一种细胞扩增系统的细胞自动收集方法与流程

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种细胞扩增系统的细胞自动收集方法。

背景技术：

细胞扩增培养是将细胞在适宜的条件下进行培养，以达到细胞扩增的目的的一种培养方式，在现有技术中，通过滤膜将细胞反应器分隔为营养液腔和细胞生长腔，将细胞接种于细胞生长腔中进行扩增培养已成为细胞培养的主流，由于滤膜的作用，营养液腔内的营养液可不断渗透至细胞生长腔为细胞提供营养，进而使得营养液腔内的营养液可与细胞生长腔内的细胞进行营养交换，模拟体内细胞代谢环境，可保持细胞生存环境的稳定。

但是，采用该细胞反应器对细胞进行扩增培养完成之后，随着细胞大量增殖，细胞聚集在狭窄的细胞生长腔内，在将细胞通过细胞输送泵排至细胞收集器内进行收集时，细胞与细胞生长腔之间的附着或者粘附作用使得细胞容易发生残留，不利于细胞的自动收集，因此，通常需要打开细胞反应器对细胞进行收集，这样所采用的人工介入会造成细胞污染，且操作复杂，收集效率较低，不利于细胞的培养和应用。

技术实现要素：

本发明的实施例提供一种细胞扩增系统的细胞自动收集方法，能够在避免细胞残留的情况下对细胞进行自动收集，从而能够减少人工介入带来的污染，且操作简单，收集效率高。

为达到上述目的，本发明的实施例采用如下技术方案：

本发明实施例提供一种细胞扩增系统的细胞自动收集方法，包括：

步骤1)在细胞扩增完成后，对扩增后的细胞进行扰动，以使得所述扩增后的细胞分散和脱落；

步骤2)转动细胞反应器，使得营养液对粘附在细胞生长腔壁面的细胞进行冲刷，并通过细胞输送泵将分散于营养液中的细胞排至细胞收集器中进行收集。

可选的，转动细胞反应器具体包括：

控制所述细胞反应器的两端绕所述细胞反应器的中心在竖直平面内往复转动。

可选的，所述往复转动的角度大于0度小于等于180度，次数为3-5次。

可选的，所述往复转动的速度为1-3转/分钟。

可选的，通过细胞输送泵将分散于营养液中的细胞排至细胞收集器中进行收集之前，所述方法还包括：将所述细胞反应器转动至细胞输出端位于所述细胞反应器的下方且向下倾斜45度。

可选的，在所述步骤1)之前，所述方法还包括：在培养过程中对细胞在压力扩展箱和细胞反应器之间进行驱动，以防止细胞聚集。

可选的，当所述细胞为贴壁细胞时，对扩增后的细胞进行扰动之前，所述方法还包括：

对所述扩增后的细胞进行消化。

可选的，对扩增后的细胞进行扰动具体包括：

改变营养液腔和/或细胞生长腔的压力，使得营养液腔和细胞生长腔之间产生压差，通过压差作用对细胞进行扰动；和/或，转动细胞反应器，以对细胞进行扰动。

可选的，改变营养液腔和/或细胞生长腔的压力，使得营养液腔和细胞生长腔之间产生压差具体包括：

将营养液输送泵以脉冲的形式输送营养液，以使得营养液腔和细胞生长腔之间的压差正负交替变化。

可选的，改变营养液腔和/或细胞生长腔的压力，使得营养液腔和细胞生长腔之间产生压差具体包括：

交替向压力扩展腔内充入气体和排出气体，以使得所述培养液通道和细胞生长腔之间的压差正负交替变化。

可选的，转动细胞反应器，以对细胞进行扰动具体包括：

控制所述细胞反应器的两端绕所述细胞反应器的中心在竖直平面内往复转动。

可选的，所述往复转动的角度大于0度小于等于180度，次数为3-10次。

可选的，所述往复转动的速度为2-10转/分钟。

本发明实施例提供的一种细胞扩增系统的细胞自动收集方法，由于在通过细胞反应器对细胞进行扩增时，细胞反应器内通过滤膜分隔为细胞生长腔和营养液腔，细胞接种于细胞生长腔内，营养液腔中的营养液渗透该滤膜为细胞提供营养，在此过程中，细胞在狭窄的腔室内扩增之后，大量细胞会聚集在一起，并且还有的细胞附着于细胞生长腔的壁面上，在细胞扩增完成后，通过对扩增后的细胞进行扰动，以使得细胞分散并脱落，而后，通过转动细胞反应器，使得营养液对粘附在细胞生长腔壁面的细胞进行冲刷，并通过细胞输送泵将分散于营养液中的细胞排至细胞收集器中进行收集，在此过程中，能够避免细胞与细胞生长腔粘附而造成细胞残留，并通过细胞输送泵进行输送，能够实现自动化收集，从而能够减少人工介入带来的污染，且操作简单，收集效率高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提供的一种细胞扩增系统的细胞自动收集方法的流程示意图；

