一种广谱新型嵌合裂解酶GBS‑PlySb及其编码基因和应用的制作方法

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种广谱新型嵌合裂解酶gbs-plysb及其编码基因和应用。

背景技术：

链球菌是一类球形的革兰氏阳性细菌，能引起人和动物的多种疾病。几种主要的链球菌致病菌包括肺炎链球菌、b组链球菌、猪链球菌、变形链球菌、化脓链球菌等。肺炎链球菌是导致大叶性肺炎和婴幼儿支气管肺炎，是院内感染的主要病原菌之一。b组链球菌，尤其是无乳链球菌能导致人和动物的多种感染。在医院内，无乳链球菌能导致孕妇围产期感染，严重威胁新生儿的健康；在养殖业，无乳链球菌能导致多种鱼类的鱼链球菌病，给养殖业造成的损失非常严重。猪链球菌病是一种人畜共患的急性、热性传染病，一旦感染危害非常巨大。变形链球菌是导致口腔龋齿的主要致病菌，目前还没有有效的预防和治疗药物。化脓链球菌则更普遍地分布于自然界，是人类细菌感染中最要的病原之一，能引起各种化脓性炎症，包括猩红热、丹毒、新生儿败血症、脑膜炎以及链球菌变态反应等疾病。由上所述可知，针对链球菌发展新型抗菌药物具有非常重要的意义。

噬菌体裂解酶是双链dna噬菌体感染宿主细菌后晚期表达的一种细胞壁水解酶，用于水解宿主细菌的细胞壁释放子代噬菌体。裂解酶通常具有模块化的结构，即包括n-端的催化功能域(cd)和c-端的细胞结合功能域(cbd)。这两个功能域相对独立，具有比较明确的功能。cd功能域主要体现为肽聚糖水解活性，而cbd功能域则具有与特定把细菌特异性识别的功能。基于这两者的功能上的差异，可以将不同来源的裂解酶的cd与cbd组合发展具有新功能的嵌合裂解酶。这种构建策略是目前裂解酶分子体外定向进化的一种有力工具，但是否将任意一个蛋白质的催化结构域和另外一个蛋白质的结合结构域融合在一起就可以获得一个新的有杀菌活性和新功能的裂解酶是不可预测的，且大多数随机组合所得到的都是没有活性、或者活性很低的裂解酶。如daniela等人通过人工设计才从7种不同的组合中筛选出1种有杀菌活性的裂解酶(antimicrobialagentsandchemotherapy,apr.2010,p.1603–1612)。

裂解酶由于具有较强的裂解活性和极低的耐药性，是一种潜在的抗菌分子。但是，由于裂解酶具有较强的宿主选择性，通常具有较窄的裂解谱，不能满足细菌混合感染的需求。因此，开发具有广谱裂解活性的嵌合裂解酶对于满足临床上治疗、控制细菌混合感染的需求、发展新的抗菌药物具有非常重要的意义。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种广谱新型嵌合裂解酶gbs-plysb，此裂解酶具有能采用大肠杆菌可溶性表达，酶活性高，能广谱杀灭链球菌的优点，可应用于制备体内、体外抗感染药物；本发明的另一目的是提供上述广谱的新型嵌合裂解酶gbs-plysb的应用。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种广谱新型嵌合裂解酶gbs-plysb，其氨基酸序列如seqidno.1所示。

一种广谱新型嵌合裂解酶gbs-plysb的编码基因，其核苷酸序列如seqidno.2所示。

一种广谱新型嵌合裂解酶gbs-plysb的应用，所述广谱新型嵌合裂解酶gbs-plysb应用于动物和人体外及体内杀灭链球菌、肠球菌和金黄色葡萄球菌。

进一步地，所述的链球菌包括肺炎链球菌、化脓链球菌、猪链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、变形链球菌、海豚链球菌。

