腈水解酶突变体及其应用的制作方法

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(一)技术领域

本发明涉及一种来源于敏捷食酸菌(acidovoraxfacilis)cctccno:m209044腈水解酶的突变体及其在抗癫痫药物中间体1-氰基环己基乙酸合成中的应用。

(二)

背景技术：

加巴喷丁是美国warner-lambert公司首先开发的抗癫痫药，与目前使用的同类产品相比，具有口服吸收快，耐受性好，毒副作用小，治疗效果好，在体内不代谢，不与血浆蛋白结合，不诱导肝酶，能够穿过人体大脑的血脑屏障，与其他抗癫痫病药物相互作用的可能性很低，作为难治性癫痫病的叠加用药作用尤为突出。

1-氰基环己基乙酸(1-cyanocyclohexaneaceticacid)是合成新一代抗癫痫药物加巴喷丁(gabapentin)的关键中间体，市场前景非常广阔。目前，用于合成加巴喷丁包括其关键中间体1-氰基环己基乙酸全部采用化学合成技术，生产过程中存在三废排放量大，环境污染严重，三废处理成本高等问题。

腈水解酶(nitrilaseec3.5.5.1)是一种能将腈类物质(含有-cn)水解为相应羧酸的酶。腈水解酶催化反应具有高效性、高选择性、反应条件温和、环境污染小、成本低等特点，是一种环境友好的绿色合成方法，符合原子经济的要求，对节能减排及建设和谐社会具有重要的现实意义。由于腈水解酶的这些优异的特性，使其成为工业上极具发展潜力的催化剂。目前工业化应用中比较成功的腈水解酶的例子很多，德国basf公司的产品(r)-扁桃酸，首先由苯甲醛和氢氰酸反应生成消旋扁桃腈，再选择合适的反应条件，通过腈水解酶催化的动态动力学拆分，可以定量地转化为(r)-扁桃酸。杜邦公司开发了一套工业化生产过程，将2-甲基戊二腈(mgn，己二腈制造尼龙-66过程中产生的副产物)转化为1,5-二甲基-2-哌啶酮(1,5-dmpd)。1,5-二甲基-2-哌啶酮在电子学、涂层及溶剂应用中具有令人满意的特性。mgn首先用固定化的含腈水解酶的微生物细胞催化剂(acidovoraxfacilis72w)水解为4-氰基戊酸(4-cpa)铵盐，水解反应的选择性大于98％，转化率为100％，能得到二分之一氰基羧酸铵盐，产生1～2％的唯一反应副产物2-甲基戊二酸二铵盐。与一个由mgn加氢直接转化为1,3-dpmd和1,5-dmpd混合物的化学工艺相比，化学-酶法生产工艺产量高、产生的浪费较少，并生成单一的内酰胺异构体。此外，许多腈水解酶已经被开发并用于多种药物中间体和精细化学品的合成。

但是，天然的腈水解酶热稳定性普遍较差，这阻碍了其工业应用。提高酶的热稳定性，可通过对酶进行化学修饰或分子改造而实现。由于腈水解酶的晶体结构报道较少，对于腈水解酶稳定性的改造也罕有报道。crum和benedik等人多年来研究来源于短小芽胞杆菌(bacilluspumilus)的cyanidedihydratase(cyndpum)的温度稳定性。研究者首先利用易错pcr，筛选出了多个正向突变株(k93r,d172n和e327k)，随后将施氏假单胞菌(pseudomonasstutzeri)cyanidedihydratase(cyndstu)的c端与cyndpum融合，提高了其温度稳定性(参考文献)。

从敏捷食酸菌(acidovoraxfacilis)cctccno:m209044克隆的腈水解酶已经在大肠杆菌(escherichiacoli)bl21(de3)中过量表达，通过分子改造，对底物1-氰基环己基乙腈表现出了较高的催化活力，能够催化1-氰基环己基乙腈生产加巴喷丁的中间体1-氰基环己基乙酸(catalysiscommunications,2015，66,121-125)。但是，由于现有的生物催化剂还存在温度稳定性较差，高温下催化反应效率较低，反应时间较长等问题，而底物1-氰基环己基乙腈的溶解度就受到温度的显著影响，在温度较高的条件下反应能增加底物溶解度，促进反应效率，但是现有的腈水解酶还不能满足这一要求。因此，通过分子改造的方法提高腈水解酶的温度稳定性，提高反应效率，进一步降低生产成本具良好的工业应用价值。

