本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种乳酸菌组合物的分离方法及其应用。
背景技术：
真菌是一类生命力极强的腐败微生物，其中由酵母菌和霉菌污染所导致的的饲料损失已有大量报道。目前已经确定有超过200种霉菌在特定食品、动物饲料中生长时会产生对人和动物有害的物质，主要有黄曲霉毒素类、串珠镰刀菌素、赫曲霉毒素类、棒曲霉素、单端孢霉烯类和玉米赤霉烯酮6大类。由于这些毒素具有致癌致畸性，对神经、肝肾也有毒害作用，因此这些腐败真菌在造成巨大经济损失的同时，也对公众的健康构成了极大威胁。如发生在20世纪60年代英国鸡场的“火鸡x病”，几个月内10多万只雏火鸡相继死亡，结果1963年由spensley证实这种病是由黄曲霉菌产生的黄曲霉毒素b1引起。
国内外对抑制黄曲霉毒素进行了大量研究。但是这些传统方法都存在一定的弊端，比如物理方法会造成营养成分的损失，化学防腐剂则会对人和动物的健康及环境带来危害。因此，目前急需一种抑制黄曲霉菌的乳酸菌组合物。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种能够抑制黄曲霉菌的乳酸菌组合和该种乳酸菌的分离方法。本发明通过采用双层平板法来筛选具有抑制黄曲霉菌活性的乳酸菌，从而为改善和提高青贮饲料品质提供了优良的菌种。
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种乳酸菌组合物的分离方法，所述乳酸菌由新疆的发面面肥中分离获得，所述乳酸菌包括类芽孢杆菌、屎肠球菌和乳酸乳球菌。
进一步地，该乳酸菌组合物的分离方法具体包括如下步骤：
(1)每称取10g发面面肥加入到盛有90ml无菌蛋白胨水的容器中，并将容器密封置于摇床上以120r/min摇动2h，即得沉淀一和上清液一，吸取1ml上清液一加入到另一盛有9ml无菌蛋白胨水的容器中，并将容器置于漩涡混合器上漩涡震荡，即得菌液；
(2)取100μl步骤(1)中制备的菌液涂布于乳酸菌平板培养基表面，并将乳酸菌平板培养基置于30℃的条件下培养48～72h，即得单菌落；
(3)挑取单菌落在乳酸菌固体培养基上划线，并将乳酸菌固体培养基置于30℃的条件下培养48～72h，重复划线分离培养3次，即得单菌株，将单菌株接入乳酸菌液体培养基中，并将乳酸菌液体培养基置于30℃的条件下培养24h，即得乳酸菌液，将所制备的乳酸菌液和等体积的甘油混合后并封装置于-70℃的条件下保存，备用；
(4)称取10g发霉花生放入盛有90ml无菌蒸馏水的容器中，并将容器密封置于摇床上以120r/min摇动2h，即得沉淀二和上清液二，吸取1ml上清液二加入到另一盛有9ml无菌蛋白胨水的容器中，并将容器置于漩涡混合器上漩涡震荡，即得菌悬液；
(5)取100μl步骤(4)中制备的菌悬液涂布于曲霉菌琼脂固体培养基表面，并将曲霉菌琼脂固体培养基置于28℃的条件下培养4～7天，即得黄曲霉菌落，挑取黄曲霉菌落所产的孢子在曲霉素琼脂固体培养基上划线分离，即得黄曲霉菌株；
(6)将黄曲霉菌株接种在马铃薯葡萄糖斜面培养基表面，并将马铃薯葡萄糖斜面培养基置于28℃的条件下培养3～5天，待黄曲霉菌株产生大量孢子时，加入5ml灭菌生理盐水于装有马铃薯葡萄糖斜面培养基的试管中，并将试管置于漩涡混合器上漩涡震荡5min，即得黄曲霉悬浊液，用无菌纱布过滤除去营养菌丝体，并将黄曲霉悬浊液的浓度调整为105个/ml，即得黄曲霉孢子液，备用；
