（一）技术领域
本发明涉及一种乳酸菌，特别涉及一种乳酸菌杂交菌种及其制备方法。
（二）
背景技术：
市场上发酵酸奶所用乳酸菌有多种，保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌等，主要用其中的2种、3种或4种菌种通过合适比例的添加来发酵酸奶，这些乳酸菌生长特点各异，都需要厌氧高温培养。所以，对菌种的保藏、繁育是乳酸菌生产厂家比较繁重的一项工作。另外，在酸奶发酵生产过程中，不同菌种配比的不同对最终酸奶的风味、口感影响很大，配比一旦出现问题，会直接导致酸奶风味、口感的不稳定，影响市场销售和声誉。
要解决这些问题，可以对多种乳酸菌进行杂交，使多种菌的优良性状融合于一株菌上，这样，就可以省却很多菌种保藏的工作，也可以使得用这种杂合菌发酵所得的酸奶长期保持稳定的优良特性。
关于乳酸菌的杂交，张莉滟等做过双歧杆菌与乳杆菌原生质体的融合及筛选,改良了双歧杆菌严格厌氧的特性，陈军等做过产粘瑞士乳杆菌与保加利亚乳杆菌的融合实验，获得了表观粘度优于亲本的融合菌株。但通过融合后能够兼备亲株优点，提高发酵酸奶品质，简化酸奶制作流程的融合菌株却缺乏报道。
本专利就是针对这个问题，对生产中常用的保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌进行了原生质体电融合，获得了子代稳定的融合菌株，用其发酵酸奶，品质优于亲本。
（三）
技术实现要素：
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种乳酸菌杂交菌种及其制备方法，使多种乳酸菌的优良性状融合于一株菌上，这样，就可以省却很多菌种保藏的工作，也可以使得用这种杂合菌发酵所得的酸奶长期保持稳定的优良特性。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种乳酸菌杂交菌种，其特殊之处在于：利用保加利亚乳杆菌菌种、嗜热链球菌菌种通过电融合得到乳酸菌杂交菌种。
所述的乳酸菌杂交菌种，编号cgmccno：12911，保藏单位为cgmcc-中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2016年08月29日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。
所述的乳酸菌杂交菌种的制备方法，包括以下步骤：
a)菌种活化：保藏的保加利亚乳杆菌菌种、嗜热链球菌菌种活化备用；
b)原生质体制备：（1）取培养至对数期的菌液，冰水浴；（2）取3-5ml菌液于离心管中，离心，弃上清；（3）加3-5ml生理盐水，摇匀，离心，弃上清；（4）加3-5ml原生质体稳定液，摇匀，离心，弃上清，该步骤重复n次；（5）加4-6ml过滤酶液，32-42℃水浴，离心，弃上清；（6）加3-5ml原生质体稳定液，摇匀，离心，弃上清，该步骤重复n次；（7）加3-5ml原生质体稳定液，制成原生质体悬液，备用，
c)原生质体融合：（1）电击杯无菌处理；（2）取保加利亚乳杆菌，嗜热链球菌紫外诱变致死率刚好在100%的菌株悬液按1:0.8-1.2混合均匀，无菌操作；（3）设置好电击参数进行电融合；（4）将电击融合的菌悬液倾注倒平板，36-46℃下培养，观察、分离纯化出融合菌种。
所述的乳酸菌杂交菌种的制备方法，优选方案：
a)菌种活化：保藏的保加利亚乳杆菌菌种、嗜热链球菌菌种活化若干次备用，活化条件为：36-46℃厌氧培养24-72h；
b)原生质体制备：（1）取培养至对数期的菌液，冰水浴10-30min；（2）取3-5ml菌液于离心管中，1500-4500r/min离心5-15min，弃上清；（3）加3-5ml生理盐水，摇匀，1500-4500r/min离心5-15min，弃上清；（4）加3-5ml原生质体稳定液，摇匀，1500-4500r/min离心5-15min，弃上清，该步骤重复n次；（5）加4-6ml过滤酶液，32-42℃水浴10-30min，2000-6000r/min离心5-15min，弃上清；（6）加3-5ml原生质体稳定液，摇匀，2000-6000r/min离心5-15min，弃上清，该步骤重复n次；（7）加3-5ml原生质体稳定液，制成原生质体悬液，备用，
c)原生质体融合：（1）电击杯/0.1cm无菌处理；（2）取保加利亚乳杆菌，嗜热链球菌紫外诱变致死率刚好在100%的菌株悬液按1:0.8-1.2混合均匀，无菌操作加入电击杯0.2-0.4ml；（3）设置好电击参数进行电融合，电压：2-3kv，脉冲次数：1次，电击时间：1-3ms；（4）将电击融合的菌悬液倾注倒平板，36-46℃无氧条件下培养16-32h，观察、分离纯化出融合菌种。
