一种用于去除组织细胞的试剂盒和去细胞方法与流程

本发明涉及组织工程材料领域，更特别地，涉及一种用于去除组织细胞的试剂盒以及去细胞方法。

背景技术：

去细胞生物支架被广泛用于组织工程与再生医学中，目前应用于临床和临床前期研究的组织工程瓣膜支架材料亦主要为去细胞生物支架。然而免疫原性是阻碍异种去细胞生物支架应用于临床的最大障碍。

CryoLife公司在临床上推出了两种去细胞瓣膜(SynerGraft)：CryoValve(同种异体去细胞主动脉瓣膜)和500/700(异种猪去细胞瓣膜)。CryoValve去细胞瓣膜自2000年已应用于超过5700例患者，近期临床结果较为满意。而同种异体主动脉瓣膜的最大不足是由于供体短缺而造成来源稀少。因此来源于猪或牛的异种组织因其来源广泛且与人体组织成分和性能相似，常用于去细胞瓣膜的构建。然而，异种猪瓣制备的500/700去细胞瓣膜用于4例患儿的右室流出道重建术，3例患儿均在术后一年内死亡，死因与强烈的免疫排斥反应导致瓣膜衰败相关。随后，异种组织来源的去细胞瓣膜在临床上的应用已寥寥无几。由此可见，异种组织的免疫原性是阻碍异种组织去细胞生物支架进一步应用于临床的关键难题。

异种组织的免疫原性主要来源于细胞，因此去细胞可降低异种组织的免疫原性。目前去细胞基质的制备方法主要包括物理方法如压力法、冻融法，化学试剂如去污剂、有机溶剂，生物制剂如酶类等。多种去细胞方法均可完全地去除组织中的细胞成分，然而在这些方法处理的去细胞生物支架中仍可检测到异种抗原如α-Gal、MHC I，这些抗原的存在最终导致去细胞生物支架植入体内后发生免疫排斥反应和迅速衰败。单纯地去除组织的细胞成分难以最大限度地降低其免疫原性，这提醒我们需另辟蹊径。此外，目前应用的去细胞试剂和去细胞方法对瓣膜的结构和力学性能均造成不同程度的破坏，这些损伤可能会导致去细胞瓣膜植入体内后发生功能不全或迅速衰败。

因此，需要一种新的去细胞生物支架的制备方法和试剂，其不仅能去除异种组织的免疫原性，而且能最大限度地保留细胞外基质成分与力学性能。

技术实现要素：

为解决以上问题，本发明提供了一种一种用于去除组织细胞的试剂盒，其由A液、B液和C液组成，其中所述A液为亲水性去细胞溶液，为3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-propanesulfonate,CHAPS)为浓度5-50g/L并且磷酸三丁酯(tri(n-butyl)phosphate,TnBP)浓度为1-5mM的20-100mM的TRIS-HCl缓冲液；所述B液为CHAPS浓度为5-50g/L、TnBP浓度为1-5mM、脒基磺基甜菜碱(amidosulfobetaine 14,ASB-14)浓度为5-50g/L并且硫代甜菜碱10(sulfobetaine 3-10,SB 3-10)浓度为5-50g/L的20-100mM的TRIS-HCl缓冲液；并且所述C液为全能核酸酶溶液。

优选地，在所述A液中，所述CHAPS的浓度为20g/L，所述TnBP的浓度为2mM，所述TRIS-HCl的浓度为40mM，并且所述A液的pH值为7.8。

优选地，在所述B液中，所述CHAPS的浓度为20g/L，所述TnBP的浓度为2mM，所述ASB-14的浓度为10g/L，所述SB3-10的浓度为20g/L,所述TRIS-HCl的浓度为40mM，并且所述B液的pH值为7.8。