(7)将乳酸菌固体培养基倒入培养皿中作为下层平板，待其凝固后，用接种环沾取步骤(3)中备用的乳酸菌液在下层平板上划2条2～3cm的平行直线，将培养皿置于37℃的条件下培养24～36h至长出菌苔，再将步骤(6)中备用的黄曲霉孢子液倒入培养皿中，覆盖在含有乳酸菌菌苔的下层培养基上，并将培养皿置于28℃的条件下培养48～72h，即得抑制黄曲霉菌的乳酸菌。
进一步地，所述乳酸菌固体培养基为将10g的蛋白胨、10g的牛肉膏、5g的酵母粉、20g的柠檬酸二胺、0.05g的硫酸镁、2g的磷酸氢二钾、5g的乙酸钠、1g的吐温80、0.05g的硫酸锰、1g的碳酸钙以及15g的琼脂溶于1l去离子水后并在121℃的条件下灭菌15min制得。
进一步地，所述马铃薯葡萄糖斜面培养基为将200g的马铃薯、20g的葡萄糖以及8g的琼脂溶于1l去离子水后并在121℃的条件下灭菌20min制得。
进一步地，所述曲霉菌琼脂固体培养基为将20g的酵母粉、10g的蛋白胨、0.5g的柠檬酸铁铵、1ml的0.2％的二氯硝基苯胺、0.1g的氯霉素以及15g的琼脂溶于1l去离子水后并在121℃的条件下灭菌15min制得。
本发明还提供了上述的分离方法所制得的乳酸菌组合物在抑制黄曲霉菌方面的应用，所述乳酸菌组合物包括类芽孢杆菌、屎肠球菌和乳酸乳球菌。
优选地，所述乳酸菌组合物由类芽孢杆菌、屎肠球菌和乳酸乳球菌中任意两种的菌液以1％的接种量1:1两两组合而成。
优选地，所述乳酸菌组合物由类芽孢杆菌、屎肠球菌和乳酸乳球菌三种的菌液以1％的接种量1:1鼻裂混合而成。
与现有技术相比，本发明所达到的有益效果：
(1)本发明中筛选出来的类芽孢杆菌、屎肠球菌和乳酸乳球菌对黄曲霉菌均有抑制作用，两两混合后抑菌效果显著提高，其中，两两混合的抑菌效果较好的是类芽孢杆菌液和屎肠球菌液组合，抑菌区直径可达到5.3～5.4cm；将类芽孢杆菌液、屎肠球菌液和乳酸乳球菌液三者混合后抑菌效果最佳，抑菌区直径达到6.2～6.4cm；屎肠球菌液的抑菌效果显著高于其他单个菌液的抑菌效果，屎肠球菌液的抑菌区直径达到4.5～5.0cm。
(2)本发明中的类芽孢杆菌、屎肠球菌和乳酸乳球菌均能在40℃和45℃条件下生长，说明本发明中的类芽孢杆菌、屎肠球菌和乳酸乳球菌能够在高温条件下生长；本发明中的类芽孢杆菌、屎肠球菌和乳酸乳球菌能在nacl浓度达到3％或6.5％的情况下生长，说明本发明筛选出来的菌株能够在盐渍地区的存活；同时筛选出来的菌株还能在酸性的条件下生存。
(3)本发明中在制备乳酸菌液时，需要重复划线分离培养3次；重复划线培养是为了确定无杂菌；本发明中将乳酸菌液和等体积的甘油混合后并封装置于-70℃的条件下保存；向乳酸菌液中加入甘油，可使乳酸菌液的冰点降低，在缓慢冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞，从而减少冰晶的形成。
附图说明
以下结合附图及具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
图1是本发明中黄曲霉菌落的示意图；
