本发明属于微生物新应用领域，尤其是涉及一种婴儿型双歧杆菌在防治食物过敏食品或者药物中的应用。
背景技术：
：过敏性疾病的发生率逐年升高，据世界卫生组织报道，全球20％的人口经历了过敏性疾病如特应性皮炎，食物过敏，哮喘，过敏性鼻炎，过敏性结膜炎，其中以气道、食物过敏较常见，而且在1岁以内的幼儿发生率比较高。诱发过敏反应发生常见的过敏原有牛奶、花生、海鲜、花粉、螨虫、药物等，过敏症可轻可重，对于严重的过敏反应，如果不加控制导致死亡，伴随着随时可能发生的过敏反应、生活质量的下降以及直接和间接的经济花费，过敏人群的面临的困难是难以想象的。婴儿出生后不久，胃肠道内便出现了多种菌群，大约一个星期，肠道菌群定植已完成。人体肠道菌群在婴儿时期仅有200余种，成人大约由400-500余种细菌组成，肠道微生物总量约为1013-1014个，每克粪便中包含了大约1012个微生物。过敏性疾病的发病机制复杂，通常认为是thl/th2免疫失衡，过度的th2免疫应答引发了一系列的过敏症状。在过敏发病中，食道及气道上皮细胞屏障功能受损与过敏反应紧密相关，受损的食道及气道上皮屏障，允许完整抗原或其他有害物质通过，进入机体的抗原有机会接触免疫细胞，当宿主再次接触过敏原可引发不同程度的过敏反应。临床主要的治疗用药，如糖皮质激素、抗组胺药、白三烯受体阻滞剂等，主要是减轻过敏症状，特异性免疫治疗可诱导机体对过敏原免疫耐受，但都不能彻底治愈的治疗食物过敏。技术实现要素：本发明的目的在于经过对各种益生菌进行广泛深入的筛选，最终筛选出一株婴儿型双歧杆菌，可以应用于防治食物过敏食品或者药物中。所述婴儿型双歧杆菌（bifidobacteriuminfantis），在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为cgmccno.0313-2，在防止食物过敏的食品或者药物中的应用。进一步的，所述婴儿型双歧杆菌为3-5×1010cfu/ml。本发明通过深入研究过敏性疾病与益生菌的关系，建立了食道过敏两种小鼠，将婴儿型双歧杆菌应用于防止食物过敏的食品或者药物中，取得了意想不到的技术效果，为防止食物过敏提供了新的解决方案。附图说明图1为本发明具体实验例中小鼠28天增重结果示意图；图2a-2d为本发明具体实验例中小鼠空肠he染色结果示意图（×200）；图3为本发明具体实验例中小鼠血清总ige检测结果示意图；图4a-4c为本发明具体实验例中小鼠血清中细胞因子elisa检测结果示意图。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。实验例实验动物：balb/c小鼠，雄性，6周龄，体重18-22g，小鼠饲料、垫料、鼠笼等物品皆为第四军医大学实验动物中心提供，本实验所有动物实验严格按照《第四军医大学实验动物条例》执行，并于生物安全实验室（bsl-ⅱ）中完成动物饲养：balb/c小鼠按spf级饲养与专用效度饲养笼内，自由饮用消毒去离子水。动物房温度为19～25℃，湿度为55～65%，光照10～12小时/日，鼠笼每周清洗消毒两次。实验菌株：婴儿型双歧杆菌cgmccno.0313-2株（bifidobacteriuminfantiscgmccno.0313-2），经中国科学院微生物所鉴定，由山东科兴生物制品有限公司提供。主要实验试剂及仪器ß-乳球蛋白(blg，sigma，buchs，switzerland),霍乱毒素（ctx(choleratoxin，listbiologicallaboratories,campbell,ca,usa)。总ige定量试剂盒（美国chondrex公司）il-4、il-10、il-13、ifn-γelisa定量试剂盒（rdsystems，us）普通光学显微镜olympuscx-31,japan-70℃低温冰箱sanyo,japan-20℃低温冰箱sanyo,japan显微摄象系统olympushfx-ⅱa,japan恒温水浴箱if-90北京六一仪器厂全自动酶标仪bio-rad，usa纯水系统milli-q美国millipore公司dk-8b型电热恒温水槽上海精宏试验设备有限公司电子天平bp221s德国sartorius公司菌粉-20℃保存，实验灌胃婴儿型双歧杆菌时，菌粉用生理盐水稀释至5×1010cfu/ml，平衡至室温再进行灌胃，现用现配。