(三)

技术实现要素：

本发明要针对来源于敏捷食酸菌(acidovoraxfacilis)cctccno:m209044腈水解酶温度稳定性较差的问题，提供了多个腈水解酶突变体蛋白及在1-氰基环己基乙酸合成中的应用，包括含有该基因的重组载体，以及重组载体转化得到的重组基因工程菌。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种腈水解酶突变体，所述突变体是将seqidno.2所示氨基酸序列的第201位，第339位和第343位氨基酸中的一位或多位进行突变获得的。

本发明利用易错pcr技术对来源于敏捷食酸菌(a.facilis)cctccno:m209044腈水解酶编码基因(genbankaccessionno.:ahw42593.1)进行随机突变，首先利用t7引物进行pcr扩增，进行随机突变，得到腈水解酶突变体核苷酸序列，连接至表达载体pet-28b(+)后转入大肠杆菌宿主，诱导表达后通过大规模、高通量的筛选方法检出正突变子，然后结合定点突变的方法，得到温度稳定性进一步提高的突变体，从而获得能够高效催化双腈化合物区域选择性水解合成单氰基羧酸化合物的突变体蛋白。

进一步，优选所述突变体为下列之一：(1)将seqidno.2所示氨基酸序列的第201位苏氨酸突变为苯丙氨酸(t201f)、异亮氨酸(t201i)、亮氨酸(t201l)或色氨酸(t201w)；(2)将seqidno.2所示氨基酸序列第339位谷氨酰胺突变为赖氨酸(q339k)；(3)将seqidno.2所示氨基酸序列第343位谷氨酸突变为赖氨酸(q343k)；(4)将seqidno.2所示氨基酸序列第201位的苏氨酸突变为苯丙氨酸，同时将第339位和第343位谷氨酸突变为赖氨酸。具体方法如下：构建含敏捷食酸菌(a.facilis)cctccno:m209044腈水解酶acn-f168v(即seqidno:2，由369个氨基酸残基组成，其核苷酸序列seqidno:1所示)的质粒pet-28b(+)-acn-f168v。将构建获得的pet-28b(+)-acn-f168v表达质粒导入大肠杆菌e.colibl21(de3)中实现过表达。采用易错pcr方法进行随机突变，并重组至表达载体pet-28b(+)，再将重组质粒转入表达宿主e.colibl21(de3)中，构建突变文库。挑选突变文库中的单菌落至96孔板中诱导表达蛋白，将培养的湿菌体溶于ph7.0的磷酸盐缓冲液中，取1/2菌液，利用苯酚-次氯酸钠法检测活力，其余菌液在45℃恒温水浴锅中保存24h后，采用相同的方法检测活力。将温度稳定性提高的菌株进行测序分析，获得突变体序列信息。将温度稳定性提高的突变体蛋白进一步进行定点突变，通过液相色谱测定水解双腈化合物酶活，将筛选得到的高稳定性突变体菌株进行测序分析，经过对上述构建的突变文库筛选以及理性设计方法，获得了活力提高的突变体为：acn-t201l(核苷酸序列seqidno.3)、acn-t201f(核苷酸序列seqidno.7)、acn-t201i(核苷酸序列seqidno.6)、acn-t201w(核苷酸序列seqidno.8)、acn-q339k(核苷酸序列seqidno.4)，acn-q343k(核苷酸序列seqidno.5)及acn-t201f/q339k/q343k(核苷酸序列seqidno.9)。

本发明还涉及一种所述腈水解酶突变体的编码基因、由所述编码基因构建的重组载体以及由所述重组载体转化宿主细胞获得的重组基因工程菌。所述的宿主细胞可以是本领域的各种常规宿主细胞，本发明优选大肠杆菌e.colibl21(de3)。