优选地，所述全能核酸酶溶液的溶剂为pH值为8.0的50mM Tris-HCl缓冲液，并且所述全能核酸酶的浓度为100unit/ml。

优选地，所述全能核酸酶溶液中还包含1mM的MgCl₂。

本发明还提供了一种用于去除组织细胞的去细胞方法，使用上述试剂盒处理所述组织，包括用所述A液、B液和C液依次浸泡所述组织的步骤。

进一步地，所述方法包括以下步骤：

S1：用所述A液处理所述组织；

S2：用无菌水漂洗经S1处理的所述组织；

S3：用所述B液处理经S2处理的所述组织；

S4：用PBS漂洗经S3处理的所述组织；

S5：用所述C液处理经S4处理的所述组织；

S6：用PBS漂洗经S5处理的所述组织，即得到去细胞的生物支架。

优选地，所述方法包括以下步骤：

S1：将所述组织浸没于所述A液中，于室温下持续振荡24小时；

S2：用无菌水漂洗经S1处理的组织6次，每次10分钟；

S3：将经S2处理的组织浸没于所述B液中，于室温下持续振荡24小时；

S4：用PBS漂洗经S3处理的组织4次，每次6小时；

S5：将经S4处理的组织浸没于所述C液中，于37℃下持续振荡24小时；

S6：用PBS漂洗经S5处理的组织4次，每次6小时，即得到去细胞的生物支架。

优选地，所述组织为猪主动脉瓣膜。

本发明还提供了一种去细胞生物支架，其通过上述方法得到。

通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果。

(1)异种抗原主要是蛋白质，本发明利用蛋白溶解的原理，以连续水溶性蛋白溶解以及脂溶性蛋白溶解的方法制备得到本发明的异种组织去细胞生物支架。其中，亲水性去细胞溶液中包含CHAPS和TnBP，被用来溶解和去除异种组织中的水溶性抗原；而亲脂性去细胞溶液除CHAPS和TnBP提供水溶性蛋白的溶解外，SB 3-10和ASB-14被用来去除异种组织中的脂溶性蛋白。全能核酸酶，能降解所有形式(包括单链、双链、线性和环状)的DNA和RNA而没有蛋白裂解活性，在广泛条件范围具有很高的特异性。

(2)本发明采用连续水溶性蛋白溶解以及脂溶性蛋白溶解的方法可有效去除猪主动脉瓣膜的细胞成分，较好地保留了猪主动脉瓣膜结构和细胞外基质成分(胶原纤维、弹性纤维、糖胺聚糖)，对力学性能影响小，组织结构及力学性能接近正常组织。

(3)本发明采用连续水溶性蛋白溶解以及脂溶性蛋白溶解的方法可有效去除猪主动脉瓣膜中的异种抗原α-Gal和MHC I，其处理的瓣膜在体外能降低白细胞的激活。表明该方法可降低机体对去细胞瓣膜的免疫反应。此外，基于蛋白溶解的去细胞方法能够不仅去除α-Gal，还能去除一些未知的非α-Gal异种抗原，从而改善去细胞生物支架的生物相容性。

(4)本发明获得的去细胞生物支架具有良好的生物相容性，植入大鼠体内后发生了组织重塑，表现为植入物大量降解，原组织结构不明显，较为规则的结缔组织形成，组织中央可见肌细胞，且不易发生钙化。

(5)本发明的异种组织去细胞生物支架制备周期短、费用低，并可制备成不同规格，优于以往异种去细胞基质，具有很好的临床应用前景。

附图说明

图1为天然瓣膜和去细胞瓣膜DAPI染色的显微照片；

图2为是天然瓣膜和去细胞瓣膜组织学染色(HE、Masson、VVG染色)的显微照片(F:Fibrosa纤维层；S:Spongiosa疏松层；V:Ventricularis心室层，箭头指示弹性纤维)；

