本发明涉及培养生产腈水合酶的微生物的方法、培养生产腈水合酶的微生物的组合物、以及含有糖类和有机酸的组合物用于培养生产腈水合酶的微生物的用途。在本发明的上下文中提供的并用于本发明的组合物特别适用于诱导相应微生物的生长和腈水合酶的生产。
背景技术：
聚丙烯酰胺广泛用作絮凝剂、用作造纸工业中的增稠剂、用作三次采油中的添加剂、以及许多其它领域。聚丙烯酰胺的原料通常是其单体丙烯酰胺。原则上，存在两种不同的工业规模生产丙烯酰胺的方法：化学合成和生物合成，其中由于更温和的反应条件和固有的工艺安全性，生物合成方法呈日益上升趋势。由于更温和的反应条件、不存在铜催化剂和腈的定量转化，在生物合成中可以避免昂贵的下游加工步骤例如蒸馏或离子交换，因此导致更廉价的设备，显著降低的设备蓝图。
两种合成方法都使用丙烯腈作为起始物质。虽然化学合成方法使用铜催化剂(例如us4048226，us3597481)，但是生物合成方法使用生物催化剂水合丙烯腈以获得丙烯酰胺。一般地，这样的生物催化剂是微生物，其能够生产酶的腈水合酶(2014年9月30日的iubmb命名法：ec4.2.1.84；cas-no.2391-37-5；也称为，例如nhase)。生产腈水合酶的微生物广泛地分布在环境中，并且包括，例如，作为代表的玫瑰色红球菌(rhodococcusrhodochrous)、食吡啶红球菌(rhodococcuspyridinovorans)、红城红球菌(rhodococcuserythropolis)、马红球菌(rhodococcusequi)、赤红球菌(rhodococcusruber)、浑浊红球菌(rhodococcusopacus)、黑曲霉(aspergillusniger)、燕麦食酸菌(acidovoraxavenae)、速生食酸菌(acidovoraxfacilis)、根癌土壤杆菌(agrobacteriumtumefaciens)、放射形土壤杆菌(agrobacteriumradiobacter)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、苍白芽孢杆菌(bacilluspallidus)、史密斯芽孢杆菌(bacillussmithii)、芽孢杆菌br449(bacillusspbr449)、bradyrhizobiumoligotrophicum、bradyrhizobiumdiazoefficiens、大豆慢生根瘤菌(bradyrhizobiumjaponicum)、新洋葱伯克霍尔德氏菌(burkholderiacenocepacia)、唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(burkholderiagladioli)、产酸克雷伯菌(klebsiellaoxytoca)、肺炎克雷伯菌(klebsiellapneumonia)、栖异地克雷伯菌(klebsiellavariicola)、鹰嘴豆中间根瘤菌(mesorhizobiumciceri)、机会中间根瘤菌(mesorhizobiumopportunistum)、中间根瘤菌f28(mesorhizobiumspf28)、莫拉菌属(moraxella)、pantoeaendophytica、成团泛菌(pantoeaagglomerans)、绿针假单胞菌(pseudomonaschlororaphis)、恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)、根瘤菌属(rhizobium)、沼泽红假单胞菌(rhodopseudomonaspalustris)、液化沙雷氏菌(serratialiquefaciens)、粘质沙雷氏菌(serratiamarcescens)、拟无枝酸菌属(amycolatopsis)、节杆菌属(arthrobacter)、短杆菌属物种ch1(brevibacteriumspch1)、短杆菌属物种ch2(brevibacteriumspch2)、短杆菌属物种r312(brevibacteriumspr312)、蛾短杆菌(brevibacteriumimperiale)、corynebacteriumnitrilophilus、假白喉棒杆菌(corynebacteriumpseudodiphteriticum)、谷氨酸棒状杆菌(corynebacteriumglutamicum)、corynebacteriumhoffmanii、蛾微杆菌(microbacteriumimperiale)、耻垢微杆