本发明还提供一种所述腈水解酶突变体在催化双腈化合物制备单氰基羧酸化合物中的应用，具体所述的应用以含腈水解酶突变体编码基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体、湿菌体固定化细胞或者湿菌体超声破碎后提取的纯酶为催化剂，以双腈化合物为底物，以ph＝7.0、200m磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液为反应介质，45℃恒温水浴反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得单氰基羧酸化合物；所述双腈化合物为1-氰基环己基乙酸、丙二腈或丁二腈。所述底物终浓度以缓冲液体积计为100～1000mm，优选1000mm，所述催化剂用量以湿菌体重量计为10～100g/l缓冲液，优选50g/l。

进一步，所述催化剂按如下方法之一制备：(1)将含腈水解酶突变体编码基因工程菌接种到lb培养基中，37℃培养10-12小时，按体积浓度2％的接种量接种至含终浓度50mg/l卡那霉素的lb培养基进行扩大培养，37℃培养至培养液的od600为0.6-0.8之间，加入终浓度为0.1mm异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷，28℃诱导培养10小时，离心，收集菌体，用生理盐水清洗2次，得到湿菌体；(2)将步骤(1)湿菌体用含终浓度300mmnacl的ph8.0、50mmnah2po4缓冲液重悬，超声波破碎(400w,15min,1s破碎1s暂停)，破碎产物离心(12000×g,20min)后取上清液作为粗酶液；将粗酶液以1ml/min的流速通过经平衡缓冲液冲洗的ni-nta柱，用洗脱缓冲液洗脱弱吸附的杂蛋白，流速为2ml/min；再用蛋白洗脱缓冲液洗脱并收集目的蛋白，流速为2ml/min；最后将收集的目的蛋白以质量浓度0.9％氯化钠水溶液为透析液进行透析，取截留液即为纯酶；所述平衡缓冲液为含终浓度300mmnacl的ph8.0、50mmnah2po4缓冲液；所述洗脱缓冲液为含终浓度300mmnacl和50mm咪唑的ph8.0、50mmnah2po4缓冲液；所述蛋白洗脱缓冲液为含终浓度300mmnacl和250mm咪唑的ph8.0、50mmnah2po4缓冲液；(3)将步骤(1)湿菌体悬浮于ph＝7.0、200mm磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液体系中，加入6mg/ml硅藻土，室温搅拌1h，随后加入体积终浓度3％聚乙烯亚胺，室温搅拌1h，最后加入体积终浓度1％戊二醛，搅拌1h，真空抽滤，获得固定化细胞；所述聚乙烯亚胺以质量浓度5％水溶液形式加入，所述戊二醛以质量浓度25％水溶液形式加入。

本发明所述的腈水解酶突变体可以是含有该腈水解酶突变体基因的重组表达转化体(即湿菌体，优选为大肠杆菌e.colibl21(de3))，也可以是未纯化的粗酶液，或是经过纯化后的纯酶，如果需要可以对其进行固定化后进行使用。

luria-bertani(lb)液体培养基终浓度组成：10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l氯化钠，溶剂为水，ph值自然。

lb固体培养基质量终浓度组成：10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l氯化钠，琼脂1.5％，溶剂为水，ph值自然。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明经过蛋白质分子改造，腈水解酶acn纯酶的热稳定性最高提高了14倍，且利用含有腈水解酶突变体的重组大肠杆菌在高温下(45℃)水解1-氰基环己基乙腈，反应时间缩短为原来的三分之一。因此，本发明所获得的突变体在高效催化1-氰基环己基乙腈合成加巴喷丁中间体1-氰基环己基乙酸中具有良好的应用前景。另外，发现突变株在45℃条件下催化丙二腈或丁二腈生产相应的氰基羧酸活性也大幅度提高，具有很高的应用价值。

(四)附图说明

图1腈水解酶突变体蛋白纯化后的电泳图。泳道1为acn-t201w，泳道2为acn-t201f，泳道3为acn-f168v，泳道4为acn-t201l，泳道5为acn-q343k，泳道6为acn-q339k，泳道7为acn-t201i。

