本发明属于工业生物技术领域，特别涉及一种腈水解酶产生酵母菌的筛选方法及其在腈类化合物生物转化制备3-羟基丙酸中的应用。
背景技术：
腈水解酶能将腈类底物中的腈基转化为羧基从而制备得到有机酸、氨基酸等化合物，在大宗化学品、食品添加剂和医药中间体等领域具有重要应用。自1964年robinson等人首次从土壤中分离到一株产蓖麻碱腈水解酶的假单胞菌属pseudomonas菌株以来，不同来源的腈水解酶已经得到广泛研究，日本学者采用红球菌rhodococcusrhodochrousj1产腈水解酶，可水解多种腈类化合物制备得到有机酸。自此，不同来源的腈水解酶产生菌逐渐见诸报道，包括红球菌属rhodococcus，诺卡氏菌属nocardia，不动杆菌属acinetobacter，产碱杆菌属alcaligenes，假单胞菌属pseudomonas，短根瘤菌属bradyrhizobium，丛毛单胞菌属comamonas，芽胞杆菌属bacillus，火球菌属pyrococcus，盐单胞菌halomonas，节杆菌属arthrobacter，嗜热芽胞菌geobacillus，棒状杆菌corynebacterium等各种不同来源的细菌；镰刀菌fusarium，曲霉aspergillus和青霉菌penicillium等来源的真菌。这些文献报道的利用腈水解酶获得的化合物包括烟酸、扁桃酸、丙烯酸、羟基乙酸、亚氨基二乙酸以及多种非天然氨基酸等。这些报道中，以细菌来源的腈水解酶为主，而真菌腈水解酶则相对报道较少，尤其是来源于酵母菌的腈水解酶更是鲜有报道。
3-羟基丙酸，是一种三碳无手性化合物，具有羟基和羧基两个官能团，与乳酸互为同分异构体，是很多光学活性物质的前体；作为一种重要平台化合物，被用于众多医药化工产品的生产中，是合成大分子化合物和聚合物的重要单体。2004年美国能源部将3-羟基丙酸列为当今世界12种最具开发潜力的化工产品之一，具有重要的开发价值，近年来也逐步受到关注。3-羟基丙酸的传统生产方法主要通过化学法进行。一般利用氰化钾与邻卤代醇反应，生成3-羟基丙腈，再通过reformatsky反应生成3-羟基丙酸；在高温下，丙烯酸可发生水合反应合成3-羟基丙酸；此外，也可利用铂金和一种固体酸催化剂zsm5zeolite分别催化3-羟基丙醛和丙烯酸生成3-羟基丙酸；总结来看，化学法合成步骤相对复杂，对设备要求高，且产品分离纯化流程繁琐，生产成本相应较高。
近年来发展的生物法中利用微生物发酵生产3-羟基丙酸，则可有效避免化学合成法所带来的不利因素，且具有原料来源丰富，绿色环保，生产成本低等优势。结合基因工程手段可以较好实现3-羟基丙酸的生产。利用基因工程菌株生产3-羟基丙酸的方法按照底物的不同主要包括两类：一类是以谷物类碳水化合物葡萄糖为底物；一类是以三碳化合物甘油为底物。而在野生菌生产3-羟基丙酸的研究中，如1，3-丙二醇、丙酸、丙烯酸、3-氨基丙酸等作为底物均有报道。但生物发酵法需要辅酶参与，并且产率和产物纯度不高，同时菌体对高浓度底物耐受能力偏低。利用腈水解酶一步催化腈类物质3-羟基丙腈制备3-羟基丙酸是一种可替代性技术，该方法步骤简单，避免了中间产物的影响，而且该工艺具有反应条件温和、能耗低、环境友好等技术优势。迄今为止，尚未见酵母属菌株，尤其是季也蒙毕赤酵母meyerozymaguilliermondii产腈水解酶用于3-羟基丙酸合成的报道。
技术实现要素：
本发明的发明人从土样中分离筛选获得一株产3-羟基丙酸的季也蒙毕赤酵母3h2-2，并对这株菌进行了发酵研究。本发明提供的菌株是从化工厂取得土样分离筛选获得一株酵母菌，根据形态特征，以及18s和its基因测序，该菌株属于季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii)3h2-2，现保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.12935，保藏日期为2016年9月5日。
本发明提供的菌株季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii3h2-2，cgmccno.12935)的生理形态特征及分子鉴定如下：