图2为本发明实施例提供的一种细胞扩增自动收集系统的结构示意图；

图3为本发明实施例提供的一种转动细胞反应器的结构示意图；

图4为本发明实施例提供的一种细胞反应器转动至细胞输出端向下倾斜45度的结构示意图；

图5为本发明实施例提供的一种细胞扩增系统的结构示意图；

图6为本发明实施例提供的另一种细胞扩增系统的结构示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

本发明的实施例提供一种细胞扩增系统的细胞自动收集方法，参见图1与图2，包括：步骤1)在细胞扩增完成后，对扩增后的细胞进行扰动，以使得所述扩增后的细胞分散并脱落；

步骤2)转动细胞反应器1，使得营养液对粘附在细胞生长腔12壁面的细胞进行冲刷，并通过细胞输送泵3将分散于营养液中的细胞排至细胞收集器4中进行收集。

本发明实施例提供的一种细胞扩增系统的细胞自动收集方法，由于在通过细胞反应器1对细胞进行扩增时，细胞反应器1内通过滤膜2分隔为细胞生长腔12和营养液腔11，细胞接种于细胞生长腔12内，营养液腔11中的营养液渗透该滤膜为细胞提供营养，在此过程中，细胞在狭窄的腔室内扩增之后，大量细胞会聚集在一起，并且还有的细胞附着于细胞生长腔12的壁面上，在细胞扩增完成后，通过对扩增后的细胞进行扰动，以使得细胞分散并脱落，而后，通过转动细胞反应器1，使得营养液对粘附在细胞生长腔12壁面的细胞进行冲刷，并通过细胞输送泵3将分散于营养液中的细胞排至细胞收集器4中进行收集，在此过程中，能够避免细胞与细胞生长腔12粘附而造成细胞残留，并通过细胞输送泵3进行输送，能够实现自动化收集，从而能够减少人工介入带来的污染，且操作简单，收集效率高。

需要说明的是，本发明实施例的细胞收集方法中的细胞反应器1，可适用于绝大多数细胞的培养，尤其适用于悬浮细胞和贴壁细胞的培养。其中，悬浮细胞在培养时可直接注入到细胞培养器1内进行培养，贴壁细胞在培养前需要对细胞反应器1内的细胞生长腔12的壁面进行处理，以便于细胞贴壁生长，例如，将具有附着功能的蛋白铺在细胞生长腔12壁面后，再进行贴壁细胞的培养。在扩增完成后，对细胞进行收集时，通过对所述细胞进行扰动，以使得细胞从细胞生长腔12的壁面脱落，对于悬浮细胞而言，随着细胞的扩增，大量细胞聚集成细胞团，并有部分细胞粘附在细胞生长腔12的腔壁上，通过轻轻扰动就能够使细胞从壁面脱落，并将细胞团打散；而对于贴壁细胞而言，由于贴壁细胞在培养前在细胞生长腔12的壁面铺设有蛋白，因此，优选的，当所述细胞为贴壁细胞时，在对扩增后的细胞进行扰动之前，所述方法还包括：对所述扩增后的细胞进行消化。这样，便于细胞快速脱落，提高收集效率。

对所述扩增后的细胞进行消化的具体操作不做限定，可以将细胞生长腔内的营养液排空，再向其中注入胰蛋白酶，静置一段时间，以对所述细胞进行消化。

其中，对转动细胞反应器1的具体操作不做限定，可以将细胞反应器1的第一端固定，将细胞反应器1的第二端绕第一端进行转动，也可以将细胞反应器1绕自身轴线进行转动，只要能够通过营养液对细胞进行冲刷即可。

本发明的一实施例中，参见图3，转动细胞反应器1具体包括：控制所述细胞反应器1的两端绕所述细胞反应器1的中心在竖直平面内往复转动。

往复转动是指细胞反应器1顺时针转动一定的角度之后，逆时针转回到初始状态的过程，或者，细胞反应器1逆时针转动一定的角度之后，顺时针转回到初始状态的过程。在本发明实施例中，通过控制所述细胞反应器1的两端绕所述细胞反应器1的中心在竖直平面内往复转动，能够在对细胞进行充分扰动的同时，最大程度上减小细胞反应器1的转动空间，避免转动空间过大而对周边的仪器造成干扰，另外，由于细胞反应器1上还连通有营养液输送管道、细胞输送管道等各种管道，因此，采用往复转动的形式，能够防止细胞反应器1不断转动发生管道缠绕。

