一种黄芪药材的检测方法
【专利摘要】本发明属于中药材质量检测领域，具体涉及一种黄芪药材的质量检测方法。该方法包括对黄芪所含的黄芪甲苷、毛蕊异黄酮含量的测定以及对黄芪药材农药残留量的测定。本发明解决了传统理化特性的鉴别方法的操作复杂和局限性以及质量难以调控的技术问题，以提供了一种准确度高，操作简便快速，成本低廉的检测方法，具有良好的应用前景和经济效益。
【专利说明】一种黄芪药材的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于中药材质量检测领域，具体涉及一种黄芪药材的质量检测方法。
【背景技术】
[0002]黄芪，含有种化学成分，有蔗糖、葡萄糖醛酸、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、黄芪皂苷I1、黄芪皂苷II1、黄芪多糖A、B、C、D，黏液质，多种氨基酸、苦味素、黄芪皂苷、胆碱、叶酸、黄烷化合物及含有硒、硅、锌、钴、铜、钥等多种微量元素。用于补气固表，利尿托毒，排脓，敛疮生肌。黄芪药材在我国已上市多年，临床效果得以广泛肯定。其中的主要成分黄芪甲苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、黄芪皂苷I1、黄芪皂苷III为黄芪的有效成分，现代研究表明其具有广泛的生理活性作用，这些成分的含量与黄芪的解热抗炎功效密切相关，因此所含上述成分的的多少常作为黄芪药材质量控制的重要指标。
[0003]近几年黄芪的市场需求量持续增加，野生资源逐年减少，人工栽培发展缓慢，使得黄芪资源蕴藏量和产量都在大幅下降。导致市场上出现了很多伪品，其中不少伪品的农药残留量超标爆表，给黄芪药材的质量、用药的安全性及有效性带来了很大的冲击，已成为制约黄芪系列药材开发的瓶颈。
[0004]目前，正品黄芪的有效检测方法是传统的形态特征和理化特性的鉴别方法，具有一定的局限性，不足以从整体上控制黄芪的质量，作为一味临床常用中药，其真伪优劣受其理化指标、农药残留量多等诸多因素的影响，因此有必要建立一种科学的质量检测方法对黄芪的质量进行评价。
【发明内容】
[0005]为此，本发明所要解决的技术问题在于现有技术中黄芪药材检测方法复杂，质量难以调控的问题，进而提供一种准确度高，简单、快速的检测黄芪药材的方法。
[0006]为解决上述技术问题，本发明是通过如下技术方案实现的:
[0007]本发明提供了一种黄芪药材的检测方法，包括如下有效成分含量的测定步骤以及农药残留量的测定步骤，其中，
[0008]A:黄芪甲苷含量的测定包括如下步骤:
[0009](I)精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每Iml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；
[0010](2)精密称定待测黄芪药材粉末4g，置索氏提取器中，加甲醇40ml，冷浸，再加甲醇适量，加热回流4小时，提取液回收溶剂并浓缩至干，残渣加水10ml，微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40ml，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40ml，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水5ml使溶解，放冷，通过DlOl型大孔吸附树脂柱吸附，以水50ml洗脱，弃去水液，再用40%乙醇30ml洗脱，弃去洗脱液，继用70%乙醇80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
[0011](3)按照高效液相色谱法试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为32:68的乙腈-水为流动相；蒸发光散射检测器进行检测；
[0012]分别精密吸取对照品溶液10μ 1、20μ 1，供试品溶液20 μ I，注入液相色谱仪，测定，以外标两点法对数方程计算；其中，理论板数以黄芪甲苷峰计算应不低于4000 ；
[0013]B毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的测定包括如下步骤:
[0014](I)取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每Iml含50μ g的溶液，作为对照品溶液；
[0015](2)精密称定待测黄芪药材粉末lg，精密加入甲醇50ml，称定重量，加热回流4小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解并定容至5ml，作为供试品溶液；
[0016](3)按照高效液相色谱法试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动性A，以0.2%甲酸溶液为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱:从0-20min，流动相A:流动相B的体积比由20%:80%- 40%:60% ;从20_30min，流动相A:流动相B的体积比为40%:60% ;控制检测波长为260nm ；