图2是本发明中乳酸菌液对黄曲霉菌的抑制效果图。
具体实施方式
以下实施例仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
1材料的来源
1.1样品来源：2016年7月从新疆阿克苏地区随机采集发面面肥、发霉花生、发霉玉米及变质青贮样品。将样品封于密封袋中，贴上标签、标明采样时间和地点后运回实验室，于4℃条件下，由塔里木大学畜牧科技重点实验室草食家畜营养研究室保存备用。
1.2菌种来源：从发面面肥样品中分离获得乳酸菌，从发霉花生、发霉玉米及变质青贮饲料中分离获得黄曲霉菌，由塔里木大学畜牧科技重点实验室草食家畜营养研究室保存备用。
实施例1
一种乳酸菌组合物的分离方法，所述乳酸菌组合物由新疆的发面面肥中分离获得，所述乳酸菌组合物包括类芽孢杆菌、屎肠球菌和乳酸乳球菌。
具体地，上述乳酸菌组合的分离方法步骤如下：
(1)称取10g发面面肥加入到盛有90ml无菌蛋白胨水的容器中，并将容器密封置于摇床上以120r/min摇动2h，即得沉淀一和上清液一，吸取1ml上清液一加入到另一盛有9ml无菌蛋白胨水的容器中，并将容器置于漩涡混合器上漩涡震荡，即得菌液；
(2)取100μl步骤(1)中制备的菌液涂布于乳酸菌平板培养基表面，并将乳酸菌平板培养基置于30℃的条件下培养48h，即得单菌落；
(3)挑取单菌落在乳酸菌固体培养基上划线，并将乳酸菌固体培养基置于30℃的条件下培养48h，重复划线分离培养3次，即得单菌株，将单菌株接入乳酸菌液体培养基中，并将乳酸菌液体培养基置于30℃的条件下培养24h，即得乳酸菌液，将所制备的乳酸菌液和等体积的甘油混合后并封装置于-70℃的条件下保存，备用；
(4)称取10g发霉花生放入盛有90ml无菌蒸馏水的容器中，并将容器密封置于摇床上以120r/min摇动2h，即得沉淀二和上清液二，吸取1ml上清液二加入到另一盛有9ml无菌蛋白胨水的容器中，并将容器置于漩涡混合器上漩涡震荡，即得菌悬液；
(5)取100μl步骤(4)中制备的菌悬液涂布于曲霉菌琼脂固体培养基表面，并将曲霉菌琼脂固体培养基置于28℃的条件下培养4天，即得黄曲霉菌落，挑取黄曲霉菌落所产的孢子在曲霉素琼脂固体培养基上划线分离，即得黄曲霉菌株；
(6)将黄曲霉菌株接种在马铃薯葡萄糖斜面培养基表面，并将马铃薯葡萄糖斜面培养基置于28℃的条件下培养3天，待黄曲霉菌株产生大量孢子时，加入5ml灭菌生理盐水于装有马铃薯葡萄糖斜面培养基的试管中，并将试管置于漩涡混合器上漩涡震荡5min，即得黄曲霉悬浊液，用无菌纱布过滤除去营养菌丝体，并将黄曲霉悬浊液的浓度调整为105个/ml，即得黄曲霉孢子液，备用；
(7)将乳酸菌固体培养基倒入培养皿中作为下层平板，待其凝固后，用接种环沾取步骤(3)中备用的乳酸菌液在下层平板上划2条2cm的平行直线，将培养皿置于37℃的条件下培养24h至长出菌苔，再将步骤(6)中备用的黄曲霉孢子液倒入培养皿中，覆盖在含有乳酸菌菌苔的下层培养基上，并将培养皿置于28℃的条件下培养48h，即得抑制黄曲霉菌的乳酸菌组合物。
在本实施例中，所述乳酸菌固体培养基为将10g的蛋白胨、10g的牛肉膏、5g的酵母粉、20g的柠檬酸二胺、0.05g的硫酸镁、2g的磷酸氢二钾、5g的乙酸钠、1g的吐温80、0.05g的硫酸锰、1g的碳酸钙以及15g的琼脂溶于1l去离子水后并在121℃的条件下灭菌15min制得。