其中，在控制所述细胞反应器1的两端绕细胞反应器1的中心在竖直平面内往复转动时，可以根据实际需要来设定往复转动的次数、角度以及转速，以通过营养液对细胞进行冲刷，避免粘附。

示例性的，所述往复转动的角度大于0度小于等于180度，次数为3-5次。往复转动的角度是指细胞反应器1从初始位置转动至一定的位置进行回转的角度，如图3所示，实线表示细胞反应器1的初始位置，虚线表示细胞反应器1转动90度的位置。通过实验发现，以该角度进行往复转动，能够最大程度上减少管道缠绕，并通过对往复转动的次数进行实验发现，往复转动3-5次能够避免细胞粘附，最大程度上减少细胞残留。

再示例性的，所述往复转动的速度为1-3转/分钟。通过实验发现，将往复转动的速度控制在该范围内，能够通过营养液对细胞进行充分冲刷，避免细胞粘附。

需要说明的是，在实际应用中，细胞反应器1中的滤膜2可以为中空纤维管，细胞生长腔12可以为中空纤维管的管内空间，也可以为中空纤维管的管外空间，优选的，参见图4，细胞生长腔12为中空纤维管的管外空间，并且细胞输出端13设置在细胞反应器1的侧壁上。这样有利于细胞的接种和排出。

鉴于此，本发明的一实施例中，通过细胞输送泵3将分散于营养液中的细胞排至细胞收集器4中进行收集之前，参见图4，所述方法还包括：将所述细胞反应器1转动至细胞输出端13位于所述细胞反应器1的下方且向下倾斜45度。

在本发明实施例中，通过将细胞反应器1转动至细胞输出端13位于所述细胞反应器1的下方，且向下倾斜45度，能够保证细胞反应器1中的拐角处的细胞在重力作用下流出，防止细胞残留。

在本发明的又一实施例中，参见图5，在所述步骤1)之前，所述方法还包括：在培养过程中对细胞在压力扩展箱5和细胞生长腔12之间进行驱动，以防止细胞聚集。通过在培养过程中对细胞进行驱动，能够保持细胞处于流动状态，防止细胞聚集，有利于细胞收集。

并且，在培养过程中，随着细胞不断扩增，通过将细胞在细胞生长腔12和压力扩展箱5之间驱动，还能够对细胞扩增提供合适的空间，避免细胞聚集。

本专利申请适合压力扩展箱5与细胞生长腔12连通的情况，当然，当所述压力扩展箱5与营养液腔11连通时，也可以另外设置一个细胞储存器，将该细胞储存器与所述细胞生长腔12连通，同样也能够实现该发明目的。

在培养过程中对细胞在压力扩展箱5和细胞生长腔12之间进行驱动可以通过细胞输送泵3进行，这时，可以将细胞输送泵3与细胞收集器4之间的阀门关闭。

同时，在本发明实施例中，由于细胞生长腔12和压力扩展箱5或者一个细胞储存器连通，因此，在细胞扩增完成后，压力扩展箱5或者细胞储存器中的细胞可以直接通过所述压力扩展箱5或者所述细胞储存器进行收集。

其中，对扩增后的细胞进行扰动的具体操作不做限定，只要能够使细胞分散和脱落即可，示例性的，可通过机械搅拌的方法对细胞进行扰动，也可以摆动细胞反应器对细胞进行扰动。

本发明的一实施例中，对扩增后的细胞进行扰动具体包括：

改变营养液腔11和细胞生长腔12之间的压差，通过压力作用对细胞进行扰动；和/或，转动细胞反应器1，以对细胞进行扰动。

在本发明实施例中，通过在营养液腔11和细胞生长腔12之间产生压差，采用营养液的冲击对细胞进行扰动，与机械搅拌对细胞进行扰动相比，能够减少对细胞和滤膜的损坏，同样地，通过转动细胞反应器1，也是采用营养液的冲击对细胞进行扰动，也能够减少对细胞和滤膜造成损坏的情况发生。

其中，所述压差可以是营养液腔11的压力减细胞生长腔12的压力，也可以为细胞生长腔的压力减营养液腔的压力，在实际应用中，通过控制营养液腔11和细胞生长腔12之间压差，就能够使营养液不断对细胞生长腔12内的细胞进行扰动，从而能够将细胞分散和脱落。