菌(microbacteriumsmegmatis)、藤黄微球菌(micrococcusluteus)、小球诺卡氏菌(nocardiagloberula)、玫瑰色诺卡氏菌(nocardiarhodochrous)、嗜热假诺卡氏菌(pseudonocardiathermophila)、木霉属(trichoderma)、疣孢漆斑菌(myrotheciumverrucaria)、出芽短梗霉(aureobasidiumpullulans)、candidafamata、季也蒙假丝酵母(candidaguilliermondii)、热带假丝酵母(candidatropicalis)、黄隐球酵母(cryptococcusflavus)、隐球酵母ufmg-y28(cryptococcusspufmg-y28)、汉逊德巴利酵母(debaryomyceshanseii)、白地霉(geotrichumcandidum)、地霉属物种jr1(geotrichumspjr1)、有孢汉逊酵母属(hanseniaspora)、耐热克鲁维酵母(kluyveromycesthermotolerans)、克鲁弗毕赤酵母(pichiakluyveri)、红酵母(rhodotorulaglutinis)、睾丸酮丛毛单胞菌(comomonastestosteroni)、pyrococcusabyssi、激烈热火球古菌(pyrococcusfuriosus)和美未氏热火球古菌(pyrococcushorikoshi)。(参见，例如，prasad，biotechnologyadvances(2010)，28(6)：725-741；fr2835531)。酶腈水合酶是铁或钴依赖性的(即其具有在其活性中心配位的铁或钴原子)，特别地其特征在于其催化丙烯腈转化以通过水合丙烯腈获得丙烯酰胺的能力(kobayashi，naturebiotechnology(1998)，16：733-736)。
微生物作为将丙烯腈转化为丙烯酰胺的生物催化剂的能力基本上取决于两个参数：微生物的充分生长及其腈水合酶的生产速率。用于培养生产腈水合酶的微生物的已知发酵方法面临几个不同的困难，例如，适合生长的高浓度的碳或氮源可能抑制酶生产，所谓的“分解代谢物抑制”(leonova，appliedbiochembiotechnol(2000)，88：231-241)或金属离子辅因子的抑制作用(ep-b11283256；pei，biotechnologyletters(2013)，35：1419-1424)。这些困难导致在给定时间段内低的腈水合酶活性速率，这是由于低的酶生产速率(即微生物主要生长但仍显示低的酶生产速率)，或由于低的微生物生长速率(即微生物显示高生产速率，但仍然有太少的微生物)。
因此，需要一种培养生产腈水合酶的微生物的方法，其允许在短时间内获得高产率的腈水合酶活性。
这一技术问题已经通过权利要求中限定的并且如下文所描述和示例的本发明所克服。
技术实现要素：
本发明的要点在于令人惊讶的发现，根据腈水合酶活性水平，糖类和有机酸的组合增加生长和腈水合酶的生产速率。不受理论的束缚，据信通过有机酸可以改善糖进入细胞中。
因此，本发明涉及用于培养生产腈水合酶(nhase)的微生物的方法，其包括以下步骤：
(a)使所述微生物与包含糖(i)和有机酸(ii)的水性组合物接触；
(b)在所述(a)的水性组合物中培养所述微生物。
本发明还涉及通过本文所述和提供的培养方法获得的或可获得的微生物。
本发明还涉及用于培养生产腈水合酶的微生物的组合物，所述组合物包含糖(i)和有机酸(ii)。
本发明还涉及包含糖(i)和有机酸(ii)的组合物用于培养生产腈水合酶的微生物的用途。
在下文中，当进一步限定和说明根据本发明所描述和提供的方法、组合物和组合物用途的各单个特征(如腈水合酶、微生物、组合物、糖、有机酸等)时，这些定义和说明应适用于如本文所述和提供的所有本发明方法、本发明组合物和本发明组合物用途。
与本发明的发现相一致，已经证实，一些糖类，相较于其他糖类，看上起与有机酸组合可以更有效地增加腈水合酶活性(例如，允许微生物的高生长和高酶产量)。因此，在一个实施方案中，由本发明上下文中提供和使用的组合物所包含的糖(i)是单糖。此外，在本发明的上下文中，糖(i)可以是其中碳原子数为至少5、优选至少6的糖。在一个实施方案中，糖(i)中的碳原子数是6。包含在本文提供的组合物中和用于本发明上下文中的糖的具体实例包括葡萄糖、果糖、核糖和甘露糖；优选葡萄糖、果糖或甘露糖。在一个实施方案中，糖(i)是葡萄糖。