在本实施例中，所述马铃薯葡萄糖斜面培养基为将200g的马铃薯、20g的葡萄糖以及8g的琼脂溶于1l去离子水后并在121℃的条件下灭菌20min制得。
在本实施例中，所述曲霉菌琼脂固体培养基为将20g的酵母粉、10g的蛋白胨、0.5g的柠檬酸铁铵、1ml的0.2％的二氯硝基苯胺、0.1g的氯霉素以及15g的琼脂溶于1l去离子水后并在121℃的条件下灭菌15min制得。
实施例2
一种乳酸菌组合物的分离方法，所述乳酸菌组合物由新疆的发面面肥中分离获得，所述乳酸菌组合物包括类芽孢杆菌、屎肠球菌和乳酸乳球菌。
具体地，上述乳酸菌组合物的分离方法步骤如下：
(1)称取10g发面面肥加入到盛有90ml无菌蛋白胨水的容器中，并将容器密封置于摇床上以120r/min摇动2h，即得沉淀一和上清液一，吸取1ml上清液一加入到另一盛有9ml无菌蛋白胨水的容器中，并将容器置于漩涡混合器上漩涡震荡，即得菌液；
(2)取100μl步骤(1)中制备的菌液涂布于乳酸菌平板培养基表面，并将乳酸菌平板培养基置于30℃的条件下培养60h，即得单菌落；
(3)挑取单菌落在乳酸菌固体培养基上划线，并将乳酸菌固体培养基置于30℃的条件下培养60h，重复划线分离培养3次，即得单菌株，将单菌株接入乳酸菌液体培养基中，并将乳酸菌液体培养基置于30℃的条件下培养24h，即得乳酸菌液，将所制备的乳酸菌液和等体积的甘油混合后并封装置于-70℃的条件下保存，备用；
(4)称取10g发霉花生放入盛有90ml无菌蒸馏水的容器中，并将容器密封置于摇床上以120r/min摇动2h，即得沉淀二和上清液二，吸取1ml上清液二加入到另一盛有9ml无菌蛋白胨水的容器中，并将容器置于漩涡混合器上漩涡震荡，即得菌悬液；
(5)取100μl步骤(4)中制备的菌悬液涂布于曲霉菌琼脂固体培养基表面，并将曲霉菌琼脂固体培养基置于28℃的条件下培养6天，即得黄曲霉菌落，挑取黄曲霉菌落所产的孢子在曲霉素琼脂固体培养基上划线分离，即得黄曲霉菌株；
(6)将黄曲霉菌株接种在马铃薯葡萄糖斜面培养基表面，并将马铃薯葡萄糖斜面培养基置于28℃的条件下培养4天，待黄曲霉菌株产生大量孢子时，加入5ml灭菌生理盐水于装有马铃薯葡萄糖斜面培养基的试管中，并将试管置于漩涡混合器上漩涡震荡5min，即得黄曲霉悬浊液，用无菌纱布过滤除去营养菌丝体，并将黄曲霉悬浊液的浓度调整为105个/ml，即得黄曲霉孢子液，备用；
(7)将乳酸菌固体培养基倒入培养皿中作为下层平板，待其凝固后，用接种环沾取步骤(3)中备用的乳酸菌液在下层平板上划2条2.5cm的平行直线，将培养皿置于37℃的条件下培养30h至长出菌苔，再将步骤(6)中备用的黄曲霉孢子液倒入培养皿中，覆盖在含有乳酸菌菌苔的下层培养基上，并将培养皿置于28℃的条件下培养60h，即得抑制黄曲霉菌的乳酸菌组合物。
在本实施例中，所述乳酸菌固体培养基为将10g的蛋白胨、10g的牛肉膏、5g的酵母粉、20g的柠檬酸二胺、0.05g的硫酸镁、2g的磷酸氢二钾、5g的乙酸钠、1g的吐温80、0.05g的硫酸锰、1g的碳酸钙以及15g的琼脂溶于1l去离子水后并在121℃的条件下灭菌15min制得。