所述的乳酸菌杂交菌种的制备方法，更有方案：
a)菌种活化：保藏菌种活化3次备用，活化条件为：36-46℃厌氧培养24-72h；
b)原生质体制备：（1）取培养至对数期的菌液，冰水浴20min；（2）取4ml菌液于离心管中，3000r/min离心10min，弃上清；（3）加4ml生理盐水，摇匀，3000r/min离心10min，弃上清；（4）加４ml原生质体稳定液，摇匀，3000r/min离心10min，弃上清，再重复该步骤一次；（5）加5ml过滤酶液，37℃水浴20min，4000r/min离心10min，弃上清；（6）加４ml原生质体稳定液，摇匀，4000r/min离心10min，弃上清，再重复该步骤一次；（7）加４ml原生质体稳定液，制成原生质体悬液，备用，
c)原生质体融合：（1）电击杯/0.１cm无菌处理；（2）取保加利亚乳杆菌，嗜热链球菌紫外诱变致死率刚好在100%的菌株悬液按1:1混合均匀，无菌操作加入电击杯0.3ml；（3）设置好电击参数进行电融合，电压：2.5kv，脉冲次数：1次，电击时间：2ms；（4）将电击融合的菌悬液倾注倒平板，42℃无氧条件下培养24h，观察、分离纯化出融合菌种。
其中，
原生质体稳定液：甘露醇与磷酸盐缓冲液/pbs混合液，其中，甘露醇浓度为0.7-0.9mol/l，甘露醇浓度优选0.8mol/l，
酶液：80-120mg溶菌酶20000u/mg+20ml磷酸盐缓冲液/pbs，微孔滤膜过滤后备用，优选，100mg溶菌酶20000u/mg+20ml0.2mol/l的磷酸盐缓冲液/pbs，用0.22μm的微孔滤膜过滤后备用。
磷酸盐缓冲液/pbs：磷酸盐缓冲液/pbs：565-935ml0.2mol/lnah2po4+65-435ml0.2mol/lna2hpo4，ph5.7-6.7，优选，磷酸盐缓冲液/pbs：877ml0.2mol/lnah2po4+123ml0.2mol/lna2hpo4，ph6。
菌种活化过程中，通过再生固体培养基培养。
原生质体融合过程步骤（4）中，将电击融合的菌悬液先混入再生半固体培养基内，然后再倾注倒平板至再生固体培养基上，观察、分离纯化出融合菌种，培养温度均为36-46℃，
其中，
再生固体培养基（1500ml）：葡萄糖7-8g，酵母浸粉7-8g，胰蛋白胨7-8g，l-cys盐酸盐0.4-0.8g，乳糖6-7.5g，乙酸钠14-16g，琼脂22-23g，kh2po43-4.2g，cacl2·2h2o5.5-6.5g，mgcl2·6h2o27-28g，ph6-7；
再生半固体培养基（1500ml）：葡萄糖7-8g，酵母浸粉7-8g，胰蛋白胨7-8g，l-cys盐酸盐0.4-0.8g，乳糖6-7.5g，乙酸钠14-16g，琼脂11-16.5g，kh2po43-4.2g，cacl2·2h2o5.5-6.5g，mgcl2·6h2o27-28g，ph6-7。
一种乳酸菌杂交菌种制备酸奶的方法，包括以下步骤：将融合菌种接种至装有无菌纯奶的锥形瓶中，36-46℃培养16-32h制备酸奶。
一种酸奶酸度的测定方法，包括以下步骤：取10ml酸乳，用20ml蒸馏水稀释。加入0.5%的中性酚酞指示剂0.5ml，以0.1mol/lnaoh溶液滴定至粉红色（30s内不变色），将所消耗的naoh毫升数乘以10，即为酸奶的酸度，所述酸奶的酸度用吉尔涅尔度°t表示。
本发明的有益效果：本发明对生产中常用的保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌进行了原生质体电融合，获得了子代稳定的融合菌株，品质优于亲本，简化了菌种保藏流程，将其用于发酵酸奶，大大改善了酸奶风味，简化了酸奶生产流程，而且保证了酸奶长期风味稳定。
（四）具体实施方式
实施例1
1.菌种：保藏的保加利亚乳杆菌菌种、嗜热链球菌菌种。
2.试剂
磷酸盐缓冲液/pbs(0.2mol/l)：877ml0.2mol/lnah2po4+123ml0.2mol/lna2hpo4，ph6。
原生质体稳定液：含0.8mol/l甘露醇的0.2mol/l的磷酸盐缓冲液/pbs。
酶液（5mg/ml）：100mg溶菌酶（20000u/mg）+20ml0.2mol/l的磷酸盐缓冲液/pbs，用0.22μm的微孔滤膜过滤后备用。
蒙牛纯牛奶：制作酸奶用。
