一种改造腈水合酶及其应用的制作方法

本发明属于酶工程和工业微生物技术领域，具体涉及一种改造腈水合酶及其应用。

背景技术：

微生物生产的腈水合酶可以高效催化丙烯腈水合生成丙烯酰胺。丙烯酰胺聚合产生的聚丙烯酰胺在三次采油、水处理、造纸等工业生产领域具有非常广泛的应用。利用微生物产生的腈水合酶催化生产丙烯酰胺具有一系列优点，包括反应在常温常压下进行、能耗低、操作简单、安全、丙烯腈转化率高、产物浓度和纯度高等，因此逐渐成为丙烯酰胺生产的主要方法。

微生物法生产丙烯酰胺的研究重点在于高产腈水合酶菌株的发现和改造以及对腈水合酶本身性能的基因工程改造。其中，在基因工程方面，日本三菱化成株式会社对来自根瘤菌属的腈水合酶基因和蛋白申请了专利《具有腈水合酶活性的新型蛋白和编码该蛋白的基因》(申请号：93106122.9)；三井化学株式会社对来自嗜热假诺卡氏菌jcm3095的腈水合酶的蛋白以及编码它的基因申请了专利《参与活化腈水合酶的蛋白以及编码它的基因》(专利号：zl99106291.4)；《新型腈水合酶》(专利号：02156180.x)，并研究了该基因在重组大肠杆菌中的表达；德国底古萨股份公司申请了《红球菌属的腈水合酶》(申请号：200580008206.8)；清华大学公开了“一种腈水合酶及其编码基因与应用”，构建了α亚基起始密码子突变的腈水合酶，并在大肠杆菌中高活性表达(专利号：zl200410042576.0)；清华大学在专利“一种腈水合酶基因簇及其应用”中公开了红色(赤)红球菌rhodococcusruberth中与腈水合酶高表达相关的结构基因和调控基因序列(专利号：zl200910076710.1)。

除了产物/底物耐受性外，在微生物法生产丙烯酰胺的催化水合过程中，制约生产效率的另一个主要问题就是产酶细胞的耐热性较差，水合温度必须通过低温制冷剂控制在15-22℃。由于腈水合酶催化丙烯腈水合生成丙烯酰胺是强放热反应，工业生产中控温的冷量经常供应不足，导致水合温度波动到25℃以上。较高的水合温度一方面会加快反应速率，提高生产效率，另一方面则会造成腈水合酶的快速失活，减少反应批次，增加生产成本。日本三菱丽阳株式会社公开了专利《改良型腈水合酶》(公开号：cn1961072a)，对腈水合酶β亚基第93位、第167位和219位氨基酸残基进行定点突变，提高了腈水合酶的热稳定性；清华大学在专利“一种突变腈水合酶”中对腈水合酶β亚基的141位ser、143位ser、144位leu进行置换，使得腈水合酶的耐热性、产物耐受性和超声耐受性都有显著提升(专利号：zl201110415465x)。

技术实现要素：

本发明为了提高腈水合酶的抗逆性、耐热性和产物耐受性，提出一种改造腈水合酶及其应用。

具体技术方案如下：

一种改造腈水合酶通过将原腈水合酶的α亚基第215位氨基酸和β亚基第133位氨基酸之间形成二硫键改造而成。

进一步地，所述原腈水合酶的α亚基的氨基酸序列如序列表seqidno:2所示氨基酸序列；所述原腈水合酶的β亚基的氨基酸序列如序列表seqidno:1所示氨基酸序列。

进一步地，所述二硫键形成的方法为：将seqidno:1所示氨基酸序列的215位asp置换为cys，将seqidno:2所示氨基酸序列的133位pro置换为cys。

一种编码上述改造腈水合酶的基因。

进一步地，所述改造腈水合酶的基因序列如seqidno:3所示。

一种含有所述改造腈水合酶基因的表达载体。

进一步地，所述表达载体优选质粒。

进一步地，所述启动子为原核生物启动子，包含但不限于如pami，pa2，ptac，placz启动子(刘昌春等.红球菌启动子识别及β-半乳糖苷酶报告基因表达.生物工程学报,2009,25(9):1360-1365.)。

一种含有所述改造腈水合酶基因或含有所述表达载体的转化体。

进一步地，所述转化体的构建方法为：将含有权利要求4所述改造腈水合酶基因直接插入受体菌的染色体，或采用氯化钙法或电穿孔转化法将含有权利要求6所述改造腈水合酶基因的表达载体导入受体菌。

进一步地，所述受体菌为大肠杆菌、红球菌、诺卡氏菌或丙酸棒杆菌。

进一步地，所述转化体在制备丙烯酰胺中的应用。

上述改造腈水合酶在制备丙烯酰胺中的应用。

本发明的有益效果：

1、本发明改造腈水合酶的抗逆性、耐热性和产物耐受性都有显著提升，并且没有导致腈水合酶活性的降低。在60℃高温下浸泡10min，改造后腈水合酶的残留酶活是改造前腈水合酶残留酶活的2.35倍；在高浓度丙烯酰胺溶液的浸泡下，改造后腈水合酶的残留酶活是改造前腈水合酶残留酶活的2.12倍。