菌株在固体发酵培养基平板上划线接种，长出菌落呈圆形、水滴状，乳白色奶油状，菌体表面较湿润、有光泽，易挑取。在30℃恒温箱中培养24h后，直径1mm左右；48h后单菌落直径达到2mm左右；培养6d后，直径可达9mm左右。菌落中心及周边部分无其他颜色。在显微镜下观察，细胞多呈椭圆形，多成簇生长。在电子显微镜下，菌体之间大小差异较大，长度在1.5-5μm之间，呈现椭球形或橄榄球形，可见明显出芽痕和诞生痕，证明其可进行芽殖。
利用真菌通用引物对季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii3h2-2，cgmccno.12935)的18s和its基因序列进行pcr扩增，分别得到1677bp和610bp大小的片段。通过在ncbi网站应用blast软件与数据库中的已有序列进行相似性比较分析，得出该菌株的18srdna序列与meyerozyma属(kj126853.2、kc178873等)的相关序列存在99％以上同源性，同时与pichia属(eu784644.1)及candida属(ay227715.1、ay518523.1)的相关菌株序列同源性也在99％左右，最终将其归为meyerozyma属菌株。由该菌株的its序列分析得出，菌株3h2-2与m.guilliermondiigk8存在最高同源性。结合形态特征和生理生化特性，将其鉴定为季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii3h2-2，cgmccno.12935)。
本发明还提供了一种3-羟基丙酸生产菌的筛选方法，其特征如下：
初筛，采集土样，在具有3-羟基丙腈作为单一氮源的筛选培养基分离能够利用底物的菌株；复筛，首先进行种子培养，以3％的接种量接入发酵培养基，培养结束后取发酵液对3-羟基丙腈进行转化实验，采用苯酚-次氯酸钠法检测其酶活。
所述土样来源于生产腈类化合物厂房周围的土样及其下水道污泥。
所述初筛方法如下：
取1g土样及污泥样品，溶入10ml的0.9％生理盐水中，于30℃条件下充分震荡30min，静置；取1ml土壤悬浮液，接入含筛选培养基的三角瓶中(50ml/250ml)于30℃温度下在120rpm往复式摇床中培养；48h后，取100μl浑浊培养液涂布于固体筛选培养基平板上，将平板置于恒温培养箱倒置培养，30℃培养48h；挑取筛选培养基平板上长出的大而壮的单菌落，转接至新鲜的筛选培养基划线分离，转接3～5代。
所述筛选培养基的组成成分为：
葡萄糖5-10g/l；kh2po40.5-4g/l；mgso40.05-0.4g/l；feso40.01-0.1g/l；cacl20.01-0.1g/l；nacl0.5-4g/l；3-羟基丙腈0.5-4g/l。
所述固体筛选培养基的组成成分为：
葡萄糖5-10g/l；kh2po40.5-4g/l；mgso40.05-0.4g/l；feso40.01-0.1g/l；cacl20.01-0.1g/l；nacl0.5-4g/l；3-羟基丙腈0.5-4g/l；琼脂粉15～20g/l。
所述复筛方法如下：
发酵培养基组成为(g/l)：
酵母粉5-15g/l，蛋白胨5-20g/l，nacl0.5-4g/l，kh2po41-5g/l，k2hpo41-5g/l，甘油5-15g/l，3-羟基丙腈0.5-4g/l，ph5.0-8.0。培养方法为：250ml三角瓶装液量25-50ml，接种量为1-10％，在转速为100-250r/min的摇床中于25-40℃培养20-60h；发酵液处理方法为：将发酵液在8000-15000rpm条件下离心2～10min，收集经培养获得的菌体，用0.01-0.5m，ph6.0-8.0的磷酸盐缓冲液洗涤菌体2～4次；离心，弃上清，于4℃条件下保藏菌体备用检测酶活。
所述季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii)3h2-2检测酶活的方法如下：
采用苯酚-次氯酸钠法测定酶活。用100mm、ph7.2的磷酸钠缓冲液重悬适量上述菌体至反应体积为0.9ml，将该体系在30℃下温浴5min，随后加入0.1ml0.5m的3-羟基丙腈，制备成底物终浓度为50mm，总体积为1ml的酶反应体系；本实验中测量筛选到的每株菌对底物的转化情况，各组做三个平行实验，于30℃的摇床转化反应10min，反应结束后12000×g离心10min终止反应，取10μl反应液上清，用除氨水定容至1ml，然后依次加入1ml苯酚钠溶液、1.5ml亚硝基铁氰化钠溶液、1.5ml次氯酸钠溶液，在27℃水浴中培养15min后，检测od630nm。