进一步地，所述广谱新型嵌合裂解酶gbs-plysb作为有效成份应用于制备抗链球菌感染、肠球菌或金黄色葡萄球菌药物。

进一步地，所述的药物为预防与治疗奶牛乳腺炎、鱼链球菌病、猪链球菌病以及龋齿的药物。

有益效果：本发明公开的广谱新型嵌合裂解酶gbs-plysb可用于杀灭多种链球菌和葡萄球菌，特别是肺炎链球菌、化脓链球菌、猪链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、变形链球菌、海豚链球菌等以及多种肠球菌和金黄色葡萄球菌；gbs-plysb稳定性高，对高浓度的nacl不敏感，重组蛋白gbs-plysb能很好的在大肠杆菌bl21(de3)中表达，高剂量的gbs-plysb没有明显的细胞毒性。因此，gbs-plysb能单独，或者作为添加剂用于多种链球菌的控制以及治疗由这些菌导致的感染，具有广泛的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为gbs-plysb基因pcr扩增结果图；

图2为gbs-plysb杀灭停乳链球菌标准菌株atcc35666的时间变化结果图；

图3为gbs-plysb体外杀灭链球菌、葡萄球菌等不同菌株广谱性的结果图；

图4为gbs-plysb酶在不同nacl浓度下杀灭停乳链球菌atcc35666的活性结果图；

图5为gbs-plysb酶在不同ph时杀灭停乳链球菌atcc35666的活性结果图；

图6为gbs-plysb酶在不同edta浓度下杀灭停乳链球菌atcc35666的活性结果图；

图7为gbs-plysb酶在不同温度下杀灭停乳链球菌atcc35666的活性结果图；

图8为gbs-plysb酶对于细胞毒性的测试结果图；

图9为牛奶中gbs-plysb酶杀灭停乳链球菌atcc35666的结果图；

图10为血清中gbs-plysb酶杀灭停乳链球菌atcc35666的结果图；

图11为gbs-plysb酶与其它嵌合裂解酶的活性比较的结果图。

具体实施方式

展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。

实施例1：广谱链球菌嵌合裂解酶的构建

1.plygbs的催化域、plyss2的细胞壁结合域的制备

全序列合成裂解酶plygbs和裂解酶plyss2(南京金斯瑞生物技术有限公司)，合成序列装入puc57质粒中。以plygbs基因为模板，gbs180-f/gbs180-r为引物，扩增得plygbs的催化域gbs180的序列，以plyss2基因为模板，plysb-f/plysb-r为引物，扩增得plyss2的细胞壁结合域。克隆构建中所用到的引物和酶切位点信息如下：

gbs180-f:5-ttaaccatgggcatggctacctaccagg-3

gbs180-r:5-tataggatccgatcgttttggtcgtgc-3

plysb-f:5-tataggatcctctcgttcctatcgcgag-3

plysb-r:5-tatactcgagtttaaatgtaccccaag-3

gbs180-f引物下划线标注的是限制性内切酶ncoi位点，gbs180-r和plysb-f引物下划线标注的是限制性内切酶bamhi位点，plysb-r引物下划线标注的是限制性内切酶xhoi位点。

pcr扩增基因片段的程序如下：以2μl基因为模板，各加入引物1μg进行pcr扩增，pcr反应条件为：(1)94℃预变性5min；(2)94℃变性30sec，62℃，45sec，72℃，45sec，30个循环；(3)72℃延伸10min。

2.可溶表达gbs-plysb蛋白质

将gbs-plysb片段用相应的酶消化后连入用ncoi和xhoi消化后的pet28b(+)载体中，得到gbs-plysb的表达载体pet28b-gbs-plysb。然后将其转化大肠杆菌bl21(de3)。以gbs180-f/plysb-r为引物对转化子进行pcr验证，可扩增得到全长的gbs-plysb基因，如图1所示，图中m为标准分子量，箭头所指处为扩增gbs-plysb的条带，与目标大小801bp相符。

3.gbs-plysb的表达纯化

将表达菌株bl21(de3)/pet28b-gbs-plysb用2mm的iptg低温诱导表达。收集菌体后超声破碎，取上清过ni亲和柱，收集250mm洗脱峰，后于pbs中透析过夜。

透析后的蛋白可进一步经过离子交换树脂纯化，过hitrapqsepharoseffcolumn(gehealthcare)，收集柱流出物。将柱流出物过hitrapspsepharoseffcolumn，然后用1m的nacl梯度洗脱，分段收集洗脱峰。将有活性的各管混合后于pbs中透析过夜，即为纯化后的酶液。

