本发明涉及中药材分子鉴定的
技术领域：
，具体地说是一种黄芪药材分子鉴定方法和试剂盒。
背景技术：
：黄芪是多年生草本植物，豆科，黄芪属，入药部位为黄芪的根部。黄芪主要分布在内蒙古，陕西，山西，甘肃，宁夏，东北，黑龙江，新疆等地。近年来，由于大量采挖，野生黄芪数量急剧减少，因此定为渐危物种，属国家三级保护植物。主要栽培品种是蒙古黄芪和荚膜黄芪。主产区为内蒙古，山西。黄芪的药用迄今已有2000多年的历史，在中医上认为其有补气升阳，固表止汗，利水消肿，生津养血，行滞通痹，托毒排脓，敛创生肌之效。近年研究表明，黄芪有增强机体免疫功能，降压，利尿消肿，保护心肌，抗压等功效。目前市场上黄芪出现伪劣品、混淆品的原因很多，有的是商贩有意伪造或掺伪牟利，有的是以地方习用药材充药典正品药材，或是有的地区用药材名称与正品药材相近而造成误用，有点以相对廉价的他种药材冒充贵重药材，有的药材因其形状相似而造成误用。因此对于黄芪中药材品种的鉴别有着重要意义。现有的中药材品种鉴别技术包括：1)传统经验法，该方法利用感觉器官来观察中药的形状、大小、色泽、质地、断面以及气味等特征来确定中药品种；2)显微鉴别法，该方法利用显微镜来观察中药粉末所具有的器官构造，阻止构造碎片及细胞形状来鉴别真伪；3)一般理化鉴别法，该方法包括荧光法、显色法、沉淀法、升华法、结晶法等。现代方法包括：色谱鉴别，使用薄层色谱，气相色谱，高效液相色谱等方法来确定中药材的成分。光谱法是利用中药光谱学行为的不同进行鉴定。目前已有的检测方法检测过程复杂，对检测人员的技术要求高，如检测人员缺乏丰富的dna测序知识和经验很容易导致检测失败，而且测序法所用仪器设备昂贵，广泛应用推广困难。随着中药材的推广以及黄芪的广泛应用，一般鉴别方法以不能满足对黄芪品种鉴别的需求，因此，发明一种黄芪药材分子鉴定方法和试剂盒已成了急需解决的技术问题。技术实现要素：本发明的目的则是克服了现有技术的不足，提供一种黄芪药材分子鉴定方法和试剂盒，通过选用一个或少数几个基因片段即可对黄芪药材分子进行准确鉴定，鉴定过程更加快速，在短时间内可以鉴定大量样本，重复性和稳定性高，实验过程标准、操作简便、更易实现药材分子鉴别的自动化，可以有效缓解分类鉴定人才缺乏的现状，此外还可以通过互联网和信息平台对数据统一管理，从而实现数据信息的共享。为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：一种黄芪药材分子鉴定试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括包装盒体(1)、衬垫(2)、多个装有检测荧光定量pcr反应混合液的试管(3)、一个装有阳性对照品的试管(4)、一个装有阴性对照品的试管(5)、96反应孔检测引物探针板封垫(6)和96反应孔基因检测引物探针板(7),所述衬垫位于所述包装盒体中，多个所述反应混合液的试管位于所述衬垫的一侧，所述装有阳性对照品的试管和所述装有阴性对照品的试管位于所述衬垫的另一侧，所述引物探针板封垫位于所述引物探针板上方。进一步的，所述96反应孔基因检测引物探针板的引物探针的一端连接有第一荧光发射基团，另一端连接有荧光淬灭基团。进一步的，所述荧光定量pcr反应混合液的成分包括：pcr缓冲液、mgcl2、dntps。进一步的，所述96反应孔基因检测引物探针板包括：引物位点检测用上游引物、引物位点检测用下游引物、引物位点基因型一荧光探针、引物位点基因型二荧光探针、taqdna聚合酶，其中，引物探针的比例为1：20。进一步的，所述荧光发射基团自选fam。进一步的，所述96反应孔中总体积10μl，其中包括8μlpcr反应混合液，2μl检测样品，该检测样品包括基因组dna、阳性对照品或阴性对照品。进一步的，所述引物的序列为：一种黄芪药材分子鉴定方法，其特征在于：在每次检测前均设立阳性对照品和阴性对照品；在荧光定量pcr仪上进行扩增检测，分别在96反应孔检测引物探针板进行引物位点检测，每一个引物位点检测使用1个反应孔，一组共计4个反应孔；加入被检测样品和荧光定量pcr反应混合液，再分别加入阳性对照品和阴性对照品进行质控；在预设的反应条件下进行反应，待反应完成后，在荧光定量pcr仪上进行终点荧光读取，根据得到的二维荧光图和实时扩增曲线读取被检测样品的检测位点基因型。进一步的，所述引物探针板的探针的一端连接有第一荧光发射基团，另一端连接有荧光淬灭基团。进一步的，所述荧光发射基团自选fam。进一步的，所述荧光定量pcr反应混合液的成分包括：pcr缓冲液、mgcl2、dntps。进一步的，每个反应孔中总体积10μl，其中包括8μlpcr反应混合液，2μl检测样品，所述检测样品包括基因组dna、阳性对照品或阴性对照品。进一步的，所述反应条件为，在50℃环境下反应2分钟，在95℃环境下反应10分钟，再在95℃环境下反应30秒、在60℃环境下反应1分钟，并将这两次反应循环60次。进一步的，所述引物的序列为：本检测方法和试剂盒主要用于检测黄芪dna特异性位点，从而判断黄芪中药材的产地及道地性，进而推进中药材市场标准化。与现有技术相比，本发明的有益效果是：该试剂盒运用荧光定量pcr技术,实现了同时对十个黄芪dna位点基因型进行检测的目的，相对于现有的荧光定量pcr试剂盒只能检测单个引物位点，本发明的试剂盒将针对同一黄芪dna的十个基因位点检测整合到了一个试剂盒中，使用更方便且成本更低。附图说明通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：附图1示出了该试剂盒的结构示意图；附图2示出了被检测样品的二维荧光图；附图3示出了所有位点实时扩增曲线图。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细描述：图1示出了该试剂盒的结构示意图。所述试剂盒包括包装盒体(1)、衬垫(2)、多个装有检测荧光定量pcr反应混合液的试管(3)、一个装有阳性对照品的试管(4)、一个装有阴性对照品的试管(5)、96反应孔检测引物探针板封垫(6)和96反应孔基因检测引物探针板(7)。所述探针板的探针的一端连接有第一荧光发射基团，另一端连接有荧光淬灭基团。所述引物探针板包括：引物位点检测用上游引物、引物位点检测用下游引物、引物位点基因型一荧光探针、引物位点基因型二荧光探针、taqdna聚合酶。其中荧光定量pcr反应液的成分包含：pcr缓冲液、mgcl2、dntps，是为使用taqman、mgb探针等序列特异性荧光标记探针检测体系的realtimepcr而研制的2×浓度的预混液。该试剂将除样本dna&cdna、探针及primers外的其他pcr成分预先混合，使反应液配制更简便化，同时添加特殊的增强剂能将样品间的荧光强度散乱控制在最小范围内，从而使得实验结果的可重复性大大提高。dna聚合酶采用了genecoretaqgoldhsdnapolymaras，能灵敏检测较低拷贝目的基因的表达水平并有效降低引物二聚体和非特异性扩增。所述反应孔中总体积10μl，其中包括8μlpcr反应混合液，2μl检测样品，该检测样品包括基因组dna、阳性对照品或阴性对照品。本鉴定方法基本原理是taqman荧光技术，即以taqman荧光探针为基础。实施例11.材料：植物总dna提取试剂盒购于天根公司，taqdna聚合酶、dntps等pcr相关试剂购于美国promega公司，7900型荧光定量pcr仪为美国abi公司生产的产品。2.引物及探针：根据黄芪品种特定的dna序列来设计taqman荧光检测的引物和探针。