显色液配制方法为：显色液1，7.8ml4mmnaoh加2.5g苯酚配得的苯酚钠溶液；显色液2，0.1mg·ml-1亚硝基铁氰化钠液；显色液3，0.02m次氯酸钠溶液。
氨标准曲线绘制方法为：制备10μg·ml-1的氨标准液；分别取0、100、200、300、400、500、600、700、800μl氨标准液于9只10ml离心管中，按次序先后添加1.0ml苯酚钠溶液、1.5ml亚硝基铁氰化钠和1.5ml次氯酸钠溶液，并用除氨水定容至5ml，混匀，并于27℃水浴锅中反应15min；取200μl反应液置于96孔板中，在酶标仪上检测其吸收值od630nm。
酶活计算方法如下：
酶活(1u)定义：在标准生物转化反应条件下，每1min形成1μm氨所对应的酶量，测定均重复3次。
本发明还提供一种cgmccno.12935的应用方法，其特征如下：
将cgmccno.12935接入发酵培养基，获得高活性高生物量的发酵液；在8000-15000rpm条件下离心2～10min，收集经培养获得的菌体，用0.01-0.5m，ph6.0-8.0的磷酸盐缓冲液洗涤菌体2～4次；菌体重悬于缓冲液中，并与底物溶液混匀，添加0.5％-10％终浓度的葡萄糖，反应温度保持在20-60℃，搅拌转速保持在50-250r/min，反应时间10～150h。采用高效液相色谱法检测转化后上清液中生成的3-羟基丙酸浓度以及残余的底物浓度。转化液处理方法为：将转化液12000rpm离心10min，上清液经0.22μm滤膜过滤后用于3-羟基丙酸含量检测。
所述转化液中3-羟基丙酸采用高效液相色谱法检测，色谱条件为：dionex3000型高效液相色谱仪，色谱柱为waters公司的xbridgedc18柱(5.0μm，250mm×4.6mm)，柱温30℃，流速为0.8ml·min-1，紫外检测波长210nm，流动相为甲醇/0.05％磷酸(5/95)等度洗脱。
本发明的优点和有益效果：
首次发现一株产腈水解酶的季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii3h2-2，cgmccno.12935)能利用腈水解反应催化3-羟基丙腈一步生成3-羟基丙酸，季也蒙毕赤酵母cgmcc12935具有生命力强、腈转化能力突出等特点，为3-羟基丙酸的合成建立了一种新工艺；本工艺具有反应条件温和、能耗低、环境友好等特点。本工艺在转化过程中添加0.5％-10％的葡萄糖，大幅提升了产物3-羟基丙酸的积累量；本工艺还具有反应条件温和，产率高，生产成本低，对环境友好等特点。
附图说明
图1cgmccno.12935在300mm、400mm和500mm底物浓度下以及添加不同浓度葡萄糖后产3-羟基丙酸变化曲线。
具体实施方式
实施例1
⑴菌株的富集筛选过程
采集腈类化合物厂房周围的土样，采集土样时，先用小铲子铲去表层土，采集5～15cm深度处的土样。取1g采集到的土样及污泥样品，溶入10ml的0.9％生理盐水中，于30℃条件下充分震荡30min，静置；取1ml土壤悬浮液，接入含筛选培养基的三角瓶中(50ml/250ml)于30℃温度下在120rpm往复式摇床中培养；48h后，取100μl浑浊培养液涂布于固体筛选培养基平板上，将平板置于恒温培养箱倒置培养，30℃培养48h；挑取筛选培养基平板上长出的大而壮的单菌落，转接至新鲜的筛选培养基划线分离，转接3～5代。
再进行复筛，挑取88株纯化好的菌株进行种子培养，以3％的接种量接入发酵培养基，于30℃温度下120rpm往复式摇床中培养36h，取该培养液12000rpm离心5min收集菌体，采用苯酚-次氯酸钠法检测菌株对底物3-羟基丙腈的酶活。得到酶活相对最好的一株菌株，编号为3h2-2。
所述筛选培养基的组成为(g/l)：葡萄糖5；kh2po41；mgso40.1；feso40.02；cacl20.02；nacl1，3-羟基丙腈1。
所述固体筛选培养基的组成为(g/l)：葡萄糖5；kh2po41；mgso40.1；feso40.02；cacl20.02；nacl1，3-羟基丙腈1；琼脂粉20。
所述发酵培养基(g/l)为：酵母粉7.5，蛋白胨15，nacl1，kh2po42，k2hpo42，甘油15，3-羟基丙腈1，ph7.2。
⑵菌株的形态