实施例2：gbs-plysb杀灭停乳链球菌标准菌株atcc35666的验证

将停乳链球菌过夜培养，离心收集后用pbs洗涤一次然后溶于pbs中，并调菌液od600nm＝0.6～0.8。取0.01ml的gbs-plysb酶液与0.19ml上述菌液混合，同时用酶标仪监测混合液在600nm吸收值的变化。同时，用0.01mlpbs缓冲液与0.19ml停乳链球菌的混合液作为负对照。最后得到的裂解曲线如图2所示，两条曲线分别表示停乳链球菌与缓冲液混合后od600随时间的变化趋势和停乳链球菌与gbs-plysb混合后od600随时间的变化趋势，结果显示，gbs-plysb能快速的裂解atcc35666菌株从而导致混合液在600nm吸收值快速降低。

实施例3、gbs-plysb的体外杀灭链球菌广谱性验证

将多种链球菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌以及大肠杆菌等菌株过夜培养，离心收集后用pbs洗涤一次然后溶于pbs中，并调od600nm＝0.6～0.8。取0.01ml的gbs-plysb酶液与上述菌液混合在37℃条件下孵育60min，同时用酶标仪监测混合液在600nm吸收值的变化。用od600降低的数值表示不同菌株的裂解效果。同时，用0.01mlpbs缓冲液与0.19ml菌液的混合液作为负对照，试验得到的杀灭效果见图3所示。结果显示gbs-plysb酶能快速的杀灭多种链球菌(包括肺炎链球菌、化脓链球菌、猪链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、变形链球菌、海豚链球菌等)以及葡萄球菌和肠球菌，而对大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌的裂解作用非常微弱，其它的测试菌株没有裂解作用。

实施例4、gbs-plysb在不同nacl浓度下杀灭停乳链球菌atcc35666活性验证。

将停乳链球菌过夜培养物，离心收集后用tris-hcl洗涤一次然后溶于20mmtris-hcl(ph7.4)中，并调od600nm＝0.6～0.8。取0.01ml的gbs-plysb酶液与0.19ml上述菌液混合，添加nacl至终浓度分别为0mm、25mm、50mm、100mm、200mm、500mm、1000mm，用酶标仪监测混合液在600nm吸收值的变化。同时，用0.01mlpbs缓冲液与0.19ml停乳链球菌的混合液作为负对照。将得到的裂解曲线进行处理，计算在60min内各组od600nm降低的数值，并以降低值最大的为100％活性，其它各组与之作比较得到相对酶活性见图4所示。结果显示500mm以下的nacl对gbs-plysb快速裂解atcc35666菌株的酶活性没有显著性影响。

实施例5、gbs-plysb在不同ph时杀灭停乳链球菌atcc35666活性的验证。

将停乳链球菌过夜培养物，离心收集后用pbs洗涤一次后分别重悬在不同ph的缓冲液中(ph＝2～14)，并调od600nm＝0.6～0.8。取0.01ml的gbs-plysb与0.19ml上述菌液混合，用酶标仪监测混合液在600nm吸收值的变化。同时，用0.01mlpbs缓冲液与0.19ml停乳链球菌的混合液作为负对照。将得到的裂解曲线进行处理，计算在60min内各组od600nm降低的数值，并以降低的最大数值定义为100％活性，其它各组与之作比较得到相对酶活性如图5所示。结果显示，ph在7～9的范围内，gbs-plysb具有快速裂解atcc35666菌株的活性。

实施例6、gbs-plysb在不同edta浓度下杀灭停乳链球菌atcc35666活性的验证。

将停乳链球菌过夜培养物，离心收集后用pbs洗涤一次后重悬在pbs中，并调od600nm＝0.6～0.8。取0.01ml的gbs-plysb与0.19ml上述菌液混合，添加edta至终浓度为0μm、50μm、100μm、200μm、400μm、800μm，用酶标仪监测混合液在600nm吸收值的变化，同时用0.01mlpbs缓冲液与0.19ml停乳链球菌的混合液作为负对照。将得到的裂解曲线进行处理，计算在60min内各组od600nm降低的数值，并以降低值最大的为100％活性，其它各组与之作比较得到相对酶活性如图6所示，纵坐标表示在不同edta浓度条件下gbs-plysb杀灭停乳链球菌的相对活性。结果显示edta对gbs-plysb裂解atcc35666菌株活性的影响呈现浓度依赖的抑制效应。