实验例1经适应性喂养1周后，根据体重排序标号，体重相邻的4只老鼠为一个区组，产生随机数，按照随机数分组，将40只balb/c雄性小鼠随机分为四组，分别为：正常对照组（blg-nc）、阳性对照组（blg-pc）、预防组（blg-pre）、治疗组（blg-tre），每组10只。分组完成后开始建模，婴儿型双歧杆菌干预治疗。（1）建模：正常对照组建模予生理盐水做对照，其余三组在第7、14和21天时进行致敏，灌胃致敏液2ml/只/次，2ml致敏液含有20mgß-乳球蛋白(blg，sigma，buchs，switzerland)+佐剂10µg霍乱毒素（ctx，listbiologicallaboratories,campbell,ca,usa)；建模的第28天，进行激发1次，激发液体为3ml/只/次，3ml激发液含有100mgblg。（2）益生菌干预治疗：建立模型的同时，预防组（blg-pre）和治疗组（blg-tre）灌胃菌液进行干预治疗，预防组（blg-pre），第0至21天灌胃菌液0.2ml/天，第22至28天灌胃生理盐水0.2ml/天；治疗组（blg-tre），第0至21天灌胃生理盐水0.2ml/天，第22至28天灌胃菌液0.2ml/天。正常对照组（blg-nc）和阳性对照组（blg-pc）每天灌胃无菌生理盐水，0.2ml/只。第29天，记录小鼠实验前后体重变化，计算小鼠增重情况；处死小鼠后取小鼠空肠，行he染色；elisa法检测血清中总ige、ifn-γ、il-4、il-5、il-13和il-10的水平。实验例2（1）blg致敏液配制：-20℃冻存，现用现配，用天平称取1gblg和0.5mgctx粉末，将其混合均匀后溶解于10ml生理盐水中，750rmp离心15分钟，弃去少量上清液，调整混悬液为10ml，保证blg终浓度为0.1g/ml；（2）blg激发液配制：现用现配，用天平称取1gblg，将其溶解于2ml生理盐水中，混匀后混悬液约为3ml，每只小鼠激发时灌胃0.3ml混悬液。实验例3（1）四组小鼠称重后，用3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，摘眼球取血，2ml/只，室温静置2小时后，2500rpm，室温离心20分钟，收集血清，分装后-80℃冻存。实验例4四组的小鼠完成眼球取血后，取小鼠空肠5cm，用4℃生理盐水冲洗小鼠的肠腔，反复冲洗3次，用组织将肠管剪成长约0.8cm肠段，用10%中性福尔马林中固定48小时后，标号后放入包埋盒中，在将标本送至第四军医大学病理教研室进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、脱蜡、复水、he染色、脱水、封片、光镜下观察拍片。实验例5血清总ige及细胞因子的检测elisa检测血清总ige方法如下：（1）抗体包被：按照说明书用稀释缓冲液稀释好抗体，在反应孔中加抗体稀释液，100μl/孔，盖上封板膜，4℃孵育过夜；（2）准备好吸水纸，将所有试剂放置室温半小时，按照说明书配制好洗涤液、标准品及待测样品（10倍稀释），过程中避免产生泡沫，根据实验孔、空白和标准品总数量,确定所需的板条数目，均做复孔；（3）洗板：弃去板条内液体，用滤纸拍干，加入已经配好的洗涤液，停留lmin后弃去孔内液体，拍干后再次重复3次；（4）加样：空白孔加溶液b，标准孔加入稀释好的标准品，样品孔加入稀释好的样品，100μl/孔，盖上封板膜，室温孵育2小时；（5）洗板：步骤同前；（6）加酶标抗体：用10ml溶液c稀释1支抗体，100μl/孔，盖上封板膜，室温孵育1小时；（7）洗板：步骤同前；（8）加链霉亲和素过氧化物：用10溶液d稀释1支链霉亲和素过氧化物，100μl/孔，盖上封板膜，室温孵育1小时；（9）洗板：步骤同前；（10）显色：使用前临时配制tmb底物溶液，洗板后立即使用，100μl/孔，封板后室温孵育25分钟；（11）终止：于各反应孔中加入终止液50μl；（12）读板：观察各个孔的颜色，颜色越深od值越大，终止后10分钟内,在波长450nm检测，在酶标仪上同时读板记录数据；(13)计算浓度：用curveexpert1.4软件绘制标准曲线，根据标准品的浓度及吸光度值建立标准曲线，计算样本的浓度。