包含在本文提供的用于本发明的组合物中的有机酸(ii)可以是，例如，包含不超过3个羧基、优选不超过2个羧基、并且最优选不超过1个羧基基团的有机酸。根据本发明已经发现，这样的有机酸对于增加腈水合酶活性特别有效，如在本文中和实施例中进一步描述和例示的。有机酸(ii)通常不受尺寸限制，但可包含例如不超过6个碳原子、优选不超过4个碳原子、最优选不超过3个碳原子。本发明上下文中，有机酸的具体实例包括乳酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸和琥珀酸。在本发明的一个实施方案中，有机酸(ii)选自乳酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸和琥珀酸；优选选自乳酸、酒石酸、苹果酸和琥珀酸；更优选选自乳酸、酒石酸和苹果酸；最优选乳酸。
在本发明的一个具体实施方案中，本文提供的和在本发明的上下文中使用的组合物中所含的糖(i)是葡萄糖，有机酸(ii)是乳酸。
在本文提供和描述的培养生产腈的微生物的方法中，可以首先根据步骤(a)使微生物与包含糖(i)(并且还不包含有机酸(ii))的组合物接触，然后根据步骤(b)开始培养微生物，并直到这时才在微生物培养期间向组合物中加入有机酸(ii)。另外，反之亦然，在本文提供和描述的培养生产腈的微生物的方法中，可以首先根据步骤(a)使微生物与包含有机酸(ii)(并且还不包含糖(i))的组合物接触，然后根据步骤(b)开始培养微生物，并直到这时才在微生物培养期间向组合物中加入糖(i)。换句话说，没有必要，从培养一开始就在与微生物接触的组合物中存在糖(i)和有机酸(ii)两组分。相反，也可以在开始培养生产腈水合酶的微生物后，将组分(i)和(ii)中的一种或两种添加到组合物中，只要最终微生物在包含两种组分的组合物中培养以实现增加腈水合酶活性的期望效果即可。
本文提供的和在本发明的上下文中使用的组合物中所含的糖(i)和有机酸(ii)的比例通常不受限制。本文提供的和在本发明的上下文中使用的组合物中所含的糖(i)和有机酸(ii)之间的比例(本文通常以重量/重量比表示)可以为，例如1:9至9:1；2:8至8:2；2.5:7.5至7.5:2.5；3:7至7:3；3.5:6.5至6.5:3.5；4:6至6:4；4.5:5.5至5.5:4.5；或1:1。在一个实施方案中，组合物中糖(i)和有机酸(ii)之间的比例在2:8和9:1之间、优选3:7和9:1之间、更优选3:7和8:2之间、更优选3:7和7.5:2.5之间、最优选3:7和7:3之间或1:1和7:3之间。在本发明的上下文中，这些比例是指，加入到本文提供的和在本发明的上下文中使用的用于培养生产腈水合酶的微生物的组合物中的糖(i)和有机酸(ii)的相应重量。例如，组合物中的比例可以在生产腈水合酶的微生物的培养期间变化，因为两种组分可以独立地被消耗或更快或更慢地转化，或者因为组分中的一种或两种在整个培养过程中以额外量添加。
在本发明的一个具体实施方案中，本文提供的和在本发明的上下文中使用的组合物中所含的糖(i)是葡萄糖，有机酸(ii)是乳酸，并且组合物中糖(i)和有机酸(ii)之间的比例在3:7和7:3之间。
根据本发明描述和提供和使用的，包含糖(i)和有机酸(ii)的组合物还可以包含本领域已知的对培养微生物的组合物有用的其它组分。最优选地，在本发明的上下文中，所述组合物是水性组合物。其它组分可以包括例如氮源(例如铵或硝酸盐，有机酸如谷氨酸，酵母提取物或蛋白质水解产物)、磷源(例如磷酸盐，其也可以提供缓冲能力)、硫源(例如硫酸盐)、钴和/或铁源(作为nhase的辅因子)、用于表达腈水合酶的诱导剂例如尿素、其它营养源如镁，钙，锌，锰，铜以及维生素。
本文所述的生产腈水合酶的微生物的培养，特别是在本文提供的方法的步骤(b)中，可以以本领域技术人员已知的常规方式进行。也就是说，本文提供的和在本文上下文中使用的组合物，除了本文所述的糖(i)和有机酸(ii)外，还应包含允许培养的微生物生长和维持所必需的其它组分。此外，应设定其它参数，例如温度、ph、溶解氧浓度、压力、通气和搅动，以允许在本发明中培养的微生物生长和维持。在本文上下文中，用于培养本文所述和例示的微生物的典型温度可以在30℃和40℃之间、优选在35℃和38℃之间、最优选在36.5℃和37.5℃之间、特别是37℃。然而，也可以根据在本发明中培养的微生物，设定其它温度。应通过在发酵培养基中提供缓冲液或通过反馈控制强酸和/或碱的加入，将ph保持在6和8之间、优选在6.5和7.5之间。典型的溶解氧浓度值可以在饱和浓度的5％至75％之间、优选20％至40％。