3.仪器设备：mjx智能霉菌培养箱（mjx型，宁波江南仪器厂），全温振动器（hzq-y型，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）、高速台式离心机（tgl-16c，上海安亭科学仪器厂）、电穿孔仪genepulser（bio-rad型，伯乐生命医学产品（上海）有限公司）、电击杯（0.1cm）高压蒸汽灭菌器（mls-3780，三洋电机株式会社）、双人垂直超净工作台（vj-vs-2型，无锡一净净化设备有限公司）、电子精密天平（cav4102c型，奥豪斯中国地区）、紫外可见分光光度计（tu-1810，）、移液枪（brandtransferpetted-1000、d-5000型，普兰德（上海）贸易有限公司）、ph计（phs-3c型，上海精密科学仪器有限公司）。
4.培养基
（1）再生固体培养基（1500ml）葡萄糖7.5g，酵母浸粉7.5g，胰蛋白胨7.5g，l-cys盐酸盐0.6g，乳糖6.75g，乙酸钠15g，琼脂22.5g，kh2po43.75g，cacl2·2h2o5.67g，mgcl2·6h2o27.5g，ph6.5。
（2）再生半固体培养基：除琼脂减半外，其他成分同培养基（１），ph6.5。
（3）双层再生培养基：将菌液混入再生半固体培养基内，倾注倒平板至再生固体培养基上。
5.方法
5.1菌种活化：保藏菌种活化3次，备用，活化条件：42℃厌氧培养48h，通过再生固体培养基培养。
5.2原生质体制备方法：（1）取培养至对数期的菌液，冰水浴20min。（2）取4ml菌液于离心管中，离心（3000r/min）10min，弃上清。（3）加4ml生理盐水，摇匀，3000r/min离心10min，弃上清，其中，生理盐水为0.9%的氯化钠水溶液。（4）加４ml原生质体稳定液，摇匀，3000r/min离心10min，弃上清。（该步骤再重复一次）。（5）加5ml过滤酶液，37℃水浴20min，4000r/min离心10min，弃上清。（6）加４ml原生质体稳定液，摇匀，4000r/min离心10min，弃上清。（该步骤再重复一次）。（7）加４ml原生质体稳定液，制成原生质体悬液，备用。
5.3原生质体融合：（1）电击杯/0.１cm无菌处理。（2）加入菌悬液，将不同乳酸菌的原生质体悬液浓度调到1×106个/ml进行混菌融合（取保加利亚乳杆菌，嗜热链球菌紫外诱变致死率刚好在100%的菌株悬液按1:1混合均匀，无菌操作加入电击杯0.3ml。）（3）设置好电击参数进行电融合（电压：2.5kv；脉冲次数：1次；电击时间：2ms。）（4）将电击融合的菌悬液先混入再生半固体培养基内，然后再倾注倒平板至再生固体培养基上培养，观察、分离纯化出融合菌种，培养条件均为：42℃无氧条件下培养24h。
5.4酸奶的制作
（1）分别将定量的亲本菌种和融合菌种（菌悬液浓度为1×106个/ml，接种量为10%，）接种至装有无菌纯奶的锥形瓶中，42℃培养24h。从酸、涩、风味、酸度、ph值5个方面来比较酸奶风味。
（2）酸奶酸度的测定：酸奶的酸度用吉尔涅尔度（°t）表示。
方法：取10ml酸乳，用20ml蒸馏水稀释。加入0.5%的中性酚酞指示剂0.5ml，以0.1mol/lnaoh溶液滴定至粉红色（30s内不变色），将所消耗的naoh毫升数乘以10，即为酸奶的酸度。
（3）ph值测定：用ph计测定酸奶的ph值。
（4）对制作好的酸奶进行感官评定。
表1：感官评定标准
6.结果
6.1融合菌大小
二菌融合菌株呈链状，杆球混合链状，直径0.5-0.8μm，长2-6μm，宽0.4-0.7μm。
表2亲本菌株与融合菌大小比较
6.2.发酵酸奶结果
表3：亲本菌株与融合菌发酵酸奶结果
6.3对融合菌株及亲本菌株进行测序鉴定
结果如下：
（1）融合菌株（fusantxu1lactobacillussp.）的16sdna序列
atgcagtcgaacgagttctcgttgattgcatcggtgcttgcaccgagattcaacatggaacgagtggcggacgggtgagt
aacacgtgggtaacctgcccttaagtgggggataacatttggaaacagatgctaataccgcatagatccaagaaccgcat
ggttcttggctgaaagatggcgtaagctatcgcttttggatggacccgcggcgtattagctagttggtgaggtaatggct
caccaaggcgatgatacgtagccgaactgagaggttgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacggg
aggcagcagtagggaatcttccacaatggacgcaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaaggctttcgggtcg
taaaactctgttgttggagaagaatggtcggcagagtaactgttgtcggcgtgacggtatccaaccagaaagccacggct
aactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcgg
ttttttaagtctgatgtgaaagccctcggcttaaccgaggaagcgcatcggaaactgggaaacttgagtgcagaagagga
cagtggaactccatgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctgtctggtctgta
actgacgctgaggctcgaaagcatgggtagcgaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgatgaatgcta
ggtgttggagggtttccgcccttcagtgccgcagctaacgcattaagcattccgcctggggagtacgaccgcaaggttga
aactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccag
gtcttgacatcttttgatcacctgagagatcaggtttccccttcgggggcaaaatgacaggtggtgcatggttgtcgtca
gctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatgactagttgccagcatttagttgggcact
ctagtaagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacac
acgtgctacaatggatggtacaacgagttgcgagaccgcgaggtcaagctaatctcttaaagccattctcagttcggact
gtaggctgcaactcgcctacacgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcacgccgcggtgaatacgttcccgggc
cttgtacacaccgcccgtcacaccatgagagtttgtaacacccgaagccggtggcgtaactcctttagggagcgagccgt
ctaaggtgacaaatt
（2）亲本菌株保加利亚乳杆菌的16sdna序列
tatacatgcaagtcgaacgagttctcgttgattgcatcggtgcttgcaccgagattcaacatggaacgagtggcggacgg
gtgagtaacacgtgggtaacctgcccttaagtgggggataacatttggaaacagatgctaataccgcatagatccaagaa
ccgcatggttcttggctgaaagatggcgtaagctatcgcttttggatggacccgcggcgtattagctagttggtgaggta
atggctcaccaaggcgatgatacgtagccgaactgagaggttgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcc
tacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgcaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaaggctttc
gggtcgtaaaactctgttgttggagaagaatggtcggcagagtaactgttgtcggcgtgacggtatccaaccagaaagcc
acggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggatttattgggcgtaaagcgagcgc
aggcggttttttaagtctgatgtgaaagccctcggcttaaccgaggaagcgcatcggaaactgggaaacttgagtgcaga
agaggacagtggaactccatgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctgtctgg
tctgtaactgacgctgaggctcgaaagcatgggtagcgaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgatga
atgctaggtgttggagggtttccgcccttcagtgccgcagctaacgcattaagcattccgcctggggagtacgaccgcaa
ggttgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaacct
taccaggtcttgacatcttttgatcacctgagagatcaggtttccccttcgggggcaaaatgacaggtggtgcatggttg
tcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatgactagttgccagcatttagttg
ggcactctagtaagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctggg
ctacacacgtgctacaatggatggtacaacgagttgcgagaccgcgaggtcaagctaatctcttaaagccattctcagtt
cggactgtaggctgcaactcgcctacacgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcacgccgcggtgaatacgttc
ccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgagagtttgtaacacccgaagccggtggcgtaaccctttagggagcga
gccgtctaagtga
（3）亲本菌株嗜热链球菌的16sdna序列
gctatacatgcagtcgagcgaacagataaggagcttgctcctttgacgttagcggcggacgggtgagtaacacgtggata
acctacctataagactgggataacttcgggaaaccggagctaataccggataacatattgaaccgcatggttcaatagtg
aaaggcggctttgctgtcacttatagatggatccgcgccgtattagctagttggtaaggtaacggcttaccaaggcaacg
atacgtagccgacctgagagggtgatcggccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtagg
gaatcttccgcaatgggcgaaagcctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggtcttcggatcgtaaaactctgtta
tcagggaagaacaaatgtgtaagtaactgtgcacatcttgacggtacctgatcagaaagccacggctaactacgtgccag
cagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggaattattgggcgtaaagcgcgcgtaggcggttttttaagtctg
atgtgaaagcccacggctcaaccgtggagggtcattggaaactggaaaacttgagtgcagaagaggaaagtggaattcca
tgtgtagcggtgaaatgcgcagagatatggaggaacaccagtggcgaaggcgactttctggtctgtaactgacgctgatg
tgcgaaagcgtggggatcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggt
ttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaat
tgacggggacccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaaatcttgacatcct
ttgaccgctctagagatagagtcttccccttcgggggacaaagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgt
gagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttaagcttagttgccatcattaagttgggcactctaagttgact
gccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgatttgggctacacacgtgctacaa
tggacaatacaaagggcagctaaaccgcgaggtcaagcaaatcccataaagttgttctcagttcggattgtagtctgcaa