在本实施例中，所述马铃薯葡萄糖斜面培养基为将200g的马铃薯、20g的葡萄糖以及8g的琼脂溶于1l去离子水后并在121℃的条件下灭菌20min制得。
在本实施例中，所述曲霉菌琼脂固体培养基为将20g的酵母粉、10g的蛋白胨、0.5g的柠檬酸铁铵、1ml的0.2％的二氯硝基苯胺、0.1g的氯霉素以及15g的琼脂溶于1l去离子水后并在121℃的条件下灭菌15min制得。
实施例3
一种乳酸菌组合物的分离方法，所述乳酸菌组合物由新疆的发面面肥中分离获得，所述乳酸菌组合物包括类芽孢杆菌、屎肠球菌和乳酸乳球菌。
具体地，上述乳酸菌组合物的分离方法步骤如下：
(1)称取10g发面面肥加入到盛有90ml无菌蛋白胨水的容器中，并将容器密封置于摇床上以120r/min摇动2h，即得沉淀一和上清液一，吸取1ml上清液一加入到另一盛有9ml无菌蛋白胨水的容器中，并将容器置于漩涡混合器上漩涡震荡，即得菌液；
(2)取100μl步骤(1)中制备的菌液涂布于乳酸菌平板培养基表面，并将乳酸菌平板培养基置于30℃的条件下培养72h，即得单菌落；
(3)挑取单菌落在乳酸菌固体培养基上划线，并将乳酸菌固体培养基置于30℃的条件下培养72h，重复划线分离培养3次，即得单菌株，将单菌株接入乳酸菌液体培养基中，并将乳酸菌液体培养基置于30℃的条件下培养24h，即得乳酸菌液，将所制备的乳酸菌液和等体积的甘油混合后并封装置于-70℃的条件下保存，备用；
(4)称取10g发霉花生放入盛有90ml无菌蒸馏水的容器中，并将容器密封置于摇床上以120r/min摇动2h，即得沉淀二和上清液二，吸取1ml上清液二加入到另一盛有9ml无菌蛋白胨水的容器中，并将容器置于漩涡混合器上漩涡震荡，即得菌悬液；
(5)取100μl步骤(4)中制备的菌悬液涂布于曲霉菌琼脂固体培养基表面，并将曲霉菌琼脂固体培养基置于28℃的条件下培养7天，即得黄曲霉菌落，挑取黄曲霉菌落所产的孢子在曲霉素琼脂固体培养基上划线分离，即得黄曲霉菌株；
(6)将黄曲霉菌株接种在马铃薯葡萄糖斜面培养基表面，并将马铃薯葡萄糖斜面培养基置于28℃的条件下培养5天，待黄曲霉菌株产生大量孢子时，加入5ml灭菌生理盐水于装有马铃薯葡萄糖斜面培养基的试管中，并将试管置于漩涡混合器上漩涡震荡5min，即得黄曲霉悬浊液，用无菌纱布过滤除去营养菌丝体，并将黄曲霉悬浊液的浓度调整为105个/ml，即得黄曲霉孢子液，备用；
(7)将乳酸菌固体培养基倒入培养皿中作为下层平板，待其凝固后，用接种环沾取步骤(3)中备用的乳酸菌液在下层平板上划2条3cm的平行直线，将培养皿置于37℃的条件下培养36h至长出菌苔，再将步骤(6)中备用的黄曲霉孢子液倒入培养皿中，覆盖在含有乳酸菌菌苔的下层培养基上，并将培养皿置于28℃的条件下培养72h，即得抑制黄曲霉菌的乳酸菌组合物。
在本实施例中，所述乳酸菌固体培养基为将10g的蛋白胨、10g的牛肉膏、5g的酵母粉、20g的柠檬酸二胺、0.05g的硫酸镁、2g的磷酸氢二钾、5g的乙酸钠、1g的吐温80、0.05g的硫酸锰、1g的碳酸钙以及15g的琼脂溶于1l去离子水后并在121℃的条件下灭菌15min制得。
在本实施例中，所述马铃薯葡萄糖斜面培养基为将200g的马铃薯、20g的葡萄糖以及8g的琼脂溶于1l去离子水后并在121℃的条件下灭菌20min制得。