2、改造腈水合酶可催化获得高浓度丙烯酰胺产物，并且可以多批次回用。在利用丙烯腈生产丙烯酰胺的过程中，改造后腈水合酶可催化生产62％高浓度丙烯酰胺，而改造前腈水合酶仅可催化生成50％丙烯酰胺；在利用腈水合酶催化生产50％丙烯酰胺的批次反应过程中，改造后腈水合酶可实现连续4批次回用，而改造前腈水合酶仅可用1次，改造后腈水合酶综合性能优势明显，具有良好的工业应用前景。

附图说明

图1为改造前、后腈水合酶的活性比较。

图2为改造前、后腈水合酶的热稳定性比较。

图3为改造前、后腈水合酶的丙烯酰胺耐受性比较。

图4为改造前、后腈水合酶催化丙烯腈生成高浓度丙烯酰胺比较。

图5为改造后腈水合酶sbmdb生产得到的高浓度丙烯酰胺。

图6为改造后腈水合酶催化丙烯腈水合生成丙烯酰胺批次反应中丙烯酰胺浓度变化。

图7为改造后腈水合酶催化丙烯腈水合生成丙烯酰胺批次反应中电导率值变化。

具体实施方式

以下实施例便于更好地理解本发明，但不仅限于此。

以下实验方法如无特殊说明均为常规方法；实验试剂如无特殊说明均可从商业途径获得。

实施例1：改造后腈水合酶sbmdb基因置换过程

(1)以质粒pnv-sbm(陈杰等，耦合末端盐桥与定点突变的重组腈水合酶催化动力学.化工学报，2014，65(7)：2821-2828)为模板，采用反向聚合酶链式反应(pcr)方法进行基因突变。首先对腈水合酶sbm的β亚基引入置换aspβ215cys。

采用正向引物sbm-beta215-sense：tgtgtagtgtgcgtcgatctctg；反向引物sbm-beta215-anti：tttcccgtttccgtcgtcg。

pcr反应体系为：

反应条件为：

所得pcr扩增产物利用omegabiotek公司生产的e.z.n.a.gelextractionkit凝胶回收试剂盒回收，回收过程按照说明书所述过程完成。所得dna片段进行磷酸化反应，磷酸化反应体系为：

反应条件为37℃，30min。

所得磷酸化产物利用omegabiotek公司生产的e.z.n.a.gelextractionkit凝胶回收试剂盒进行纯化，纯化过程按照说明书所述过程完成。纯化片段利用t4dna连接酶在4℃进行连接反应16h；再将连接反应产物转化宿主菌e.colibl21(de3)的感受态细胞(天根生化科技有限公司)，采用卡那霉素抗性(kan)lb固体培养基平板，挑选阳性克隆，所得重组质粒送铂尚生物科技公司进行dna测序验证。

lb培养基组成为：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l，卡那霉素，50mg/l，琼脂粉，15g/l，ph7.0。

以上述所得重组质粒为模板，继续对腈水合酶α亚基引入置换proα133cys。突变方法与上述腈水合酶β亚基引入置换方法相似，采用正向引物为sbm-alpha133-sense：tgtcgtggagtgctcaagcg，反向引物为sbm-alpha133-anti：gtctgctaccactcgggaccg。

通过以上基因置换过程，即得到改造后的腈水合酶基因，其具有seqidno:3所示序列，将其命名为sbmdb。

实施例2：改造后腈水合酶转化体的构建及改造腈水合酶在转化体中的表达

将实施例1获得的改造腈水合酶基因(seqidno:3所示)的质粒pnv-sbmdb采用电穿孔的方式转入宿主菌红色红球菌r.ruberth3。转化体采用含卡那霉素浓度为25mg/l的红球菌平板培养基进行筛选，从而得到转化体r.ruberth3/pnv-sbmdb。

得到的表达菌株r.ruberth3/pnv-sbmdb进行摇瓶发酵培养。首先在含有25mg/l卡那霉素的红球菌种子培养基中接种，于28℃、200rpm培养36h。

从培养得到的种子液中接种10％至红球菌发酵培养基中，于28℃、200rpm培养48h。所得细胞进行酶活测定。

红球菌平板培养基组成为：葡萄糖10g/l，酵母膏3g/l，nacl1g/l，k2hpo4·3h2o2g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，琼脂15g/l。

红球菌种子培养基组成为：葡萄糖20g/l，酵母膏1g/l，蛋白胨7g/l，k2hpo4·3h2o0.5g/l，kh2po40.5g/l，mgso4·7h2o0.5g/l。

红球菌发酵培养基组成为：葡萄糖30g/l，酵母膏7.5g/l，尿素10g/l，k2hpo4·3h2o2.28g/l，kh2po40.866g/l，mgso4·7h2o1g/l，谷氨酸钠1g/l，cocl210.4mg/l。