其中，改变营养液腔11和/或细胞生长腔12的压力，使得营养液腔11和细胞生长腔12之间产生压差的具体操作不做限定，在细胞扩增系统中，营养液腔11与营养液输送泵6连通，营养液腔11或细胞生长腔12连通有压力扩展箱5，通过营养液输送泵6向营养液腔11输送营养液，当营养液腔11的压力大于细胞生长腔12的压力时，营养液通过滤膜2进入细胞生长腔12与细胞发生营养交换，而压力扩展箱5不论与营养液腔11连通还是和细胞生长腔12连通，都能够使营养液腔11和细胞生长腔12之间的压力逐渐趋于平衡，因此，在实际应用中，可以通过调节所述营养液输送泵6的流速突然增大或者突然减小，在营养液腔11和细胞生长腔12之间产生压差。具体的，当营养液输送泵6的流速突然增大时，营养液腔11和细胞生长腔12之间产生一个正向压差，这时，营养液腔11内的营养液以一定的渗透速度进入细胞生长腔12中，能够对细胞进行扰动，在压力扩展箱5的作用下，细胞生长腔12和营养液腔11之间的压力趋于平衡。而相应地，通过向压力扩展箱5内充入气体或者排出气体，来突然增大或减小压力扩展箱5内的压力，这样，也能够在营养液腔11和细胞生长腔12之间产生压差，对细胞进行扰动，同样地，在此过程中，由于压力扩展箱5的平衡作用，同样能够使营养液腔11和细胞生长腔12之间的压力趋于平衡。

本发明的又一实施例中，参见图6，改变营养液腔11和/或细胞生长腔12的压力，使得营养液腔11和细胞生长腔12之间产生压差具体包括：将营养液输送泵6以脉冲的形式输送营养液，以使得营养液腔11和细胞生长腔12之间的压差正负交替变化。

在本发明实施例中，通过将营养液输送泵6以脉冲的形式输送营养液，使得营养液腔11和细胞生长腔12之间的压差正负交替变化，能够避免不断增大营养液腔11或者细胞生长腔12的压力而使得系统过压的情况发生，保证系统稳定运行，同时，还能够持续对细胞进行扰动。

当然，通过在营养液腔11的出口处还可以设置有阀门a，可以在营养液输送泵6工作时适当关闭所述阀门a，使营养液腔11内的压力增大，进而实现调节营养液腔11内与细胞生长腔12内的压差。

其中，脉冲是指一个物理量在短持续时间内突变后迅速回到其初始状态的过程。在这里，将营养液输送泵6以脉冲的形式输送营养液是指，营养液输送泵6的输送速度以脉冲的形式变化，这样，营养液输送泵6的输送速度忽高忽低，使得营养液输送泵6的输送速度突然增大时，营养液腔11和细胞生长腔12之间就会产生正向压差，而后，营养液输送泵6的输送速度突然降低时，营养液腔11和细胞生长腔12之间产生负向压差，这样，通过使营养液腔11和细胞生长腔12之间的压差正负交替变化，能够使营养液不断冲击细胞，使细胞在足够的压力作用下发生分散和脱落。

其中，在将营养液输送泵6以脉冲的形式输送营养液时，可以根据所需要达到的压差以及细胞生长腔12的压力来调节所述营养液输送泵的输送速度。在此过程中，对所述脉冲的波形不做限定，只要能够使营养液以浪潮的形式不断对细胞进行冲击，从而使细胞发生分散和脱落即可。

优选的，所述脉冲的波形为矩形波，这样，控制营养液输送泵6以第一速度和第二速度交替输送营养液，使得所述营养液输送泵6的速度为矩形波的波峰时，营养液腔11的压力大于细胞生长腔12的压力，接着，营养液输送泵6的速度迅速转换到矩形波的波谷，细胞生长腔12的压力大于营养液腔11的压力，这样压差不断正负交替变化，能够使营养液不断对细胞产生冲击力，使细胞分散和脱落。

本发明的又一实施例中，继续参见图6，改变营养液腔11和/或细胞生长腔12的压力，使得营养液腔11和细胞生长腔12之间产生压差，以对细胞进行扰动；具体包括：交替向压力扩展箱5内充入气体和排出气体，以使得所述营养液腔11和细胞生长腔12之间的压差正负交替变化。

在本发明实施例中，通过改变压力扩展箱5内的压力，使营养液腔11和细胞生长腔12之间的压差正负交替变化，同样能够避免不断增大营养液腔11或者细胞生长腔12的压力而使得系统过压的情况发生，保证系统稳定运行，同时，也能够持续对细胞进行扰动，从而能够使营养液不断冲击细胞，使细胞在足够的压力作用下发生分散和脱落。