图2腈水解酶突变体的活力比较。

图3腈水解酶突变体在45℃下的热稳定性。

图4含有腈水解酶突变体的重组大肠杆菌静息细胞45℃下温度稳定性。

图5含有腈水解酶突变体的重组大肠杆菌静息细胞转化750mm1-氰基环己基乙腈时间比较曲线图。

图6为1-氰基环己基乙酸高效液相色谱图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：构建腈水解酶突变文库

以含有克隆来源于敏捷食酸菌(a.facilis)cctccno:m209044腈水解酶基因acn-f168v(核苷酸序列seqidno.1、氨基酸序列seqidno.2)的pet-28b(+)-acn-f168v质粒为模版，利用t7promoter和t7terminator为引物(表1)进行pcr扩增，随机引入突变。pcr反应体系(50μl)：模版0.5～20ng，1×taqbuffer(不含mg²⁺)，0.2mmdntp，0.3mmmncl2，2mmmgcl2，引物t7promoter与t7terminator各0.2μm，taqdna聚合酶5u。pcr条件(1)95℃预变性5min；(2)94℃变性50s；(3)55℃退火60s；(4)72℃延伸120s，步骤(2)～(4)共30个循环；(5)最后72℃延伸5min，4℃保存。pcr产物经过琼脂糖凝胶电泳分析后切胶回收。

随后以上述胶回收产物为引物，扩增得到完整的质粒。pcr体系(50μl)为5×primestarbuffer(mg²⁺plus)，0.2mmdntp，2.5uprimestarhsdnapolymerase，胶回收产物50ng，pet-28b(+)-acn-f168v质粒20ng。pcr条件：(1)72℃保温5min；(2)98℃预变性3min；(3)98℃变性10s；(4)68℃退火5s；(5)72℃延伸6min，步骤(3)～(5)共35个循环；(5)最后72℃延伸5min，4℃保存。

扩增得到的pcr产物经内切酶dpni37℃消化3h后转化导入e.colibl21(de3)，涂布于含卡那霉素(50μg/ml)的lb平板，37℃培养过夜。

通过该易错pcr方法，每轮可以产生大概150-200个单菌落，总共产生了300,000-600,000个单菌落，并且经过测序，其突变频率(1-2bp/1000bp)符合预期。

表1引物设计表

实施例2：突变体的高通量筛选

挑取实施例1中的单菌落至96深孔板中培养，每个孔板加入1000μllb液体培养基(含有终浓度50μg/ml卡那霉素，终浓度1mmiptg)，37℃培养18h。将96深孔板的菌体离心30min(3000rpm，4℃)，弃上清后，用1.5ml磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液(200mm，ph7.0)重悬菌体。取出500μl菌悬液于新的96深孔板中，各孔中加入底物1-氰基环己基乙腈(终浓度100mm)，35℃反应1h。取出500μl菌悬液于新的96深孔板中，各孔中加入底物1-氰基环己基乙酸(终浓度100mm)，35℃反应12h。其余菌液放置于45℃恒温水浴摇床中，保温1天后，加入底物1-氰基环己基乙腈(终浓度100mm)，35℃反应1h。反应结束后，将96深孔板的反应液离心30min(3000rpm，4℃)，取出上清液(即为待测反应液)，采取苯酚-次氯酸钠法进行显色反应。

用移液管取2ml的a溶液(10g/l苯酚，50mg/l亚硝基铁氰化钠，溶剂为水)置于10ml的离心管中，加入4μl待测反应液，混合均匀之后再用移液管加入2ml的b溶液(5g/l氢氧化钠，8.8ml/l含5.2％有效氯的次氯酸钠溶液，溶剂为水)混合均匀。放入37℃中水浴加热5min，至离心管内颜色不再发生变化后，取200μl置于96孔板中，630nm处测量吸光度。配置100mm氯化铵水溶液，梯度稀释后，使用上述方法测定吸光度，以氯化铵浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线方程为y＝0.014x-0.01，x为氯化铵浓度，y为吸光值。之后依据标准曲线对比得到待测反应液中铵根的浓度，铵根浓度等于转化后得到的1-氰基环己基乙酸的浓度。