2.6.2elisa检测血清中il-4（稀释3倍）、il-10（稀释2倍）、il-5（稀释2倍）、il-13（稀释3倍）和ifn-γ（稀释2倍）的方法同第一部分。elisa检测结果用curveexpert1.4软件绘制标准曲线和计算样品浓度，采用spss19.0软件进行数据统计分析，计量资料数据以±s表示，组间对比采用t检验，p<0.05为差异有统计学意义。结果为了检测婴儿型双歧杆菌的效果，我们进行了如下检测：（1）小鼠的症状及增重情况；（2）空肠组织的病理学he染色；（3）血清总ige水平检测；（4）炎性细胞因子il-4、il-5、il-13、il-10、ifn-γ的检测。小鼠的症状及增重情况在blg致敏及激发后，阳性对照组（blg-pc）致敏后出现大便次数多、稀水样，体重减轻。阳性对照组体重明显减轻，其余三组增重明显（blg-nct=13.55，p＜0.001，blg-pre，t=20.51，p＜0.001；blg-tre，t=11.71，p＜0.001）,治疗组比预防组增重明显（t=6.49，p＜0.01）（见表1，图1；注：*p<0.05;**p<0.01,***p<0.001）。表1各组小鼠28天增重结果（n=6，±s）分组增重(g)正常对照组（blg-nc）5.675±0.864阳性对照组（blg-pc）-4.088±1.350***预防组（blg-pre）1.165±0.824***治疗组（blg-tre）4.658±0.720***，**空肠he染色光镜观察结果正常对照组小鼠肠黏膜结果清晰，肠绒毛排列整齐，绒毛无明显损伤，无炎症细胞浸润，而其余三组均有不同程度的肠粘膜上皮脱落，肠绒毛水肿、断裂，肠上皮下大量炎症细胞浸润，表明blg过敏原引起了肠道黏膜病变。口服婴儿型双歧杆菌的预防组和治疗组，空肠炎症细胞浸润程度减轻，肠上皮细胞结构相对完整（见图2a-d；a为正常对照组；b为阳性对照组；c为预防组；d为治疗组）。血清总ige的水平阳性对照组较正常对照组明显升高（t=7.019，p＜0.001）。婴儿型双歧杆菌的预防组和治疗组同阳性对照组比较，总ige水平降低，差异具有统计学意义（blg-pre，t=3.352，p＜0.05；blg-tre，t=8.096，p＜0.001）；治疗组比预防组降低更明显（t=4.3，p＜0.01）（见表2，图3；注：*p<0.05;**p<0.01,***p<0.001）。表2血清总ige检测结果（n=6，±s）分组总ige(ng/ml)正常对照组（blg-nc）301.3±81.75阳性对照组（blg-pc）789.1±106.2***预防组（blg-pre）508.8±106.4*治疗组（blg-tre）307.3±86.40***，**血清相关细胞因子的检测结果有关食道过敏的相关细胞因子通过elisa检测，血清中il-5和ifn-γ各组浓度都较低，稀释后的样品孔浓度低于检测的最范围，不能通过吸光度计算出其浓度，各组间无法进行下一步统计分析；只有血清il-4、il-13和il-10的浓度在可检测范围内。表3血清中细胞因子elisa检测结果（n=6，±s）分组il-4(pg/ml)il-13(pg/ml)il-10(pg/ml)正常对照组（blg-nc）6.906±2.573126.4±6.77154.50±7.728阳性对照组（blg-pc）15.29±2.123**146.4±13.91*23.10±4.653***预防组（blg-pre）9.084±3.547*121.6±7.015*24.54±2.072治疗组（blg-tre）18.15±3.499n,**122.2±7.670**22.31±2.214阳性对照组小鼠的血清中细胞因子il-4和il-13水平生高明显。