在本实施例中，所述曲霉菌琼脂固体培养基为将20g的酵母粉、10g的蛋白胨、0.5g的柠檬酸铁铵、1ml的0.2％的二氯硝基苯胺、0.1g的氯霉素以及15g的琼脂溶于1l去离子水后并在121℃的条件下灭菌15min制得。
实验与结果
以实施例2所筛选的乳酸菌组合物和黄曲霉菌落，做实验总结如下：
1、从发霉花生中筛选出来的黄曲霉菌落呈放射状，孢子呈淡黄色；在马铃薯葡萄糖斜面培养基上生长，培养基背面呈亮橙色，如图1所示。
2、将实施例2的分离出的乳酸菌组合物筛选后发现，有3株乳酸菌对黄曲霉菌有抑制作用，如图2所示，其中这3株乳酸菌分别为类芽孢杆菌、屎肠球菌和乳酸乳球菌，具体抑菌效果如下表所示。
表1乳酸菌液对黄曲霉菌的抑制效果表
注：同列数据后标不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。
由表1可知，本发明筛选出来的类芽孢杆菌、屎肠球菌和乳酸乳球菌对黄曲霉菌均有抑制作用，两两混合后抑菌效果显著提高，其中，两两混合的抑菌效果较好的是类芽孢杆菌液和屎肠球菌液组合，抑菌区直径可达到5.3～5.4cm；将类芽孢杆菌液、屎肠球菌液和乳酸乳球菌液三者混合后抑菌效果最佳，抑菌区直径达到6.2～6.4cm；屎肠球菌液的抑菌效果显著高于其他单个菌液的抑菌效果，屎肠球菌液的抑菌区直径达到4.5～5.0cm。
3、对具有抑菌活性的类芽孢杆菌液、屎肠球菌液和乳酸乳球菌液分别进行产气实验、温度生长实验和耐酸耐碱实验，结果如表2和表3所示。
表2乳酸菌液产气试验和温度生长试验测定结果表
注：“+”表示生长，“-”表示不生长，“w”表示弱生长，下同。
由表2可以看出，在产气试验中3株乳酸菌液发酵葡萄糖均不能产气，说明均为同型发酵乳酸菌；在温度生长试验中，3株乳酸菌液均能在5℃条件下生长，在10℃条件下除屎肠球菌液生长良好，其余2株菌液生长较弱，在40℃和45℃条件下，3株乳酸菌液均生长良好。
表3乳酸菌耐酸耐盐试验测定结果
由表3可以看出，在耐酸耐盐试验中，nacl为3％和6.5％时，3株菌均能良好生长；在ph＝3的条件下，3株乳酸菌液均不能生长；在ph＝4的条件下，3株菌生长较弱；在ph值为5～7时，3株菌生长状况良好。
4、对具有抑菌活性的类芽孢杆菌液、屎肠球菌液和乳酸乳球菌液进行碳源发酵实验，结果如表4和表5所示。
表4乳酸菌碳源发酵试验
表5乳酸菌碳源发酵试验
由表4和表5可知,3株乳酸菌液均可利用d-葡萄糖、d-麦芽糖、d-甘露糖、纤维二糖、d-甘露醇、d-果糖、蔗糖及d-山梨醇；类芽孢杆菌液不能发酵乳糖、d-半乳糖、l-山梨糖、d-松三糖、木糖醇、d-棉籽糖、l-鼠李糖、d-木糖及d-蜜二糖；屎肠球菌液不能发酵l-山梨糖、d-松二糖、木糖醇、d-棉籽糖及l-鼠李糖；乳酸乳球菌液不能利用l-山梨糖、木糖醇、d-棉籽糖、l-鼠李糖及d-木糖。
综上所述，本发明中筛选出来的类芽孢杆菌液、屎肠球菌液和乳酸乳球菌液对黄曲霉菌有明显的抑菌效果，并且，将3株菌液混合后抑菌效果最佳。
本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非用作为对本发明的限定，只要在本发明的实质精神范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明的权利要求范围内。