在实际应用中，通过在压力扩展箱5上设置阀门b，当向所述压力扩展箱5内充入气体或者排出气体时可以通过开启所述阀门b来实现，同时，通过关闭阀门b，也可以对压力扩展箱5内的压力进行保持。

其中，需要说明的是，由于压力扩展箱5可以与营养液腔11或者细胞生长腔12连通，因此，具体的，当压力扩展箱5与营养液腔11连通时，向压力扩展箱5内充入气体，能够增大营养液腔11和细胞生长腔12之间的压差，反之，则减小营养液腔11和细胞生长腔12之间的压差，当压力扩展箱5与细胞生长腔12连通时，向压力扩展箱5内充入气体，能够减小营养液腔11和细胞生长腔12之间的压差，反之，则增大营养液腔11和细胞生长腔12之间的压差。

在此过程中，同样可以根据所需要达到的压差以及细胞生长腔12或者营养液腔11的压力来调节充入或者排出气体的气体量，以使得营养液腔11和细胞生长腔12之间的压差正负交替变化。

如果同时对营养液输送泵6的流速和压力扩展箱5内的压力进行调节，以使得营养液腔11和细胞生长腔12之间的压差正负交替变化，则操作复杂，不利于控制，但仍可作为一选项。

本发明的一实施例中，所述压差为20-80kpa。通过实验发现，控制营养液腔11和细胞生长腔12之间的压差在该范围内，能够最大程度上对细胞进行扰动，使细胞分散和脱落，同时，还能够避免压差过大造成系统运行不稳定，当然，系统还可以设置过压保护，以避免压差过大。

在实际应用中，还可以在所述营养液腔11和细胞生长腔12上分别设置压力传感器，对所述营养液腔11和细胞生长腔12之间的压差进行实时检测，便于对营养液腔11和细胞生长腔12之间的压差进行调节。

其中，在营养液腔11和细胞生长腔12之间的压差正负交替变化时，所述压差正负交替变化的数值可以为该范围内的任意值，示例性的，当营养液输送泵6以第一速度输送营养液时，营养液腔11与细胞生长腔12之间的压差可以为20kpa，而后，营养液输送泵6以第二速度输送营养液，这时，营养液腔11与细胞生长腔12之间的压差可以为-20--80kpa中的任意值，这与第一速度和第二速度的大小有关；再示例性的，当向所述压力扩展箱5内充入气体时，营养液腔11和细胞生长腔12之间的压差可以为-80kpa，而后，从所述压力扩展箱5内排出气体时，营养液腔11和细胞生长腔12之间的压差可以为20-80kpa中的任意值，这与所充入和排出的气体量有关。

本发明的又一实施例中，所述压差正负交替变化的频度为2-5次/分钟。这里，所述压差正负交替变化的频度是指在一定的时间段内压差正负交替变化的频繁程度，通过将压差正负交替变化的频度控制在该范围内，能够对细胞进行很好的扰动，使细胞得以充分分散和脱落。

本发明的一实施例中，参见图3，转动细胞反应器1，以对细胞进行扰动具体包括：控制所述细胞反应器1的两端绕所述细胞反应器1的中心在竖直平面内往复转动。

往复转动是指细胞反应器1顺时针转动一定的角度之后，逆时针转回到初始位置的过程，或者，细胞反应器1逆时针转动一定的角度之后，顺时针转回到初始位置的过程。

在本发明实施例中，通过控制所述细胞反应器1的两端绕所述细胞反应器1的中心在竖直平面内往复转动，能够在对细胞进行充分扰动的同时，最大程度上减小细胞反应器的转动空间，避免转动空间过大而对周边的仪器造成干扰，另外，由于细胞反应器1上还连通有营养液输送管道、细胞输送管道等各种管道，因此，采用往复转动的形式，能够防止细胞反应器不断转动发生管道缠绕。

其中，在控制所述细胞反应器1的两端绕细胞反应器1的中心在竖直平面内往复转动时，可以根据实际需要来设定往复转动的次数、角度以及转速，以对细胞进行扰动，使得细胞分散和脱落。

示例性的，所述往复转动的角度大于0度小于等于180度，次数为3-10次。如图3所示，实线表示细胞反应器1的初始位置，虚线表示细胞反应器1转动90度的位置。通过营养液对细胞进行扰动以使得细胞分散和脱落，与步骤2)中转动细胞反应器1相比，可以适当增大往复转动的次数，以使得细胞脱落完全。

再示例性的，所述往复转动的速度为2-10转/分钟。同样地，与步骤2)中转动细胞反应器1相比，也可以适当增大往复转动的速度，以便于细胞分散和脱落。

以上为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。