季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii3h2-2，cgmccno.12935)菌株在筛选培养基平板上采用划线接种，长出菌落呈圆形、水滴状，乳白色奶油状，菌体表面较湿润、有光泽，易挑取。在30℃恒温箱中培养24h后，直径1mm左右；48h后单菌落直径达到2mm左右；培养6d后，直径可达9mm左右。菌落中心及周边部分无其他颜色。在显微镜下观察，细胞多呈椭圆形，多成簇生长。在电子显微镜下，菌体之间大小差异较大，长度在1.5-5μm之间，呈现椭球形或橄榄球形，可见明显出芽痕和诞生痕，证明其可进行芽殖。
⑶菌株的分子鉴定
收集在液体发酵培养基中生长的菌体，经低温液氮研磨后，用真菌基因组dna提取试剂盒提取总dna。扩增引物分别为18s的通用引物和its序列的通用引物。
pcr反应采用50μl反应体系，
pcr扩增条件：95℃预变性5min，95℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸90s，共30个循环，最后72℃终延伸10min。pcr扩增产物的纯化按上海生工生物技术公司的小量胶回收pcr产物纯化试剂盒说明进行，测序由上海睿迪生物科技有限公司完成。
经测序后获得的18s和its基因序列在genbank中进行blast比对确定其种属。最终将其命名为季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii)3h2-2，该菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号cgmccno.12935。
实施例2
本实例说明对cgmccno.12935接入发酵培养基进行了培养获得高活性高生物量的菌体，以及生物转化3-羟基丙腈生产3-羟基丙酸的方法。
发酵培养基组成(g/l)为：酵母粉7.5g，蛋白胨15g，nacl1g，kh2po42g，k2hpo42g，甘油15g，3-羟基丙腈1g，ph7.2；
将cgmccno.12935以3％接种量接入培养基中，30℃，120rpm往复式摇床培养36h，12000rpm离心5min收集培养好的菌体，用100mm、ph7.2的磷酸钠缓冲液洗涤菌体2～3次，并将菌体重悬于该缓冲液中。
将底物溶液与菌悬液混匀，并使底物终浓度为300mm，控制培养条件在30℃，120rpm往复式摇床中进行转化反应，30h后底物转化完全，16h处检测到的3-羟基丙酸最高累积浓度为45.63mm。
实施例3
通过离心从培养液中收集菌体，用100mm、ph7.2的磷酸钠缓冲液洗涤菌体2～3次，重新悬浮制成菌悬液，将底物溶液与菌悬液混匀，并使底物终浓度为400mm，控制培养条件在30℃，120rpm往复式摇床中进行转化反应，41h后底物完全转化，在21.5h时检测到的3-羟基丙酸累积浓度最高，为52.90mm。
实施例4
通过离心从培养液中收集菌体，用100mm、ph7.2的磷酸钠缓冲液洗涤菌体2～3次，重新悬浮制成菌悬液，将底物溶液与菌悬液混匀，并使底物终浓度为500mm，控制培养条件在30℃，120rpm往复式摇床中进行转化反应，47.5h后底物完全转化，30h时检测到的3-羟基丙酸累积浓度最高，为64.68mm。
实施例5
将cgmccno.12935通过离心从培养液中收集菌体，用100mmol·l-1、ph7.2的磷酸钠缓冲液洗涤菌体2～3次，重新悬浮制成菌悬液，将底物溶液与菌悬液混匀，并使底物终浓度为300mm，同时在该转化体系中添加3％的葡萄糖，控制培养条件在30℃，120rpm往复式摇床中进行转化反应，78.5h后底物完全转化，此时检测到的3-羟基丙酸最高累积浓度为158.2mm。
实施例6
将cgmccno.12935通过离心从培养液中收集菌体，用100mm、ph7.2的磷酸钠缓冲液洗涤菌体2～3次，重新悬浮制成菌悬液，将底物溶液与菌悬液混匀，并使底物终浓度为400mm，同时在该转化体系中添加3％的葡萄糖，控制培养条件在30℃，120rpm往复式摇床中进行转化反应，100h后底物转化完全，此时检测到的3-羟基丙酸最高累积浓度为191.5mm。
实施例7
将cgmccno.12935通过离心从培养液中收集菌体，用100mm、ph7.2的磷酸钠缓冲液洗涤菌体2～3次，重新悬浮制成菌悬液，将底物溶液与菌悬液混匀，并使底物终浓度为500mm，同时在该转化体系中添加3％的葡萄糖，控制培养条件在30℃，120rpm往复式摇床中进行转化反应，100h后底物转化完全，此时检测到的3-羟基丙酸最高累积浓度为216.3mm。