ctcgactacatgaagctggaatcgctagtaatcgtagatcagcatgctacggtgaatacgttcccgggtcttgtacacac
cgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagccggtgggagtaaccatttatggagctagccgtcgaaggtgaca
aagg
通过序列比对，融合菌株与两亲本菌株的16sdna序列存在较大差异。
通过绘制发育树分析，融合菌株与两个亲本菌株相差甚大。说明亲本菌株发生了融合，产生了杂交的乳酸菌。
实施例2
1.菌种：保藏的保加利亚乳杆菌菌种、嗜热链球菌菌种。
2.试剂
磷酸盐缓冲液/pbs：935ml0.2mol/lnah2po4+65ml0.2mol/lna2hpo4，ph5.7。
原生质体稳定液：甘露醇与磷酸盐缓冲液/pbs混合液，甘露醇含0.7mol/l。
酶液（4.5mg/ml）：90mg溶菌酶（20000u/mg）+20ml磷酸盐缓冲液/pbs，用0.22μm的微孔滤膜过滤后备用。
蒙牛纯牛奶：制作酸奶用。
3.仪器设备：mjx智能霉菌培养箱（mjx型，宁波江南仪器厂），全温振动器（hzq-y型，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）、高速台式离心机（tgl-16c，上海安亭科学仪器厂）、电穿孔仪genepulser（bio-rad型，伯乐生命医学产品（上海）有限公司）、电击杯（0.1cm）高压蒸汽灭菌器（mls-3780，三洋电机株式会社）、双人垂直超净工作台（vj-vs-2型，无锡一净净化设备有限公司）、电子精密天平（cav4102c型，奥豪斯中国地区）、紫外可见分光光度计（tu-1810，）、移液枪（brandtransferpetted-1000、d-5000型，普兰德（上海）贸易有限公司）,ph计（phs-3c型，上海精密科学仪器有限公司）。
4.培养基
（1）再生固体培养基（1500ml）葡萄糖7g，酵母浸粉8g，胰蛋白胨7g，l-cys盐酸盐0.8g，乳糖6g，乙酸钠16g，琼脂22g，kh2po44.2g，cacl2·2h2o5.5g，mgcl2·6h2o28g，ph6。
（2）再生半固体培养基：除琼脂减半外，其他成分同培养基（１），ph6。
（3）双层再生培养基：将菌液混入再生半固体培养基内，倾注倒平板至再生固体培养基上。
5.方法
5.1菌种活化：保藏菌种活化3次，备用，活化条件：36℃厌氧培养72h，通过再生固体培养基培养。
5.2原生质体制备方法：（1）取培养至对数期的菌液，冰水浴10min。（2）取3ml菌液于离心管中，离心（4500r/min）15min，弃上清。（3）加3ml生理盐水，摇匀，4500r/min离心15min，弃上清。（4）加3ml原生质体稳定液，摇匀，1500r/min离心15min，弃上清。（该步骤再重复一次）。（5）加4ml过滤酶液，42℃水浴10min，2000r/min离心15min，弃上清。（6）加3ml原生质体稳定液，摇匀，6000r/min离心5min，弃上清。（该步骤再重复一次）。（7）加3ml原生质体稳定液，制成原生质体悬液，备用。
5.3原生质体融合：（1）电击杯/0.１cm无菌处理。（2）加入菌悬液，将不同乳酸菌的原生质体悬液浓度调到1×106个/ml进行混菌融合（取保加利亚乳杆菌，嗜热链球菌紫外诱变致死率刚好在100%的菌株悬液按1:0.8混合均匀，无菌操作加入电击杯0.2ml。）（3）设置好电击参数进行电融合（电压：3kv；脉冲次数：1次；电击时间：3ms。）（4）将电击融合的菌悬液先混入再生半固体培养基内，然后再倾注倒平板至再生固体培养基上培养，观察、分离纯化出融合菌种，培养条件均为：36℃无氧条件下培养32h。
5.4酸奶的制作
（1）分别将定量的亲本菌种和融合菌种（菌悬液浓度为1×106个/ml，接种量为10%，）接种至装有无菌纯奶的锥形瓶中，36℃培养32h。从酸、涩、风味、酸度、ph值5个方面来比较酸奶风味。
（2）酸奶酸度的测定：酸奶的酸度用吉尔涅尔度（°t）表示。
方法：取10ml酸乳，用20ml蒸馏水稀释。加入0.5%的中性酚酞指示剂0.5ml，以0.1mol/lnaoh溶液滴定至粉红色（30s内不变色），将所消耗的naoh毫升数乘以10，即为酸奶的酸度。
（3）ph值测定：用ph计测定酸奶的ph值。
（4）对制作好的酸奶进行感官评定，如表1所述。
实施例3
1.菌种：保藏的保加利亚乳杆菌菌种、嗜热链球菌菌种。
2.试剂
磷酸盐缓冲液/pbs：565ml0.2mol/lnah2po4+435ml0.2mol/lna2hpo4，ph6.7。