在本发明的上下文中，在根据本文描述和提供的培养方法培养生产腈水合酶的微生物之后，可以从培养组合物收集微生物并干燥或以其它方式积累。任选地，可以在干燥之前浓缩细胞悬浮液，例如，通过离心或交叉流过滤(以微量过滤或超滤模式)。在干燥之前，还可以用水或缓冲溶液洗涤细胞，以从发酵肉汤中除去残留物质。例如，在培养后，然后可以通过喷雾干燥、流化床干燥、喷雾造粒或冷冻干燥来干燥微生物，优选通过喷雾或冷冻干燥。例如，可以在温和条件下(例如使用入口温度为80至150℃、优选90至120℃，和出口温度为，例如35至65℃、优选40至50℃)，喷雾干燥细胞，至残留水含量为1至10％、优选4至8％重量。
在本发明的上下文中，用包含糖(i)和有机酸(ii)的组合物培养的生产腈水合酶的微生物可以是能够生产本文所述的酶腈水合酶的任何微生物。酶腈水合酶是铁或钴依赖性的(即其具有在其活性中心配位的铁或钴原子)，尤其是其特征在于其催化丙烯腈转化以通过水合丙烯腈获得丙烯酰胺的能力(kobayashi，naturebiotechnology(1998)，16：733-736)。在本发明的上下文中使用的这种微生物可以是能够天然生产腈水合酶的微生物，即天然含有编码腈水合酶的基因。这样的微生物也可以是能够天然生产腈水合酶并且进一步被遗传改造，例如以增加腈水合酶的生产或增加腈水合酶的稳定性和/或输出的微生物。这样的微生物也可以是天然不能生产腈水合酶并且进一步被遗传改造以稳定表达和生产腈水合酶的微生物。在该上下文中，能够天然生产腈水合酶的微生物在本领域中是公知的，并且包括，例如，作为代表的玫瑰色红球菌(rhodococcusrhodochrous)、食吡啶红球菌(rhodococcuspyridinovorans)、红城红球菌(rhodococcuserythropolis)、马红球菌(rhodococcusequi)、赤红球菌(rhodococcusruber)、浑浊红球菌(rhodococcusopacus)、黑曲霉(aspergillusniger)、燕麦食酸菌(acidovoraxavenae)、速生食酸菌(acidovoraxfacilis)、根癌土壤杆菌(agrobacteriumtumefaciens)、放射形土壤杆菌(agrobacteriumradiobacter)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、苍白芽孢杆菌(bacilluspallidus)、史密斯芽孢杆菌(bacillussmithii)、芽孢杆菌br449(bacillusspbr449)、bradyrhizobiumoligotrophicum、bradyrhizobiumdiazoefficiens、大豆慢生根瘤菌(bradyrhizobiumjaponicum)、新洋葱伯克霍尔德氏菌(burkholderiacenocepacia)、唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(burkholderiagladioli)、产酸克雷伯菌(klebsiellaoxytoca)、肺炎克雷伯菌(klebsiellapneumonia)、栖异地克雷伯菌(klebsiellavariicola)、鹰嘴豆中间根瘤菌(mesorhizobiumciceri)、机会中间根瘤菌(mesorhizobiumopportunistum)、中间根瘤菌f28(mesorhizobiumspf28)、莫拉菌属(moraxella)、pantoeaendophytica、成团泛菌(pantoeaagglomerans)、绿针假单胞菌(pseudomonaschlororaphis)、恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)、根瘤菌属(rhizobium)、沼泽红假单胞菌(rhodopseudomonaspalustris)、液化沙雷氏菌(serratialiquefaciens)、粘质沙雷氏菌(serratiamarcescens)、拟无枝酸菌属(amycolatopsis)、节杆菌属(arthrobacter)、短杆菌属物种ch1(brevibacteriumspch1)、地芽孢杆菌rapc8(geobacillussprapc8)、短杆菌属物种ch2(brevibacteriumspch2)、短杆菌属物种r312(brevibacteriumspr312)、蛾短杆菌(brevibacteriumimperial)、corynebacteriumnitrilophilus、假白喉棒杆菌(corynebacteriumpseudodiphteriticum)、谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)、corynebacteriumhoffmanii、蛾微杆菌(microbacteriumimperiale)、耻垢微杆菌(microbacteriumsmegmatis)、藤黄微球菌(micrococcusluteus)、小球诺卡氏菌(nocardiagloberula)、玫瑰色诺卡氏菌(nocardiarhodochrous)、嗜热假诺卡氏菌(pseudonocardiathermophila)、木霉属(trichoderma)、疣孢漆斑菌(myrotheciumverrucaria)、出芽短梗霉(aureobasidiumpullulans)、candidafamata、季也蒙假丝酵母(candidaguilliermondii)、热带假丝酵母(candidatropicalis)、黄隐球酵母(cryptococcusflavus)、隐球酵母ufmg-y28(cryptococcusspufmg-y28)、汉逊德巴利酵母(debaryomyceshanseii)、白地霉(geotrichumcandidum)、地霉属物种jr1(geotrichumspjr1)、有孢汉逊酵母属(hanseniaspora)、耐热克鲁维酵母(kluyveromycesthermotolerans)、克鲁弗毕赤酵母(pichiakluyveri)、红酵母(rhodotorulaglutinis)、睾丸酮丛毛单胞菌(comomonastestosteroni)、pyrococcusabyssi、激烈热火球古菌(pyrococcusfuriosus)和美未氏热火球古菌(pyrococcushorikoshi)。此外，天然不表达腈水合酶的微生物如埃希氏杆菌(如大肠杆菌)，一旦已经被遗传改造从而稳定表达和生产腈水合物，也可以使用。在本发明的一个实施方案中，生产腈水合酶的微生物的代表是红球菌属(rhodococcus)，例如玫瑰色红球菌或食吡啶红球菌。在本上下文中，玫瑰色红球菌种的代表实例可以包括在“ncimb41164、ferm-bp1478(j1)、m33或m8下保藏的菌株。此外，在本发明上下文中，生产腈水合酶的微生物可以是被遗传改造的微生物，这些微生物天然不含有编码腈水合酶的基因，但其已被处理，从而含有编码腈水合酶的多核苷酸(例如，通过转化、转导、转染、缀合或其他本领域已知的适于将多核苷酸转移或插入细胞的方法，如sambrook和russell2001，molecularcloning：alaboratorymanual，cshpress，coldspringharbor，ny，usa)，从而使得微生物能够生产腈水合酶。为此目的，可能还需要插入额外的多核苷酸，其可以是分别允许腈水合酶基因或mrna转录和翻译所必需的多核苷酸。此类额外的多核苷酸例如可以包括启动子序列、polyt-或polyu-尾，或复制起点或其它质粒-控制序列等。在本上下文中，这种天然地不含有编码腈水合酶的基因但已被操作以例如含有编码腈水合酶的多核苷酸的遗传改造的微生物，可以是原核或真核微生物。这种原核微生物的实例包括，例如，代表的大肠杆菌种。真核微生物的实例包括，例如，酵母(例如，酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)。
在本发明的一个具体实施方案中，本文提供的和在本发明的上下文中使用的组合物中所含的糖(i)是葡萄糖，有机酸(ii)是乳酸，并且生产腈水合酶的微生物是玫瑰色红球菌，例如，ncimb41164或ferm-bp1478。
在本发明的另一个具体实施方案中，生产腈水合酶的微生物是玫瑰色红球菌，并且组合物中糖(i)和有机酸(ii)之间的比率为3:7至7:3之间。
在本发明的另一个具体实施方案中，本文提供的和在本发明的上下文中使用的组合物中所含的糖(i)是葡萄糖，有机酸(ii)是乳酸，生产腈水合酶的微生物是玫瑰色红球菌，并且该组合物中糖(i)和有机酸(ii)的比率为3:7和7:3之间。