根据以下3个原则筛选突变体：1)突变体相较于出发菌株，活力没有明显的降低；2)突变体的区域选择性没有下降，即对于1-氰基环己基乙酸没有水解活力；3)45℃保温前后，突变体水解1-氰基环己基乙腈的活力下降速度相较于出发菌株慢。利用液相色谱复筛验证后，送至杭州擎科生物公司测序分析。确定热稳定性提高的突变体为t201l、q339k、q343k，其核苷酸序列分别为seqidno.3，seqidno.4，seqidno.5。

实施例3：定点突变及筛选

以表达质粒pet-28b(+)-acn-f168v为模版，通过全质粒扩增进行定点突变。pcr体系(50μl)为：模版0.5～20ng，引物t201-f及t201-r(序列见表1)各10-15pmol，5×primestarbuffer(mg²⁺plus)，0.2mmdntp，1.25uprimestarhsdnapolymerase。pcr条件(1)98℃预变性3min；(2)98℃变性10s；(3)55℃退火5s；(4)72℃延伸6.3min，步骤(2)～(4)共30个循环；(5)最后72℃延伸5min，4℃保存。pcr产物经过琼脂糖凝胶电泳验证，利用dpni消化后导入e.colibl21(de3)，涂布至含有50μg/ml卡那霉素的lb平板，得到单克隆。此轮定点饱和突变，一共产生200-300个单克隆，经过测序，包含了所有20种天然氨基酸。

利用实施例2中的显色反应，初步检测突变体的热稳定性、活力及区域选择性，随后利用液相色谱复筛验证。最终确定热稳定性提高突变体为t201i，t201f，t201w，核苷酸序列分别为seqidno.6，seqidno.7和seqidno.8所示。并且，利用同样的方法，构建组合突变体t201f/q343k/q339k，其核苷酸序列如序列表seqidno.9所示。

实施例4：腈水解酶突变体的表达

实施例2和实施例3中得到的突变体转化子e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201l，e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201i，e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f，e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201w，e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-q343k，e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-q339k和组合突变体e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f/q339k/q343k，以及原始菌株e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-f168v接种到lb培养基中，37℃培养10-12小时，按体积接种量2％接种至含有卡那霉素(终浓度50mg/l)的lb培养基进行扩大培养(37℃)。待培养液的od600为0.6-0.8之间，加入异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)至终浓度为0.1mm，28℃诱导培养10小时。培养液离心收集菌体，用生理盐水清洗2次，得到湿菌体。

实施例5：腈水解酶突变体蛋白的纯化

(1)向实施例4中收集到的湿菌体中加入50mmnah2po4，300mmnacl缓冲液(ph8.0)，重悬菌体后超声波破碎(400w,15min,1s破碎1s暂停)。破碎产物离心(12000×g,20min)后取上清液作为粗酶液，准备分离纯化。

(2)预装好20mlni-nta亲和层析柱后，使用平衡缓冲液(50mmnah2po4，300mmnacl，ph8.0)进行平衡，流速为2ml/min。

(3)清洗8-10个柱体积后将所得到的粗酶液以1ml/min的流速通过ni-nta柱，目的蛋白则挂载在层析柱上。上样后大量未吸附的杂蛋白不与树脂结合，将直接被除去。

(4)使用洗脱缓冲液(50mmnah2po4，300mmnacl，50mm咪唑，ph8.0)洗脱弱吸附的杂蛋白，流速为2ml/min。

(5)使用蛋白洗脱缓冲液(50mmnah2po4，300mmnacl，250mm咪唑，ph8.0)洗脱并收集目的蛋白，流速为2ml/min。

(6)收集的酶液使用透析袋(economicalbiotechmembrane，14kd，34mmwidth，购自生工生物工程(上海)股份有限公司)，透析液为质量浓度0.9％氯化钠水溶液，取截留液即为纯化后的蛋白。