图3为天然瓣膜和去细胞瓣膜的扫描电镜照片；

图4为天然瓣膜和去细胞瓣膜的含水量统计图；

图5为天然瓣膜和去细胞瓣膜的胶原蛋白含量统计图；

图6为天然瓣膜和去细胞瓣膜的弹性蛋白含量统计图；

图7为天然瓣膜和去细胞瓣膜的糖胺聚糖含量统计图；

图8为去细胞瓣膜的大体形态以及力学性能检测时周向和径向样本制备示意图；

图9为天然瓣膜和去细胞瓣膜的极限拉伸应变；

图10为天然瓣膜和去细胞瓣膜的极限抗张强度；

图11为天然瓣膜和去细胞瓣膜的弹性模量；

图12为免疫荧光检测天然猪主动脉瓣膜和去细胞瓣膜上α-Gal表达的结果；

图13为免疫荧光检测天然猪主动脉瓣膜和去细胞瓣膜上MHC I表达的结果；

图14为天然猪主动脉瓣膜和去细胞瓣膜刺激PMN弹性蛋白酶的分泌水平；

图15为天然猪主动脉瓣膜和去细胞瓣膜刺激SC5b-9的分泌水平；

图16为天然猪主动脉瓣膜和去细胞瓣膜植入大鼠体内6周后HE和Masson染色照片；

图17为戊二醛固定瓣膜和去细胞瓣膜植入大鼠体内6周后植入物中浸润的巨噬细胞免疫组化染色照片；

图18为天然猪主动脉瓣膜、去细胞瓣膜和戊二醛固定瓣膜植入大鼠体内6周后钙染色照片；

图19为天然猪主动脉瓣膜、去细胞瓣膜和戊二醛固定瓣膜植入大鼠体内6周后钙定量检测统计图。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1用于去细胞的试剂盒的制备

表1.A液(亲水性去细胞溶液)的配置

按照上表的配方，将精准称量的试剂加入干净的广口玻璃瓶中，摇床上振荡0.5～1h，使试剂充分溶解，制备成亲水性去细胞溶液(TnBP试剂因破坏性较强，最后加入，且现配现用)。

表2.B液(亲脂性去细胞溶液)的配制

将精准称量的试剂加入干净的广口玻璃瓶中，摇床上振荡0.5～1h，使试剂充分溶解，制备成去细胞溶液(TnBP试剂因破坏性较强，最后加入，且现配现用)。

SB 3-10是一种两性离子型硫代甜菜碱，对溶解细胞膜蛋白具有超强的能力。ASB-14是一种两性离子型脒基磺基甜菜碱，它能促进多种脂溶性蛋白如红细胞带3蛋白的溶解。虽然SB 3-10和ASB-14均属于具有长线性末端的甜菜碱类两性离子去污剂，但它们溶解蛋白的质量与类型各具特点。SB3-10倾向于溶解不同类别的酸性蛋白，而ASB-14对中性和碱性蛋白具有强烈的溶解作用，可用于去除异种组织中的脂溶性蛋白。

C液为含有1mmol/L MgCl2和100units/ml全能核酸酶的TRIS-HCI缓冲液(50mmol/L，pH 8.0)。

实施例2使用实施例1的试剂盒进行去细胞处理

猪主动脉瓣膜的获取：在屠宰场清洁条件下获取猪心并置于含肝素的冷生理盐水中快速转运至实验室。在猪死亡的1h内，无菌条件下裁剪猪主动脉瓣膜，置于4℃含抗生素(100U/ml青霉素,250mg/ml两性霉素B和100mg/ml链霉素)的高糖DMEM培养基中12h。

去细胞步骤：猪主动脉瓣膜的去细胞过程在六孔板中进行，每孔的工作容量为4ml且最多放置3片瓣膜。以亲水性去细胞溶液进行去细胞处理：将猪主动脉瓣置于含有20g/L CHAPS和2mmol/L TnBP的TRIS-HCI缓冲液(40mmol/L,pH 7.8)中，在室温下持续震荡去细胞处理24h。以无菌水漂洗6次，每次10分钟。以亲脂性去细胞溶液进行去细胞处理：再将其置于含有20g/L CHAPS、2mmol/L TnBP、10g/L ASB-14和20g/L SB 3-10的TRIS-HCI缓冲液(40mmol/L,pH 7.8)中，在室温下继续震荡去细胞处理24h。以核酸酶继续处理：先将去细胞瓣膜以PBS漂洗4次，每次6h。然后置于含有1mmol/L MgCl₂和100units/ml全能核酸酶的TRIS-HCI缓冲液(50mmol/L,pH8.0)中，在37℃持续震荡下继续处理24h；最后以PBS漂洗4次以去除残余的试剂及细胞碎片，每次6h，后置于含抗生素的PBS中，4℃保存备用。