原生质体稳定液：甘露醇与磷酸盐缓冲液/pbs混合液，含甘露醇0.9mol/l。
酶液（5.5mg/ml）：110mg溶菌酶（20000u/mg）+20ml磷酸盐缓冲液/pbs，用0.22μm的微孔滤膜过滤后备用。
蒙牛纯牛奶：制作酸奶用。
3.仪器设备：mjx智能霉菌培养箱（mjx型，宁波江南仪器厂），全温振动器（hzq-y型，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）、高速台式离心机（tgl-16c，上海安亭科学仪器厂）、电穿孔仪genepulser（bio-rad型，伯乐生命医学产品（上海）有限公司）、电击杯（0.1cm）高压蒸汽灭菌器（mls-3780，三洋电机株式会社）、双人垂直超净工作台（vj-vs-2型，无锡一净净化设备有限公司）、电子精密天平（cav4102c型，奥豪斯中国地区）、紫外可见分光光度计（tu-1810，）、移液枪（brandtransferpetted-1000、d-5000型，普兰德（上海）贸易有限公司）、ph计（phs-3c型，上海精密科学仪器有限公司）。
4.培养基
（1）再生固体培养基（1500ml）葡萄糖8g，酵母浸粉7g，胰蛋白胨8g，l-cys盐酸盐0.4g，乳糖7.5g，乙酸钠14g，琼脂23g，kh2po43g，cacl2·2h2o6.5g，mgcl2·6h2o27g，ph7。
（2）再生半固体培养基：除琼脂减半外，其他成分同培养基（１），ph7。
（3）双层再生培养基：将菌液混入再生半固体培养基内，倾注倒平板至再生固体培养基上。
5.方法
5.1菌种活化：保藏菌种活化3次，备用，活化条件：46℃厌氧培养24h，通过再生固体培养基培养。
5.2原生质体制备方法：（1）取培养至对数期的菌液，冰水浴30min。（2）取5ml菌液于离心管中，离心（1500r/min）5min，弃上清。（3）加5ml生理盐水，摇匀，1500r/min离心5min，弃上清。（4）加5ml原生质体稳定液，摇匀，4500r/min离心5min，弃上清。（该步骤再重复一次）。（5）加6ml过滤酶液，32℃水浴30min，6000r/min离心5min，弃上清。（6）加5ml原生质体稳定液，摇匀，2000r/min离心15min，弃上清。（该步骤再重复一次）。（7）加5ml原生质体稳定液，制成原生质体悬液，备用。
5.3原生质体融合：（1）电击杯/0.１cm无菌处理。（2）加入菌悬液，将不同乳酸菌的原生质体悬液浓度调到1×106个/ml进行混菌融合（取保加利亚乳杆菌，嗜热链球菌紫外诱变致死率刚好在100%的菌株悬液按1:1.2混合均匀，无菌操作加入电击杯0.4ml。）（3）设置好电击参数进行电融合（电压：2kv；脉冲次数：1次；电击时间：1ms。）（4）将电击融合的菌悬液先混入再生半固体培养基内，然后再倾注倒平板至再生固体培养基上培养，观察、分离纯化出融合菌种，培养条件均为：46℃无氧条件下培养16h。
5.4酸奶的制作
（1）分别将定量的亲本菌种和融合菌种（菌悬液浓度为1×106个/ml，接种量为10%，）接种至装有无菌纯奶的锥形瓶中，46℃培养16h。从酸、涩、风味、酸度、ph值5个方面来比较酸奶风味。
（2）酸奶酸度的测定：酸奶的酸度用吉尔涅尔度（°t）表示。
方法：取10ml酸乳，用20ml蒸馏水稀释。加入0.5%的中性酚酞指示剂0.5ml，以0.1mol/lnaoh溶液滴定至粉红色（30s内不变色），将所消耗的naoh毫升数乘以10，即为酸奶的酸度。
（3）ph值测定：用ph计测定酸奶的ph值。
（4）对制作好的酸奶进行感官评定，如表1所述。
实施例4
磷酸盐缓冲液/pbs：815ml0.2mol/lnah2po4+185ml0.2mol/lna2hpo4，ph6.2。
原生质体稳定液：甘露醇与磷酸盐缓冲液/pbs混合液，其含甘露醇0.8mol/l。
酶液（4mg/ml）：80mg溶菌酶（20000u/mg）+20ml磷酸盐缓冲液/pbs，用0.22μm的微孔滤膜过滤后备用。
实施例5
磷酸盐缓冲液/pbs：900ml0.2mol/lnah2po4+100ml0.2mol/lna2hpo4，ph5.9。
原生质体稳定液：甘露醇与磷酸盐缓冲液/pbs混合液，其含甘露醇0.82mol/l。
酶液（5mg/ml）：100mg溶菌酶（20000u/mg）+20ml磷酸盐缓冲液/pbs，用0.22μm的微孔滤膜过滤后备用。
实施例6
磷酸盐缓冲液/pbs：735ml0.2mol/lnah2po4+265ml0.2mol/lna2hpo4，ph6.4。
原生质体稳定液：甘露醇与磷酸盐缓冲液/pbs混合液，其含甘露醇0.78mol/l。