(7)通过sds-page分析纯化后的蛋白，蛋白电泳结果如图1所示。

实施例6：腈水解酶活力的测定

对实施例5中纯化后的蛋白进行酶活的测定。腈水解酶活力检测反应体系(10ml)：缓冲液磷酸二氢钠-磷酸氢二钠(100mm,ph7.0)，200mm1-氰基环己基乙腈，50-100mg纯酶(优选75mg)。反应液于45℃预热10min后，150rpm反应10min。取样500μl上清，加入500μl2m的hcl终止反应后，利用液相色谱(岛津lc-16)外标法测定转化液1-氰基环己基乙酸转化率。色谱柱为c-18column(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为缓冲液(0.58g/l磷酸氢二铵，1.83g/l高氯酸钠，高氯酸调节ph为1.8)∶乙腈＝76∶24(v/v)，流速为1ml/min，紫外检测波长215nm，柱温40℃。酶活定义(u)：在45℃、ph7.0，100mm磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液条件下，每分钟催化生成1μmol1-氰基环己基乙酸所需要的酶量定义为1u。

实施例7：含腈水解酶突变体的重组大肠杆菌活力测定

对实施例4中重组大肠杆菌进行活力的测定。含腈水解酶突变体的重组大肠杆菌活力检测反应体系(10ml)：缓冲液磷酸二氢钠-磷酸氢二钠(200mm,ph7.0)，终浓度200mm1-氰基环己基乙腈，0.1g湿菌体。反应液于45℃预热10min后，150rpm反应10min。取样1ml，12000rpm离心3min后取上清，反应液用高效液相色谱分析产物浓度。高效液相色谱分析条件如实施例6中所述。

实施例8：腈水解酶突变体45℃下温度稳定性的测定

对实施例5中纯化后的蛋白进行热稳定性的测定。取一定量的蛋白于50ml无菌聚丙烯离心管中，保存于45℃恒温水浴锅中。于不同时间取出蛋白，按照实施例6的方法，测定蛋白的活力。以未保存时，蛋白的活力为对照，计算各时间下，蛋白的相对残余活力(residualactivity，简称ra)。以时间(h)为横坐标，相对残余活力的自然对数(ln(ra))为纵坐标，进行线性拟合，得出斜率k。根据一级失活动力学的公式可以得到酶蛋白的半衰期t1/2。

经测定，原始腈水解酶acn-f168v的半衰期为12.5h，突变体acn-t201w的半衰期为135h，突变体acn-t201l的半衰期为119h，突变体acn-t201i的半衰期为55h，突变体acn-t201f的半衰期为163h，突变体acn-q343k的半衰期为22.8h，突变体acn-q339k的半衰期为16.4h，组合突变体acn-t201f/q339k/q343k的半衰期为180h。

表2腈水解酶突变体在45℃下的半衰期

实施例9：含有腈水解酶突变体的重组大肠杆菌活力的测定

将实施例4中培养得到的含有腈水解酶突变体的重组大肠杆菌e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201l，e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201i，e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f，e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201w，e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-q343k，e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-q339k和e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f/q339k/q343k，以及原始菌株e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-f168v进行活力的测定。腈水解酶活力检测反应体系(10ml)：缓冲液磷酸二氢钠-磷酸氢二钠(200mm,ph7.0)，终浓度100mm1-氰基环己基乙腈，重组大肠杆菌湿菌体10g/l。反应液于45℃预热10min后，150rpm反应10min。取样500μl上清，利用液相色谱(岛津lc-16)外标法测定转化液1-氰基环己基乙酸转化率。液相检测条件如实施例6中所述，结果见图2所示。

实施例10：含有腈水解酶突变体的重组大肠杆菌45℃下温度稳定性的测定

将实施例4中培养得到的含有腈水解酶突变体的重组大肠杆菌e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201l，e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201i，e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f，e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201w，e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-q343k，e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-q339k和e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f/q339k/q343k，以及原始菌株e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-f168v静息细胞用缓冲液磷酸二氢钠-磷酸氢二钠(200mm,ph7.0)配置成20g/l的菌悬液，保存于45℃恒温水浴锅中。于不同时间取出菌悬液，按照实施例9的方法，测定静息细胞的活力。以未保存时，静息细胞的活力为对照，计算各时间下，静息细胞的相对残余活力，结果见图4所示。同样条件下测试实施例5获得的腈水解酶突变体纯化蛋白在45℃下温度稳定性，结果见图3所示。