[0017]分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μ 1，注人液相色谱仪，测定；理论板数按毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰计算应不低于3000 ；
[0018]C:所述农药残留量的测定包括如下步骤:
[0019](I)精密称取三苯基磷酸酯适量，加丙酮制成每Iml含100 μ g三苯基磷酸酯的溶液，作为内标贮备液；
[0020]分别精密量取各农药对照品贮备溶液Iml及所述内标贮备液1ml，加丙酮定容至100ml，作为混合对照品贮备溶液；分别精密量取适量，加乙腈定容制成20-1000ng/ml的不同浓度的溶液，作为混合对照品溶液；
[0021]另取核糖酸内酯适量，加乙腈溶解制成每Iml含20mg核糖酸内酯的溶液，另取山梨醇适量，加水溶解制成每Iml含山梨醇1mg的溶液；分别精密量取上述核糖酸内酯、山梨醇溶液各Iml混勻,加乙腈定容至1ml,作为分析保护剂；
[0022](2)精密称取待测药材细粉10g，并加入氯化钠Ig混匀，精密加入丙酮100ml，冰浴超声处理30分钟，离心，将上清液迅速移入装有Ig无水硫酸钠的具塞锥形瓶中，放置30分钟；随后精密量取上述溶液60ml减压浓缩至近干，并加入体积比为1:1的环已烷-乙酸乙酯溶液溶解样品并定容至10ml，过滤后取滤液经GPC凝胶渗透色谱净化，以体积比为1:1的环已烷-乙酸乙酯溶液为流动相洗脱，收集洗脱液，移入KD瓶中，减压浓缩至近干；
[0023]向上述样品中加入体积比为1:1的乙酸乙酯-丙酮混合溶液5ml溶解，并转移至石墨碳-氨基混合固相萃取小柱上，以体积比为1:1的乙酸乙酯-丙酮混合溶液15ml洗脱，收集洗脱液，氮吹至近干，随后加入所述内标贮备液5μ 1，加乙腈定容至1ml，作为供试品溶液；
[0024](3)精密量取上述各浓度混合对照品溶液及供试品溶液各400 μ L，并分别加入所述分析保护剂100 μ L混匀，随后分别精密吸取I μ L，进行气相色谱-质谱联用仪测定；其中，
[0025]所述气相色谱分析条件为:取规格为30mX0.25mmX0.25um的弹性石英毛细管柱DB 17ms,以高纯氦气为载气，柱流速1.3ml/分钟，进样量I μ I，采用高压不分流进样，设置进样口温度为230°C，升温程序具体为:初始温度60°C，以30°C /分钟升至120°C、以10°C /分钟升至200°C、以2°C /分钟升至230°C、以30°C /分钟升至300°C，并保持7分钟；
[0026]所述EI源质谱测定的条件为:设置电子能量70eV，离子源温度230°C，接口温度250。。。
[0027]其中，所述农药残留量的测定中，所述GPC凝胶渗透色谱净化步骤的条件具体为:填料为B1-Beads S-X3 200-400目，净化柱为2.5mmX40cm,具体洗脱参数为净化去杂900s，目标物收集1200s，柱子清洗300s。
[0028]进一步的，所述农药残留量的测定中，所述农药对照品包括敌敌畏、甲胺磷、乙酰甲胺磷、四氯硝基苯、六氯苯、α-六六六、β-六六六、Y-六六六、δ-六六六、氧化乐果、二嗪磷、五氯硝基苯、久效磷、地虫硫磷、磷胺1、乐果、七氯、五氯苯胺、百菌清、甲基毒死蜱、艾氏剂、克菌丹、磷胺I1、甲基对硫磷、甲基嘧啶磷、甲基五氯苯基硫醚、甲霜灵、三唑酮、毒死蜱、马拉硫磷、杀螟硫磷、对硫磷、二甲戊灵、顺式环氧七氯、反式环氧七氯、三唑醇Α、三唑醇B、反式氯丹、顺式硫丹、顺式氯丹、反式硫丹、pp’ -DDE、PP’ -DDD、OP’ -DDT、PP’ -DDT、狄氏齐U、杀扑磷、异狄氏剂、乙硫磷、三苯基磷酸酯、联苯菊酯、硫丹硫酸酯、异菌脲、甲氰菊酯、三氯杀螨醇、氯氟氰菊酯、甲氧DDT、三氯杀螨砜、伏杀硫磷、氯菊酯1、氯菊酯2、氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯。
[0029]所述黄芪甲苷、毛蕊异黄酮含量的测定中，所述待测药材的粒径为180-2000 μ m。
[0030]所述黄芪甲苷含量的测定步骤中，所述DlOl型大孔吸附树脂柱的内径为1.5cm,长 12cm。
[0031]所述农药残留量的测定中，所述待测药材的粒径为180-2000 μ m。
[0032]本发明所述方法通过对黄芪药材所含的黄芪甲苷含量的测定以及对黄芪药材农药残留量的检测，进行黄芪药材真伪优劣的判定标准。并通过高效液相色谱法测定黄芪甲苷含量，所述方法不仅准确且简单易行。本发明所述方法通过气相色谱-质谱联用的方式检测药材的残留农药量，不仅检测的准确度高，方法简单、快速，而且通过对检测条件的特定筛选，可一次性将黄芪药材中常见的农药种类进行一次性的有效检测，所述方法准确率及实用效果均较好。
【专利附图】
【附图说明】
[0033]为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实验例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中:
[0034]图1是本发明实施例3中农药标准品的全扫描气相色谱图；
[0035]图2是本发明实施例3中农药标准品的0-10分钟扫描气相色谱图；
