本发明属于兽用生物制品领域，尤其是一种鸡球虫卵囊保护溶液及其制备方法。
背景技术：
由于环保及食品安全问题，农业部规定饲料里面禁止添加抗生素及抗寄生虫药物，逐步实现无抗饲料，近年来在球虫病的预防治疗上减少药物的使用，特别是磺胺类药物的使用，逐步向使用球虫疫苗方向发展，目前国内外球虫疫苗的保护液基本上是用重铬酸钾溶液、盐酸聚六亚基胍溶液、氯胺t和氯胺b溶液、蔗糖溶液等作为孢子化培养及保护液，但是孢子化率都不高，并且长时间储存会导致安全性和效力检测不符合要求。重铬酸钾溶液是一种金属化合物，长期使用会残留于动物机体和环境中，影响人类和动物健康，因此寻求一种绿色、环保、安全、长效的鸡球虫卵囊保护液是今后寄生虫疫苗的研发工作重点。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种鸡球虫卵囊保护溶液及其制备方法，本发明配方组成科学合理，工艺简单，使用方便，成本较低，本发明保护溶液利用醋酸洗必泰等成分作为鸡球虫卵囊的保护液可以有效提高鸡球虫卵囊的孢子化率。且鸡柔嫩、堆型、巨型和毒害艾美尔球虫卵囊保存至六个月内，活力不受任何影响，八个月安全检验及效力检验均符合要求。
本发明的另一个目的在于提供一种鸡球虫卵囊保护溶液及其制备方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种鸡球虫卵囊保护溶液及其制备方法，其保护溶液的组分及其重量份数比为：
而且，该保护溶液组分及其最优重量份数比分别为：
一种鸡球虫卵囊保护溶液及其制备方法，其制备方法的步骤为：
(1)按照重量配比依次称取醋酸洗必泰、苯甲酸钠、氯化钠、β-甘露聚糖放入配液罐内，然后加入灭菌水至没过上述投料，在室温下浸泡3小时后，再继续加入剩余灭菌水，搅拌均匀，至投料完全溶解，再用0.45um聚醚砜滤芯过滤得溶液a，储存至配液罐中；
(2)将配液罐加热以蒸汽压力0.09mpa为宜，蒸发器15分钟排放冷凝水一次，每两小时排放加热器的冷凝汽一次,室内自然冷却，备用，得溶液b备用；
(3)向步骤(2)中所得溶液b中加入0.03％硫柳汞钠后，用0.22um聚醚砜滤芯过滤，并调节溶液ph值至5.5-6.5，搅拌15分钟，再次用0.22um聚醚砜滤芯过滤，得溶液c，其通过管道直接进入灌装机；
(4)将步骤(3)中所得溶液c灌装到烘干后的医用瓶内，即可得到一种鸡球虫卵囊保护溶液。
本发明的优点及有益效果是：
1.本发明配方组成科学合理，工艺简单，使用方便，成本较低，能够有效提高球虫卵囊孢子化率，提高孢子化卵囊的活力，降低成本，增加疫苗的生产量。
2.本发明保护溶液利用醋酸洗必泰等成分作为鸡球虫卵囊的保护液可以有效提高鸡球虫卵囊的孢子化率，且鸡柔嫩、堆型、巨型和毒害艾美尔球虫卵囊保存至六个月内，活力不受任何影响，八个月安全检验及效力检验均符合要求。
3.本发明通过β-甘露聚糖维持卵囊壁的完整性减少卵囊在振荡器中破裂。
具体实施方式
本发明通过以下实施例进一步详述。需要说明的是：下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明组分中的醋酸洗必泰、苯甲酸钠钠、氯化钠、β-甘露聚糖均可以在市场上购买得到。
实施例1
一种鸡球虫卵囊保护溶液，其保护溶液的组分及其重量分别为：醋酸洗必泰10kg、苯甲酸钠钠40kg、氯化钠10kg、β-甘露聚糖30kg、灭菌水80kg。
一种鸡球虫卵囊保护溶液及其制备方法，其制备方法的步骤为：
(1)按照重量配比依次称取醋酸洗必泰、苯甲酸钠、氯化钠、β-甘露聚糖放入配液罐内，然后加入灭菌水至没过上述投料，在室温下浸泡3小时后，再继续加入剩余灭菌水，搅拌均匀，至投料完全溶解，再用0.45um聚醚砜滤 芯过滤得溶液a，储存至配液罐中；
(2)将配液罐加热以蒸汽压力0.09mpa为宜，蒸发器15分钟排放冷凝水一次，每两小时排放加热器的冷凝汽一次,室内自然冷却，备用，得溶液b备用；
(3)向步骤(2)中所得溶液b中加入0.03％硫柳汞钠后，用0.22um聚醚砜滤芯过滤，并调节溶液ph值至5.5-6.5，搅拌15分钟，再次用0.22um聚醚砜滤芯过滤，得溶液c，其通过管道直接进入灌装机；
(4)将步骤(3)中所得溶液c灌装到烘干后的医用瓶内，即可得到一种鸡球虫卵囊保护溶液。
实施例2