在本发明的上下文中，术语“腈水合酶”是指能够催化丙烯腈水合成丙烯酰胺的酶腈水合酶(在本文中也称为“nhase”)，即其具有腈水合酶活性。在本发明的上下文中，本发明意义上的腈水合酶的活性可如下测定：首先将100μl细胞悬浮液、细胞裂解物、溶解的酶粉末或含有推定的腈水合酶的任何其它制剂，与875μl的50mm磷酸钾缓冲液和25μl的丙烯腈在25℃下在eppendorf管摇床上以1,000rpm反应10分钟。在10分钟的反应时间后，抽取样品并通过加入相同体积的1.4％盐酸立即淬灭。混合样品后，通过在10,000rpm下离心1分钟除去细胞，通过hplc分析澄清上清液，测定形成的丙烯酰胺的量。丙烯酰胺的浓度应在0.25和1.25mmol/l之间——如果必要，样品必须相应稀释，并且必须重复转化。用hplc分析获得的丙烯酰胺浓度，除以反应时间(其为10分钟)、并将该值与hplc样品和原始样品之间的稀释因子相乘，从丙烯酰胺的浓度推导出酶活性。活性>10u/ml，优选>100u/ml，更优选>1,000u/ml，表示存在功能性表达的腈水合酶，并被认为是腈水合酶活性，因此，是在本发明上下文中的腈水合酶。例如，本文所用的腈水合酶还包括根据iubmb命名法(截至2014年9月30日)分类为ec4.2.1.84或cas-no.2391-37-5的酶，以及例如能够更快地将腈化合物(例如丙烯腈)转化为酰胺化合物(例如丙烯酰胺)的修饰或增强的酶，或可以以更高的产率/时间比生产的酶，或者更稳定的酶，只要它们能够催化腈化合物(例如丙烯腈)转化(即水合)成酰胺化合物(例如丙烯酰胺)。在本发明的上下文中，腈水合酶可以是由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含与seqidno：1的核苷酸序列(玫瑰色红球菌腈水合酶的α-亚基)和/或seqidno：3的核苷酸序列(玫瑰色红球菌腈水合酶的β-亚基)至少70％、优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％、更优选至少99.5％、最优选100％相同的核苷酸序列，或由所述核苷酸序列组成，其中，
seqidno：1的核苷酸序列为：
gtgagcgagcacgtcaataagtacacggagtacgaggcacgtaccaaggcgatcgaaaccttgctgtacgagcgagggctcatcacgcccgccgcggtcgaccgagtcgtttcgtactacgagaacgagatcggcccgatgggcggtgccaaggtcgtggccaagtcctgggtggaccctgagtaccgcaagtggctcgaagaggacgcgacggccgcgatggcgtcattgggctatgccggtgagcaggcacaccaaatttcggcggtcttcaacgactcccaaacgcatcacgtggtggtgtgcactctgtgttcgtgctatccgtggccggtgcttggtctcccgcccgcctggtacaagagcatggagtaccggtcccgagtggtagcggaccctcgtggagtgctcaagcgcgatttcggtttcgacatccccgatgaggtggaggtcagggtttgggacagcagctccgaaatccgctacatcgtcatcccggaacggccggccggcaccgacggttggtccgaggaggagctgacgaagctggtgagccgggactcgatgatcggtgtcagtaatgcgctcacaccgcaggaagtgatcgtatga
其中seqidno：3的核苷酸序列为：
atggatggtatccacgacacaggcggcatgaccggatacggaccggtcccctatcagaaggacgagcccttcttccactacgagtgggagggtcggaccctgtcaattctgacttggatgcatctcaagggcatatcgtggtgggacaagtcgcggttcttccgggagtcgatggggaacgaaaactacgtcaacgagattcgcaactcgtactacacccactggctgagtgcggcagaacgtatcctcgtcgccgacaagatcatcaccgaagaagagcgaaagcaccgtgtgcaagagatccttgagggtcggtacacggacaggaagccgtcgcggaagttcgatccggcccagatcgagaaggcgatcgaacggcttcacgagccccactccctagcgcttccaggagcggagccgagtttctctctcggtgacaagatcaaagtgaagagtatgaacccgctgggacacacacggtgcccgaaatatgtgcggaacaagatcggggaaatcgtcgcctaccacggctgccagatctatcccgagagcagctccgccggcctcggcgacgatcctcgcccgctctacacggtcgcgttttccgcccaggaactgtggggcgacgacggaaacgggaaagacgtagtgtgcgtcgatctctgggaaccgtacctgatctctgcgtga