酶活测定以丙烯腈为底物，采用气相色谱法。取4.5ml10mmph7.0的磷酸盐pbs缓冲液和0.1ml的菌液装入10mlep管中，恒温至28℃，加入200μl丙烯腈后迅速混匀，与此同时，按下秒表计时，准确反应5min后，加入200μl2.5mhcl终止反应。将反应液离心后，与4％的乙酰胺(内标)溶液等体积混合，采用气相色谱仪trace1300(thermo，美国)内标法测量丙烯酰胺浓度。气相色谱操作条件为：聚乙二醇高分子毛细管柱peg-20m(30m×0.25mm×2μm)，进样口为spl，温度260℃；fid检测器，温度260℃；柱温190℃；载气为氮气，分压为108kpa；分流进样，进样量0.4μl，分流比为50:1。

酶活测定结果表明，重组菌r.ruberth3/pnv-sbmdb表达改造腈水合酶的酶活为3452u/ml，改造前腈水合酶酶活为3601u/ml(如图1)。改造后腈水合酶酶活仅略有下降。

实施例3：改造后腈水合酶的抗逆性评估

将实施例2中收获的50ml表达菌株r.ruberth3/pnv-sbmdb细胞(表达改造腈水合酶)与对照菌株r.ruberth3/pnv-sbm细胞用等体积的去离子水洗涤一次，再重悬于等体积的10mm的pbs缓冲液中。

各取5ml重悬的细胞，在60℃水浴中放置10min。对改造后腈水合酶和改造前腈水合酶的残余酶活进行测定，结果表明，改造后腈水合酶的残留酶活为69.40％，而改造前腈水合酶的残留酶活仅为29.47％。改造后腈水合酶的热稳定性显著提升(如图2)。

各取20ml重悬的重组细胞分别放置于100ml锥形瓶中，边搅拌边滴加丙烯酰胺，60％的丙烯酰胺以0.5ml/min的流速均匀滴加至锥形瓶中。每隔一段时间从锥形瓶中取出1ml混合液离心，所得沉淀用去离子水清洗三次后，测定残余的腈水合酶酶活。当混合液中丙烯酰胺浓度达到40％时，改造后腈水合酶的残留酶活为36％，而改造前的腈水合酶残留酶活仅为17％。改造后腈水合酶的丙烯酰胺耐受性显著提升(如图3)。

实施例4：改造后腈水合酶催化丙烯腈水合生成高浓度丙烯酰胺

将实施例2中收获的表达菌株r.ruberth3/pnv-sbmdb细胞(表达改造腈水合酶)与对照菌株r.ruberth3/pnv-sbm细胞用等体积的去离子水洗涤一次，再重悬于等体积的去离子水中。

分别取400ml上述细胞悬浮液放置于1000ml三口瓶中，冰浴条件下进行水合反应。边搅拌边滴加丙烯腈，滴加速度以控制反应温度为18-25℃来调节，当反应体系中丙烯腈浓度高于1％时，停止滴加丙烯腈。如图4所示，改造后表达菌株r.ruberth3/pnv-sbmdb细胞可催化生成浓度为62％的丙烯酰胺，最终生成的丙烯酰胺由于浓度过高从而产生晶体附着于瓶壁(如图5)。而改造前菌株仅能催化生成浓度为50％的丙烯酰胺。

实施例5：改造后腈水合酶催化丙烯腈水合生成丙烯酰胺批次反应

分别取400ml实施例4中所得的细胞悬浮液放置于1000ml三口瓶中，冰浴条件下进行水合反应。边搅拌边滴加丙烯腈，滴加速度以控制反应温度为18-25℃来调节，当丙烯酰胺产物浓度达到50％时，停止滴加丙烯腈。反应得到的丙烯酰胺通过中空纤维膜与菌体分离，所得菌体回收并继续进行下一批次水合反应，如此重复。反应过程中隔一段时间取样测定反应液中的丙烯酰胺浓度和电导率值。如图6所示，改造后表达菌株r.ruberth3/pnv-sbmdb细胞可以完成4批反应，而改造前细胞仅能完成1批反应。在该反应过程中，改造后表达菌株r.ruberth3/pnv-sbmdb细胞电导值也明显低于改造前菌株(如图7)。说明改造后腈水合酶具有更加优良的水合催化效果，所得改造菌株在丙烯腈水合生成丙烯酰胺催化过程中具有更优秀的表现。

sequencelisting

<110>清华大学

<120>一种改造腈水合酶及其应用

<130>2017

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>229

<212>prt

<213>人工序列

<400>1

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thrleuserileleuthrtrpmethisleulysglymetsertrptrp

354045

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505560

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65707580

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100105110

arglyspheaspproalagluileglulysalailegluargleuhis

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130135140

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145150155160

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180185190

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225

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<212>prt

<213>人工序列

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180185190

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