一种鸡球虫卵囊保护溶液，其保护溶液的组分及其重量分别为：醋酸洗必泰5kg、苯甲酸钠钠10kg、氯化钠5kg、β-甘露聚糖10kg、灭菌水10kg。
其制备方法的步骤同实施例1。
实施例3
一种鸡球虫卵囊保护溶液，其保护溶液的组分及其重量分别为：醋酸洗必泰8kg、苯甲酸钠钠8kg、氯化钠6kg、β-甘露聚糖20kg、灭菌水60kg。
其制备方法的步骤同实施例1。
临床应用
试验说明：
每组所用疫苗保护溶液为本发明溶液，保存不同时间段对鸡免疫接种并做攻毒试验，如果攻毒后病变记分符合打分标准，则说明本发明保护溶液对卵囊保护从安全检查、效力检查是符合要求的；每组用5日龄的spf鸡20只，其中10只经口接种1羽份球虫疫苗，另10只不接种作为对照。将两组鸡分别在相同条件下隔离饲养。接种后的第8天每只鸡口服柔嫩艾美尔球虫10万个，观察6日，剖检所有鸡，检查每只鸡的球虫适宜寄生部位的病变记分。对照组至少9只鸡的十二指肠、小肠中断、盲肠病变记分均应≥+3.0分；所有免疫鸡的十二指肠、小肠中断、盲肠病变记分均应≤+2.0分，其中至少8只鸡的十二指肠、小肠中段、盲肠病变记分均应≤+1.0分。
表1保护溶液对柔嫩艾美尔球虫免疫攻毒试验数据
附注
1病变记分标准
1.1柔嫩艾美耳球虫引起的病变感染后第6日剖检盲肠(两侧盲肠病变不一致时，以严重一侧为准)。
0分无肉眼可见病变。
+1分盲肠内容物正常，肠壁黏膜面可见少量散在出血点或出血斑。
+2分盲肠内容物带血，肠壁黏膜面出血点或出血斑数量较为密集，肠壁增厚。
+3分盲肠轻度肿大，肠腔内没有正常的盲肠粪便，肠道黏膜增厚，盲肠腔内充满暗红色血液或出现盲肠芯(呈灰白色干酪样香蕉型块状物)。
+4分盲肠高度肿大，盲肠腔内没有盲肠粪便或已被包在肠芯中，肠腔内充满坏死凝血块和盲肠黏膜碎片。因本球虫致死的鸡记为+4分。
每组用5日龄的spf鸡20只，其中10只经口接种1羽份球虫疫苗，另10只不接种作为对照。将两组鸡分别在相同条件下隔离饲养。接种后的第8天每只鸡口服毒害艾美尔球虫10万个，观察6日，剖检所有鸡，检查每只鸡的球虫适宜寄生部位的病变记分。对照组至少9只鸡的十二指肠、小肠中断、盲肠病变记分均应≥+3.0分；所有免疫鸡的十二指肠、小肠中断、盲肠病变记分均应≤+2.0分，其中至少8只鸡的十二指肠、小肠中段、盲肠病变记分均应≤+1.0分。
表2保护溶液对毒害艾美尔球虫免疫攻毒试验数据
附注：
毒害艾美耳球虫引起的病变感染后第5～7日之间剖检小肠。
0分无肉眼可见病变。
+1分小肠中段浆膜面可见针尖状大小散在的出血点和白点，肠腔内可见少量橘红色内容物，肠壁略增厚。
+2分肠壁增厚，浆膜面有大量的出血点和白点，小肠中段出现轻度胀气，肠腔局部混有凝血块。
+3分浆膜面布满红色出血点和白点，肠腔鼓气扩张，肠壁明显增厚，整个肠内容物中含有多量的血凝块和坏死脱落的上皮组织，肠黏膜面粗糙，没有正常的肠内容物。
+4分小肠中段高度肿胀，肠段出现萎缩、明显缩短，病变延伸至十二指肠和小肠后段，小肠内容物中含有酱油色或棕色粘液，肠道黏膜出血，坏死。因本球虫致死的鸡记为+4分。
每组用5日龄的spf鸡20只，其中10只经口接种1羽份球虫疫苗，另10只不接种作为对照。将两组鸡分别在相同条件下隔离饲养。接种后的第8天每只鸡口服巨型艾美尔球虫10万个，观察6日，剖检所有鸡，检查每只鸡的球虫适宜寄生部位的病变记分。对照组至少9只鸡的十二指肠、小肠中断、盲肠病变记分均应≥+3.0分；所有免疫鸡的十二指肠、小肠中断、盲肠病变记分均应≤+2.0分，其中至少8只鸡的十二指肠、小肠中段、盲肠病变记分均应≤+1.0分。
表3保护溶液对巨型艾美尔球虫免疫攻毒试验数据
附注：巨型艾美耳球虫引起的病变感染后第5～7日之间剖检肠。
0分无肉眼可见病变。
+1分小肠中段黏膜面可见较小的出血点，肠腔中有少量桔黄色粘液。
+2分小肠中段出现轻度胀气，浆膜面可见许多出血点，延伸至十二指肠，肠腔内可见大量的桔黄色粘液。
+3分肠管扩张，没有正常的肠内容物，肠内容物混有血凝块和桔黄色粘液，肠壁变薄，黏膜面粗糙。
+4分肠管肿胀，肠内容物粘稠，呈红棕色，并混有大量血凝块，呈淡洗肉水色，肠黏膜充血、出血、脱落。因本球虫致死的鸡记为+4分。
结论：通过上述三组试验1-10个月保存时间段、每个组的保护率、免疫力、增重率、剖检病变、安全检查、效力检测都实验组完全高于空白对照组，充分说明以本发明保护液为基础的球虫疫苗完全可以替代其他重铬酸钾溶液、盐酸聚六亚基胍溶液、氯胺t溶液等。