实施例7、gbs-plysb在不同温度下杀灭停乳链球菌atcc35666活性的验证

将停乳链球菌过夜培养物，离心收集后用pbs洗涤一次后重悬在pbs中，并调od600nm＝0.6～0.8。取0.01ml的gbs-plysb在设定的温度中(4℃、25℃、37℃、45℃、55℃、65℃)保温放置60min后再与上述菌液混合，用酶标仪监测混合液在600nm吸收值的变化，用0.01mlpbs缓冲液与0.19ml停乳链球菌的混合液作为负对照。将得到的裂解曲线进行处理，计算在60min内各组od600nm降低的数值，并以降低值最大的为100％活性，其它各组与之作比较得到相对酶活性如图7所示。结果显示gbs-plysb在45℃以下具有较高的裂解atcc35666菌株的活性。

实施例8、gbs-plysb细胞毒性测试

将caco-2细胞以每孔5×103的浓度接种到96孔板中，培养24小时后，向孔板中加入一定浓度的gbs-plysb(浓度分别为0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml)以及离子霉素(15mg/ml)和丝裂霉素c(15mg/ml)。继续培养24小时。培养结束后，向孔板中加入染色剂wst-8，静置后在酶标仪上读取450nm吸光值。所得到的结果如图8所示，结果显示，离子霉素和丝裂霉素c为细胞有毒性的阳性对照时，0.2mg/ml，0.4mg/ml和0.8mg/ml的gbs-plysb作用于caco-2细胞没有观察到明显的细胞毒性。

实施例9、牛奶中gbs-plysb清除链球菌实验验证。

将1ml链球菌过夜培养物离心收集后用pbs洗涤一次然后溶于1ml无菌纯牛奶中。取不同浓度的gbs-plysb(0mg/ml、0.025mg/ml、0.05mg/ml、0.10mg/ml)与上述菌液混合，混匀后的反应液置于37℃作用1小时，然后稀释平板计算其中的活菌数。试验得到的鉴定结果如图9所示。结果显示gbs-plysb酶能有效的清除牛奶中的链球菌，在牛奶中能保持高效的裂解活性。

实施例10、血清中gbs-plysb清除链球菌实验验证。

将1ml链球菌过夜培养物离心收集后用pbs洗涤一次然后溶于1ml小鼠血清中。取不同浓度的gbs-plysb(0mg/ml、0.025mg/ml、0.05mg/ml、0.10mg/ml)与上述菌液混合，混匀后的反应液在37℃条件下作用1小时，然后稀释平板计算其中的活菌数。试验得到的鉴定结果如图10所示，结果显示gbs-plysb酶能有效的清除血清中的链球菌，在血清中能何持高效的裂解活性。

实施例11、gbs-plysb与其它嵌合裂解酶的活性比较的验证。

采用实施例1中的步骤，全序列合成裂解酶plyca(催化域plycac)和裂解酶plyss2(催化域plysc，结合域plysb)(南京金斯瑞生物技术有限公司)后，通过基因工程手段随机构建和表达纯化其它几种嵌和裂解酶plycac-v12b,plysc-v12b,以及v12c-plysb。将停乳链球菌过夜培养，离心收集后用pbs洗涤一次然后溶于pbs中，并调od600nm＝0.6～0.8。取0.19ml上述菌液分别与1μm的plycac-v12b、plysc-v12b、gbs-plysb以及v12c-plysb混合，同时用酶标仪监测混合液在600nm吸收值的变化。同时，用0.01mlpbs缓冲液与0.19ml停乳链球菌的混合液作为负对照。将得到的裂解曲线进行处理，计算在60min内各组od600nm降低的数值，并将降低的最大数值定义为100％活性，其它各组与之作比较得到相对酶活性如图11所示。结果显示只有gbs-plysb能快速地裂解atcc35666菌株。

该结果显示gbs-plysb是以上四个全长裂解酶中较优的组合,其它组合没有很好的裂解活性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>武汉赛思锐微生物技术有限公司

<120>一种广谱新型嵌合裂解酶gbs-plysb及其编码基因和应用

<130>2017

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tyrpheaspgluvalgluvalmetglnalaglyaspvalalailephe

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210215220

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