以下为通过上述方法得到的去细胞的猪主动脉瓣膜性能检测

1.组织学检测

组织学染色与扫描电镜检测瓣膜组织结构的变化。去细胞瓣膜(sequential hydrophile and lipophile solubilization,SHLS)和天然瓣膜(NATIVE)以4％多聚甲醛缓冲液固定24h后，梯度脱水，常规石蜡包埋，切片厚度5μm，以试剂盒常规染色。DAPI染色用于评价不同去细胞方法对细胞核的去除作用。如图1所示，在天然猪主动脉瓣膜(NATIVE)中，可见大量呈蓝色荧光的细胞核；在去细胞瓣膜(SHLS)中，未见任何细胞核的成分。HE、Masson以及VVG染色用来评价去细胞方法对瓣膜结构的影响：Masson染色主要用来观察胶原纤维的变化、而VVG染色用来观察弹性纤维的变化。去细胞瓣膜(SHLS)中，HE染色未见任何细胞核成分，瓣膜的三层结构与天然瓣膜(NATIVE)相仿，Masson染色显示三层结构中的胶原纤维保存良好，VVG染色显示心室层的弹性纤维轻度减少(图2)。扫描电镜检测用来观察瓣膜的微观结构。去细胞瓣膜(SHLS)表面未见任何细胞成分，结构保留良好，胶原纤维排列较为整齐(图3)。

2.细胞外基质成分含量检测

含水量：取出各组瓣膜样本(n＝6，n为检测样本的个数，以下n的含义相同)，以滤纸尽量吸干瓣膜表面的样品保存液，称取200mg待测组织，剪碎，置于-80℃冷冻1h，然后冻干36h。再次称重，得到样本的干重(dry weight,DW)，通过比较湿重与干重求各组样本的含水量。去细胞瓣膜(SHLS)的含水量(93.33±1.46％)显著高于天然瓣膜(NATIVE)的含水量(87.32±1.61％,p<0.05)。该结果表明去细胞处理会增加瓣膜的含水量(图4)。

胶原蛋白含量：取称各组瓣膜(n＝6)干重为200mg的待测组织，以6mmol/l盐酸(1ml/10mg)在106℃下溶解24h；水解产物与氯胺T在20℃下反应20min；加入对二甲基氨基苯甲醛，60℃水浴15min；以分光光度计在550nm处测量吸光度值；以不同浓度羟脯氨酸标准品的结果绘制标准曲线，计算各组瓣膜的胶原蛋白含量。去细胞瓣膜(SHLS)的胶原蛋白含量(55.21±5.43％per DW)与天然瓣膜(NATIVE)的胶原蛋白含量(50.43±3.59％per DW)差异无统计学意义。该结果表明该去细胞处理对瓣膜的胶原蛋白含量无显著影响(图5)。

弹性蛋白含量：称取各组瓣膜(n＝6)干重为200mg的待测样品，以0.25mol/l草酸在100℃消化1h。冷却，离心收集悬浮液。草酸重复消化提取3次，合并悬浮液。以弹性蛋白测定试剂盒测定瓣膜的弹性蛋白含量：去细胞瓣膜(SHLS)的弹性蛋白含量(8.00±0.79％per DW)显著低于天然瓣膜(NATIVE)的弹性蛋白含量(9.16±0.46％per DW,p<0.05)(图6)。

糖胺聚糖(GAGs)含量：称取各组瓣膜(n＝6)干重为200mg的待测样品，剪碎。加入木瓜蛋白酶溶液10ml，60℃溶解消化3h。待测样品溶解后，以磷酸二氢钾溶液定容至20ml，加入1,9二甲基亚甲蓝染料各200ul。以分光光度计在540nm处测定各样品的吸光度值。不同浓度的硫酸软骨素标准品用于标准曲线的绘制，计算各待测样品的GAGs含量。以糖胺聚糖测定试剂盒测定瓣膜的糖胺聚糖含量：去细胞瓣膜(SHLS)的糖胺聚糖含量(2.20±0.12％per DW)显著低于天然瓣膜(NATIVE)的糖胺聚糖含量(2.46±0.12％per DW,p<0.05)(图7)。