食物过敏的阳性对照组il-4水平比正常对照组高（t=4.873，p＜0.01）；同阳性对照组比较，预防组il-4水平降低（t=3.524，p＜0.05），有统计学意义，治疗组与阳性对照组之间无明显差别（t=1.431，p＞0.05），无统计学意义(见表3、图4a；*p<0.05;**p<0.01,***p<0.001)。食物过敏阳性对照组il-13水平明显高于正常对照组（t=2.713，p＜0.05）；同阳性对照组比较，预防组和治疗组均明显降低（blg-pre，t=3.251，p＜0.05；blg-tre，t=5.762，p＜0.01），预防组和治疗组之间无明显差异(见表3、图4b)。阳性对照组il-10的水平明显低于正常对照组（t=12.00，p＜0.001），同阳性对照组比较，预防组和治疗组均无明显差异（blg-pre，t=0.696，p＞0.05；blg-tre，t=0.284，p＞0.05）（见表3、图4c）。空肠是食物过敏最常累及并且结构改变最明显的部位，是食物过敏的评估指标之一，过敏后可出现肥大细胞、嗜酸性粒细胞增多，肠道通透性增加，肠粘膜及绒毛结构紊乱等。本实验中正常对照组小鼠空肠形态结构基本正常，食物过敏的阳性对照组肠粘膜上皮脱落，肠绒毛有断裂，肠上皮下大量炎症细胞浸润，婴儿型双歧杆菌的预防组和治疗组空肠炎症细胞浸润程度明显减轻，肠上皮细胞结构相对完整。症状方面，实验根据体重进行随机分组，记录小鼠重增重情况，食物过敏组小鼠体重明显下提示了模型成功，婴儿型双歧杆菌的预防和治疗组小鼠体重有增长，治疗组增重明显，说明婴儿型双歧杆菌可以减轻消化道炎症，致敏结束后服用更利于改善食物过敏的生存质量。ige是引发过敏反应的抗体，肥大细胞是主要的效应细胞，ige与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面受体结合，当接触食物过敏原后可引起炎症因子的释放，引发过敏的连锁反应。实验中发现食物过敏中肥大细胞在数量及ige水平与食物过敏密切相关。口服益生菌（乳球菌）可以抑制特异性抗体ige和igg1的生成，增加分泌性iga水平，使il-10增加，减轻食物过敏。短乳杆菌hy7401在食物过敏的中应用，证明短乳杆菌hy7401可以促进th1细胞因子释放，抑制th2细胞因子，可以降低ova特异性抗体ige、igg1、igg2等所有特异性抗体水平。本实验检测血清中总ige水平，评估小鼠食物过敏严重程度，结果显示阳性对照组较正常对照组明显升高，婴儿型双歧杆菌的预防组及治疗组总ige水平降低，结果与国内外研究相符，证明了致敏和激发期间口服婴儿型双歧杆菌可以预防和减轻食物过敏。关于益生菌防治食物过敏的作用机制的研究中，th1细胞、th2细胞、treg细胞、树突状细胞和肥大细胞均有相关研究，但结果不尽相同。短双歧杆菌，通过增加肠道内cd4+treg细胞数量增加il-10分泌来维持肠道稳态，减轻肠道炎症。过敏性疾病常表现为过度的th2免疫反应，产生th2炎症细胞因子il-4、il-13和il-9，细胞因子又能与其相应受体结合，直接或间接引起肥大细胞、ige增多。也有研究表明il-10可阻止效应性t细胞的活化，抑制肥大细胞的脱颗粒，从而促炎性因子释放减少，促使抗体ige向iga或igg转换来发挥其免疫抑制作用。本实验发现食道过敏小鼠血清中il-4和il-13水平均显著升高，提示小鼠免疫失衡，发生了过度的th2免疫反应。口服婴儿型双歧杆菌的治疗和预防组小鼠血清il-13的水平均明显降低，预防组il-4水平有降低，治疗组il-4与阳性对照组无明显差异，小鼠th2细胞因子减少，说明婴儿型双歧杆菌可以抑制th2免疫反应。当前第1页12