[0036]图3是本发明实施例3中农药标准品的10-20分钟扫描气相色谱图；
[0037]图4是本发明实施例3中农药标准品的20-40分钟扫描气相色谱图。
【具体实施方式】
[0038]实施例1黄芪甲苷含量的测定
[0039]1.仪器与试药
[0040]1.1仪器岛津LC-20AT型高效液相色谱仪，岛津STO-MlOA VP型二极管阵列检测器，梅特勒AL-204型电子天平，DlOl型大孔吸附树脂柱，索氏提取器。
[0041]1.2试剂黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷标准品，购自中国食品药品鉴定所，乙腈，甲醇(色谱级)；甲酸，氨试液，正丁醇，纯化水，为分析纯试剂。
[0042]1.3药材样品收集了甘肃各地黄芪样品，供试药材产地批次分别选自:甘肃陇西县2批次，分别标注为1-2、甘肃陇西首阳董家堡、甘肃陇西首阳菜子坪、甘肃渭源会川、甘肃临洮、甘肃渭源2批次，分别标注为1-2、渭源莲峰绽坡村3批次，分别标注为1-3、甘肃商品O
[0043]2.方法
[0044]色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(32:68)为流动相；蒸发光散射检测器。理论板数以黄芪甲苷峰计算应不低于4000。
[0045]对照品溶液的制备精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每Iml含0.5mg的溶液，即得。
[0046]供试品溶液的制备取本品中粉约4g，精密称定，置索氏提取器中，加甲醇40ml，冷浸过夜，再加甲醇适量，加热回流4小时，提取液回收溶剂并浓缩至干，残渣加水1ml，微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40ml，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40ml，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水5ml使溶解，放冷，通过DlOl型大孔吸附树脂柱(内径1.5cm,长12cm)，以水50ml洗脱，弃去水液，再用40%乙醇30ml洗脱，弃去洗脱液，继用70%乙醇80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
[0047]测定法精密吸取对照品溶液10 μ 1>20μ 1，供试品溶液20 μ 1，注入液相色谱仪，测定，以外标两点法对数方程计算，即得。
[0048]本品按干燥品计算，含黄芪甲苷(C41H68O14)不得少于0.040%。
[0049]3.对上述药材的黄芪甲苷含量的鉴定结果见表I如下。
[0050]表I黄芪药材中2个成分的含量)
[0051]
【权利要求】
1.一种黄芪药材的检测方法，其特征在于，该方法包括如下有效成分含量的测定步骤以及农药残留量的测定步骤，其中， A:黄芪甲苷含量的测定包括如下步骤: (1)精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每Iml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液； (2)精密称定待测黄芪药材粉末4g，置索氏提取器中，加甲醇40ml，冷浸，再加甲醇适量，加热回流4小时，提取液回收溶剂并浓缩至干，残渣加水10ml，微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40ml，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40ml，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水5ml使溶解，放冷，通过DlOl型大孔吸附树脂柱吸附，以水50ml洗脱，弃去水液,再用40%乙醇30ml洗脱，弃去洗脱液，继用70%乙醇80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液； (3)按照高效液相色谱法试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为32:68的乙腈-水为流动相；蒸发光散射检测器进行检测； 分别精密吸取对照品溶液10μ 1、20μ 1，供试品溶液20 μ 1，注入液相色谱仪，测定，以外标两点法对数方程计算；其中，理论板数以黄芪甲苷峰计算应不低于4000 ； B毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的测定包括如下步骤: (1)取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每Iml含50μ g的溶液，作为对照品溶液； (2)精密称定待测黄芪药材粉末lg，精密加入甲醇50ml，称定重量，加热回流4小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解并定容至5ml，作为供试品溶液； (3)按照高效液相色谱法试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动性A，以0.2%甲酸溶液为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱:从0-20min，流动相A:流动相B的体积比由20%:80%- 40%:60% ;从20_30min，流动相A:流动相B的体积比为40%:60% ;控制检测波长为260nm ； 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μ 1，注人液相色谱仪，测定；理论板数按毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰计算应不低于3000 ； C:所述农药残留量的测定包括如下步骤: (1)精密称取三苯基磷酸酯适量，加丙酮制成每Irnl含100μ g三苯基磷酸酯的溶液，作为内标贮备液； 分别精密量取各农药对照品贮备溶液Iml及所述内标贮备液1ml，加丙酮定容至100ml，作为混合对照品贮备溶液；分别精密量取适量，加乙腈定容制成20-1000ng/ml的不同浓度的溶液，作为混合对照品溶液； 另取核糖酸内酯适量，加乙腈溶解制成每Iml含20mg核糖酸内酯的溶液，另取山梨醇适量，加水溶解制成每Iml含山梨醇1mg的溶液；分别精密量取上述核糖酸内酯、山梨醇溶液各Iml混勻,加乙腈定容至1ml,作为分析保护剂； (2)精密称取待测药材细粉10g，并加入氯化钠Ig混匀，精密加入丙酮100ml，冰浴超声处理30分钟，离心，将上清液迅速移入装有Ig无水硫酸钠的具塞锥形瓶中，放置30分钟；随后精密量取上述溶液60ml减压浓缩至近干，并加入体积比为1:1的环已烷-乙酸乙酯溶液溶解样品并定容至10ml，过滤后取滤液经GPC凝胶渗透色谱净化，以体积比为1:1的环已烷-乙酸乙酯溶液为流动相洗脱，收集洗脱液，移入KD瓶中，减压浓缩至近干； 向上述样品中加入体积比为1:1的乙酸乙酯-丙酮混合溶液5ml溶解，并转移至石墨碳-氨基混合固相萃取小柱上，以体积比为1:1的乙酸乙酯-丙酮混合溶液15ml洗脱，收集洗脱液，氮吹至近干，随后加入所述内标贮备液5 μ 1，加乙腈定容至1ml，作为供试品溶液； (3)精密量取上述各浓度混合对照品溶液及供试品溶液各400 μ L，并分别加入所述分析保护剂10yL混匀，随后分别精密吸取lyL，进行气相色谱-质谱联用仪测定；其中， 所述气相色谱分析条件为:取规格为30mX0.25mmX0.25um的弹性石英毛细管柱DB 17ms,以高纯氦气为载气，柱流速1.3ml/分钟，进样量I μ 1，采用高压不分流进样，设置进样口温度为230°C，升温程序具体为:初始温度60°C，以30°C /分钟升至120°C、以10°C /分钟升至200°C、以2°C /分钟升至230°C、以30°C /分钟升至300°C，并保持7分钟； 所述EI源质谱测定的条件为:设置电子能量70eV，离子源温度230°C，接口温度250。。。
2.根据权利要求1所述的黄芪药材的检测方法，其特征在于，所述农药残留量的测定中，所述GPC凝胶渗透色谱净化步骤的条件具体为:填料为B1-Beads S-X3 200-400目，净化柱为2.5mmX 40cm，具体洗脱参数为净化去杂900s，目标物收集1200s，柱子清洗300s。
3.根据权利要求1或2所述的黄芪药材的检测方法，其特征在于，所述农药残留量的测定中，所述农药对照品包括敌敌畏、甲胺磷、乙酰甲胺磷、四氯硝基苯、六氯苯、α-六六六、β_六六六、Y-六六六、δ -六六六、氧化乐果、二嗪磷、五氯硝基苯、久效磷、地虫硫磷、磷胺1、乐果、七氯、五氯苯胺、百菌清、甲基毒死蜱、艾氏剂、克菌丹、磷胺I1、甲基对硫磷、甲基嘧啶磷、甲基五氯苯基硫醚、甲霜灵、三唑酮、毒死蜱、马拉硫磷、杀螟硫磷、对硫磷、二甲戊灵、顺式环氧七氯、反式环氧七氯、三唑醇Α、三唑醇B、反式氯丹、顺式硫丹、顺式氯丹、反式硫丹、PP’ -DDE,PP' -DDD、0P’ -DDT,PP' -DDT、狄氏剂、杀扑磷、异狄氏剂、乙硫磷、三苯基磷酸酯、联苯菊酯、硫丹硫酸酯、异菌脲、甲氰菊酯、三氯杀螨醇、氯氟氰菊酯、甲氧DDT、三氯杀螨砜、伏杀硫磷、氯菊酯1、氯菊酯2、氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯。
4.根据权利要求1-3任一所述的黄芪药材的检测方法，其特征在于，所述黄芪甲苷、毛蕊异黄酮含量的测定中，所述待测药材的粒径为180-2000 μ m。
5.根据权利要求1-4任一所述的黄芪药材的检测方法，其特征在于，所述黄芪甲苷含量的测定步骤中，所述DlOl型大孔吸附树脂柱的内径为1.5cm，长12cm。
6.根据权利要求1-5任一所述的黄芪药材的检测方法，其特征在于，所述农药残留量的测定中，所述待测药材的粒径为180-2000 μ m。
【文档编号】G01N30/02GK104198600SQ201410373774
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年7月31日 优先权日:2014年7月31日
【发明者】杨锡, 陈杰, 李波, 韩斌, 李登鹏, 赵建邦, 何禄仁, 宋平顺, 张平 申请人:甘肃中天药业有限责任公司