条件是，由所述多核苷酸编码的多肽能够催化丙烯腈水合成丙烯酰胺(即具有腈水合酶活性)，如本文所述和例举的。同样在本发明的上下文中，腈水合酶可以是包含与seqidno：2的氨基酸序列(玫瑰色红球菌腈水合酶的α-亚基)和/或seqidno：4的氨基酸序列(玫瑰色红球菌腈水合酶的β-亚基)至少70％、优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％、更优选至少99.5％、最优选100％相同的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成的多肽，
其中seqidno：2的氨基酸序列为：
vsehvnkyteyeartkaietllyerglitpaavdrvvsyyeneigpmggakvvakswvdpeyrkwleedataamaslgyageqahqisavfndsqthhvvvctlcscypwpvlglppawyksmeyrsrvvadprgvlkrdfgfdipdevevrvwdssseiryiviperpagtdgwseeeltklvsrdsmigvsnaltpqeviv
其中seqidno：4的氨基酸序列为：
mdgihdtggmtgygpvpyqkdepffhyewegrtlsiltwmhlkgiswwdksrffresmgnenyvneirnsyythwlsaaerilvadkiiteeerkhrvqeilegrytdrkpsrkfdpaqiekaierlhephslalpgaepsfslgdkikvksmnplghtrcpkyvrnkigeivayhgcqiypesssaglgddprplytvafsaqelwgddgngkdvvcvdlwepylisa
条件是所述多肽能够催化丙烯腈水合成丙烯酰胺，如本文所述和例举的。
两个或更多个序列(例如，核酸序列或氨基酸序列)之间的同一性水平可以通过本领域已知的方法例如通过blast分析容易地确定。通常，在本发明的上下文中，如果待(例如通过序列比较)进行比较的两个序列(例如，多核苷酸序列或氨基酸序列)在同一性上不同，则术语“同一性”可以指较短的序列和与所述较短序列匹配的较长序列的那部分。因此，当比较的序列不具有相同的长度时，同一性程度优选地可以指较短序列中与较长序列中的核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分比，或者指在较长序列中与较短序列中的核苷酸序列相同的核苷酸的百分比。在本上下文中，技术人员容易确定与较短序列匹配的较长序列的部分。此外，如本文所使用的，核酸序列或氨基酸序列的同一性水平可以指相应序列的整个长度，并且优选成对评估，其中每个空位计为一个错配。序列比较的这些定义(例如，“同一性”值的建立)适用于本文描述和公开的所有序列。
此外，如本文所使用的术语“同一性”是指，在相应序列之间存在功能和/或结构等同。与本文所述的特定核酸/氨基酸序列具有给定同一性水平的核酸/氨基酸序列可以表示这些序列的衍生物/变体，其优选具有相同的生物学功能。它们可以是天然存在的变异，例如来自其他变种，物种等的序列，或可以是突变，并且所述突变可以是天然形成的或可以通过有意诱变产生。此外，变异可以是合成产生的序列。变体可以是天然存在的变体或合成产生的变体或通过重组dna技术产生的变体。与上述核酸序列的偏差可以通过例如缺失、取代、添加、插入和/或重组产生。术语“添加”是指在给定序列的末端添加至少一个核酸残基/氨基酸，而“插入”是指在给定序列中插入至少一个核酸残基/氨基酸。术语“缺失”是指删除或去除给定序列中的至少一个核酸残基或氨基酸残基。术语“取代”是指替换给定序列中的至少一个核酸残基/氨基酸残基。同样，这里使用的这些定义经必要修改后适用于本文提供和描述的所有序列。