实施例11：使用含腈水解酶突变体的重组大肠杆菌转化750mm1-氰基环己基乙腈

分别称取0.5g实施例4方法获得的e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f，e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f/q339k/q343k，以及原始菌株e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-f168v湿菌体悬浮于10ml磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液体系中(200mm，ph＝7.0)，加入1.125g1-氰基环己基乙腈(终浓度750mm)，45℃恒温水浴反应。于不同时间取样，12000rpm离心，弃去沉淀。处理后的反应液用高效液相色谱分析产物浓度。高效液相色谱分析条件如实施例6中所述。

经测定，如图5所述，突变体e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f和e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f/q339k/q343k均可在60min内将底物反应完全，远快于e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-f168v。

实施例12：使用含腈水解酶突变体的重组大肠杆菌转化1m1-氰基环己基乙腈

分别称取0.5g实施例4方法获得的e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f，e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f/q339k/q343k，e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201w以及原始菌株e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-f168v湿菌体悬浮于10ml磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液体系中(200mm，ph＝7.0)，加入1.5g1-氰基环己基乙腈(终浓度1m)，45℃恒温水浴反应。于不同时间取样，12000rpm离心，弃去沉淀。处理后的反应液用高效液相色谱分析产物浓度。高效液相色谱分析条件如实施例6中所述。

经测定，如表3所述，突变体e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f和e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f/q339k/q343k均可在2-2.5h内将底物反应完全，远优于e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-f168v。

表3含有腈水解酶突变体的重组大肠杆菌静息细胞转化1m1-氰基环己基乙腈

a：数据来源于xue,y.p.,etal.(2015).catalysiscommunications,66,121-125.

实施例13：使用含腈水解酶突变体的重组大肠杆菌转化丙二腈和丁二腈

分别称取0.1g实施例4方法获得的e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f，e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f/q339k/q343k，以及原始菌株e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-f168v湿菌体悬浮于10ml磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液体系中(200mm，ph＝7.0)，分别加入终浓度为50mm的丙二腈，丁二腈，45℃恒温水浴反应。于不同时间取样，12000rpm离心，弃去沉淀。处理后的反应液使用高效液相色谱测定。液相检测方法如下，色谱柱为chromolithspeedrodrp-18column50×4.6mm(merck)，流动相为乙腈/水/磷酸＝20:80:0.1％(v/v)，流速为2ml/min。

结果如表4所述，突变株e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f及e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f/q339k/q343k在区域选择性上与原始菌株e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-f168v相同，在催化丙二腈、丁二腈时，主要产物为单腈酸，且突变株e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f及e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f/q339k/q343k的反应速度均快于原始菌株e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-f168v。

表4使用含腈水解酶突变体的重组大肠杆菌转化其他的α,ω-双腈

实施例14：使用固定化细胞转化1m1-氰基环己基乙腈

分别称取2g实施例4方法获得的e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f，e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f/q339k/q343k，以及原始菌株e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-f168v湿菌体悬浮于20ml磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液体系中(200mm，ph＝7.0)，加入0.006g/ml硅藻土，室温搅拌1h。随后加入3％(v/v)聚乙烯亚胺(5％(w/w))，室温搅拌1h。最后加入1％(v/v)戊二醛(25％(w/w))，搅拌1h，真空抽滤获得固定化细胞。

将上述得到的全部固定化细胞悬浮于20ml磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液体系中(200mm，ph＝7.0)，加入3g1-氰基环己基乙腈(终浓度1m)，45℃恒温水浴反应。其中由原始菌株e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-f168v制得的固定化细胞每批次反应7-8小时，由e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f，e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f/q339k/q343k制得的固定化细胞，每批反应时间2.5-3.5小时。每批反应结束后，进行真空抽滤固液分离，反应液用高效液相色谱分析产物浓度(见实施例6)，固定化细胞则投入下一批次反应。结果如表5所示。

表5使用固定化细胞转化1m1-氰基环己基乙腈

sequencelisting

<110>浙江工业大学

<120>腈水解酶突变体及其应用

<130>

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