酵培养基以水作为溶剂，每1l水中的添加以下重量的组分：
在本发明的一些实施例中，采用40％(wt/v)的氢氧化钠溶液和36％(v/v)盐酸溶液调整发酵培养基的初始ph值，所述发酵培养基的ph值为6.0-6.5；优选所述发酵培养基的ph值为6.0。
上述步骤b在发酵培养过程中采用流加的方式补充碳源，并且补充碳源以补料培养基的方式加入。
在本发明的一些实施方式中，所述补料培养基以水作为溶剂，每1l水中添加以下重量的组分：
根据本发明的一些实施方式，在步骤c中，向酵母益生菌制剂前体混合物中加入冻干保护剂，搅拌均匀，平衡后再进行预冻处理，获得预冻酵母益生菌制剂前体混合物。
在本发明的一些实施例中，所述冻干保护剂与菌泥质量比为1:5
在本发明的一些实施例中，所述冻干保护剂的配比如下：脱脂乳粉10g，海藻糖10g，丙三醇5g，蔗糖8g。
在本发明的一些实施例中，在步骤c中，低温平衡的温度为2-4℃，优选为4℃。
在本发明的一些实施例中，在步骤c中，低温平衡的时间为1-2h，优选为1h。
在本发明的一些实施例中，在步骤c中，预冻处理的-80℃至-60℃，优选为-80℃。
在本发明的一些实施例中，在步骤c中，预冻处理的时间为12-24h，优选为24h。
在本发明的一些具体实施例中，向含有67g酵母泥的酵母益生菌制剂前体混合物中添加33g冻干保护剂，搅拌均匀，平衡60min后放置在-80℃条件下预冻处理后，预冻酵母益生菌制剂前体混合物。
在本发明的一些实施例中，在步骤d中，冷冻干燥的温度≤-45℃，优选冷冻干燥的温度为-50℃至-45℃，优选冷冻干燥的温度为-50℃。
在本发明的一些实施例中，在步骤d中，冷冻干燥的时间≤2h。
在本发明的一些具体实施例中，将预冻酵母益生菌制剂前体混合物置于冷冻干燥机中，开启冷冻干燥机，等温度降至-50℃时进行冷冻干燥，24h后取出，获得酵母益生菌制剂。
在本发明的一些具体实施例中，制备用于提高奶牛产奶量和牛乳品质的酵母益生菌制剂，包括以下步骤：
(1)制备发酵培养基，用500ml三角瓶装入配制好的液体发酵培养基100ml，瓶口用通空气膜封口后在高温(121℃)高压(0.15mpa)下灭菌20min，然后在洁净工作台内紫外线照射灭菌20min后使用。
(2)种子培养，将斜面毕赤酵母菌种接种至发酵培养基中，ph6.0，培养温度30±0.5℃，振荡培养24-36h，获得液体种子培养液(发酵菌种)。
(3)发酵培养，将发酵菌种(种子培养液)将液体种子培养液按照5％(v/v)比例接种至发酵培养基中，ph6.0，培养温度30±0.5℃，培养30h后获得毕赤酵母发酵液。
上述步骤(3)的发酵过程中，采用流加方式补充碳源。
(4)分离制备毕赤酵母泥，在4℃条件下，使用高速冷冻离心机以6000rpm的转速对毕赤酵母发酵液进行分离，离心处理10min后收集毕赤酵母泥。
(5)制备预冻酵母益生菌制剂前体混合物，向毕赤酵母泥1000质量份中加入60质量份的脱脂乳粉、60质量份的海藻糖、30质量份的甘油以及50质量份的蔗糖，混合均匀后，在4℃条件下平衡1h后进行预冻处理，获得预冻酵母益生菌制剂前体混合物。
(6)冷冻干燥，采用冷冻干燥机将预冻酵母益生菌制剂前体混合物在不高于-45℃条件下进行冷冻干燥24h，获得酵母益生菌制剂。
本发明第四方面所涉及的酵母益生菌制剂在奶牛养殖中的应用可以理解为采用酵母益生菌制剂用于奶牛养殖的方法，其包括在奶牛饲料中添加本发明的酵母益生菌制剂，添加量为每头奶牛每日饲喂5g本发明的酵母益生菌制剂。
发明用于培养基或发酵培养过程中的“水”，在没有特别指定的情况下，是指经0.45μ滤膜过滤获得的去离子水。
本发明中，所述离心分离处理，是指将待分离物装入离心管中，在一定转速下进行离心分离，然后将上清液与沉淀物分离的过程。
本发明中所有培养基配制完成后，均在115℃高压灭菌30min后备用。
为使本发明更加容易理解，下面将结合附图和实施例来进一步详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件。
下列实施例中所使用海藻糖、脱脂乳粉、丙三醇和蔗糖均为市售食品级产品。
实施例1
(1)制备毕赤酵母泥
将斜面毕赤酵母菌种接种至液体培养基1中，ph6.0，培养温度30℃，振荡培养24h，获得液体种子培养液，将液体种子培养液按照5％(v/v)比例接种至30l发酵培养基中，转速0-6小时200rpm，6-12小时400rpm，12小时后600rpm，ph控制不低于6.0，曝气1l/l·min。采用流加方式补充碳源，培养30h后获得毕赤酵母发酵液，在4℃条件下6000rpm，离心10min，获得毕赤酵母泥。
所述流加方式补充碳源步骤如下：在发酵开始第12h，开始匀速流加补料液。补加体积为1.5l。
所述补料液培养基通过如下步骤制备：葡萄糖500g/l，酵母膏15g/l，磷酸二氢钾6g/l,无水硫酸镁5g/l。
(2)配制保护剂，冷冻干燥前处理
按照质量比为1:5(保护剂：菌泥)的比例加入保护剂，4℃条件下平衡1h，预冻，准备进行冷冻干燥。
所述保护剂每100g配比如下：脱脂乳粉30g，海藻糖30g，甘油15g，蔗糖25g。
(3)冷冻干燥
冷冻干燥机开机，预冷至-40℃，样品在-80℃预冻后放入冷阱中，打开真空泵抽真空，直到系统压力低于200mtorr,计时24h。
(4)活菌数检测
冷冻干燥完成后，将样品研磨成粉获得如图2所示的酵母益生菌制剂；采用稀释平板计数，所得的样品活菌数为4.5x1010cfu/g。
实施例2
选取3岁龄处于泌乳中期的荷斯坦奶牛，随机分为2个处理组，每个处理组9头奶牛，饲喂周期为28天。对照组饲喂添加冻干保护剂的饲料，试验组饲喂添加毕赤酵母益生菌制剂的饲料，毕赤酵母益生菌制剂量为5g/天·头，统计试验第0、7、14、21和28天奶牛产奶量和奶中体细胞数目，结果显示，整个试验周期中，对照组奶牛产奶量和体细胞数目基本平稳，约为23kg/天·头和4.5×104个/ml，而饲喂添加毕赤酵母益生菌制剂的试验组，从第7天开始奶牛产奶量明显增加且奶中体细胞数目显著下降，在28天时产奶量约为33kg/天·头。
考察上述毕赤酵母菌制剂对奶牛泌乳量的影响，结果如图3所示。从图3可以看出，与对照相比提高约50％。
考察上述毕赤酵母菌制剂对牛乳中体细胞数目的影响，结果如图4所示。从图4可以看出，牛乳中体细胞数目8×103个/ml，与对照相比降低约80％。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
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<110>北京科技大学
<120>提高奶牛产奶量和牛乳品质的酵母益生菌制剂及制备方法
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<213>毕赤酵母菌dcrp株的rdna-its序列
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