引物序列如下：forwardprimer1(5'-3')reverseprimer1(5'-3')ccaacaccacctcaaatgcagggaagattcttgcatccttgaccccactcctgttaagcacaacctaaggaaggttacctgctaatcccgcataatactgataaatctcagagccgttttgctgcttagaatcccatgttgtataaacttgtacgaacgatttggtccgaactggtccattgaagacagccgcaaggcatcatcgatggcttggttccctaccgcgatcttcttgcctgaagtgtaggaacctgttgcaccagcacgaaaactccaggagggtcgatccatgtctcgtcccctttgaaggtgactcccaagggacttgcactccaatattcaccctacataacacatcacattgtctacctgattcttcaactgcaggtcctgctatcccttccaatgtagatgcgcctcttatcagcttgt本发明检测的样本获自植物黄芪的根部组织。从药材组织中提取出基因组dna，作为模板，与前述设计的引物和探针组合相混合，进行荧光pcf反应，通过检测pcr反应体系中形成的荧光情况来判断所测药材组织样品的dna是否发生荧光反应，是则为黄芪药材，否则为非黄芪以此来判断黄芪真伪；探针为独立研发特异性探针，已经通过数据库比对只为黄芪药材特有dna序列，不在任何其他植物中共有，且在不同种植地黄芪都共有该探针。3.样本检测：选取50例黄芪样本，其中已确定检测效低的为12例。样本用植物总dna提取试剂盒提取总dna。每一例检测为4个反应孔，每管中总体积10μl，其中8μpcr反应液，加入2μl被检测dna，另外2个反应孔中加入2μl阳性对照和阴性对照，在abi7900荧光定量pcr仪上进行扩增。所述反应条件为，在50℃环境下反应2分钟，在95℃环境下反应10分钟，再在95℃环境下反应30秒、在60℃环境下反应1分钟，并将这两次反应循环60次。预设的反应条件下进行反应，待反应完成后，在荧光定量pcr仪上进行终点荧光读取，根据得到的二维荧光图和实时扩增曲线读取被检测样品的检测位点基因型。4.结果：被检测样本的特异性位点检测位点被检测样品的二维荧光图参见图2,所有位点实时扩增曲线参见图3。实施例2:1.待检测基因位点确定根据有关的研究报道黄芪基因组及本人研究关于黄芪基因组研究明确了黄芪dna与其他药材植物之间的dna区别，并根据黄芪特有dna的区别，本发明人将代表黄芪dna的基因片段作为目标位点，确定了本发明的检测目标。2.检测方法设计及引物和探针的合成针对选定的(10)个检测位点，运用引物设计软件(primer5.0)，设计出(10)对引物及taqman探针。所有的引物及探针由takara公司合成。引物序列如下：3.待检测基因位点各基因标准品的构建和制备以道地黄芪药材dna序列为模板，针对各个特异性基因位点分别设计一对能扩增外显子区域的外侧引物和一对待测引物，运用pcr扩增。4.基因型标准品的测试与验证5.待测样本的测试(1)取待测黄芪根部组织样本，提取从待测黄芪根部组织样本中提取的基因组dna。(2)按照如下反应条件进行pcr反应：反应条件为，在50℃环境下反应2分钟，在95℃环境下反应10分钟，再在95℃环境下反应30秒、在60℃环境下反应1分钟，并将这两次反应循环60次。预设的反应条件下进行反应，待反应完成后，在荧光定量pcr仪上进行终点荧光读取，根据得到的二维荧光图和实时扩增曲线读取被检测样品的检测位点基因型。(3)在pcrdna序列检测仪中读取荧光信号，并判读基因型。因此可见，采用本发明的方法非常便捷快速，从而更加符合样本检测实效性便捷性的要求。本发明采用常规用于基因定量及核酸多态性检测的taqman方法，设计了一套taqman引物和探针，并构建待测基因位点各种基因型的对照，建立荧光定量pcr方法，在荧光定量pcr仪上快速准确检测出与黄芪品种相关的特定位点的基因型。该方法经过100例验证，其检测结果与其他方法所得结果完全一致，准确率超过99％。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。当前第1页12