通常，如本文所用，术语“多核苷酸”和“核酸”或“核酸分子”应同义地解释。通常，核酸分子尤其可以包含dna分子、rna分子、寡核苷酸硫代磷酸酯、取代的核糖寡核苷酸或pna分子。此外，术语“核酸分子”可以指本领域已知的dna或rna或其杂交物或其任何修饰(对于修饰的实例，参见例如us5525711、us4711955、us5792608或ep302175)。多核苷酸序列可以是单链或双链、线性或环状、天然或合成的、并且没有任何大小限制。例如，多核苷酸序列可以是基因组dna、cdna、线粒体dna、mrna、反义rna、核酶rna或编码此类rna的dna或嵌合体(chimeroplast)(gamper,nucleicacidsresearch,2000,28,4332-4339)。所述多核苷酸序列可以是载体、质粒或病毒dna或rna的形式。本文还描述了与上述核酸分子互补的核酸分子和能够与本文所述的核酸分子杂交的核酸分子。本文所述的核酸分子还可以是本发明上下文中的核酸分子的片段。特别地，这样的片段是功能片段。这样的功能片段的实例是可以用作引物的核酸分子。
一般来说，本发明涉及本文所述的所有实施例以及其所有排列和组合。本文描述的任何特定方面或实施方式不应被解释为将本发明的范围限制在这些方面或实施方案。
以下实施例举例说明本发明。然而，本发明不应被解释为受以下实施例的限制。
实施例
实施例1
红球菌的培养
在微发酵系统中，针对不同红球菌菌株(玫瑰色红球菌“ciba”(ncimb41164)和玫瑰色红球菌“j1”(fermbp-1478))，评估了不同糖/有机酸比率。
基础培养基含有酵母提取物(biospringer)(1.25g/l)、kh2po4(10g/l)、k2hpo4(10g/l)、(nh4)2so4(1g/l)、mgso4*7h2o(0.375g/l)、cacl2*2h2o(25mg/l)、微量元素溶液(2.5g/l)(参见下文)、co(no3)2(31.2mg/l)、消泡剂p2000(basf)(62.5mg/l)、尿素(7g/l)和谷氨酸铵(2.5g/l)，在h2o中。
微量元素溶液：柠檬酸一水合物(40g/l)、znso4*7h2o(11g/l)、(nh4)2fe(so4)2*6h2o(8.5g/l)、mnso4*h2o(3g/l)和cuso4*5h2o(0.8g/l)，在h2o中。
然后向培养基中补充10g/l碳源(糖、有机酸或两者的混合物，如下表所示)。使用h3po4或naoh将ph调节至6.6。将培养基直接从冷储备物接种至od0.05(在600nm测量)。在biolector微发酵系统(m2plabs，baesweiler，germany)中使用具有1.5ml工作体积的48孔花板，在37℃下以1,100rpm进行培养64小时。培养后，抽取样品，用盐酸淬灭，如实施例2所述测定腈水合酶活性。
在下表中，提供了不同菌株和糖/酸比率的相对腈水合酶活性。将糖作为唯一碳源获得的腈水合酶活性设定为100％。
表1：玫瑰色红球菌“ciba”
表2：玫瑰色红球菌“j1“
实施例2
腈水合酶活性的测定
从实施例1的培养基中取样，并用50mmol/lkh2po4缓冲液(ph7.0)1:10(v/v)稀释。获得的溶液用50mmol/lkh2po4缓冲液(ph7.0)进一步稀释1:20(v/v)，以达到培养基的最终稀释因子1:200。
反应：
将875μlkh2po4缓冲液(ph7.0)吸移到2mleppendorf管中。加入100μl稀释的培养基，并将混合物在恒温混合器中在25℃下以500rpm预孵育5分钟。预孵育后，通过加入25μl丙烯腈开始反应。反应在25℃和1,000rpm下进行10分钟。
样品制备：
在10分钟的反应时间后，通过将300μl反应溶液转移到含有300μl的1.4％(m/v)盐酸的1.5mleppendorf管中来淬灭反应。将混合物短暂涡旋并在台式离心机中以10,000rpm离心1分钟以分离细胞。将100μl澄清的上清液与900μl水混合。然后通过hplc分析混合物。
hplc分析：
柱：aqua5μc18125a，250×4.60mm(phenomenex)
烘箱温度：45℃
注射体积：1μl
检测：uv210nm
流速：1.0ml/min
溶剂a：25mmol/lkh2po4ph2.5
溶剂b：乙腈
分离：10％b(等度)
保留时间：丙烯酰胺：
hplc值应在0.25和1.25mmol/l之间
通过hplc测定的丙烯酰胺的浓度应该在0.25和1.25mmol/l之间。如果这没有直接达到，则需要相应地调节反应中使用的细胞浓度。
腈水合酶活性的测定：
c：产物物质的量[mm](hplc-值)
t：孵育时间[min]，在该测试中10分钟
k：稀释因子-从初始样品到hplc样品的总稀释度
计算活性，以ku/l计
一个活性单位[u]定义为在1分钟反应时间内生产1μmol丙烯酰胺。