3.力学性能测试

应用单轴拉伸试验进行天然瓣膜(NATIVE)和去细胞瓣膜(SHLS)(n＝6)力学性能的测定。将瓣膜在周向(circumferential direction)和径向(radial direction)分别剪成15mm×5mm长条状的样本(图5)，以电子游标卡尺测量每个样本的标距、宽度及厚度。将样本固定在力学检测仪的样本夹上，室温下以5mm/min的速度匀速向两端伸拉至样本断裂，测试过程中以PBS保持样本湿润，通过换能器记录样本的应力-应变曲线并计算极限抗张强度、极限拉伸应变以及弹性模量。结果显示：去细胞瓣膜在周向(78.02±9.82mm/mm)和径向(119.6±14.09mm/mm)的极限拉伸应变均显著高于天然瓣膜在周向(52.13±5.57mm/mm)和径向(96.95±6.23mm/mm)的极限拉伸应变(p<0.05)(图9)。去细胞瓣膜在周向(7.43±0.70MPa)和径向(1.45±0.25MPa)的极限抗张强度与天然瓣膜在周向(7.77±0.37MPa)和径向(1.59±0.16MPa)的差异无统计学意义(图10)。去细胞瓣膜在周向(19.13±3.61MPa)和径向(2.17±0.39MPa)的弹性模量与天然瓣膜在周向(21.10±3.14MPa)和径向(2.40±0.19MPa)的无显著差异(图11)。

4.体外异种抗原及免疫原性

去细胞瓣膜和天然瓣膜以4％多聚甲醛缓冲液固定24h后，梯度脱水，常规石蜡包埋，切片厚度5μm，以免疫荧光染色检测去细胞瓣膜及天然瓣膜中异种抗原(α-Gal和MHC I)的表达：免疫荧光染色结果显示天然猪主动脉瓣膜(NATIVE)中可检测到大量携带红色荧光的α-Gal与蓝色荧光的细胞核。去细胞瓣膜(SHLS)中未见细胞核的存在，亦未检测到α-Gal抗原的表达(图12)。免疫荧光染色结果显示天然猪主动脉瓣膜(NATIVE)中可检测到大量携带绿色荧光的MHC I与蓝色荧光的细胞核。在去细胞瓣膜(SHLS)中未见细胞核的存在，亦未检测到MHC I的表达(图13)。该结果提示去细胞方法可完全去除异种抗原α-Gal和MHC I。

天然猪主动脉瓣膜(NATIVE)和去细胞瓣膜(SHLS)分别与人血孵育进行体外免疫原性检测。通过ELISA法分别检测PMN弹性蛋白酶和SC5b-9评估白细胞和补体系统的激活。去细胞瓣膜的PMN弹性蛋白酶水平(116.7±23.11ng/ml)显著低于天然瓣膜的PMN弹性蛋白酶水平(206.0±39.14ng/ml,p<0.05)(图14)。SC5b-9是一个常用来评估炎症反应时补体激活水平的指标。在去细胞瓣膜和天然瓣膜间，SC5b-9水平差异无统计学意义(图15)。

5.去细胞瓣膜的组织相容性

应用大鼠腹壁缺损模型来评价去细胞瓣膜的组织相容性，以0.3％戊巴比妥钠(10ml/kg)对SD大鼠进行腹腔麻醉。腹部备皮并以碘伏消毒。左腹旁正中做一长约1cm的纵行切口，蚊钳钝性分离皮下组织，暴露腹侧腹壁。切除部分腹壁内外斜肌，保留腹膜、横行肌筋膜完整，建立一个大小为1cm×1cm的腹壁缺损。然后应用各组的瓣膜对腹壁缺损进行修补：4-0Prolene不可吸收性缝合线将瓣膜的四个角分别固定于相邻的腹壁肌肉，以利于取出植入物时区分边界。尽可能使用较少缝线以免发生线结反应。皮肤切口以4-0可吸收缝线间断缝合。术后动物在电热毯上进行麻醉后恢复。每天观察伤口是否有肿胀或感染并作记录。分别于术后6周处死大鼠，取出植入物和毗邻组织，用于组织学染色和钙含量检测。结果显示去细胞瓣膜(SHLS)植入体内6周后，去细胞瓣膜表现为植入物大量降解，原组织结构基本消失，较为规则的细胞外基质形成，组织中央可见肌细胞(图16)。免疫组化结果显示去细胞瓣膜(SHLS)以抗炎型M2巨噬细胞(CD206+)浸润为主，可促进植入物组织重塑(图17)。对术后6周取出的植入物行硝酸银染色，去细胞瓣膜(SHLS)中未见硝酸银阳性染色结果(图18)。以原子吸收法测定术后6周各组植入物中的钙含量，结果提示去细胞瓣膜(SHLS)中的钙离子含量(0.85±0.22μg/mg)，显著低于天然瓣膜组(NATIVE)(5.92±1.33μg/mg)和戊二醛交联瓣膜组(GA)(25.59±3.27μg/mg)(图19)(p<0.05)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。