酶液（5mg/ml）：100mg溶菌酶（20000u/mg）+20ml磷酸盐缓冲液/pbs，用0.22μm的微孔滤膜过滤后备用。
实施例7
磷酸盐缓冲液/pbs：900ml0.2mol/lnah2po4+100ml0.2mol/lna2hpo4，ph5.9。
原生质体稳定液：甘露醇与磷酸盐缓冲液/pbs混合液，其含甘露醇0.78mol/l。
酶液（6mg/ml）：120mg溶菌酶（20000u/mg）+20ml磷酸盐缓冲液/pbs，用0.22μm的微孔滤膜过滤后备用。
sequencelisting
<110>菏泽学院
<120>一种乳酸菌杂交菌种及其制备方法
<130>1
<160>1
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>1455
<212>dna
<213>乳杆菌
<400>1
atgcagtcgaacgagttctcgttgattgcatcggtgcttgcaccgagattcaacatggaa60
cgagtggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcccttaagtgggggataacattt120
ggaaacagatgctaataccgcatagatccaagaaccgcatggttcttggctgaaagatgg180
cgtaagctatcgcttttggatggacccgcggcgtattagctagttggtgaggtaatggct240
caccaaggcgatgatacgtagccgaactgagaggttgatcggccacattgggactgagac300
acggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgcaagtctg360
atggagcaacgccgcgtgagtgaagaaggctttcgggtcgtaaaactctgttgttggaga420
agaatggtcggcagagtaactgttgtcggcgtgacggtatccaaccagaaagccacggct480
aactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggatttattggg540
cgtaaagcgagcgcaggcggttttttaagtctgatgtgaaagccctcggcttaaccgagg600
aagcgcatcggaaactgggaaacttgagtgcagaagaggacagtggaactccatgtgtag660
cggtgaaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctgtctggtctgta720
actgacgctgaggctcgaaagcatgggtagcgaacaggattagataccctggtagtccat780
gccgtaaacgatgaatgctaggtgttggagggtttccgcccttcagtgccgcagctaacg840
cattaagcattccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacggg900
ggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccag960
gtcttgacatcttttgatcacctgagagatcaggtttccccttcgggggcaaaatgacag1020
gtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagc1080
gcaacccttatgactagttgccagcatttagttgggcactctagtaagactgccggtgac1140
aaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacac1200
acgtgctacaatggatggtacaacgagttgcgagaccgcgaggtcaagctaatctcttaa1260
agccattctcagttcggactgtaggctgcaactcgcctacacgaagtcggaatcgctagt1320
aatcgcggatcagcacgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtca1380
caccatgagagtttgtaacacccgaagccggtggcgtaactcctttagggagcgagccgt1440
ctaaggtgacaaatt1455